SUMÁRIO
PROBLEMAS ESPERMÁTICOS RESULTANDO EM BAIXA FERTILIDADE
DOS REPRODUTORES
(Prof. Dr.Dr.h.c. Karl-Fritz Weitze)_________________________________ 3
FATORES DE RISCO PARA CONTAMINAÇÃO DAS DOSES DE SÊMEN:
COMO OTIMIZAR A HIGIENE NA COLETA E PROCESSAMENTO DO
EJACULADO
(Ana Paula Gonçalves Mellagi) ___________________________________ 6
EVALUATION OF SEMEN BY USING THE CASA SYSTEM (COMPUTER
ASSISTED SEMEN ANALYSIS) SPERM VISION IN SEMEN PRODUCTION
LABORATORIES: EXPERIENCE IN SPAIN AND GERMANY
(Carmen de Alba) _____________________________________________ 17
LAYOUTS E TECNOLOGIAS PARA ÁREAS DE COLETA E
LABORATÓRIOS DE CENTRAIS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL
(Alexandre Marchetti) __________________________________________ 27
PROBLEMAS ESPERMÁTICOS RESULTANDO EM BAIXA
FERTILIDADE DOS REPRODUTORES
de KF Weitze e Dagmar Waberski,
Escola Superior de Medicina Veterinária de Hannover, Alemanha
A IA em suínos desenvolveu-se muito nos últimos 25 anos, tanto em relação ao
número de animais inseminados como também devido a melhora da qualidade
genética.
Durante
este
tempo
reduziu-se
constantemente
o
número
de
espermatozoides (SPZ) por dose de IA, de aproximadamente 6x109 a menos de 3
x109, ou mesmo abaixo de 2x109 , facilitando muito a eficiência do uso do sêmen. Ao
mesmo tempo a prolongação da vida útil do sêmen diluído permitiu o uso mais flexível
da inseminação. O uso de doses com menor número de SPZ e a necessidade para
maior tempo de armazenamento do sêmen requerem que as centrais de IA forneçam
apenas sêmen de alta qualidade, o que exige que sejam realizados controles
regulares e efetivos de qualidade.
A análise rotineira de sêmen em centrais de IA tem por finalidade eliminar
ejaculados com parâmetros de qualidade abaixo de um valor marginal (aparência
macroscópica, odor, motilidade e morfologia); bem como determinar parâmetros de
sêmen quantitativos para assegurar um número especifico de células móveis em cada
inseminado. Métodos para assegurar isto variam amplamente, sendo em geral de
natureza subjetiva e por isso pouco padronizado. Um nível bom de prática de
laboratório que inclui processos internos de controle de qualidade serve para o
treinamento de técnicos e para assegurar consistência em oferecer valores definidos
espermatológicos dentro da central de IA. Porém, a meta final de assegurar a
produção de dose de sêmen contendo um número definido de SPZ de alta qualidade
espermática nem sempre é alcançada.
A análise do sêmen não é propriamente um preditor bom de fertilidade ou
infertilidade (4), mas esta metodologia melhorou bastante a objetividade, exatidão e
reprodutibilidade através do exame de danos membranosos (29), enquanto a detecção
de dano acrossomal ainda se verifica em microscópio com óptica de contraste de fase
em amostras fixas de sêmen. A integridade da membrana plasmática pode ser
examinada com citometria de fluxo usando corantes permeantes que se ligam ao
DNA. Por citometria de fluxo, cerca de 10.000 células podem ser analisadas em
segundos, comparado as aproximadamente 200 células, que usualmente são
examinadas subjetivamente com microscopia convencional.
Considerando a tendência de reduzir o número de espermatozoides na dose
em caso de inseminações pós-cervicais e intra-uterinas ou em animais com cio e
ovulação induzida (inseminação fixa), é essencial o uso de machos com alta fertilidade
provada e de genética superior. Para alcançar essa meta é importante, num primeiro
passo, poder identificar machos com fertilidade relativa baixa. Fundamental é, que tal
identificação só dá resultados úteis quando se usa o sêmen em situações mais
provocantes de números de espermatozoides reduzidos na dose de IA ou por
inseminação. Devido a essa situação, a definição de “sêmen útil” muda e não se
baseia somente em parâmetros espermatológicos medíveis como motilidade,
morfologia e integridade de membranas, senão inclui também características do
sêmen que in vitro não são detectáveis rotineiramente, mas resultam in vivo em
fertilidade reduzida quando submetido ao desafio de um número de espermatozoides
reduzido na dose de inseminação.
Além da avaliação clássica da qualidade de sêmem, métodos mais modernos
como a marcação por fluorescência para avaliar a integridade da membrana
plasmática e a avaliação computadorizada da motilidade progressiva permitem medir
grandes números de células em curto prazo.
Como já foi mencionado, a fertilidade de um reprodutor ou de uma dose de
inseminação depende principalmente de parâmetros quantitativos e qualitativos do
ejaculado. Pelo modelo assimptótico de Salisbury e Vandemark (1961) existe para
cada reprodutor uma relação entre número de espermatozoides na dose de
inseminação e o sucesso máximo da fertilização (taxa de prenhez). A fertilidade não
pode ser aumentada sobre este valor máximo por incrementar o número de
espermatozoides, baseado na regra que defeitos qualitativos espermáticos não podem
ser compensados por qualquer aumento do número espermático. Dentre estes
defeitos tem-se por exemplo danos do DNA, numéricos ou estruturais, que em geral
não afetam a taxa de fertilização inicial mas aumentam a taxa de mortalidade
embrionária. Testes in vivo portanto, necessitam uma padronização do número
espermático.
Além das falhas espermáticas como causas de sub- ou infertilidade cabe destacar as
outras causas, que estão relacionadas principalmente ao manejo e à técnica de
inseminação.
Na palestra são comunicados em forma mais detalhada os valores mínimos de
qualidade do sêmen, que se considera indispensáveis para assegurar uma fertilização
suficiente, discutindo-se também resultados de diversas pesquisas que investigaram o
efeito específico de alterações espermáticas quali- e quantitativas sobre a capacidade
fertilizante do sêmen.
