UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO
ESPECIALIZAÇÃO lato-sensu
PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO EM BOVINOS
Ultra-sonografia na Aspiração Folicular de Bovinos
Felipe Campos Coimbra de Miranda
Rio de Janeiro, agosto de 2008
UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO
ESPECIALIZAÇÃO lato-sensu
PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO EM BOVINOS
ULTRA-SONOGRAFIA NA ASPIRAÇÃO
FOLICULAR DE BOVINOS
Felipe Campos Coimbra de Miranda
Rio de Janeiro, agosto de 2008
ii
Felipe Campos Coimbra de Miranda
Aluno do Curso de Especialização lato-sensu de Produção e Reprodução de Bovinos
ULTRA-SONOGRAFIA NA ASPIRAÇÃO
FOLICULAR DE BOVINOS
Trabalho monográfico de conclusão do
curso de Especialização lato-sensu
Produção e Reprodução de Bovinos
(TCC), apresentado a UCB como
requisito parcial para a obtenção do
título de Especialista em Produção e
Reprodução de Bovinos, sob a
orientação do Prof. Dr. Athos de
Assumpção Pastore.
Rio de Janeiro, agosto de 2008
iii
ULTRA-SONOGRAFIA NA ASPIRAÇÃO
FOLICULAR DE BOVINOS
Elaborado por Felipe Campos Coimbra de Miranda
Aluno do Curso de Especialização lato-sensu Produção e Reprodução de
Bovinos
Foi analisado e aprovado com
grau: ...................................
Rio de Janeiro, ____ de _______________ de ______.
________________________________
Membro
_________________________________
Membro
_________________________________
Prof. Dr. Athos de Assumpção Pastore
Presidente
Rio de Janeiro, agosto de 2008.
iv
RESUMO
A aspiração folicular transvaginal com auxílio do ultra-som (OPU) é uma
técnica da reprodução assistida que associada à produção “in vitro” de
embriões (PIV) tem proporcionado comercialmente a maior quantidade de
crias/vaca/ano. O futuro dessa biotécnica é promissor e o conhecimento e
aplicabilidade dos aspectos relacionados à aspiração folicular são
fundamentais para o sucesso do processo, ou seja, obtenção de grande
quantidade de bezerros oriundos de uma única vaca. Procurou-se descrever
vários pontos pertinentes a OPU como conceito, histórico, comparações entre
outras técnicas, quadro atual, utilização, pré-requisitos para a realização da
aspiração folicular com ultra-som, aplicação da técnica, morfologia dos oócitos
coletados, vantagens e desvantagens, seqüelas e futuras pesquisas.
Palavras-chave: Aspiração folicular; produção “in vitro” de embriões; ultra-som;
vaca.
v
ABSTRACT
The follicular aspiration transvaginal with aid of the ultrasound (OPU) is one
technique of the attended reproduction that associated to the production “in
vitro” of embryos (PIV) has proportionate commercially the biggest amount of
creates/cow/year. The future of this human engineering is promising and the
knowledge and applicability of the aspects related to the follicular aspiration are
basic for the success of the process, that is, attainment of great amount of
deriving year-old calves of an only cow. The OPU was looked to describe some
pertinent aspects as concept, description, comparisons among others
techniques, current picture, job of the OPU, prerequisite for the accomplishment
of the follicular aspiration with ultrasound, application of the technique,
morphology of the collected oócitos, advantages and disadvantages, sequels
and future research.
Key words: Ovum pick-up; embryo production “in vitro”; ultra-sound; cow;
vi
SUMÁRIO
1 – Introdução
1
2 – Desenvolvimento
4
2.1 - Conceito da OPU
2.2 - Histórico da OPU
2.3 - Comparações
2.3.1 - Natural x TE x OPU
2.3.2 - Tipos de Aspiração
2.4 - Quadro atual da OPU
2.5 - Utilização da OPU
2.6 - Pré-requisitos para a realização da OPU
2.6.1 - Seleção do folículo
2.6.2 - Fatores biológicos que influenciam a OPU
2.6.2.1 - Freqüência e momento da OPU
2.6.2.2 - Fisiologia e condição corporal da doadora para OPU
2.6.2.3 - Tempo e transporte dos oócitos coletados pela OPU
2.6.2.4 - Raça, idade e individualidade da doadora submetida a OPU
2.6.2.5 - Estimulação ou não estimulação antes da OPU
2.6.3 - Fatores técnicos que influenciam a OPU
2.6.3.1 - Materiais utilizados na OPU
2.7 - Procedimentos básicos da OPU
2.8 - Classificação morfológica dos oócitos coletados pela OPU
2.9 - Vantagens e Desvantagens associadas a OPU
2.9.1 - Vantagens
2.9.2 - Desvantagens
2.10 - Seqüelas associadas a OPU
2.11 - Preços do serviço de OPU
2.12 - Futuras pesquisas para ampliar e maximizar o emprego da
OPU
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29
29
30
30
32
33
3 – Conclusão
35
4- Referências bibliográficas
36
vii
1 - Introdução
A produção “in vitro” de embriões (PIVE) é constituída das etapas de
colheita, maturação (MIV) e fecundação de oócitos (FIV), além do cultivo ou cocultivo (CIV) de zigotos e estruturas embrionárias. A PIVE é uma biotécnica
empregada,
alternativamente,
para
acelerar
a
produção
de
animais
geneticamente superiores e impedir, pela aspiração “in vivo” de folículos guiada
por ultra-sonografia, o descarte precoce de fêmeas geneticamente privilegiadas
que possuem alterações adquiridas (GONÇALVES et. al., 2001).
A aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-sonografia, conhecida
como OPU (“ovum pick-up”), é a primeira etapa do processo de produção “in
vitro” de embriões. Por esse motivo deve-se ter bastante eficácia no emprego
dessa técnica, cuja realização correta resultará em um processo de PIVE com
maior sucesso, proporcionando, como produto final dessa biotecnologia, várias
crias para o produtor.
A OPU é entendida como uma técnica ou biotecnologia que permite
coletar oócitos, por diversas vezes, através da aspiração folicular guiada por
ultra-som. (MENDES, 2005).
Pieterse e Kapeen (1988) descreveram a técnica de OPU pela primeira
vez. A partir, então, do final da década de 80 e início da década de 90 é que a
OPU começou a ser reconhecida e, conseqüentemente, empregada no meio
científico e comercial (BOLS et. al., 2005). Nos últimos anos a técnica de
aspiração folicular com auxílio do ultra-som tem se desenvolvido e, por isso,
viii
vem ganhando bastante aceitação, principalmente na América do Sul e Ásia
(VIANA e BOLS, 2005).
A OPU quando comparada à transferência de embriões (TE) e à forma
natural de concepção, é a que mais produtos ou crias proporciona. Por meio
natural à vaca só pode conceber uma cria por ano (Manual Merck de
Veterinária, 2001).
Na técnica de TE pode-se obter anualmente uma
quantidade de 25 crias por vaca (BOLS et. al., 2005). Getz et. al. (2000) citam
que na biotécnica OPU/PIVE pode-se obter, em um período de 6 meses,
aproximadamente 50 embriões. Dode et. al. (2002) relataram que é possível,
através da OPU/PIVE, obter 36 crias/vaca/ano.
Diversas são as formas conhecidas de se coletar oócitos, porém a de
maior sucesso e menos invasiva é a OPU (BOLS et. al., 2005). Becker et. al.
(1996) compararam as formas de aspiração e concluíram que tal técnica foi a
que proporcionou melhores oócitos.
Atualmente, tem-se obtido com a técnica de aspiração folicular por via
transvaginal guiada por ultra-som uma média de dez a quinze oócitos por
sessão de OPU, resultando em oito oócitos fertilizados, dois a três chegando à
etapa de transferência para a receptora e uma cria sendo concebida
(CENATTE EMBRIÕES, 2006).
A OPU pode ser empregada em várias classes de doadoras bovinas,
desde fêmeas que apresentam patologias adquiridas até vacas de alto
potencial genético (CENATTE EMBRIÕES, 2006).
