IX Congresso Brasileiro de Análise Térmica e Calorimetria
09 a 12 de novembro de 2014 – Serra Negra – SP - Brasil
Desenvolvimento e avaliação da atividade cardioprotetora do complexo de inclusão do ácido
úsnico em β-ciclodextrina
Paula P. Menezes 1* , Péligris H. Santos 2 , Lucas A. Sá2 , Grace Kelly M. Almeida2 , José M. Mendes Neto 2 , Jucilene F. Santos 2 ,
Rodrigo M. Santos 2 , Sandra L. Santos 2 , Polliana B. P. Santos 1 , Grace Anne A. Dória 1 , Francielly O. Araújo 1 , Gabriel F.
Silva3 , Daniel P. Bezerra 4 , Adriano A. S. Araújo 1 , Mairim R. Serafini1
1
Departamento de Farmácia, 2 Departamento de Fisiologia, 3 Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal
de Sergipe, Sergipe, Brasil .4 Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Bahia, Brasil.
*Autor correspondente. Departamento de Farmácia, Universidade Federal de Sergipe -UFS, Av. Marechal Rondon, s/n, São
Cristóvão, Sergipe-Brasil. Tel.: +55-79 9958-0958; E-mail: [email protected]
Resumo
O ácido úsnico (AU) é um metabólito secundário de liquens com potencial efeito cardiogênico, no entanto com solu bilidade
limitada. A estrutura da β-ciclodextrina (β-CD) tem uma característica interessante de formar complexos de inclusão com
moléculas de baixa solubilidade. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi obter e caracterizar o complexo de inclusão
do AU em β-CD pelo método da co-evaporação (CE) e compará-lo com a MF, através das técnicas de
termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectrofotometria na
região do infravermelho (FTIR). Uma vez caracterizado, o material foi submetido a avaliação da atividade cardioprotetora e
antioxidante. Os resultados da caracterização físico-química demonstraram que o AU foi complexado na cavidade da β-CD e
isso pode ser visto na segunda etapa de perda de massa da TG, onde o CE apresentou Δm=19,2% enquanto a MF,
Δm=16,2%. Além disso, as imagens de MEV demonstraram claramente que a MF não interagiu com a β -CD ao passo que o
CE sofreu alteração de forma. Os espectros de FTIR indicaram a presença do AU no CE e na MF, em menor proporção. O
complexo do AU demonstrou uma importante atividade cardioprotetora, não alterando a pressão ventricular nem a frequência
cardíaca, além de não alterar as enzimas hepáticas. Dessa forma, a inclusão do AU em β-CD, além de melhorar a
solubilidade, apresentou resultados positivos na função cardíaca.
Palavras-chave: ácido úsnico, β-ciclodextrina, complexo de inclusão
1. Introdução
O ácido úsnico (AU), derivado dibenzofurano (2,6-diacetil-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3[2H,9bH]-dibenzo-furandiona),
é um metabólito secundário de liquens, Cladonnia substelata e largamente estudado em diversos tratamentos tais quais
antimicrobiano, antitumoral, anti-inflamatório, dentre outros [1]. No entanto, o potencial uso terapêutico é limitado por sua
baixa solubilidade em água [2]. As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos [3] modificadas enzimaticamente com
habilidade de formar complexos de inclusão com moléculas lipofílicas [4]. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi
preparar e caracterizar físico-quimicamente complexo de inclusão do AU em β-CD, bem como avaliar sua atividade
cardioprotetora após o pré-tratamento com AU no modelo de injúria por isquemia e reperfusão global.
2. Material e métodos
2.1 Preparo da amostra
O AU (lote: 04028BJ; pureza: 98%) e a β-CD (lote:#041M1759V; pureza ≥ 97%) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. A
mistura física (MF) foi preparada mediante mistura mecânica de 344 mg do AU e 1135 mg da β -CD e a co-evaporação (CE)
foi preparada de acordo com o procedimento anterior seguida de adição de 20 mL de água destilada e posterior agitação
magnética por 36h, seguida de secagem em dessecador de vidro. Todos os procedimentos foram realizados a temperatura
ambiente.