FATORES DE RISCO PARA CONTAMINAÇÃO DAS DOSES DE
SÊMEN: COMO OTIMIZAR A HIGIENE NA COLETA E
PROCESSAMENTO DO EJACULADO
Ana Paula Gonçalves Mellagi
Minitub do Brasil Ltda – Av. Maranhão, 590 – Porto Alegre, Brasil
[email protected]
Introdução
A inseminação artificial (IA) é a técnica reprodutiva mais utilizada na
suinocultura tecnificada. Várias são as vantagens da IA, como uso de machos
geneticamente superiores, possibilidade de descartar ejaculados impróprios e higiene
na cobertura das fêmeas. A qualidade das doses inseminantes inclui não só a origem
(macho), mas também a viabilidade dos espermatozóides, grau de aglutinação e
quantidade de defeitos morfológicos. Todos estes aspectos podem estar relacionados
à quantidade de bactérias presentes no sêmen e nas doses. Com o uso de meios de
conservação (diluentes) de longa duração, as doses ficam armazenadas por mais
tempo e os cuidados para minimizar a contaminação do ejaculado e durante o
processamento tornam-se fundamentais.
Contaminação do sêmen
No aparelho reprodutivo dos cachaços, os espermatozóides são produzidos em
condições estéreis. Entretanto, durante a coleta, é inevitável que ocorra contaminação
bacteriana do sêmen (Weitze & Palma, 2008; Althouse & Lu, 2005). O grau de
contaminação dependerá das condições higiênicas da Central e também do coletador.
Mesmo tomando todos os cuidados higiênicos nas baias e na coleta, Dias et al. (2000)
encontraram uma amplitude de 100 a 217 UFC/ml (unidades formadoras de
colônia/ml). No mesmo trabalho, poucos cuidados de limpeza e posicionamento
errôneo da mão, durante a coleta, representaram ejaculados com até 45.000 UFC/ml.
A importância da higiene na coleta também foi verificada no trabalho de
Goldberg (2009), em que ejaculados com baixa contaminação (≤220 UFC/ml)
produziram menor percentual de doses inseminantes com contaminação superior a 10
UFC/ml, nas 48 horas de armazenamento.
O método manual de coleta do sêmen contribui para a contaminação,
particularmente quando o copo coletor encontra-se abaixo do macho. Isso porque
secreção prepucial e sujeiras na pele e pêlos podem cair no copo e filtro. O divertículo
prepucial é uma importante região que acumula muitas secreções, como urina, sêmen
e restos celulares (Weitze & Palma, 2008). Por isso é recomendado que o pênis do
macho seja desviado lateralmente para reduzir possíveis sujeiras e partículas que
caiam no filtro.
As principais fontes de contaminação estão na Tabela 1. De acordo com
Althouse & Lu (2005), a origem da contaminação pode ser única ou múltipla, e as
cepas podem ser as mesmas ou diversificar em diferentes momentos. Muitas destas
fontes, uma vez contaminadas, agem semeando pontos para os próximos ejaculados.
Tabela 1. Fontes de contaminação bacteriana de sêmen suíno
Origem Animal
Origem Não-Animal
Fecal
Torneira de água
Fluidos da cavidade prepucial
Água (falha na destilação/sistema de
osmose reversa
Pele e Pêlos
Planta seca (i.e. alimentos, cama)
Secreções respiratórias
Ar/Sistema de ventilação
Humana
Pias e drenos
Althouse et al. 2000
No trabalho de Golberg (2009), foram identificados quatro fatores que
contribuem para a contaminação do ejaculado acima de 220UFC: comprimento dos
pêlos prepuciais acima de 1 cm, luva de coleta suja, pingos pela mão do coletador e
duração da coleta acima de 7 minutos. No mesmo trabalho, ao avaliar o efeito de sete
fatores de risco (reprodutor sujo, óstio prepucial sujo, divertículo prepucial grande,
pêlos prepuciais compridos, luva de coleta suja, pingos pela mão do coletador para
dentro do recipiente de coleta e pênis que escapou durante a coleta), isolados ou em
associação, sobre o número de UFC/ml no ejaculado in natura, observou-se um
aumento significativo do número de amostras com contaminação superior a 220
UFC/ml, a partir da associação de 2 fatores, quando comparadas às amostras nas
quais nenhum destes fatores estiveram presentes (Tabela 2). Quando essa avaliação
foi realizada separadamente para mesófilos aeróbios e coliformes totais, observou-se
um aumento gradual da contaminação bacteriana, em ambos os tipos, à medida que
aumenta o número de fatores associados.
Tabela 2. Contaminação do sêmen in natura (>220 UFC/mL) de acordo com a
associação ou não dos seguintes fatores: reprodutor sujo, óstio prepucial sujo,
divertículo prepucial grande, pêlos prepuciais compridos, luva de coleta suja,
pingos pela mão do coletador para dentro do recipiente de coleta e pênis que
escapou durante a coleta
Associação dos fatores
Amostras com >220 UFC/mL
0
25,6%
1
43,6%
2
55,4%
3
56,8%
4–5
79,0%
Goldberg, 2009
A fonte primária de contaminação está associada ao reprodutor, mas existem
fontes de contaminação nos funcionários, higiene deficiente do manejo dos animais,
no laboratório de manipulação do sêmen e da água que é utilizada na Central (Weitze
& Palma, 2008). A contaminação do diluente utilizado na granja pode ser devido tanto
à falha na purificação da água (Ness et al. 2007) quanto no local de preparação do
meio (Goldberg, 2009). Barriletes de PVC, com sistema de aquecimento, são muito
utilizados nas Centrais, e mesmo havendo cuidados higiênicos, é comum a formação
de biofilmes. Isso porque há vários pontos de difícil alcance no momento da
higienização. Os microorganismos, em biofilme, tornam-se mais resistentes, tanto à
ação de antimicrobianos como de desinfetantes, do que as células isoladas (Silva et
al. 2006). Goldberg (2009) avaliou 4 unidades de produção de sêmen, e em duas
delas, houve contaminação do diluente devido ao uso destes barriletes, enquanto as
demais granjas utilizavam sacos plásticos em tanques de aço inoxidável, que são
descartadas após o dia de trabalho. Segundo o autor, a contaminação de
água/diluente é muito mais preocupante do que a contaminação do ejaculado, pois as
bactérias já estariam mais adaptadas ao meio, sendo capazes de crescer mais
facilmente. Além disso, se a água para preparo do diluente estiver contaminada, todas
as doses produzidas pela central ficarão contaminadas. Caso a contaminação
ocorresse apenas em alguns ejaculados, somente as doses desses ejaculados
estariam com problemas.