É importante, para realização da OPU em doadoras bovinas, entender
alguns aspectos que envolvem essa técnica como qual o melhor folículo a ser
ix
puncionado, quais instrumentos e materiais são necessários para o emprego
da técnica, qual a freqüência e momento de aspiração, qual a fisiologia e
condição corporal da doadora, qual o tempo de transporte dos oócitos
coletados até o laboratório, aspectos ligados à raça, idade e individualidade da
fêmea doadora, estimulação ou não estimulação, classificação morfológica dos
ovócitos, vantagens e desvantagens da técnica, seqüelas causadas pelo
procedimento, além dos aspectos financeiros no que se refere aos valores
cobrados por sessão de OPU.
Todos esses aspectos ligados vão culminar na realização da técnica
propriamente dita. Para empregá-la é importante conhecer todos os passos,
desde a contenção adequada do animal, passando pela introdução da sonda,
até a colheita dos ovócitos.
A técnica de OPU é recente. Muitos aspectos necessitam de uma maior
compreensão e muito precisa ser aprimorado. Várias pesquisas têm sido
desenvolvidas com a intenção de se alcançar melhores resultados no emprego
da OPU. Algumas novidades dessa biotecnologia, que estão sendo projetadas
para um futuro próximo, estarão descritas no decorrer deste trabalho.
A realização dessa Monografia tem como objetivo descrever os diversos
aspectos da OPU e, principalmente, elucidar a importância que essa
biotecnologia da reprodução tem no incremento da formação de plantéis com
animais melhorados geneticamente e, consequentemente, proporcionar ao
produtor e consumidor produtos de alta qualidade e quantidade.
Foi utilizada, como metodologia, uma revisão bibliográfica abrangente,
onde renomados autores e reconhecidos cientistas foram pesquisados,
x
permitindo conclusões e deduções mais conscientes e emergindo, ao final,
uma visão mais esclarecedora do tema.
xi
2 – Desenvolvimento
A utilização da sigla OPU é abrangente, sendo empregada para todos os
tipos de técnicas que utilizam da aspiração ou punção folicular para colheita ou
coleta de oócitos. Entretanto, esse termo, no meio acadêmico e na literatura, se
tornou, especificamente, sinônimo da aspiração folicular transvaginal guiada
por ultra-sonografia, sendo utilizado atualmente com esse único fim.
2.1 - Conceito da OPU
A aspiração folicular transvaginal com auxílio do ultra-som é a primeira
etapa de uma biotecnologia da reprodução conhecida como PIVE ou produção
“in vitro” de embriões. A PIVE envolve a aspiração folicular ou colheita de
oócitos, a maturação, a fecundação e o cultivo “in vitro” ou co-cultivo de zigotos
e estruturas embrionárias. Sendo a punção folicular o primeiro passo de um
processo tão complexo e cuidadoso para a produção de embriões, deve-se
realizá-la da maneira mais eficaz possível, para que todo o desencadeamento
do processo tenha sucesso.
xii
Para a Cenatte Embriões (2006), uma das maiores empresas brasileira na
área de reprodução animal, a OPU consiste numa biotecnologia que permite a
aspiração “in vivo” dos folículos ovarianos guiada por ultra-sonografia e
auxiliada por uma bomba de vácuo. Os oócitos coletados (gameta feminino)
através dos folículos ovarianos são processados em laboratório e analisados,
avaliados e selecionados (oócitos de grau I, II, III) pela observação através de
uma lupa esteroscópica. Essa técnica possibilita o aproveitamento dos oócitos
advindos do crescimento de ondas foliculares constantes nos ovários das
doadoras que seriam naturalmente descartados, pois somente um ovócito é
ovulado durante o ciclo estral na espécie bovina.
Segundo a Brasgen (2006), outra reconhecida empresa de reprodução
animal, a punção folicular transvaginal consiste na aspiração de folículos
ovarianos visíveis ao ultra-som.
De acordo com Mendes (2005) a punção folicular guiada por ultra-som
consiste num método que permite coletar, repetidamente, os ovócitos por
aspiração dos folículos, visualizados na tela de um ultra-som, podendo, dessa
forma, aperfeiçoar a produção de embriões a partir do cultivo “in vitro” para
vacas vivas de elevado valor genético. A técnica é descrita como tendo o
objetivo de aspirar ovócitos dos folículos ovarianos de doadoras “in vivo” onde,
posteriormente, esses ovócitos são fecundados.
Bols et. al. (2005) disseram que a aspiração folicular transvaginal foi
adaptada para ser utilizada em doadoras vivas submetidas a recuperação
repetida de ovócitos provenientes de novilhas e vacas de alto valor genético,
para a reprodução de uma grande quantidade de bezerros com características
xiii
de produção conhecida e para o encurtamento do intervalo entre gerações em
programas reprodutivos em bovinos.
2.2 - Histórico da OPU
Segundo Viana et. al. (2001), a técnica de aspiração folicular guiada por
ultra-som foi originalmente desenvolvida para a recuperação de ovócitos
destinados a fertilização “in vitro” em mulheres com problemas reprodutivos,
sendo posteriormente adaptada para o emprego em bovinos.
Callesen et. al. (1987) foram pioneiros na utilização da ultra-sonografia
para coletar oócitos em vacas vivas, usando a abordagem transcutânea.
A aspiração folicular com o intuito de colheita de oócitos bovino, por via
transvaginal, guiada pela ultra-sonografia, foi descrita pela primeira vez no ano
de 1988. A técnica de recuperação de oócitos, até então desenvolvida para a
reprodução humana, foi adaptada para o uso em vacas. (Pieterse & Kappen,
1988).
De acordo com Seneda et. al. (2002), a técnica de aspiração folicular
utilizando ultra-sonografia foi relatada pela primeira vez em 1987 por Callesen
e Christensen. Essa técnica foi descrita em 1987 onde se relata que os ovários
foram tracionados dorso-lateralmente na cavidade abdominal, viabilizando sua
visualização com um transdutor de 3.5 MHz posicionado sobre a pele, na
região da fossa paralombar, local onde foi introduzida a agulha para puncionar
os folículos. Apesar desse procedimento ter tido eficácia, a recuperação de
oócitos bovinos com uso da ultra-sonografia só ganhou grande impulso um ano
xiv
mais tarde, com novas modificações que proporcionaram ao procedimento
maior facilidade e rapidez na sua aplicação. A técnica de OPU que era utilizada
em humanos foi adaptada para a utilização em bovinos por Pieterse em 1988,
e desde então a técnica de aspiração folicular via transvaginal com o auxílio da
ultra-sonografia tem sido empregada na colheita de oócitos com grandes
perspectivas.
A utilização da punção folicular, associada à produção “in vitro” de
embriões, foi inicialmente empregada na produção de descendentes de
animais de alto valor genético, mas que apresentavam problemas adquiridos
em relação à fertilidade ou que não mostravam respostas aos tratamentos
superovulatórios convencionais (VIANA et. al., 2003).
Segundo Bols et. al. (2005), a punção folicular para recuperação de
oócitos já tem sido utilizada há muitas décadas, por intermédio da laparotomia
e laparoscopia. Entretanto, só a partir do final dos anos 80 e início dos anos 90
é que a técnica de OPU ganhou aceitação, pois se tornou menos invasiva e
mais eficiente com o auxílio do ultra-som.
De acordo com Hafez e Hafez (2004), desde o início dos anos 90, a
captação de oócitos pela punção de folículos ovarianos de doadora viva por
laparoscopia ou ultra-sonografia vem ganhando aceitação.
A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia foi a responsável, em
1996, pelo nascimento, no Brasil, das primeiras crias por aspiração folicular
associada à fertilização “in vitro” e, em 2000, foi obtido um filhote a partir de
ovócito procedente de punção folicular de uma bezerra com três meses de
idade (DODE et. al., 2002).
xv
De acordo com Viana e Bols (2005), a baixa eficiência dos sistemas
inicialmente empregados limitou, nas décadas de 80 e 90, a expansão do uso
comercial da aspiração folicular, que se concentrou em animais de alto valor
genético, mas com problemas de fertilidade adquiridos ou histórico de
insucesso na superovulação. Nos últimos anos o cenário vem mudando, com o
uso intensivo de fêmeas em reprodução e um conseqüente acréscimo na
produção “in vitro” de embriões bovinos em todo o mundo, principalmente na
América do Sul e Ásia.
