Mecanismos de Vascularização
Estudo em dois modelos
Ana Lúcia Cordeiro
António Figueiredo
Filipa Godinho
Inês Martins
Orientadora: Prof. Doutora Delminda Magalhães
Regente: Prof. Doutora Deolinda Teixeira
23 de Maio, 2005
Introdução
O que são mecanismos de vascularização?
Angiogénese: mecanismo de proliferação de células endoteliais e
musculares lisas para formarem novos vasos sanguíneos.
Vasculogénese: origina os vasos de grande calibre “de novo”,
no embrião, a partir de percursores mesodermicos conhecidos
por angioblastos.
Angiogénese propriamente dita: ocorre após formação de
grandes troncos vasculares em que estes últimos se ramificam
e se distribuem numa rede vascular complexa. Este processo
mantém-se durante toda a vida do indivíduo, dependendo de
factores de crescimento vascular.
VEGF

Factor de crescimento vascular endotelial;
Regulador chave da angiogénese fisiológica durante a embriogénese,
crescimento ósseo, funções reprodutivas;

Também está implicado na angiogénese patológica associada a
tumores, desordens neovasculares intraoculares...

Pertence a uma família que inclui PlGF (Factor de crescimento
placentário), VEGF B, C e D;

O gene do VEGF A humano está organizado em oito exões separados
por sete intrões. O splicing alternativo resulta na formação de quatro
isoformas com diferente número de ácidos aminados.

Analisou-se o VEGF A porque é o mais bem estudado e o mais
importante ao nível do crescimento vascular.

Receptor de VEGF (VEGFR)
Os efeitos biológicos do VEGF são mediados por dois receptores:
VEGFR-1 e VEGFR-2, ambos com acção da cínase da tirosina.

Estudou-se o VEGFR-2 porque este é aquele ao qual o VEGF se liga
preferencialmente.

Modelos em estudo
Estudou-se o tecido cavernoso do pénis de rato devido às patologias que
lhe estão associadas, nomeadamente a disfunção eréctil.


A glândula supra-renal foi estudada pois é um tecido muito vascularizado.
Objectivos

Familiarização com técnicas de microscopia e de laboratório.
Caracterizar a localização do VEGFR-2 no tecido do corpo
cavernoso do pénis de rato.

Analisar as alterações na expressão e localização do VEGFR-2 no
tecido do corpo cavernoso de pénis de rato.


Identificar as junções intercelulares de aderência.

Relacionar o estudo efectuado com patologias.
Métodos
Imunocitoquímica
1º dia

Desparafinar os cortes;

Hidratar em concentrações descendentes de etanol em água;

Inibição de peroxídase endógena, usando uma solução de metanol;

Aquecer 200 ml de tampão citrato no microondas até a ebulição;

Adicionar 100 µl de tampão de incubação;

Ligação do anticorpo primário ao corte.
2º dia

Ligação do anticorpo secundário ao corte;
Adicionar cerca de 100 µl de solução de estreptavidina-biotinaperoxidase e incubar durante 30 min;


Adicionar solução de DAB/H2O2 ao corte e incubar durante 7 min;

Corar com hemateína;

Desidratar em etanol de concentrações crescentes e xilol;

Montar em Entellan;

Observar os cortes ao microscópio de luz.
Microscopia electrónica e de luz
Preparação de blocos de Epon:

Fixação;

Pós-fixação com tetróxido de ósmio;

Desidratação em etanol com concentrações crescentes;

Inclusão em Epon.
Preparação dos cortes:
Cortes efectuados no ultramicrótomo, usando uma faca de vidro – Cortes
semi-finos e ultra-finos;

Os cortes semi-finos foram corados com azur, observados ao microscópio
óptico e fotografados;

Os cortes ultra-finos foram colocados em grelha de cobre e contrastados
com acetato de uranilo e citrato de chumbo, sendo posteriormente
observados ao microscópio electrónico e fotografados com revelação dos
negativos e passagem a papel por método de rotina do laboratório.

Resultados
Microscopia de luz
Imunocitoquímica
Fig.1- Amostra controlo de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 20x.
Fig.2- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato adulto normal, com ampliação total de 20x.
Fig.3- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato idoso (18 meses), com ampliação total de 20x.
Fig.4- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato orquidectomizado, com ampliação total de 20x.
Coloração com Azur
Fig.5- Corte semi-fino de tecido cavernoso de pénis de rato, com ampliação total de 20x.
Fig.6- Corte semi-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 40x.
Fig.7- Corte semi-fino de tecido de supra-renal de rato, com ampliação total de 20x.
Fig.8- Corte semi-fino de tecido de supra-renal de rato, com ampliação total de 40x.
Microscopia electrónica

Tecido cavernoso de pénis de rato
Fig.9- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 4500x.
Fig.10- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 9400x.
Fig.11- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 4500x.

Tecido de supra-renal
Fig.12- Corte ultra-fino de tecido de supra-renal de rato com ampliação total de 3400x.
Fig.13- Corte ultra-fino de tecido de supra-renal de rato com ampliação total de 5400x.
Conclusões

Foi possível confirmar a localização de VEGFR-2, o qual se encontra
apenas nas células endoteliais, sendo a sua localização e expressão
independentes das condições do animal.

Aquando da observação ao microscópio electrónico, não se conseguiu
identificar junções intercelulares de aderência nas preparações de pénis
de rato, contrariamente ao tecido de supra-renal onde estas estruturas
eram claramente visíveis.

Relativamente às patologias dos tecidos mencionados, não foi possível
retirar conclusões neste sentido.
Bibliografia

Soares T. Angiogénese: mecanismos e factores reguladores. RFML
2003; Série III; 8 (5): 319-325.

Bazzoni G, Deyana E. Endothelial Cell-to-Cell Junctions: Molecular
Organization and Role in Vascular Homeostasis. Physiol Rev 84: 869-901,
2004.

Carmeliet P. Mecanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat
Med.2000; 6: 389-95.

Costa C, Soares R, Schmitt F. Angiogenesis: Now and then. APMIS
2004; 112: 00-00.

Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its
receptors. Nat Med. 2003; 9 (6): 669-674.

http://mphywww.tamu.edu/Movies/angio.mpg
Agradecimentos

Professora Doutora Delminda Magalhães

Professor Doutor Henrique de Almeida

Sr. Vitor Hugo Mata

Sr. D. Amélia Sarmento Ferreira
Obrigado pela atenção!