Higiene no laboratório
A higiene no laboratório tem um alto significado com relação ao processamento
do ejaculado. Sobretudo, se deve evitar a introdução de agentes bacterianos no
laboratório, através de pessoas ou material, que possam afetar o sêmen. Barreiras
sanitárias são importantes para restringir a entrada de pessoas estranhas e diminuir o
risco de aquisição de patógenos. Além disso, o banho dos funcionários minimiza a
carga contaminante que possa entrar em contato com os animais. Outro ponto a ser
salientado é que não haja trânsito de funcionários do laboratório na área dos animais e
vice-versa (Weitze & Palma, 2008).
O uso de material descartável é recomendado, pois se elimina possíveis falhas
de esterilização e otimiza o tempo de trabalho na Central. Entretanto, para os
laboratórios que utilizam materiais reutilizáveis, estes devem ser higienizados e maior
atenção deve ser dada para o momento da limpeza e higienização. Assim, a
transmissão de agentes será mínima.
A limpeza do laboratório após a rotina de trabalho deve ter a mesma dedicação
e atenção que as fases de processamento das doses. Após a manipulação do
ejaculado e produção de doses, deve-se realizar a limpeza diária do chão, bancadas e
equipamentos utilizados. Todos os objetos do laboratório que entram em contato com
o sêmen ou diluente são potenciais contaminantes, especialmente em lugares úmidos
e quentes. Recomenda-se o álcool 70%, por ser pouco espermicida e evaporar
rapidamente sem deixar resíduos. O piso deve ser higienizado 1 vez por semana, em
forma úmida com desinfetante no final da semana de trabalho (Weitze & Palma, 2008),
e conforme a rotina de cada granja.
Tipos de bactérias encontradas
A maioria dos contaminantes são bactérias Gram-negativas da família das
Enterobacteriaceae, isto é, bactérias da flora intestinal, que chegam ao sêmen através
da abertura prepucial e tecidos adjacentes (Althouse & Lu, 2005). Entre elas, se
encontram Escherichia coli, Klebsiella spp e Proteus spp. Entre as bactérias presentes
no ambiente estão as aeromonas spp., pseudomonas spp. e alcaligenes spp (Weitze &
Palma, 2008). No estudo de Althouse et al. (2000), a contaminação de uma única
bactéria ocorreu em 66% das doses, e 34% continham dois ou mais gêneros de
bactérias. Neste trabalho as bactérias mais isoladas foram tanto do grupo das
enterobactérias (Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Serratia marcescens) quanto
do grupo das não-entéricas (Alcaligenes xylosoxydans, Burkholderia cepacia,
Stenotrophomonas [Xanthomonas] maltophilia).
Quadro 1. Recomendações para o controle bacteriano nas Centrais de IA.
Instalações e Pessoal
Barreira sanitária para entrada da Central, com obrigatoriedade de banho a fim de
remover as sujeiras e células de descamação, tanto de funcionários quanto de
visitantes.
Barreiras entre zonas limpas (laboratórios) e sujas (celas, baias).
Lavagem frequente das mãos.
Estabelecer protocolos de limpeza e desinfecção do material e equipamento, usando
detergentes que não deixam resíduos, água destilada e depois álcool 70%.
Uso de sabão líquido e desinfetantes de amplo espectro, em todas as salas de coleta,
laboratório e banheiros.
Uso de álcool 70% como desinfetante de superfície, após a rotina da Central
Uso de produtos descartáveis sempre que possível.
Uso de sobreluva (luva de proteção ou higiênica) para limpeza do macho, sendo
descartada. Assim, para o momento da coleta, a luva de coleta propriamente dita
deve estar limpa para segurar o pênis.
Limpeza e desinfecção da área de coleta de sêmen ao final de cada dia de trabalho.
Animal
Corte periódico dos pêlos ao redor da abertura prepucial.
Limpeza da abertura prepucial a seco com papéis descartáveis.
Eliminação manual do conteúdo prepucial.
Apoiar o pênis em forma perpendicular ao corpo do macho durante a coleta para
minimizar a contaminação do copo de coleta.
Separação das frações pré-espermática (a primeira secreção observada) e gel,
eliminando o filtro de coleta antes de enviar o ejaculado para o laboratório.
Adaptado de Weitze & Palma (2008), Althouse et al. (2000)
No sêmen diluído podem ser encontradas outras bactérias como conseqüência
de possíveis contaminações através da manipulação e dos materiais (Weitze & Palma,
2008). Na Tabela 3, há as possíveis fontes de contaminação para cada tipo de
bactéria:
Tabela 3: Possíveis fontes de acordo com a bactéria encontrada no ejaculado
Bactérias
Possíveis fontes
ALCALIGENES
Água
Baccilus
Tubulação/Sistema de diluição
Candida guilliermondi
Pele, fezes
Clostridium perfringens
Ambiente, fezes
Enterobacter cloacae
Pele, fezes
Enterobacter SP.
Pele, fezes
Enterococcus
Fezes
Lactobacilos
Fezes
Micrococcus
Pele, ambiente
Moraxella
Pele
Providencia rettgeri
Fezes
Pseudomonas aeruginosa
Solo, água
Shewanella putrefaciens
Água, solo
Stenotrophomas maltophilia
Água
Citrobacter
Fezes
E. coli
Fezes
Staphilococcus sp.