2.3 - Comparações
2.3.1 - Natural x TE x OPU
De acordo com o Manual Merck de Veterinária (2001), o período normal
de gestação bovina varia entre 281 a 289 dias, ou seja, cerca de nove meses,
o que possibilita a vaca conceber apenas uma cria por ano.
A aspiração folicular apresenta um potencial de produção de embriões e
de gestações com resultados melhores do que os obtidos com outras técnicas,
podendo ser empregada em animais com condições reprodutivas normais ou
até pré-púberes. Ball et. al. (2006) verificaram, em suas pesquisas, que uma
vaca de 8 anos de idade, produziu 176 embriões durante 158 coletas
semanais.
xvi
Dode et. al. (2002) afirmaram que a aspiração de ovócitos imaturos por
aspiração folicular, associada à maturação e fecundação “in vitro” e ao cultivo
“in vitro” dos embriões, possibilita que sejam produzidas, em média, 36
crias/ano de uma única doadora.
De acordo com Pieterse et. al. (1998), o objetivo final da aspiração
folicular transvaginal era a produção de mais embriões e mais gestações por
vaca doadora, do que através da superovulação e programas de transferência
de embriões.
Segundo Bols et. al. (2005), na técnica de transferência de embriões a
vaca pode ser lavada 3 a 4 vezes durante o ano, com uma média de 5
embriões por lavado. Já na aspiração folicular transvaginal guiada por ultrasonografia a vaca pode ser submetida a duas sessões semanais, obtendo-se
dois embriões por doadora por semana, sendo 4 a 5 vezes maior que os
valores encontrados na TE.
Viana et. al. (2001) afirmam que a técnica de OPU apresenta grande
potencial quando comparada aos métodos convencionais de reprodução
assistida, pois possibilita a recuperação de gametas diretamente do ovário,
independentemente da época do ciclo estral e sem necessidade de
superovulação. Além disso, possibilita a obtenção de produtos de animais com
infertilidade adquirida por distúrbios na porção tubular do trato genital.
Para Seneda et. al. (2002), a TE apresenta algumas restrições como o
grande número de doadoras que apresentaram cistos ovarianos, endometrites
e lesões iatrogênicas. Além disso, o número de estruturas recuperadas nem
sempre justifica a utilização dessa técnica. Outros fatores da TE que podem
xvii
comprometer a doadora são a constante interrupção do ciclo estral e as
terapias gonadotróficas. Mais uma restrição que também pode inviabilizar a TE
é a impossibilidade de realizar essa técnica em algumas situações de
infertilidade extra-ovariana, como, por exemplo, as obstruções uterinas.
2.3.2 - Tipos de Aspiração (post-mortem, laparotomia, colpotomia,
laparoscopia, transcutânea e transvaginal)
Para Gonçalves et. al. (2001), os ovócitos da espécie bovina podem ser
obtidos in vitro pela punção folicular ou pela dissecação folicular, em ovário
provenientes de abatedouros (post-mortem) ou “in vivo”, por laparotomia ou
laparoscopia via flanco e, ainda, por laparoscopia ou ultra-sonografia via
transvaginal.
A punção de folículos imaturos dos ovários de doadoras vivas, claramente
trouxe novas perspectivas aos programas de reprodução assistida, visto que
uma quantidade maior de gametas se tornou disponível para o processo de
PIVE durante um extenso período de tempo, diferentemente das doadoras
submetidas à aspiração após o abate (BOLS et. al., 2005).
Ainda segundo Bols et. al. (2005), existem certas diferenças básicas entre
a recuperação de ovócitos “in vivo” e post-mortem. Uma dessas diferenças é a
manipulação ovariana que, em doadoras vivas, é realizada através da
manipulação transretal, para que seja possível visualizar o folículo por meio de
imagem laparoscópica ou ultra-sonográfica. Já em animais provenientes de
abatedouros a manipulação ovariana é feita de forma direta, onde um folículo
xviii
específico pode ser puncionado por meio de visualização direta. Outra
diferença está na pressão do vácuo, que é diferente “in vivo” e post-mortem,
onde a pressão deve ser ajustada para cada aspiração especificadamente.
De acordo com Malard et. al. (2001), ovócitos de bezerras podem ser
obtidos a partir de coletas “in vitro” em ovários provenientes de abatedouro, “in
vivo” por ovariectomia, por aspiração de folículos observados por cirurgia ou
pelo método de visualização utilizando ultra-sonografia.
Antigamente os ovócitos para PIVE eram obtidos, principalmente, pela
aspiração de folículos de ovários encontrados em matadouros. Os oócitos
podem ser coletados pela dissecação, fatiamento ou aspiração. A técnica de
dissecação permite o isolamento de folículos individuais; o fatiamento de
tecidos ovarianos fornece o maior número de oócitos, e a aspiração é a técnica
mais eficiente em termos de tempo para obter oócitos (HAFEZ e HAFEZ,
2004).
De acordo com Gonçalves et. al. (2001), a colheita “in vitro” de oócitos
provenientes de abatedouros é, geralmente, realizada pela punção folicular
com agulha acoplada a uma seringa ou bomba de vácuo e, “in vivo”, por
intermédio de uma agulha acoplada a uma bomba de vácuo, guiada por ultrasonografia transvaginal
De acordo com Mendes (2005), a colheita de oócitos após abate da fêmea
doadora deve ser realizada até 3 horas entre o abate e a aspiração, visto que
após esse período a viabilidade do oócito é alterada, principalmente pela
variação de temperatura. Após o ovário ser retirado da doadora abatida, esse
ovário deve ser colocado em solução salina 0,9% de NaCl a uma temperatura
xix
de 33°C a 36°C. A estrutura ovariana deve ser encaminhada ao laboratório,
onde ocorre a lavagem desses ovários com solução salina e, posteriormente,
devem ser colocados em banho-maria. A punção folicular é, então, realizada
utilizando-se uma agulha acoplada a uma seringa que perfura todo o
parênquima ovariano. Posteriormente à punção folicular, o tubo de ensaio que
contém o líquido folicular aspirado deve permanecer na posição vertical por 15
minutos, para que seja, depois de passado esse período de tempo, retirado o
sobrenadante como o auxílio de um pipetador. O sedimento é colocado em
uma placa de petri de 100 x 15 mm e o tubo é banhado, no mínimo, por duas
vezes com dois ml do meio de bancada, para não deixar nenhuma estrutura
para trás. Em seguida, faz-se o rastreamento e isolamento dos complexos
cumulus-ovócito.
Os primeiros trabalhos realizados com a técnica de PIVE envolveram a
aspiração de oócitos dos ovários removidos de bovinos abatidos. Entretanto, a
aspiração de folículos post-mortem acarreta risco de doenças inerentes e, além
disso, tais animais quase sempre não possuem genética apurada. Obviamente,
é possível o abate uma única vez, o que torna a aspiração folicular viável
apenas em casos especiais, como para estudos científicos ou em situações
irremediáveis (BALL et. al., 2006).
A colpotomia é uma técnica que consiste na manipulação dos ovários
através de uma incisão intravaginal, pressionando-os contra a parede
abdominal, por onde uma agulha para a punção folicular é introduzida. Essa
técnica tem riscos de causar peritonite e evisceração através da incisão
xx
vaginal, por isso sua utilização não teve prosseguimento (SENEDA et. al.,
2002).
De acordo com Bols et. al. (2005), diferentes métodos tem sido
empregados na coleta de ovócitos repetida em doadoras vivas, como, por
exemplo, a punção de folículos pela endoscopia, que tem proporcionado altas
taxa de recuperação, embora com a desvantagem de ser relativamente
invasiva.
Seneda et. al. (2002) citaram a laparoscopia transvaginal ou paralombar,
no intuito de coletar oócitos, como sendo um processo menos cruento que a
laparotomia, permitindo a recuperação de oócitos em novilhas e, até mesmo
em bezerras de apenas 3 meses de vida. Entretanto, essa técnica é trabalhosa,
além de ocasionar fibroses e aderências ovarianas após sua utilização.