2.2 Caracterização físico-química
2.2.1 Termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG)
As amostras do AU, β-CD, MF e CE foram submetidas ao ensaio de TG/DTG. As curvas TG/DTG foram obtidas por
meio de uma termobalança TGA-51, da marca Shimadzu, utilizando razão de aquecimento de 10°C/min . As curvas foram
obtidas de 25-900ºC, sob atmosfera dinâmica de N2 (100 mL/min), empregando-se cadinho de platina (Pt), respectivamente,
contendo ~2 mg de amostra.
2.2.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As amostras do AU, β-CD, MF e CE foram montadas em stubs de alumínio, posteriormente metalizados com feixes de
ouro e visualizadas em um microscópio eletrônico (JEOL modelo JSM -6390-LV) em aceleração de voltagem de 8 kV.
2.2.3 Espectrofotometria na região do infravermelho (FTIR)
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Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos no comprimento de on da de 4000-500 cm-1 , em
pastilhas de KBr, utilizando equipamento FTIR-SHIMADZU modelo IRTracer-100, em temperatura ambiente.
2.3 Atividade cardioprotetora
2.3.1 Animais
Foram utilizados ratos wistar, na faixa de peso de 250 a 300 gramas, obtidos do biotério central da Universidade Federal
de Sergipe, sendo obedecidas as normas vigentes pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEPA 55/2012). Os animais foram
divididos em 02 grupos: 1) Grupo ácido úsnico (AU) - onde os animais foram pré-tratados com AU (50 mg/kg/ gavagem)
durante 07 dias e 2) Grupo β-CD - onde os animais foram pré-tratados com β-CD (gavagem) durante 07 dias.
2.3.2 Indução da isquemia global e avaliação da função cardíaca
Após o tratamento, os animais foram eutanasiados e os corações retirados e canulados no sistema de perfusão de coração
isolado com tampão de Krebs -Ringer em mM (NaCl 118; KCl 4,7; KH2 PO4 1,2; MgSO4 .7H2 O 1,2; Glicose 11,1; NaHCO3
25; CaCl2 1,8), oxigenado (95% O2 e 5 % CO2 , a 37° C) e com pressão de perfusão de 80cmHg. Após a canulação, o átrio
esquerdo foi retirado e inserido um balonete acoplado a um transdutor de pressão no ventrículo esquerdo para a aquisição da
pressão ventricular esquerda (PVE) e mensuração da frequência cardíaca, os sinais obtidos foram captados e analisados no
software LabChart 8®, AD Instruments.
2.3.3 Avaliação do estresse oxidativo
2.3.3.1 TBARS
Conforme Bose et al, 1989 [10], o grau de peroxidação lipídica foi avaliado através do teste de substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS), onde o tecido foi adicionado ao tampão fosfato (50 mM, pH 7,4) e ao butilhidroxitolueno
(BHT 12,6 mM) e homogeneizado, em seguida, o homogenato foi adicionado a solução contendo ácido tricloroacético (TCA,
15%), ácido tiobarbitúrico (TBA 0,37%) e ácido clorídrico (HCl 0,25 N) e encubado por 45 minutos a 90° C. Logo após , foi
centrifugado (14000 rpm, 24°C, 5 minutos) e então adicionado n-butanol e solução saturada de NaCl e novamente
centrifugado (14000 rpm, 24°C, 2 minutos) e então colocado em uma microplaca de 96 poços e levado para o
espectrofotômetro de placas para ser lido a 540 nm e 570 nm. A quantidade de malonaldeído (MDA) formado foi expressa
em nMol/grama de tecido, adotando-se coeficiente de extinção molar para o MDA de 1,44 X 10-1 cm-1.