Pele
Actinetobacter
Água dos banheiros/caixa de aquecimento
Pseudomonas sp
Ambiente
Adaptado de De Grau et al., 1996
Consequências da contaminação no sêmen
Muitos trabalhos apontam perda de qualidade espermática quando há
contaminação do sêmen, como queda de motilidade (Bennemann et al., 2000;
Althouse et al., 2000), aumento de aglutinação (Althouse et al., 2000), defeitos de
acrossoma e alteração no pH (Goldberg, 2009; Bennemann et al., 2000). Devido a
estes problemas, é comum que granjas que utilizam doses contaminadas, relatem
aumento da taxa de retorno ao estro em intervalos regulares (17 a 25 dias), e a
extensão do problema dependerá do tempo de armazenamento das doses (Althouse
et al., 2000). Os efeitos da contaminação bacteriana nas doses inseminantes não são
observadas imediatamente, mas necessitam de 36 a 48 horas de armazenamento
para que a aglutinação e redução da motilidade sejam evidenciadas (Althouse et al.,
2000). Esse tempo é necessário para que ocorra a aderência bacteriana ao
espermatozoide (Monga & Roberts, 1994).
Bennemann et al. (2000) observaram efeito significativo do tipo de bactéria
inoculada sobre a motilidade espermática. As doses inoculadas com E.coli (105, 106 ou
107 UFC/ml) apresentaram uma menor motilidade em relação àquelas inoculadas com
S. aureus (105, 106 ou 107UFC/ml), em 96 horas de armazenamento. Além disso, os
autores observaram que após às 48 horas, a E.coli na concentração de 5x107 UFC/ml,
afeta o percentual de acrossomas intactos. A ação espermicida da E. coli é dosedependente (Monga & Roberts, 1994) e sua ação é diretamente na célula (Althouse &
Lu, 2005). Constatou-se que esta bactéria se adere a todas as áreas da superfície do
espermatozoide. Esta interação bactéria-espermatozoide colabora não só para a
formação da aglutinação, quanto também está associada a danos estruturais na
membrana espermática.
Outro aspecto a ser considerado é que a defesa uterina é maior durante
o estro, mas cai no metaestro. Por isso há a recomendação de inseminar as
fêmeas enquanto estiverem em estro. Marchetti et al. (2000) observou aumento
na taxa de retorno ao estro, queda na taxa de parto ajustada e tamanho de
leitegada em fêmeas inseminadas com 2 doses no estro e 1 no metaestro, em
comparação às fêmeas que receberam as três doses durante o estro.
Surge também a dúvida dos efeitos da bacteriospermia nas fêmeas. As
descargas vulvares são mais relacionadas ao momento da IA em relação ao ciclo
estral, sendo a contaminação do sêmen um componente oportunista (Althouse et al.,
2000). A infecção uterina ocorre devido à redução da defesa uterina, quando os níveis
progesterona estão altos (Wulster-Radcliffe et al. 2003; De Winter et al., 1996), comum
nas inseminações realizadas no metaestro.
De maneira geral, o efeito da bacteriospermia depende da concentração de
bactérias e pode afetar a qualidade in vitro do sêmen e sua longevidade tanto no
ejaculado in natura quanto diluído (Althouse & Lu, 2005). Como em todo processo
microbiológico, as condições ambientais e o tempo são fatores críticos no crescimento
e efeito negativo das bactérias sobre os espermatozóides. No entanto, se a Central
possui controle de higiene em todas as atividades, a carga bacteriana não afetará
significativamente a motilidade nem a morfologia (Weitze & Palma, 2008). Segundo
Althouse (2008), uma razão média de espermatozoide:bactéria de aproximadamente
1:1, e com algumas bactérias, a baixa diluição como 1:100, parecem suficientes para
gerar efeitos indesejados na dose inseminante e fertildidade. Numa dose padrão de
3x109 de células espermáticas, isto se traduz em uma quantidade de 3x10 7 a 3x109 de
bactérias na dose.
Uso de antimicrobianos
Como explicado anteriormente, as particularidades anatômicas do reprodutor e
o método mais usado para coleta de sêmen fazem com que seja inevitável a
contaminação do ejaculado. Além disso, mesmo com cuidados higiênicos durante a
coleta, a contaminação pode ainda ocorrer nas etapas de processamento das doses.
Portanto é comum que os meios de conservação possuem algum tipo de
antimicrobiano em suas fórmulas (Weitze & Palma, 2008). Os primeiros diluentes
desenvolvidos para sêmen usavam basicamente a combinação de penicilina e
estreptomicina. Atualmente, os antibióticos empregados são de amplo espectro, como
a gentamicina (Althouse et al., 2000). Os mais empregados nos Estados Unidos são
(Weitze & Palma, 2008):
 Ampicilina
 Gentamicina
 Lincomicina
 Neomicina
 Spectiomicina
Apesar de a gentamicina ser empregada há longo tempo, ela ainda conserva
uma boa capacidade para impedir a reprodução de bactérias de origem fecal e da pele
(Weitze & Palma, 2008).
Os antimicrobianos aprovados e recomendados atualmente devem ser
empregados segundo as indicações e protocolos do veterinário responsável.
Recomenda-se não aplicar novas associações de antimicrobianos que não estão
especificamente indicadas, porque o seu emprego poderia provocar anulação de um
ou ambos os antibióticos (Althouse & Lu, 2005).
Quando o antibiótico torna-se ineficaz no controle de cepas contaminantes, o
diluente torna-se um meio de cultura para crescimento bacteriano.
Monitoramento de contaminação
As doses processadas devem ser periodicamente analisadas em culturas
aeróbicas (Althouse & Lu, 2005) e deve ser um componente do programa de controle.
As amostras são selecionadas aleatoriamente a partir de doses homeospérmicas ou
heterospérmicas (“pool” de ejaculados), e com pelo menos 48 horas de
armazenamento. Segundo Althouse & Lu (2005), recomenda-se que 1% de todas as
coletas do mês ou quatro amostras/semana (o que for maior) sejam analisadas.
A água a ser utilizada nas doses deve ser do tipo II (condutividade < 0,5
µSiemens/cm, crescimento bacteriano até 100 UFC/ml, negativo para presença de
cloro e ph próximo a 7 – conforme National Commitee for Clinical Laboratory
Standards - NCCLS), e é uma importante fonte de contaminação. A água deve ser
analisada pelo menos periodicamente, tanto para a água de entrada do sistema de
purificação, quanto para a água de saída (água purificada a ser utilizada para preparo
do diluente). Centrais que adquirem água devem receber uma análise da partida de
água com os resultados pertinentes. Já as Centrais que realizam a purificação da
água, devem avaliar periodicamente o sistema de tratamento e realizar as
manutenções preventivas e quando necessárias. Além disso, deve ser levado em
consideração o armazenamento de água pura por no máximo 3 dias. Assim, em caso
de falta de fornecimento de água, ainda há uma janela para solucionar o problema.