Segundo Viana et. al. (2003), a técnica de aspiração folicular guiada por
ultra-sonografia surgiu devido à necessidade de um método de colheita de
oócitos menos traumático que os já existentes, como a laparotomia e a
laparoscopia.
Bols et. al. (2005) caracterizaram a aspiração folicular transvaginal com
auxílio do ultra-som como sendo uma técnica pouco invasiva e de alta
repetibilidade.
Becker et. al. (1996) compararam a recuperação de ovócitos via
transvaginal guiada por ultra-sonografia e a técnica utilizando a endoscopia. A
conclusão foi que o uso de equipamentos ultra-sonográficos resultou em uma
melhor qualidade do complexo cumulus-oócitos, possivelmente por causa das
maiores injúrias que a técnica de endoscopia causou.
xxi
2.4 – Quadro atual da OPU
Os parâmetros atuais da aspiração folicular/fertilização in “vitro” são:
média de 10-15 oócitos viáveis por aspiração, resultando em 30-35% de
embriões produzidos, finalizando com 30-40% de vacas prenhes. Em outras
palavras, pode-se coletar, em média, por doadora, 10-15 oócitos, com 8 desses
oócitos sendo fertilizados em laboratório e 2-3 atingindo estágio de
transferência para as receptoras, resultando em uma prenhez por semana
(CENATTE EMBRIÕES, 2006).
Merton et. al. (2003) relatam que a produção de embriões “in vitro”, após a
recuperação oocitária transvaginal, tem atingido um estágio de rotina de 5 a 8
embriões por sessão.
Para Gonçalves et. al. (2001), na multiplicação de doadoras de alto valor
zootécnico, a técnica da OPU pode atingir uma produção de cerca de 25 crias
de uma única fêmea, no período de um ano, o que ultrapassa, de forma
significativa os índices da transferência de embriões. A técnica de aspiração
folicular permite a recuperação de 60 % dos folículos puncionados, obtendo-se,
de cada doadora, a média de 14 ovócitos, 2 embriões e 1 gestação por
semana.
Após a colheita de ovócitos, cerca de 30% submetidos ao processo de
maturação “in vitro”, alcançam o estádio de blastocisto, havendo oscilações
xxii
desses resultados, com uma variabilidade entre 5% e 60% (GONÇALVES et.
al., 2001).
Hafez e Hafez (2004) afirmam que a OPU fornece de 4 a 8 oócitos por
coleta e pode, futuramente, ser uma alternativa para superovulação.
De acordo com Viana (2006), nos últimos 5 anos o cenário de PIVE sofreu
uma grande mudança no Brasil. Laboratórios comerciais começaram a ter
sucesso real e se multiplicaram, e a quantidade de embriões produzidos “in
vitro” saltou de números inexpressivos em 1998, para mais de 100.000 no ano
de 2005. O Brasil tornou-se o país com o maior volume de transferências de
embriões PIVE no mundo e, consequentemente, referência mundial na técnica.
Ainda segundo Viana (2006), dois fatores contribuíram para esse quadro
atual: o primeiro está relacionado a conjuntura de mercado altamente favorável,
na qual se associaram os altos preços alcançados pelos chamados “animais de
elite” das raças de corte, ou seja, um mercado de genética aquecido, com uma
demanda reprimida por animais de genética superior, principalmente tourinhos,
devido à larga utilização da monta natural nas grandes fazendas de gado de
corte. Outro fator foi o sistema de produção no qual as limitações da técnica
utilizada como alto preço, riscos potenciais à doadora, maior potencial de
nascimentos de crias do sexo masculino e dificuldade de criopreservação
foram compensadas pelo fator escala e por algumas características fisiológicas
do rebanho zebu.
No continente europeu, no ano de 2000, 10% (número igual a 15.395) do
número total de embriões usado para transferências, foram produzidos “in vitro”
xxiii
a partir de oócitos recolhidos pela aspiração folicular transvaginal (LOPES e
CALLESEN, 2001).
2.5 - Utilização da OPU
De acordo com a Cenatte Embriões (2006), a aspiração folicular guiada
por ultra-sonografia permite várias aplicações das quais podem se citadas: uso
em doadoras vazias com ou sem problemas reprodutivos; uso em doadoras
que
não
respondem
a
superovulação; uso
em
vacas
refratárias a
superovulação que respondem bem a essa técnica; uso em doadoras prenhes
que podem ser aspiradas até 3-4 meses de gestação (isso se os ovários
estiverem acessíveis, visto que ocorre um deslocamento para a cavidade
abdominal dessas estruturas dificultando a sua localização, existindo, nesses
casos, o risco de aborto); uso em doadoras pós-parto com 20-30 dias de
paridas; pode ser usada em novilhas de até cinco meses apesar desses
animais apresentarem baixa produção de ovócitos e menor produção
embrionária; uso em doadoras que serão sacrificadas por aparecimento de
doença ou por acidentes.
Segundo a Brasgen (2006), a aspiração folicular transvaginal pode ser
aplicada em fêmeas pré-púberes, gestantes até 90 dias e doadoras vazias.
Pode-se, ainda, utilizar essa técnica em doadoras que estão prestes a morrer.
Os ovários devem ser retirados e colocados em solução salina a 35°C. É
conveniente, nesse caso, realizar a superovulação previamente ao abate do
animal para aumentar a quantidade de oócitos recuperados. Os ovários
xxiv
extraídos na doadora abatida devem chegar ao laboratório no máximo 8 horas
após ter sido retirado.
De acordo com Carter et. al. (2002), pode-se realizar a OPU em curto
espaço de tempo após a parição da doadora. Segundo esse autor o período
pós–parto mínimo necessário para realizar a aspiração é de 40 dias.
Para Hafez e Hafez (2004), a OPU transvaginal guiada por ultrasonografia pode ser empregada em doadoras vivas com intervalo semanais.
2.6 - Pré-requisitos para realização da OPU
2.6.1 – Seleção do folículo
Bols et. al. (2005) salientaram que a relação entre o diâmetro folicular e a
qualidade do ovócito dentro do complexo cummulus-oócito (CCO), parece ter
grande importância na seleção dos folículos. Arlotto et. al. (1995) constataram
a presença de ovócitos em folículos de variados tamanhos. Fair et. al. (1995)
obtiveram uma baixa correlação positiva entre o diâmetro do oócito e o
tamanho do folículo.
Lonergan et. al. (1994) encontraram CCO´s de primeira qualidade (com
muitas camadas de células do cummulus) e com elevado número de
blastocistos, a partir de oócitos advindos de folículos maiores de 6 mm de
diâmetro. Isso foi confirmado por Pavlok et. al. (1992) e Blondin and Sirard
(1995), os quais documentaram um baixo desenvolvimento em oócitos
originados de folículos com diâmetro menores do que 2-3 mm.
xxv
Segundo Bols et. al. (2005), quando se realiza o procedimento de
aspiração folicular guiada por ultra-sonografia em programa comercial de
produção de embriões, é comum todos os folículos serem puncionados com o
intuito de maximizar o rendimento de oócitos obtidos.
Hafez e Hafez (2004) classificam os folículos da seguinte forma:
saudáveis não-atrésicos (uniformemente brilhante, translúcido, vascularização
extensiva, camada granulosa normal, ausência de partículas flutuando no fluido
folicular, teca interna de rosa a vermelho), ligeiramente atrésicos (ligeira perda
de translucidez, ligeiramente acinzentado), intermediário (teca interna branca,
poucas partículas flutuando na cavidade folicular), atrésico (cinza escuro
pobremente vascularizado, vasos sanguíneos vazios ou irregularmente
preenchidos com sangue coagulado, membrana granulosa destacada,
partículas livres na cavidade antral).