2.3.3.2. Determinação da atividade da enzima superóxido dismutase
O tecido foi homogeneizado em tampão fosfato (PBS 50 Mm, pH 7,4), centrifugado (Heal Force, Neofuge 15 R, 12000
rpm, 4°C, 30 minutos). Depois disso foi adcionado MTT (1,25 mM) e pirogallol (100 uM) acrescido de DTPA, assim, a
amostra foi incubada por 5 minutos e depois adicionado DMSO e levado para ser lido em um espectrofotômetro de
microplacas a 570 nM conforme Mardesh & Balasubramanian adaptado por Marklund (1974) [11]
2.3.3.3. Determinação da atividade da enzima catalase
Conforme o método descrito por Nelson & Kiesow (1972) [12] adaptado por GIODA et al (2010) [13], o tecido foi
homogeneizado em tampão fosfato (PBS 50 mM, pH 7,4) , centrifugado (12000 rpm, 4°C, 30 minutos). Depois disso , a
atividade da enzima foi determinada em tampão fosfato (50mM, pH 7,4) na pre sença de H2 O2 em espectrofotômetro de
cubetas, a 240 nm, 24°C, durante 60 segundos.
2.3.4 Determinação da concentração de proteínas
A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Lowry [14], para tanto, foi adicionado às amostras NaOH
(0,5 mM) e após 15 minutos, foi adicionado Na2 CO3 3%, KNaC4 H4 O6 ·4H2 O 4%, CuSO4 2% e reagente de Folin (1:1), em
seguida, foram encubadas por 30 minutos e depois realizada leitura a 630 nm em espectrofotômetro de placa (ELx800,
BIOTEK Instruments®) e por fim, foi construída uma curva padrão de albumina bovina (Sigma-Aldrich®) para
comparação.
2.3.5 Determinação do índice de severidade de arritmia
Conforme Barnauer, 1986 [15], a severidade das arritmias cardíacas foram avaliadas quanto a sua duração nos 30 minutos
iniciais do período de reperfusão, considerando-se como irreversível as arritmias com duração igual ou superior a 30
minutos, todavia, o surgimento de arritmias com duração de 03 minutos é classificada como fator 02, arritmias com duração
entre 03 a 06 minutos é classificada como fator 04, arritmias com duração entre 06-10 minutos é classificada como fator 06,
10 a 15 minutos fator 8, 15-20 minutos fator 10, 20-25 minutos fator 11 e 25-30 minutos fator 12.
3. Análise estatística
Os dados foram tabulados no Microsoft Exel 2010 e expressos em média + erro padrão da média, em seguida, foram
analisados pelo software Graph Pad Prism 5® e foi utilizado o teste “T” student não pareado para a comparação das médias
entre os grupos.
4. Resultados e discussão
As curvas TG/DTG (Figura 1) demonstram as perdas de massa das amostras em estudo nas faixas de temperatura
descritas na Tabela 1. A curva TG/DTG do AU apresenta duas etapas de perdas de massa, a primeira na faixa de 200-330ºC e
a segunda entre 330-713ºC, a primeira representa a decomposição e a segunda a formação de material carbonáceo da amostra
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[5]. A curva TG/DTG da β-CD apresentou perda de água de 26-120ºC, seguida da decomposição da amostra. Já nas curvas
TG/DTG da MF e CE, na faixa de 26-120ºC, pode-se observar a liberação de água característica da β-CD. A segunda etapa é
característica da decomposição do AU presente nas amostras. A perda de massa da MF representa 31,3% da decomposição
do AU, enquanto a CE representa 37,2% dessa etapa. Na faixa de 316-386ºC é possível sugerir a complexação do AU na
molécula de β-CD, uma vez que a decomposição do AU foi de 6,8% e valores superiores foram apresentados por MF e CE,
sendo atribuídos a decomposição de β-CD/AU. A última etapa relatada na Tabela 1 representa a formação de material
carbonáceo das amostras.