Mesmo com a opção de armazenamento, as Centrais devem ter uma fonte alternativa
de água em casos de emergência.
A partir de resultados positivos de crescimento bacteriano, deve-se identificar
o(s) agente(s), realizar os testes de sensibilidade a antimicrobiano, e principalmente,
identificar o local de origem da contaminação. Saber o tipo de bactéria contaminante é
uma importante ferramenta na identificação da fonte, pois algumas bactérias são
peculiares da coleta ou do processamento. Desta forma, as medidas cabíveis são
mais fáceis de serem implementadas.
Vários são os fatores que podem contaminar o sêmen. Por isso, ao se manter a
higiene das instalações, laboratório, animais e funcionários, reduz a carga bacteriana,
minimizando o risco de produção de doses contaminadas. O grau de contaminação e
o tipo de agentes encontrados são diferentes para cada granja e por isso devem ser
avaliados os programas de controle individualmente. Caso a central de inseminação
tenha contaminação, deve-se notificar os clientes, integrados ou pessoal responsável
pelas inseminações, para que as doses não sejam armazenadas por mais de 48 horas
e acompanhar os desempenho reprodutivo. Todas as medidas de correção devem ser
repassadas com os funcionários e supervisionadas. Após a resolução do problema, é
necessário manter a rotina de controle na coleta dos ejaculados, purificação da água e
processamento das doses.
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Bennemann, P.E.; Bortolozzo, F.P.; Wentz, I.; Cardoso, M.R.I.; Motilidade espermática
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Dias, C.P.; Castagna, C.D.; Reis, G.R.; Simonetti, R.; Bortolozzo, F.P.; Wentz, I.;
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EVALUATION OF SEMEN BY USING THE CASA SYSTEM
(COMPUTER ASSISTED SEMEN ANALYSIS) SPERM VISION
IN SEMEN PRODUCTION LABORATORIES: EXPERIENCE IN
SPAIN AND GERMANY
Dra. Carmen de Alba Romero. Minitub Ibérica, S.L.
[email protected]
Abstract
In the last years, Computer Assisted Semen Analysis (CASA) has been
successfully integrated into the routine work of laboratories for semen production.
Today this system is considered to be part of the equipment needed to optimize the
productivity of the centre and to meet quality and safety requirements demanded by the
livestock industry.
CASA systems meet at least two of the requirements that any modern
insemination centre must ensure: objective evaluation of semen quality and efficient
quality control of the final product, the seminal dose.
This paper summarizes some considerations concerning CASA systems, and
from a practical point of view it will help managers, technicians and laboratory staff of
the centre to understand the applicability of this system and its usefulness as a tool to
optimize productivity in the sense of "maximum performance at a minimum cost”.
Introduction
Semen evaluation is a key factor in ensuring the use of animals and/or
ejaculates with good fertility. This assessment includes measuring the volume,
concentration, motility, morphology and other characteristics that influence the
functionality of sperm.
In the past two decades, technological advances in this field have led to
develop systems capable of accurately and objectively evaluate semen quality in a
simple and practical way during the routine work of a semen production lab. In the 80’s,
the development of CASA systems able to predict the fertilizing capacity of sperm with
the help of a computer program was a valuable technology applied first in the human
and a few years later in animal reproduction. CASA systems allow an objective
measurement of semen parameters that mainly include: motility, morphology, sperm
concentration and viability.
In the last years, in Europe, this system has gained importance as a working
tool in boar centers and is considered more and more to be one of the keys of
modernization and optimization of seminal dose production. This is an ongoing process
which has been triggered by the crisis affecting the pig industry and by customers who
are increasingly critical of product quality and safety. These factors have forced the
boar studs to become more and more professional and efficient.
How does the CASA system work and which parameters does it evaluate?
The CASA system consists of a high speed video camera connected to a
microscope and of a computer with the software. The system must capture at least 30
pictures per second, and during this interval the program identifies each sperm head
for its size, looks at its movement (path) and calculates the number of cells in the
sample (sperm/ml). For the result to be statistically significant, an average of seven
fields has to be assessed (up to 15 if the microscope table is robotic), which makes the
analysis of semen accurate and precise.
In each ejaculate there are different subpopulations of sperm due to the
different degrees of development of sperm cells during spermatogenesis and to the
different stages of maturation during transit through the epididymis. CASA systems can
differentiate the subpopulations of sperm (Abaigar et al, 1999; Quintero-Moreno et al,
2004). These subpopulations do not vary much between boars, but their values are
different, which could explain fertility variations among individuals within a same group.
Within the data set shown by the CASA, there are three main types of progressive
sperm motion:
–
Group 1 represents the sperm with highest progressive movement (high VSL) and
hitting their heads vigorously (high FBC)
–
Group 2 are highly moving sperm (high VCL), but with reduced progression (low
VSL and high ALH).
–
Group 3, sperm with movement and some degree of degeneration whose motion
parameters are significantly lower compared to groups 1 and 2.
Ideally, the semen sample should show a high percentage of sperm with a
straight line movement, known as progressive motility. According to some works this
parameter is also correlated with sperm membrane integrity and can therefore be
considered to be a good predictor of the fertility of the cell.
The CASA system is able to measure from the most basic values, total motility
and concentration, up to more specific parameters, such as morphology and cell
viability. Sperm concentration is an important feature of the ejaculate and it is
necessary to evaluate it precisely to avoid low rates of fertility and guarantee maximum
productivity. One of the consequences of inaccurate or imprecise concentration
assessments is that semen doses tend to have more sperm than the recommended
concentration. Consequently, due to this “safety margin” the ejaculates are not used to
their full potential (Gadea 2005, Hansen et al., 2002). This is one of the crucial points to
considerer in stud management when optimization of boar numbers is the goal and
getting the best and maximum number of doses per boar.