Castilho e Garcia (2005) relatam que o oócito para ser fertilizado “in vivo”
deve ser doado pelo folículo saudável, durante uma fase específica do ciclo
estral. Ao passo que os ovócitos colhidos para a produção “in vitro” são obtidos
de folículos em diferentes etapas do desenvolvimento e em fases distintas do
ciclo estral, consequentemente, expostos às diferentes concentrações de
estradiol, progesterona, LH e FSH. Estes fatores podem influenciar na
competência do oócito para se desenvolver em embrião “in vitro”. Ainda são
escassos os estudos afirmando o momento exato para se realizar a OPU, com
o intuito de obter os melhores oócitos.
2.6.2 - Fatores Biológicos que influenciam a OPU
xxvi
2.6.2.1 - Freqüência e momento da OPU
Para a Cenatte Embriões (2006), as aspirações foliculares podem ser
empregadas semanalmente, mas preconiza-se que sejam realizadas de 15 em
15 dias, devido ao processo inflamatório dos ovários, oriundo da punção. Os
riscos de lesões são menores quando se proporciona um período de
recuperação adequado para os ovários.
Segundo Boni et. al. (1997), a técnica de aspiração por ultra-sonografia
pode ser utilizada em intervalos tão curtos como dois a três dias.
De acordo com Ball et. al. (2006), realizar duas aspirações por semana
pode ser melhor do que uma vez apenas, visto que é mais provável apropriarse antecipadamente de um folículo dominante, evitando-se, assim, com sua
colheita, que tal folículo impeça o desenvolvimento dos demais.
Goodhand et. al. (1999) encontraram, em seu estudos, que punções duas
vezes por semana, e não apenas uma vez, dobraram o número de embriões
transferíveis produzidos.
A Brasgen (2006) afirma que podem ser realizadas sessões a cada 7 ou
15 dias sem que ocorra lesões aparentes a sobrevida da doadora. Pieterse
et.al. (1991) puncionaram folículos durante diferentes estágios do ciclo estral,
por um período de 3 meses. Vos et. al. (1994) recuperaram cinco vezes mais
complexos cummulus-oócitos, 22 horas após o pico de LH comparado a
recuperação bem próxima ao aumento de LH.
xxvii
Hendriksen et. al. (2004) constataram, em seu estudos, que a proporção
de oócitos de boa qualidade foi superior para vacas aspiradas no dia 5 do ciclo
estral, quando comparada com as vacas aspiradas no dia 8, enquanto que o
folículo dominante teve sua competência reduzida durante o desenvolvimento
dos ovócitos de folículos subordinados, até mesmo em estágios relativamente
tardios de dominância.
Van der Schans et. al. (1991) puncionaram uma grande quantidade de
folículos e recuperaram mais complexos cummulus-oócitos em vacas
estimuladas, quando os ovários foram puncionados duas vezes, e não uma vez
por semana.
A freqüência não afetou nem o número de folículos aspirados e nem o
número de complexos cummulus-ovócitos coletados por sessão, concluindo-se
que as aspirações de folículos parecem induzir e sincronizar as ondas
foliculares (GARCIA e SALAHEDDINE, 1998).
Os pesquisadores, em sua maioria, concordam que o sistema de coleta
de ovócitos realizado duas vezes por semana tem um efeito positivo no número
de folículos disponíveis por punção e no número de blastocistos em cultivo
(GIBBONS et. al, 1994; e, SIMON et. al., 1993).
Para Bergfelt et. al. (1994), pode-se assumir que o folículo dominante é
retirado durante cada sessão onde a doadora é submetida a 2 aspirações por
semana, estimulando, dessa forma, uma onda de pequenos folículos para o
crescimento.
Outros trabalhos tem documentado ótimos resultados com um intervalo de
7 dias entre sessões de aspiração folicular (IMAI et. al., 2000).
xxviii
Para Gonçalves et. al. (2001), a punção folicular pode ser feita em 2
sessões semanais, por alguns meses, sem prejudicar o futuro desempenho
reprodutivo da doadora.
Segundo Seneda et. al. (2002), a dinâmica folicular tem sido analisada na
tentativa de se estabelecer relações que permitam melhor aproveitamento dos
oócitos. Encontrou-se um número maior de embriões após o cultivo de oócitos
recuperados entre os dias 14 e 16 do ciclo estral. Entretanto, outros estudos
demonstraram que a produção “in vitro” de embriões não era afetada pela
presença ou ausência do folículo dominante.
Ainda de acordo com Seneda et. al. (2002), a literatura é escassa quanto
à influência do diâmetro do folículo sobre a qualidade e competência do oócito
para o desenvolvimento, quando o oócito é obtido pela aspiração folicular
guiada por ultra-som. O que se pode constatar, atualmente, é que melhores
índices de desenvolvimento de embriões são oriundos de folículos maiores do
que 6 mm, quando comparados com oócitos de folículos menores. Entretanto,
vários artigos afirmam que há menor recuperação de oócitos quando há o
predomínio de grandes folículos no momento da aspiração, ao passo que
ocorre maior taxa de recuperação quando os folículos aspirados apresentamse pequenos (2 a 6 mm).
A relação inversa entre maior diâmetro folicular e a taxa de recuperação
de ovócitos por sessão, tem sido justificada de diversas formas, como
alterações morfológicas no complexo cummulus-oophorus, viscosidade do
fluido folicular e quantidade de material a ser aspirado e pressão intrafolicular,
xxix
apesar de que, quanto maior o diâmetro mais fácil à aspiração (SENEDA et. al.,
2002).
Goto et. al. (1995), estudaram a freqüência da OPU e concluíram que a
aspiração folicular duas vezes por semana, sem tratamento com FSH, pode ser
utilizada na prática de aspiração de oócitos bovino Isto porque uma maior
quantidade de transferências de embriões pode ser gerada com duas
aspirações por semana, se comparado a uma aspiração apenas..
Para Carter et. al. (2002), a técnica de aspiração folicular utilizando-se o
ultra-som, pode ser realizada de 4 a 6 vezes por mês, ou até mais.
Segundo Getz et. al. (2000), coletando-se oócitos pela técnica de OPU
por um período de 6 meses, pode-se obter até 50 embriões.
2.6.2.2 - Fisiologia e condição corporal da doadora para OPU
De acordo com Hafez e Hafez (2004), o ovário mamífero contém milhares
de oócitos. Entretanto, os ruminantes domésticos liberam apenas um ou dois
oócitos, por ciclo estral.
A aspiração folicular tem como foco principal a sua utilização em
programas reprodutivos de gado envolvendo novilhas sadias com ótimas
características. Contudo, pode-se obter ovócitos de fêmeas prenhes até os três
meses de gestação, mesmo após tratamento com FSH, embora isso não
aumente sempre a quantidade de oócitos recuperados (BUNGARTZ et. al.,
1995).
xxx
Dominguez (1995) encontrou uma quantidade inferior de folículos grandes
e médios em vacas prenhes, quando comparadas às vacas cíclicas.
Argov et. al. (2004) constataram um aumento na quantidade de oócitos
obtidos com menor número de aspirações por sessão, em doadoras no início
da lactação.
Segundo Ruiz et. al. (1996), a subnutrição teve uma influência negativa na
competência do desenvolvimento de ovócitos “in vivo”, ilustrada pela
diminuição do número de blastocistos em vacas com escore de condição
corporal diminuída e um aumento da proporção de oócitos de boa qualidade,
com o aumento do escore de condição corporal.
Leroy et. al. (2004) afirmaram que alterações metabólicas encontradas no
soro de vacas de leite de alta produção, logo após o pós-parto, são refletidas
no fluido folicular do folículo dominante, provavelmente afetando a competência
do desenvolvimento do oócito.
Ainda de acordo com Leroy et. al. (2005), vacas de alta produção leiteira,
quando estão no balanço energético negativo ou apresentam vulnerabilidade a
alterações metabólicas, tem na coleta de oócitos pela OPU seus oócitos
afetados, levando-os a falha na competência do desenvolvimento.
2.6.2.3 - Tempo de transporte dos oócitos coletados pela OPU
O período de tempo entre a aspiração e o transporte para o laboratório
interfere no processo de PIVE. É aconselhável que o período limite seja de 8
xxxi
horas entre a colheita dos oócitos e a colocação desses oócitos na estufa.
