O potencial significado terapêutico da Concentração de Prevenção da Mutação do
Baytril® no tratamento da colibacilose respiratória aviária
H. –G. Wetzstein
Bayer HealthCare AG, Animal Health, Leverkusen, Alemanha
A colibacilose, doença bacteriana muito prevalente na avicultura, tem sido tratada com
sucesso pelo uso de Baytril® (2). O enrofloxacino (ENR) - seu ingrediente ativo – foi a
primeira fluoroquinolona (FQ) moderna introduzida na medicina veterinária.
Anteriormente, a eficácia clínica do ENR podia ser explicada com base nas concentrações
da droga no soro e nos órgãos, pela baixa concentração inibitória mínima (do inglês, MIC)
e pela alta atividade bactericida contra Escherichia coli. No entanto, a determinação de
recentes parâmetros envolveu apenas populações bacterianas relativamente pequenas. A
Concentração de Prevenção da Mutação (do inglês, MPC) é um novo parâmetro que
facilita: (i) a interpretação da eficácia antibacteriana in vivo, (ii) a comparação da potência
de drogas dentro de uma classe e, possivelmente, (iii) um modelo de regime apropriado de
doses. É provável que o conceito de MPC expanda de forma ampla o MIC baseado na
farmacodinâmica (1). Originalmente, o MPC define o limiar da droga onde o crescimento
visível de uma população bacteriana compreendendo 109 a 1010 unidades formadoras de
colônia (UFC) é completamente inibido. Em contraste, 104 UFC são utilizadas para o teste
de MIC. Grandes populações contêm naturalmente variantes com reduzida sensibilidade a
drogas, o que ocorre na frequência de 10-7 a 10-8, e, mais importante, refletem de perto o
tamanho das populações de E. coli nas aves doentes (6).
Deve-se relembrar que cepas de E. coli que exibem relevante resistência clínica a FQ
emergem primeiramente através do acúmulo progressivo de mutações pontuais especificas
em um dos quatro genes (gyrA, gyrB, parC e parE) que codificam as enzimas alvo
primárias e secundárias das FQs, DNA girase e topoisomerase IV. Tais mutações
provocam a troca de uma variedade de aminoácidos conferindo susceptibilidade reduzida
às FQ. Os respectivos mutantes podem ser amplificados durante a terapia pelo
enriquecimento dos clones sob pressão seletiva a drogas permissivas. Por exemplo, assim
que a concentração da droga fica abaixo do MPC – dentro da chamada janela de seleção de
mutação – o limite inferior de tal droga pode ser aproximado pelo MIC (1).
Durante a análise do MPC, populações bacterianas são classificadas de acordo com a
capacidade de distintas frações de UFC formarem colônias visíveis, a despeito da presença
da droga. Na prática, alíquotas de uma cultura de E. coli são semeadas em série em placas
de agar, onde cada placa fornece uma concentração específica da droga. Após incubação, o
número de colônias presentes é relacionado à respectiva concentração da droga. O gráfico
resultante demonstra que as UFCs declinaram em duas fases distintas: uma queda inicial de
aproximadamente 3,5 log10 nas concentrações da droga em torno do MIC do ENR (0,03 –
0,06 µg/mL) indicou que o crescimento da população já havia sido inibido (por atingir a
primeira enzima alvo). No entanto, uma fração de aproximadamente 105 a 106 UFCs foi
capaz de formar colônias, possuindo obviamente o alvo primário resistente. Estas UFCs
foram inibidas com sucesso (através do alvo secundário) pelo aumento da concentração da
droga. No MPC, não houve crescimento residual visível: a atividade estatística foi aplicada
mesmo nas variantes mais refratárias presentes em grandes populações. O crescimento
destes clones exigiria a presença concorrente de duas mutações que conferissem resistência
às FQ. Tais clones podem estar presentes em populações em torno de 1014 UFC (1), as
quais são muito maiores que as populações de E. coli nas aves doentes (6). Obviamente, o
MPC define a sensibilidade dos alvos secundários da FQ, enquanto a sensibilidade do alvo
primário é aproximada pelo MIC. Assim, a amplificação seletiva do primeiro estágio de
resistência das subpopulações à FQ só pode ser prevenido pela inibição apropriada dos
alvos secundários da droga (não modificados), por exemplo, atingindo as condições de
MPC. A notável heterogeneidade na sensibilidade revelada pelas curvas de MPC,
estendendo em torno de 10 vezes o MIC, permanece indetectável no teste de MIC.
O aspecto conceitual do MPC é a dosagem da droga capaz de atingir as condições de MPC
nos animais medicados por período apropriado, além de fornecer tratamento eficaz, pode
prevenir o fortalecimento de variantes resistentes. Consequentemente, um retardo ou
(preferencialmente) a prevenção de cepas resistentes à FQ no campo pode se tornar viável
(1).