What are the advantages of the CASA system Sperm Vision
The integration of the CASA system Sperm Vision™ into the daily routine of a
laboratory of an insemination centre is a target that could successfully be achieved.
This system has been designed to be a production tool, and thanks to modern
computer technology, it is today extremely quick, easy to use and provides high
security of the process. It is possible to do the analysis in a very short period of time
during production and very efficiently with the help of this device.
In summary the most important user benefits are:
1. Increased productivity. Sperm Vision™ analyses accurately and precisely the
percentage of cells with progressive movement. Using routine techniques in the
laboratory, these values will generally be lower with the subjective assessment.
Sperm Vision™ eliminates this error resulting in an increase in the production of
semen doses without increasing the number of sires. The optimization of sires
reduces production costs and improves the profitability of the stud.
2. More precise seminal dose quality. Sperm Vision™ system shows the actual
motility of produced doses. In this way it is possible to certify the quality of the
dose before its delivery, improving the staff work and facilitating decisions
regarding the semen that can be sent out.
3. Increased accuracy of results. Sperm Vision™ eliminates the human factor in
the assessment of motility. The motility is calculated based on the number of
cells that move at a certain period of time. Motility assessment is done under
the same criteria in all samples, all the time.
4. Improved accuracy of concentration readings. Variations in semen colour
results in photometry readings with an error that varies between 5 and 30%
depending on the type of photometer. Sperm Vision™ directly counts the
number of cells in a fixed volume, so the error is greatly reduced.
5. Standardization of protocols between laboratories. Motility data processed with
Sperm Vision™ in different labs can be compared, avoiding the human factor
between laboratories. This helps that trials comparing animals, breeds, lines,
etc., can be assessed more realistically.
6. More secure assessment of fertility. The standardization of protocols of semen
evaluation is a base for clear decisions for elimination of low-fertility animals or
with potential reproductive failures.
What issues are critical when working with Sperm Vision™?
Successful use of the device Sperm Vision™ requires applying a consistent and
exact technique, according to the manual of the manufacturer. A certain routine
therefore is the premise for a good repeatability of the results.
The results of CASA systems analysis can in some cases show lower values with
respect to the subjective assessment. This can be explained by:
–
First, with the subjective assessment of the semen, it is often considered that a cell
moves when the sperms tail is moving, even if the movement is not progressive.
Therefore, motility is an estimate of the percentage of living cells which is not a
good indicator of the percentage of cells that move progressively. CASA systems
require that the cells undergo at least a certain distance to be considered that their
movement is progressive.
–
Secondly, the manual, subjective assessment of motility depends on sperm
concentration, sperm velocity and the eye of the evaluator. These factors may
interact in complex ways and in some cases they produce an overestimation of the
percentage of cells with movement.
Although the evaluation of semen by the CASA system has demonstrated to
have the best reproducibility, there is a certain variability among laboratories which
may be due to
various factors such as dilution rate and type of extender used
(Vizcarra, JA, Ford JJ. 2006). Other factors that influence the analysis conducted by
CASA are the method of sampling, sample processing, and the time span between
sampling and analysis.
In semen production laboratories working with CASA system, the following points
should be considered as a priority for the assessment of the sample:
–
Microscope. It must be correctly calibrated, that is light and phase rings should be
centered in order to get the brightness and contrast of the cells which is optimal for
the full function of the system.
–
Software. Select the software configuration parameters for the right species.
–
Sampling technique. The sample has to be representative of the ejaculate. Minitube
gives very detailed instructions of sampling and of homogenization of the prepared
sample prior to loading the analysis chamber.
–
Preparation of the sample. It is very important to dilute the sample correctly. The
dilution rate should be accurate for the system to calculate with high precision the
concentration of sperm/ml.
–
Duration of analysis. The measurement should not exceed 2 minutes, counted from
the moment the sample is loaded into the counting chamber until the system gives
us the result.
Field results with Sperm Vision™ in Spain and Germany.
The implantation of Sperm Vision™ in the modern boar semen production lab
has shown a growing interest during the last years. Probably, the economic situation of
the pig industry in the last 3 years (see table 1), as well as de introduction of new
reproductive technologies, has been the trigger for the integration of this system in boar
centers in order to modernize and optimize the production of seminal doses. The
experience with Sperm Vision™ in Spain and Germany, 2 of the principal countries for
pig production in Europe, will be summarized.
Study 1: External QC of AI centers by Sperm Vision™.
Reference laboratories are a useful tool for external quality control (QC) of
semen from the studs. The ideal protocol for external QC for AI stations would have to
integrate the implementation of valid tests with high relevance for fertility, including
microbiological examination, the handling of semen analysis in the labs and technical
training for lab staff.
The rules of the QC labs are among others:
–
monitor the internal efficiency of semen quality control in each stud
–
identify males with lower semen quality and/or poor response to semen
preservation
–
check the accuracy in determining the number of sperm (table 1 and 2)
–
confirm a clinical suspicion of infertility in the farm
–
certify the ability of a boar before introduction into the stud
–
monitor a treatment or find a specific therapeutic response
–
clarify and correct possible errors during semen processing
Table 1: Seminal dose concentration controlled by Sperm Vision™ in seminal
doses 24-48 hours, using Androstar Plus (Studs in Spain working at 3 x 109
billion total sperm/dose) (N=1200)
Average
(x109
total 2.99
sperms)
Maximum
7.4
Minimum
0.2
Table 2: Seminal dose motility (%) controlled by Sperm Vision™ in seminal
doses 24-48 hours, using Androstar Plus (Studs in Spain) (N=1200)
Total Motility
Progressive Motility
Average
83,02
72,16
Maximum
99,00
95,77
Minimum
15,51
5,63
Study 2: Installation and start-up of the Sperm Vision™ system in Boar Studs.