Figura 1: Curvas TG/DTG do AU, β-CD, MF e CE obtidas em atmosfera de N2 .
Tabela 1: Percentuais de perdas de massa obtidas por TG/DTG do AU, -CD, MF e CE.
Amostra
Ácido úsnico
 -ciclodextrina
Mistura física
Co-e vaporado
 m 1 (%)
26-120 °C
0,4
11,7
10,8
10,4
 m 2 (%)
120-316°C
51,6
1,9
16,2
19,2
 m 3 (%)
316-386°C
6,8
61,4
54,4
54,4
 m 4 (%)
386-900°C
41,2
25,0
18,7
16,0
A Figura 2 apresenta o espectro de FTIR de AU, β-CD, MF e CE. No espectro que corresponde ao AU é possível observar
uma banda na região de 3088 cm-1 que está relacionado ao grupo funcional C-C. A banda encontrada na região espectral de
2980-2929 cm-1 corresponde ao modo de estiramento C-H (CH3 ligado a carbono primário). É possível observar outra banda
na região de 1690 cm-1 que está relacionada ao grupo cetônico conjugado e a faixa de 1716 cm-1 caracteriza grupos cetônicos
não conjugados. A banda em 1630 cm-1 corresponde aos grupos conjugados e grupos doadores de elétrons em anéis
aromáticos. Também foi possível observar bandas simétricas referentes ao grupo C-O-C de éteres alifáticos em 1283, 1190,
1144, 1114, 1069, 1039 cm-1 [6]. O espectro de infravermelho da β-CD pura mostra uma banda larga com o máximo de
absorção a cerca de 3341 cm-1 , devido as vibrações do alongamento dos diferentes grupos hidroxila O-H da β-CD. A banda
em 1647 cm-1 , bem visível, está relacionada com as vibrações desses grupos O-H. O espectro apresenta uma série de outras
bandas, principalmente a 2926 cm-1 (vibrações C-H e de alongamento dos grupos CH e CH2 ), em 1411, 1368, 1335, 1301 e
1246 cm-1 devido as vibrações de alongamento C-H, e em 1154, 1080 e 1027 cm-1 são atribuídas as vibrações do alongamento
C-O, das ligações entre os grupos éter e hidroxila. Resultados semelhantes foram obtidos por Menezes et al (2014) [7]. Na
análise dos espectros que correspondem a MF e CE, pode-se observar a presença do AU nas amostras nas regiões de 1716,
1690 e 1144, cm-1 , com maiores intensidades no espectro da CE. Na Figura 3 estão apresentadas as fotomicrografias do AU,
β-CD, MF e CE, onde podem ser observados os cristais do AU com formas retangulares bem definidas, da mesma forma que
os cristais da β-CD também apresentam-se retangulares, no entanto, mais largos e com pequenas partículas aderidas a sua
superfície. Na MF, pode-se observar a não formação de complexo de inclusão, uma vez que os cristais de AU e β-CD estão
separados, demonstrando a falta de interação entre ambos. Entretanto, na amostra preparada pelo método da CE pode-se
observar a alteração na forma dos cristais demonstrando a interação entre eles. Dessa forma, pode-se inferir que houve
formação de complexo de inclusão por esse método.
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Figura 2: Espectros de infravermelho do AU, β-CD, MF
e CE obtidos na faixa espectral de 4000-500cm-1 .
Figura 3: Fotomicrografias do AU, β-CD,
MF e CE obtidas nos aumentos de 800 e
1000x, sob aceleração de voltagem de 8eV.