Após esse período os índices de fertilidade cairão (BRASGEN, 2006).
No sistema de produção “in vitro” de embriões, o período compreendido
entre a recuperação dos oócitos e seu processamento no laboratório, assim
como as condições de armazenamento durante o transporte, afetam a sua
capacidade de desenvolvimento (SCHWARTZ et. al., 1998).
Segundo Pinto et. al. (2002), a manutenção de oócitos bovinos pode ser
feita com sucesso em líquido folicular eqüino ou bovino por 6 horas, a 30°C,
antes da sua maturação por 18 horas, para a produção “in vitro” de embriões.
2.6.2.4 - Raça, idade e individualidade da doadora submetida a OPU
Um dos fatores que interferem na produção de embriões e prenhez na
PIVE é a individualidade da própria doadora. Existem doadoras que possuem
uma grande quantidade de folículos em desenvolvimento nos ovários,
enquanto existem outras que possuem pouca ou nenhuma atividade ovariana
(CENATTE EMBRIÕES, 2006).
Bols et. al. (2005) relataram que raças européias mostraram um número
de folículos maior quando comparadas às raças zebuínas, enquanto que não
se detectou diferenças na proporção de oócitos normais.
De Armas et. al. (1994) relataram que as raças Holandesas geraram uma
maior quantidade de complexos cummulus-oócitos por ovário, embora
apresentassem menores taxas de clivagem, sendo que os animais mestiços
(Zebu x Holandês) originaram as mais altas proporções de blastocistos.
xxxii
A utilização da aspiração folicular em doadoras jovens é limitada por
causa das pequenas dimensões da pélvis. Novilhas podem ser submetidas à
punção folicular, a partir da idade de 6 a 8 meses, dependendo das dimensões
dos transdutores e sonda intravaginais utilizadas (BOLS et. al., 2005).
Um dos maiores problemas de doadoras pré-puberes é a diminuição da
capacidade de desenvolvimento dos oócitos “in vitro” (TANEJA et. al., 2000).
De acordo com Hafez e Hafez (2004), os ovócitos podem ser coletados “in
vivo” de bezerras, por meio de laparoscopia ou laparotomia por aspiração
folicular. Todavia, a aspiração folicular transvaginal com orientação ultrasonográfica não foi eficaz em bezerras com menos de 6 meses, pelo motivo do
pequeno tamanho da vagina e da dificuldade de manipulação retal.
Ainda segundo Hafez e Hafez (2004), pode-se esperar que embriões de
PIVE obtidos pela coleta de ovócitos de bezerras de 10 a 12 semanas,
resultem em 8 a 10 gestações. Portanto, doadoras jovens não apenas
oferecem uma fonte alternativa de embriões, como reduzem o intervalo entre
gerações.
Malard et. al. (2001) concluíram em seus estudos que o índice de
recuperação de ovócitos em bezerras Nelore entre 2 e 3 meses foi satisfatório
(média de 25 ovócitos por bezerra), possuindo, assim, elevado potencial como
doadoras. Contudo, a qualidade se mostrou ruim, sendo necessários novos
estudos com o intuito de se obter melhores resultados.
Os folículos surgem no ovário do feto bovino entre 220 e 240 dias de
gestação. Ao nascer, a bezerra possui de 75.000 a 300.000 ovócitos. Apesar
de nenhum folículo ser visível macroscopicamente ao nascimento, aos 5 dias
xxxiii
de vida já existem folículos de 5 mm. Devido a senescência, no decorrer da
vida dos animais, os ovários de bezerras contêm muito mais folículos visíveis
na superfície do que os de vacas (SNEL-OLIVEIRA et. al., 2003).
Também de acordo Snel-Oliveira et. al. (2003), citando Erickson (1966),
constataram que os folículos alcançam um quantidade máxima aos 4 a 6
meses de idade, decrescem até os 7 a 8 meses (puberdade) e permanecem
constante desta idade até 10 a 14 anos.
Segundo Majerus et. al. (1999), oócitos podem ser coletados por repetidas
sessões de OPU em bezerras com 7 a 12 meses de idade, sem afetar o
crescimento ou interferir na puberdade dessa classe de animais.
2.6.2.5 – Estimulação ou não estimulação antes da OPU
De acordo com Ball et. al. (2006), coletas programadas para coincidir com
a ocorrência natural do desenvolvimento das ondas foliculares, podem
proporcionar um número aumentado de oócitos sem a necessidade de
tratamentos hormonais de superovulação. Todavia, a estimulação ovariana
com FSH três dias antes da aspiração pode ser benéfica.
Goodhand et. al. (1999) reportaram que a produção de embriões
transferíveis de aspirações semanais foi dobrada quando utilizado o tratamento
com o FSH e foi semelhante à produção das coletas duas vezes no mesmo
período sem o tratamento com o FSH.
xxxiv
Segundo Roth et. al. (2001), tanto o pré-tratamento com somatotropina
bovina (BST) melhorou a morfologia dos oócitos, quanto o pré-tratamento com
FSH melhorou a morfologia e a taxa de clivagem.
Para a Brasgen (2006), drogas para a superovulação não se fazem
necessárias para a recuperação de oócitos, caso a doadora esteja ciclando
normalmente, mas podem ser usadas para aumentar a eficiência. Em
condições normais à doadora irá apresentar de duas a três ondas de
crescimento folicular por ciclo. A média obtida para cada aspiração folicular
transvaginal, em ambos os ovários, é de 20 oócitos viáveis.
A recuperação de oócitos, durante a vida da fêmea doadora, possibilita
modificações endocrinológicas na atividade ovariana da vaca, previamente a
recuperação de oócitos, influenciando na quantidade e qualidade dos
complexos cumulus-oócitos recuperados (BOLS et. al., 2005).
Pieterse et. al. (1991) afirmaram que a aspiração folicular repetida é
possível em doadoras não estimuladas, ou em todas as situações onde
folículos maiores de 2 mm estiverem presentes. Baixa atividade folicular
precisa ser estimulada em algumas doadoras, usando-se, predominantemente,
combinações de FSH-LH ou gonadotrofinas do soro de éguas prenhes (PMSG,
eCG).
O uso de hormônios é uma prática difundida em programas de
transferência de embriões. Sua utilização em programas de aspiração folicular
necessita modificações nas doses e no momento do tratamento. O objetivo
final da estimulação hormonal antes da punção folicular é gerar um maior
número de folículos e não de ovulações (BOLS et. al., 2005).
xxxv
Pieterse et. al. (1988) encontraram taxas mais elevadas de recuperação
em doadoras tratadas com PMSG, sendo seus ovários maiores e com uma
maior quantidade de folículos, quando comparados a animais não estimulados.
Looney et. al. (1994) relataram um aumento na quantidade de folículos
puncionados e oócitos recuperados após o tratamento com FSH.
Stubbing e Walton (1995) não encontraram diferenças no número médio
de folículos disponíveis para punção realizada a cada semana, entre vacas não
estimuladas, vacas aspiradas duas vezes por semana e vacas estimuladas
com FSH, sendo aspiradas uma única vez.
Mudanças súbitas em dosagem de FSH influenciaram os tamanhos, mas
não o número de folículos, as quais foram meramente influenciadas pelas
doadoras e pelas sessões de aspiração folicular (DE ROOVER et. al., 2005).
Os tratamentos com FSH podem induzir uma assincronia entre a
maturação do oócito e seu ambiente folicular ou entre maturação nuclear e
citoplasmática, resultando em redução das taxas de desenvolvimento
(BOUSQUET et. al., 1995).
Bols et. al. (2005) realizaram experimentos com BST e constataram que
ocorreu um aumento no número total de folículos no grupo tratado com tal
hormônio, não ocorrendo aumento no número de oócitos recuperados.
Murakami et. al. (2003) constataram um efeito positivo das combinações
de FSH e BST no número de folículos puncionados e na recuperação de
oócitos viáveis.
xxxvi
Para Bols et. al. (2005), é muito provável que a estimulação hormonal e a
freqüência da aspiração transvaginal estejam relacionadas, determinando a
produtividade final de embriões.