Os primeiros resultados experimentais obtidos em camundongos infectados apenas com
Streptococcus pneumoniae forneceram evidências diretas no suporte do conceito de MPC
(3).
No trabalho aqui apresentado, a comparação de MPCs de três FQs veterinárias – ENR,
danofloxacina (DAN) e difloxacina (DIF) – foi determinada para grandes populações
selvagens de E. coli, ATCC 8739. Os MPCs foram definidos em 0,3 – 0,35; 0,5 – 0,55 e
1,5 – 1,6 µg/mL, respectivamente. As colônias crescidas compreenderam dois tipos
morfológicos: regulares e pequenas colônias variantes de crescimento lento. Embora os
MPCs da DAN e da DIF terem sido 1,6 e 4,7 vezes maior que o MPC do ENR,
teoricamente, todos os componentes podem atingir os alvos da FQ, contanto que a
concentração da respectiva droga possa ser atingida, principalmente, no local da infecção.
As concentrações plasmáticas do ENR em galinhas, estabelecidas através de aplicações via
água de bebida contínua (dose terapêutica de 10mg/kg) excederam 0,3 µg/mL cinco horas
após o início do tratamento e foram mantidas a 0,5 e 0,6 µg/mL durante o período de
tratamento de 5 dias. Além disso, o ENR foi enriquecida no pulmão e nos tecidos
musculares (5, 7, 8). Foram determinadas as concentrações séricas e teciduais para a DAN
(na dosagem de 5 mg/kg), significativamente mais baixa (5), e para a DIF (na dosagem de
10 mg/kg), menos da metade da concentração do ENR (4). Desta forma, é provável que as
condições de MPC que resultem na inibição de grandes populações de E. coli in vivo sejam
facilitadas apenas pelo ENR.
Para explicar de forma adequada a segurança do intervalo de doses, a atividade bactericida
e outras atividades bacteriostáticas do ENR, como por exemplo, os efeitos pós-antibióticos,
também precisam ser determinados (defesas imunes, também importantes), já que a
eliminação do patógeno tem importância primária tanto no resultado da terapia como na
prevenção de seleção a resistência (1). Devido a sua alta atividade bactericida, a fração
mais sensível de uma população de E. coli será rapidamente morta: uma redução de 3,5
log10 foi alcançada dentro de 2 horas. A parte mais refratária da população foi eliminada
em uma taxa mais baixa. No entanto, com 0,25 µg/mL, a esterilidade foi alcançada dentro
de 48 horas sob condições in vitro. O crescimento espontâneo da população empregada nos
experimentos de destruição pode ser prontamente demonstrado se a concentração de ENR
ficar dentro da janela de seleção de mutação, por exemplo, equivalente a 0,125 µg/mL.
Outro parâmetro in vitro, o retardo pós-antibiótico do crescimento de pequenas populações
que permaneceram após rápida exposição à droga (RED), também foi definido. Após
exposição ao ENR por 2 horas a metade do MPC, seguido por remoção da droga, o RED
ficou em torno de 2 horas. No entanto, na presença de apenas metade do MIC do ENR
(0,02 µg/mL), o novo crescimento foi retardado para aproximadamente 8 horas. Porém,
mais importante, as pequenas populações residuais devem ser rapidamente eliminadas pela
defesa imune.
Baseado na farmacocinética, a eficácia antibacteriana do ENR na colibacilose pode ser
explicada pela combinação: (i) MPC, (ii) fase inicial rápida e fase secundária lenta de
morte, assim como (iii) REDs. Espera-se que o ENR atinja os dois alvos moleculares da E.
coli devido às baixas concentrações da droga sugeridas pelo MPC. Alcançando-se as
condições de MPC in vivo, o fortalecimento do primeiro passo das variantes resistentes à
FQ, já presentes em grandes populações não tratadas do patógeno, deve ser minimizado.
Assim, as diferenças observadas nos MPCs, particularmente entre ENR e DIF,
provavelmente se traduzam nas diferentes respostas terapêuticas e na prevenção do
aparecimento de resistência a FQ no campo.
Referências
(1) Blondeau, J.M. et al., 2004. J. Chemother 16 (Sup. 3): 1 – 19.
(2) Charlestone, B. et al., 1998. Antimicrob. Agents Chemother 42: 83 – 87.
(3) Etienne, M.D. et al., 2004. J. Infect. Dis. 190 : 1472 – 1475.
(4) Heinen, E. et al., 1998. Dados não publicados.
(5) Knoll, U. et al., 1999. J. Vet. Pharmacol. Therap. 22: 239 – 246.
(6) Pourbakhsh, S.A. et al., 1997. Avian Dis. 41 : 221 – 233.
(7) Reinhardt, A.K. et al., 2005. Vet. Microbiol. 106: 129 – 137.
(8) Scheer, M. et al., 1997. J. Vet. Pharmacol. Therap. 20 (Sup. 1): 201 – 202.