Table 3: Installation and start-up of Sperm Vision™ systems in boar studs in
Spain
Location
Boars
Nº labs
Sperm/dose
Doses produced/year
(x109)
A
220
2
1-1,2
700000
B
900
3
1,9
1500000
C
2000
7
2,1
3900000
D
450
1
1.5-1.8
550000
E
900
5
2,1
1500000
F
300
1
2,0
450000
( **Progressive Motility/Total Motility ==== Sperm per doses 2.5/ 3 billions )
1. Stud 1 (Cataluña)
–
Situation:
o
Open since 1990
o
4 studs and a central lab.
o
Boars: 425
o
Staff in the lab: 3 (2 technician + 1 vet)
o
Semen collection and pre-dilution in the stud
o
Semen processing in the lab (1’30 hour distance from the studs)
o
Semen evaluation with SV (since 2006) + Scan-Stage (since 2009)
o
Automatic semen dilution and packing
o
Production (doses/year) 550.000
2. Stud 2 (Castilla-León)
–
Situation:
o
Open since 2007
o
1 stud and a central lab.
o
Boars: 100
o
Staff in the lab: 2 (Biologist)
o
Semen collection and pre-dilution in the stud
o
Semen processing in the lab (30 minutes distance from the studs)
o
Semen evaluation with SV (since 2007)
o
Automatic semen dilution and packing
o
Production (doses/year) 120.000
3. Stud 3 (Aragón)
–
Situation:
o
Open since 1995
o
Stud and lab.
o
Boars: 270
o
Staff in the lab: 2 (technicians)
o
Semen evaluation with SV and Scan-Stage, ready for AutoMorph (since
2011)
o
Automatic semen dilution and packing
o
Production (doses/year) 300.000
Study 3: Feedback from users on the CASA system Sperm Vision™ (SV)
1.
How long have you used SV and why has your company decided to invest in this
system?
–
Stud 1: 2006 (5 years). Company invested in technology to have an objective
evaluation of semen quality.
–
Stud 2: 2007 (4 years). The stud was new and the lab was designed to be fully
automated in processing of semen
–
Stud 3: 2011. The actual market and tendency pushes to work with quality and
security. SV was the system selected after another system was tested.
2.
What has changed in the routine of lab production since the installation of SV?
–
Stud 1: seminal assessment is faster and safer. In a single sample motility and
concentration is analyzed.
–
Stud 2: Nothing. The stud and the staff were new and without experience. It
was very easy and simple the implementation of the lab since everything was
automatic.
–
Stud 3: We work safe and easily since we only prepare one sample
(motility/concentration and morphology)
3.
4.
How much time did the staff require to get used to the SV?
–
Stud 1: 1 day
–
Stud 2: 2 days
–
Stud 3: 1 day
How long does it take to make a complete analysis of the ejaculate?
–
Stud 1: 1 minute. The automatic stage (Scan-Stage) gave us speed and
security.
–
Stud 2: 2 minutes
–
Stud 3: 2 minutes. We check morphology in the motility field (cytoplasmatic
droplets and tails)
5.
Has SV improved the reliability and effectiveness of the evaluation of semen?
–
Stud 1: No doubt. We can now better optimize boars and ejaculates.
–
Stud 2: For us it is no problem to share the tasks in the lab. The SV gives us
security in the evaluation of the ejaculate and dose calculation.
–
6.
7.
Stud 3: Yes. We work with safety and quality.
Have you noticed differences in the production of dose? (concentration/motility)
–
Stud 1: No. The output is the same.
–
Stud 2: We have no previous data. The stud started to operate with the system.
–
Stud 3: No. The output is the same.
What is your opinion of the SV system?
–
Stud 1: Very positive. Security is crucial for the quality of the ejaculate and the
number of processed doses.
–
Stud 2: Indispensable in a modern stud. It would be very difficult for us if we had
to do seminal assessment without SV.
–
8.
Stud 3: We are very happy.
Would you recommend the SV?
–
Stud 1: Yes, no doubt.
–
Stud 2: Yes, the quality assurance of the dose is priceless.
–
Stud 3: Yes, sure.
Conclusions
1.
Swine artificial insemination is a powerful tool for genetic improvement
and profitability. To achieve these objectives, each ejaculate must be
evaluated to determine its fertility potential.
2.
Optimal dilution rate should ensure good fertility parameters with a
minimum of spermatozoa. At present, semen analysis using computer
systems (CASA) is the best way to ensure optimal dilution rate.
3.
Semen analysis performed with CASA systems can help as a predictive
of in vivo values of the ejaculate in terms of fertility parameters such as
the pregnancy rate and litter size.
4.
CASA systems can be regarded as a quality control technique useful for
boar semen doses, being an indispensable tool for the validation of
protocols at the AI centers and a valid indicator of semen quality 24
hours after collection.
References
–
Holt C et al. (1997). Objectively Measured Boar Sperm Motility Measurements
Correlate with the Outcomes of On-farm Inseminations: Results of Two Fertility
Trials. Journal of Andrology 18(3):312-323.
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Holt, W.V., Brien, J.O. and Abaigar, T. 2007. Applications and interpretation of
computer assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding
and comparative research. Reprod. Fertil. Dev. 19: 709-718.
–
Gadea J. (2005). Sperm factors related to in vitro and in vivo porcine fertility.
Theriogenology 63, 431-444.
–
Didion, B.A. (2008). Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling
boar semen samples. Theriogenology. 70: 1374-1376.
–
Hansen C et al. (2002). Validation of the FACS Count AF System for Determination
of Sperm Concentration in Boar Semen. Reproduction in Domestic Animals 37:330334.
–
Quintero-Moreno A et al. (2003). Identification of Sperm Subpopulations with
Specific Motility Characteristics in Stallion Ejaculates. Theriogenology 59, 19731990
–
Vizcarra, JA, Ford JJ. (2006). Validation of the Sperm Mobility Assay in Boars and
Stallions. Theriogenology 66:1091-1097.
–
Abaigar T et al. (1999). Sperm Subpopulations in Boar (Sus scrofa) and Gazelle
(Gazella dama mhorr) Semen as Revealed by Pattern Analysis of Computerassisted Motility Assessments. Biology of Reproduction 60:2-41.