Goodhand et.al. (1999) concluíram que o tratamento de doadoras com
FSH aspiradas uma vez por semana, produziu um número similar de embriões
transferíveis por doadora por semana, como encontrado em aspirações
realizadas duas vezes por semana, sem tratamento com FSH.
Para Viana et. al. (2003), uma alternativa para contornar os efeitos
negativos do estabelecimento de um folículo dominante sobre a recuperação
de ovócitos por aspiração folicular é o tratamento com FSH exógeno. O FSH
eleva o número e o diâmetro médio dos folículos disponíveis para punção e
retarda a seleção do folículo dominante e a atresia dos subordinados. Os
efeitos da pré-estimulação ovariana pela administração de FSH sobre os
resultados de aspiração folicular, entretanto, sofrem variância, resultando ou
não em aumento da quantidade de oócitos recuperados ou embriões
produzidos por doadora por semana.
Viana et. al. (2003) concluíram em seus estudos que a pré-estimulação
ovariana com FSH mostrou ser uma alternativa para melhorar a qualidade
morfológica,
mas
não
a
quantidade
de
complexo
cummulus-ovócito
recuperados por punção folicular.
Seneda et. al. (2002) citam que, na literatura, pode-se encontrar trabalhos
preconizando o melhor dia de punção folicular como sendo quatro, cinco e
mesmo seis dias após o início da utilização do FSH.
xxxvii
2.6.3 - Fatores Técnicos que influenciam a OPU
A taxa de sucesso da aspiração folicular é medida parcialmente pela taxa
de recuperação (RR= número de oócitos a cada 100 folículos aspirados), a
qual é, entre outros fatores, influenciada pela visualização dos oócitos, pelo
diâmetro da agulha, pelo nível de vácuo da aspiração e pela experiência do
técnico operador. A taxa de recuperação tem variado entre 7% e 69,6% (BOLS
et. al., 2005).
Ainda segundo Bols et. al. (2005), o sucesso de qualquer técnica de
reprodução assistida é medido pelo número de bezerros produzidos.
2.6.3.1 - Materiais utilizados na OPU
Mendes (2005) descreve que, para a realização da técnica de punção
folicular utilizando ultra-som, o técnico deve possuir uma agulha (18 G e 58 cm)
acoplada a uma bomba de vácuo, guiada por ultra-sonografia transvaginal.
Ball et. al. (2006) consideram como equipamentos necessários para a
OPU, um ultra-som cujo transdutor possua uma cânula de aspiração.
A Brasgen (2006) trabalha com um transdutor vaginal associado a uma
agulha descartável acoplada a um sistema de vácuo entre 90 e 120 mmHg. O
material aspirado é colocado em um tubo com PBS (solução salina tamponada)
e anti-coagulante. Os ovócitos são selecionados e capturados com micropipeta
e colocados em criotubos.
xxxviii
Atualmente diversos avanços têm sido realizados na tecnologia de ultrasom, aumentando a resolução de imagem e a qualidade da visualização dos
ovários. Além disso, outros transdutores de ultra-som foram testados
recentemente para o uso na aspiração transvaginal. Um transdutor linear
(Esaote/Pie Medical, Maastricht, Netherlands) acoplado a uma probe transretal
padrão utilizada rotineiramente, pode ser adequada para a aspiração
transvaginal, principalmente, quando for utilizada por técnicos experientes
(BOLS et. al., 2005).
Para Bols et. al. (2005), a visualização de folículos é melhor realizada
utilizando-se a probe de múltipla angulação mecânica (Esaote/Pie Medical,
Maastricht, the Netherlands).
Uma agulha bem afiada é fundamental para a realização adequada da
aspiração (SCOTT et. al., 1994).
Segundo Simon et. al. (1993), uma desvantagem das agulhas longas e
não descartáveis é que elas se tornam rombas rapidamente e necessitam ser
afiadas regularmente, embora não adquiram mais sua condição inicial.
Bols et. al. (2005) adaptaram o sistema de aspiração ao uso de agulhas
de injeção hipodérmicas, mais baratas, e utilizando a combinação de uma
probe setorial de angulação múltipla a uma área de “scanning” unilateral,
acoplado ao novo sistema guiado por agulhas descartáveis. Tal sistema
resultou em 80-90% de complexo cummulus-oócitos recuperados, envoltos
pelo revestimento do cummulus compacto, após a aspiração. Por sua vez, 1020% encontraram-se microscopicamente afetados pelo procedimento da
punção folicular, sendo as células do cummulus parcialmente ou totalmente
xxxix
removidas, prejudicando, desta maneira, o potencial de desenvolvimento do
oócito “in vitro” (ZHANG et. al., 2005).
A pressão precisa da punção folicular, na ponta da agulha, é influenciada
pela construção do aparato, do comprimento e diâmetro do sistema de tubos,
bem como do diâmetro da agulha. A aspiração de vácuo é medida em ml ou
mmHg, sendo preferível a de ml (BOLS et. al., 2005).
Bols et. al. (2005), ainda, demonstraram que altas taxas de recuperação
foram encontradas com agulhas mais largas (18 G), independente da pressão
de vácuo utilizada, enquanto outros estudos demonstraram a recuperação de
um maior número de ovócitos utilizando-se um vácuo de aspiração mais forte.
A percentagem de recuperação do complexo cummulus-ovócito intactos
diminuiu progressivamente, assim que o vácuo de aspiração aumentou, sendo
associado a um aumento consistente no número de oócitos desnudos obtidos.
De acordo com Gonçalves et. al. (2001), a técnica de punção folicular
utiliza uma sonda ultra-sonográfica, via vaginal, de maneira a obter imagem do
ovário e dos folículos. Os ovócitos são aspirados pela punção dos folículos com
agulha de lúmen simples acoplado ao tubo ou filtro de colheita por um tubo de
teflon ou silicone. O sistema de aspiração pode ser utilizado com agulha longa
de lúmen duplo, sendo que a lavagem do folículo aspirado é realizada
empregando-se a bomba de vácuo.
Viana et. al. (2003) utilizaram, para realização da OPU, um aparelho de
ultra-som equipado com transdutor setorial intra-vaginal de 7,5 MHz e
dispositivo guia para a punção folicular. Os folículos foram puncionados com
agulha de 19 G e pressão de vácuo de 80 mmHg, correspondendo a um fluxo
xl
de cerca de 14 ml de água/minuto. O líquido folicular aspirado é destinado a
tubos plásticos de 50 ml de DPBS acrescido de soro fetal bovino e heparina,
sendo os oócitos, posteriormente, separados em filtro de coleta de embriões
com malha de 80 μ.
Segundo Antoniolli (2002), utiliza-se, basicamente, como materiais para a
realização da OPU, três componentes: aparelho de ultra-sonografia com
transdutor setorial de 7,5 MHz, bomba de vácuo e sistema condutor da agulha.
Seneda et. al. (2002) relatam que agulhas com diâmetros maiores que 19
G relacionavam-se a maiores taxas de recuperação, embora com maior
percentual de oócitos desnudos, enquanto agulhas de menor diâmetro
apresentavam índices reduzidos de recuperação de oócitos.
Intimamente relacionado com a agulha utilizada está à pressão de vácuo.
Estudos demonstraram que baixas pressões, como 50 mmHg, foram pouco
eficientes para a aspiração, enquanto que pressões maiores com 120 mmHg
danificavam o revestimento do cummulus-oophorus. A pressão de vácuo final é
influenciada por fatores como comprimento e diâmetro de conexões, altura do
equipamento de vácuo e diâmetro da agulha. Para se obter valores mais reais
da pressão de vácuo, recomenda-se que seja utilizada o mensuramento do
vácuo em volume de água por minuto. Mesmo assim, existem variações
consideráveis de 4,4 a 40 ml de água/minuto (SENEDA et.al., 2002).
A freqüência do transdutor constitui-se em variável importante no
processo de recuperação dos oócitos. Há citações de autores que utilizaram
freqüências de 3.5 MHz, 5.0 MHz, 6.5 MHz e 7.5 MHz. A maioria desses
xli
autores cita a utilização de transdutores convexos ou setoriais para a OPU,
com poucos relatos de transdutores lineares (SENEDA et. al., 2002).