O estresse oxidativo é uma condição caracterizada pelo desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio
(ROS) e de nitrogênio (RNS) com o sistema de defesa antioxidante presente na célula, composto pelas enzimas superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) [16,17, 19]. Essa situação é comumente encontrada na sepse,
intoxicação e, sobretudo, durante a isquemia cardíaca, havendo hiperprodução de ROS e de RNS que, por sua vez, interagem
com os lipídeos de membrana, proteínas e com o DNA, resultando na peroxidação lipídica, formação de proteínas
carboniladas, anormalidades na síntese e transcrição proteica e atenuação do sistema de defesa antioxidante da célula,
afetando o funcionamento celular e indução da morte celular [16,17, 19].
Além disso, durante a isquemia cardíaca observa-se acúmulo de Ca 2+, degradação da maquinaria contrátil e a produção de
arritmias [16,19]. Nesse contexto, a utilização de produtos naturais com atividade antioxidante possui um importante papel
uma vez que grande parte dos danos provocados no tecido isquêmico são causados pela hiperprodução de espécies reativas
[19]. Assim, a utilização do AU para prevenir os danos causados pelo estresse oxidativo , devido a sua ação antioxidante [18],
surge como um tratamento alternativo uma vez que no presente estudo ao avaliar o estresse oxidativo no fígado (Figura 4),
foi observado que não houve diferença entre os grupos AU e βCD para os níveis de malonaldeído (MDA) formados, produto
da peroxidação lipídica respectivamente (8,17 + 0,35 ηmols de MDA/g de fígado, n = 09; 8,17 + 0,23 ηmols de MDA/g de
fígado, n = 09; p > 0,05).
Ao avaliar a atividade da SOD, (Figura 5A), foi observado que o pré-tratamento com AU não alterou sua atividade
quando comparado com o grupo βCD, respectivamente (0,024 + 0,001 Unid SOD/ mg de proteína, n = 8; 0,024 + 0,001 Unid
SOD/ mg de proteína, n = 8; p > 0,05). Da mesma forma, na figura 5B, ao verificar a atividade da CAT também foi
observado que o pré-tratamento com AU não altera a atividade dessa enzima, respectivamente (0,02 + 0,004 ΔE/ min/ mg de
proteína, n = 6; 0,015 + 0,002 ΔE/ min/ mg de proteína, n = 6; p > 0,05), desse modo, sugerindo que o complexo de inclusão
do AU com a βCD, além de melhorar a solubilidade em ambiente hidrofílico, não é prejudicial ao tecido hepático, uma vez
que a atividade das enzimas antioxidantes avaliadas não foi alterada. Todavia, ao analisar o estresse oxidativo no coração,
(Figura 6), foi observado que após a realização da isquemia global no miocárdio, o grupo pré-tratado com AU mostrou menor
formação de MDA (5,87 + 0,57 ηmols de MDA/g de coração, n = 6) quando comparado ao grupo βCD (13,02 + 1,04 ηmols
de MDA/g de coração, n = 6; p < 0,05), mostrando que o pré-tratamento com AU é capaz de inibir a quantidade de MDA
formado, portanto, evidenciando o papel cardioprotetor dessa substância.
Na Figura 7A, ao avaliar a função cardíaca, não houve diferença entre os grupo s AU e βCD para os valores de pressão
ventricular esquerda (PVE) durante o período da estabilização (AU: 6,27 + 0,73 cmHg, n = 4; βCD: 4,74 + 0,53 cmHg, n =
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4; p > 0,05), dessa forma, muito provavelmente, o pré-tratamento com AU não altera a concentração intracelular de Ca2+,
dessa forma, minimizando as lesões provocadas pela isquemia e reperfusão do miocardio.
Entretanto, na Figura 7B, após a indução da lesão por isquemia e reperfusão global, foi observ ado no grupo AU, que o
pré-tratamento foi capaz de manter os valores de PVE em relação ao grupo βCD, respetivamente (90,09 + 3,30 %, n = 4;
47,99 + 6,89%, n = 4; p < 0,05), evidenciando que o pré-tratamento com AU é capaz de preservar a função cardíaca contrátil
após a isquemia e reperfusão cardíaca, achado de grande importância, uma vez que a isquemia e reperfusão afeta a função
cardíaca contrátil, deixando, dessa forma, o tecido propenso ao desenvolvimento da insuficiência cardíaca.