LAYOUTS E TECNOLOGIAS PARA ÁREAS DE COLETA E
LABORATÓRIOS DE CENTRAIS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL
Alexandre Marchetti
Minitub do Brasil Ltda – Av. Maranhão, 590 – Porto Alegre, Brasil
[email protected]
Layouts e Tecnologias para áreas
de coleta e laboratórios de
Centrais de Inseminação Artificial
Alexandre N. Marchetti
Médico Veterinário MSc
[email protected]
10 de Maio 2011
Introdução
Biotécnica utilizada comercialmente no Brasil desde a década de 70
Evolução:
Número de matrizes inseminadas
Insumos “caseiros” x “comerciais”
Utilização de materiais descartáveis
Padronização de parâmetros
Busca de novas tecnologias
Otimização da produção
Tecnificação das centrais
Parâmetros de produção
•Doses produzidas por macho/ano
•Considerando 3 bilhões sptz/dose
Situação 1
Situação 2
Situação 3
Situação 4
Coletas / semana
1,2
1,4
1,6
1,8
Doses / coleta
25
25
25
25
Semanas / ano
52
52
52
52
Doses/macho/ ano
1560
1820
2080
2340
Descarte 5% doses
78
91
104
117
1482
1729
1976
2223
Total doses/ano
Adaptado de Setor de Suínos – FAVET - UFRGS
Parâmetros de produção
Alemanha
Número sptz/dose
Volume/dose
EUA
9
1,5 a 2,0 x 10
Mot. Progressiva
2,25 a 3,0 x 109
Viáveis
80 a 85 ml
65 a 80 ml
Perspectivas
???
Central de IA – uma visão industrial...
Qual a META das centrais de IA ?
Qual é o produto entregue pela central?
Como avaliar a central ?
Número de doses / macho / ano:
genética X linhagens
Número de funcionários/central:
automação & layout
Número de doses / funcionário / ano:
Interação de fatores
Número de doses / gaiola / ano:
otimização instalações
A central é eficiente?
A central é eficaz?
Central de IA – uma visão industrial...
EFICIÊNCIA = QUALIDADE
+
PROCESSOS INCORRETOS
EXECUTADOS
CORRETAMENTE
PROCESSOS CORRETOS
EXECUTADOS
CORRETAMENTE
-
+
EFICÁCIA = RESULTADO
PROCESSOS CORRETOS MAS
EXECUTADOS
INCORRETAMENTE
PROCESSOS INCORRETOS E
EXECUTADOS
INCORRETAMENTE
ONDE ESTÁ NOSSA CENTRAL ??
Central de IA – uma visão industrial...
CLIENTE
Interno e externo
PRODUTO
FORNECEDOR
PROCESSOS
INSUMOS
Quais os gargalos existentes na produção?
Tecnologias & Layouts
Coleta
Avaliação
Fracionamento e envase
Coleta de sêmen
Salas de coleta: 1 para
50 machos
Não necessita energia
elétrica
Sem cabos/conexões
Número coletas por
pessoa/hora
Higiene
Risco L.E.R.
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
12
%
Coleta de sêmen
Janela comunicação
Manequim
Pia
Tábua
manejo
Barras
proteção
Tapete
Área
fuga
Adaptado de : The Swine AI Book
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Coleta de sêmen
Relato de caso – EUA 400 reprodutores
Após a automação e novo layout da
coleta
Número matrizes
Número de reprodutores
250.000
250.000
1500
1500
1.725.000
1.725.000
Número de centrais
4
4
Dias de coleta/semana
7
5
Número de doses/ano
Redução de mão-de-obra
1 ½ funcionário por CIA
Custo mão-de-obra/ano
US$ 33.000,00
Ganho anual
US$ 200.000,00
Avaliação do ejaculado
Avaliação do ejaculado
Avaliação do ejaculado
Sistema CASA
Decisão estratégica:
Precisão
Otimização reprodutores
Diluição
Smart Dispenser
e
Compact Dispenser
Controlador, balança & Bomba Peristáltica
Aproveitamento da
mão-de-obra !!
Diluentes
Tipos de diluentes
Curta x Média x Longa duração
Custo x benefício
Horário de produção - $$$
Período de armazenamento/viabilidade pós-diluição
Temperatura de armazenamento e transporte
Logística de transporte
Frequência de recebimento das doses
1, 2 ou 3 x semana
Diluentes
Acondicionamento
NOVO !!
QuickTip® Flexitubo UV Protected
QuickTip® Flexitubo UV Protected
QuickTip® Flexitubo UV Protected
Adaptado: Universidade Hannover
Fracionamento e envase
Capacidade de Produção
300 – 350 doses/hora
Fácil Manutenção
Fracionamento e envase
Capacidade de Produção
500 – 600 doses/hora
Fracionamento e envase
Capacidade de Produção
-/+ 2000 doses/hora
Fracionamento e envase
Gargalo de produção?
Dimensionamento
Coleta + Avaliação + Diluição /hora
Integração e gerenciamento
Integração e gerenciamento
Alimentação de dados via PC
Retro alimentação via equipamentos
Gerenciamento da central
Relatórios
Banco de dados
Layout laboratório
Layout laboratório
Layout laboratório
Layout laboratório
Layout laboratório
Armazenamento e transporte
Conservadoras para sêmen
Circulação de ar
Precisão da temperatura
Sistema de Proteção
Armazenamento e transporte
Caixas condicionadoras
Circulação de ar
Precisão da temperatura
Aquecimento e
Refrigeração
Armazenamento e transporte
Verificação e registro de temperaturas
Qual é o produto da central ???
Qual é o produto final da central ???
1500 doses/macho/ano
Tx Reposição 50%
3000 doses /vida útil
3 doses x 2,4 partos/ano
416 matrizes
28 terminados/matriz/ano
11.648 leitões
110 kg ao abate
1.281.280 kg de carne
R$ 2,60 / kg
R$ 3.332.000,00
Qual é o produto final da central ???
Central 100 reprodutores
Central 200 reprodutores
1500 doses/ano
1500 doses/ano
150.000 doses /ano
300.000 doses /ano
Investimento automação R$ 200.000,00
Depreciação 10 anos
R$ 0,13 / dose
R$ 0,06 / dose
Quais os novos rumos da IA no
Brasil ??
* Sêmen congelado
* Sêmen Sexado
* Novas temperaturas
armazenamento/transporte
Quais os novos rumos da IA
no Brasil ??
III Simpósio Reprodução Minitub
Pré Simpósio SINSUI 2012
15 de maio de 2012
Porto Alegre - RS
MUITO OBRIGADO