Ao avaliar a freqüência cardíaca no momento da estabilização ( Figura 8A), não foi encontrado diferença estatisticamente
significativa entre o grupo pré-tratado com AU (281,6 + 18,14 BPM, n = 6) e o grupo pré-tratado com βCD (264,6 + 8,86
BPM, n = 6; p > 0,05), achado que corrobora a hipótese de que o pré-tratamento com AU não altera a concentração
intracelular de Ca 2+. Além disso, também não foi encontrada diferença entre os grupos AU (327,6 + 19,14 BPM, n = 5) e
βCD (302,2 + 30,82 BPM, n = 5; p > 0,05) ao analisar a frequência cardíaca no momento da reperfusão (Figura 8B),
podendo-se inferir que os corações do grupo βCD podem estar apresentando redução no período de relaxamento , uma vez que
eles mantêm a frequência cardíaca, apesar da PVE apresentar-se reduzida no momento da reperfusão, achado semelhante ao
observado na insuficiência cardíaca .
Quando analisado o índice de severidade de arritmia (Figura 9), o grupo AU obteve menores escores em relação ao grupo
βCD (AU: 2,50 + 0,50 u.a, n = 4; βCD: 11,00 + 0,57 u.a, n = 4; p < 0,05), mostrando que o AU é capaz de inibir a ocorrência
de arritmias durante a reperfusão, achado que também fortalece a hipótese de que o pré-tratamento com AU é capaz de
reduzir a concentração intracelular de Ca 2+ durante a reperfusão, fator que esta intimamente associado a ocorrência de
arritmias, maior taxa de apoptose celular, necrose e, consequentemente, maior área de lesão cardíaca.
Figura 4: Mensuração do estresse oxidativo no
fígado a partir da concentração de malondealdeido
(MDA) formado nos βCD e AU através do TBARS.
Test T student, não pareado .
Figura 6: Mensuração nos βCD e AU do estresse
oxidativo no coração a partir da concentração de
malondealdeido (MDA) formado através do TBARS.
Test T student, não pareado.
Figura 5: Determinação nos grupos βCD e AU da atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) (painel A) e da enzima
catalase (painel B). Test T student, não pareado.
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Figura 7: Mensuração nos grupos βCD e AU da pressão ventricular esquerda (PVE) no período da estabilização (Painel A) e
da PVE (Painel B) expressa em percentual (PVE%) durante o período da reperfusão, dados normalizados pelos respectivos
valores da estabilização. Teste T studant, não pareado.
Figura 8: Mensuração da frequência cardíaca nos grupos βCD e AU durante o período de estabilização (painel A) e
durante o período da reperfusão (painel B). Teste T studant, não pareado.
Conclusão
Os resultados preliminares demonstraram
que uma vez complexado com a βCD pelo
método da CE, o AU não se mostrou tóxico,
sendo capaz de proteger o coração contra a
injúria de isquemia e reperfusão, portanto,
preservando a função cardíaca contrátil.
Todavia, novos estudos como doseamento do
AU no complexo de inclusão, faz-se
necessário a fim de conhecer o percentual de
complexação do mesmo.
Figura 9: Determinação do índice de
severidade de arritmia (ASI) nos grupos βCD
e AU. Teste T student não pareado.
Agradecimentos
Os autores agradecem a CAPES, CNPq, e
FAPITEC/SE pelo suporte financeiro nesta
pesquisa. Nós agradecemos também a Dra.
Maria Lúcia Vieira Moreno, Dr. Cláudio
Pereira Figueira e a Profa. Adriana Lanfredi
Rangel pelas imagens da MEV obtidas no
Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz da
Fundação Oswaldo Cruz, Salvador
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