2.7 - Procedimentos básicos para realização da OPU
Segundo Goddard (1995), são necessários dois operadores para
realização da técnica da OPU. Um para checar o visor do ultra-som e
manipular o transdutor e outro para manipular a inserção da agulha e aspirar.
Para Mendes (2005), a doadora deve ser inicialmente, colocada no brete.
Em seguida, é feita anestesia epidural (associação de 4 ml de lidocaína e 1 ml
de acepromazina). Depois de aplicada a anestesia epidural, lava-se a vulva da
doadora com água corrente e seca-se com papel toalha. O passo seguinte é a
introdução da sonda do ultra-som na vagina da vaca. Com uma das mãos
introduzida no reto faz-se a localização do ovário e posiciona-se esse ovário o
mais perto possível da sonda, que se encontra no assoalho vaginal. Através de
um pedal aciona-se a bomba de vácuo e, logo em seguida, a punção folicular é
iniciada. Os ovócitos e líquidos foliculares coletados são destinados a um tubo
de 50 ml, para posterior análise. O tubo onde são depositadas as estruturas
encontradas contém heparina, para evitar a coagulação (causada pela
presença do sangue) do material aspirado.
Ainda segundo Mendes (2005), após realizada a aspiração e coletados os
ovócitos,
o tubo onde eles se encontram são levados para um laboratório
montado na própria fazenda ou para um laboratório especializado. É importante
o isolamento do tubo de raios solares. No laboratório o conteúdo é despejado
xlii
em um filtro e são realizados lavados repetidas vezes, com solução salina
(PBS). Utiliza-se uma placa de petri para despejar o liquido que é,
posteriormente, rastreado com o auxílio de uma lupa, à procura de ovócitos. Os
ovócitos encontrados são transferidos para uma placa de petri menor, contendo
meio de lavagem (LAV). Em seguida, coloca-se esses ovócitos em pequenos
tubos eppendorf, contendo meio de transporte (MIVT). Os tubos de eppendorf
são colocados em uma garrafa térmica para serem transportados para o
laboratório e dar prosseguimento as etapas da PIVE.
Ball et.al. (2006) relataram que o procedimento para punção folicular “in
vivo” auxiliada pela ultra-sonografia, envolve, inicialmente, a anestesia epidural
da doadora. Em seguida, o transdutor é introduzido na vagina e o ovário que irá
ser aspirado é movido através do reto para a posição imediatamente anterior
ao fórnix vaginal. Feito isso, os folículos podem ser visualizados e a cânula
pode ser usada para passar uma agulha (ecogênica) através da parede vaginal
dentro do ovário. Os folículos escolhidos são posicionados e aspirados por
intermédio de um vácuo acionado pelos pés. O nível de vácuo utilizado
representa um equilíbrio entre a necessidade de recuperar o oócito e a
manutenção da integridade de suas células do cumulus que o rodeiam.
Para a Brasgen (2006), o procedimento de aspiração folicular guiada por
ultra-som é realizado utilizando-se um transdutor vaginal contendo uma agulha
descartável, acoplada a um sistema de vácuo entre 90 e 120 mmHg. Os
líquidos foliculares e os ovócitos aspirados são colocados em um tubo com
PBS adicionado a um anti-coagulante. A manipulação e o posicionamento dos
ovários são realizados, por um técnico, pela palpação retal, estando a doadora
xliii
devidamente contida em um brete, asseada na região perineal e sob anestesia
epidural. Depois de coletados os oócitos ocorre o selecionamento e a captura
desses oócitos. Com o auxílio de uma micropipeta coloca-se os ovócitos em
criotubos, contendo meio próprio para transporte, e encaminha-se esses
criotubos com os ovócitos para o laboratório.
Lopes e Callesen (2001) relatam a técnica da seguinte forma: o operador
introduz a sonda, coberta por uma camisa sanitária e gel, lenta e
cuidadosamente, na vagina da doadora, inserindo essa sonda o mais
profundamente possível. Cada ovário é manipulado transretalmente e
direcionado para a cabeça da sonda. Sendo assim, os ovários e folículos são
claramente visíveis no monitor do ecógrafo. O sistema de guia da agulha
(previamente mergulhado em meio de aspiração) é introduzido, por um
assistente, na armação da sonda. Logo em seguida, a sonda é posicionada de
forma a que a linha de punção, visível no monitor do ecógrafo, atravesse o
folículo a ser aspirado. A agulha é, então, inserida no folículo, através da
parede vaginal e rodada lentamente. O conteúdo folicular é puncionado e
recolhido em um receptáculo. Para puncionar o folículo seguinte, a agulha é
ligeiramente retraída e a sonda redirecionada, sendo o novo folículo
atravessado pela linha de punção. Quando a aspiração está completa, o
sistema de guia da agulha é removido da armação da sonda e mergulhado
novamente no meio de aspiração. Finalmente, procede-se a remoção do
sangue do fluido aspirado, usando para tal finalidade um filtro de embriões. O
fluido, filtrado, é transportado para o laboratório, onde é transferido para uma
xliv
placa de Petri. A pesquisa dos oócitos é efetuada em seguida com o auxílio de
um estereomicroscópio.
Ainda segundo Lopes e Callesen (2001), o procedimento de aspiração
dos folículos pode ser realizado o número de vezes necessário para o
recolhimento dos oócitos de todos os folículos visíveis, em ambos os ovários.
Entretanto, o tempo total de uma sessão de OPU, em uma novilha ou vaca,
não deve ultrapassar os 10-15 minutos.
De acordo com Hafez e Hafez (2004), no procedimento de OPU deve-se
inserir o transdutor na vagina da doadora e o ovário deve ser fixado por
palpação retal. Quando a imagem ultra-sonográfica do folículo está posicionada
com a linha de punção do monitor, a cânula de aspiração é introduzida através
da parede vaginal, em direção à cavidade do folículo ovariano, para aspirar o
conteúdo folicular.
Antoniolli (2002) relata a técnica da seguinte maneira: realiza-se a
sedação da doadora e a analgesia (via epidural), limpa-se e desinfecta-se a
área perineal, realiza-se a introdução do transdutor conectado ao sistema
condutor da agulha. O ovário é posicionado (pela palpação retal) na
extremidade do transdutor e os folículos são visualizados na tela do aparelho.
Um segundo operador realiza a introdução da agulha, que pode ser
acompanhada pelo visor do ultra-som, bem como a aspiração do conteúdo
folicular. A agulha é ligada a bomba de sucção, que aspira o fluído folicular e o
oócito e os depositam em um recipiente contendo PBS modificado, acrescido
de 1 % de soro fetal bovino e aproximadamente 0,1 % de heparina.
xlv
Posteriormente, os ovócitos são identificados e transferidos para placas de
maturação, fecundados e cultivados.
2.8 - Classificação morfológica dos ovócitos coletados pela OPU
Segundo Seidel et. al. (1989), os bovinos nascem com cerca de 100.000
oócitos no ovário.
Para Snel-Oliveira et. al. (2003), os ovócitos podem ser considerados
como o tipo celular mais raro existente no organismo, pois além de seu estoque
não ser renovável, em condições normais, menos de 0,1 % dos folículos
chegam a ovular.
Em se tratando de morfologia, os ovócitos de maior potencial de
viabilidade são aqueles que apresentam o plasma homogêneo com
granulações finas, de coloração marrom e completamente envolvido por várias
camadas de células do cumulus dispostas de forma compacta (GONÇALVES,
et. al., 2001).
Continuando Gonçalves et. al (2001), existem várias classificações
morfológicas para seleção dos oócitos bovinos, na tentativa de se identificar os
mais viáveis. A mais utilizada, porém, é a classificação de ovócitos que vai de 1
a 4.
Qualidade 1: Apresenta cumulus compacto e presente, contendo mais de
três camadas de células. O plasma apresenta granulações finas e
homogêneas, preenchendo o interior da zona pelúcida e de coloração marrom.
xlvi
Qualidade 2: Cumulus compacto parcialmente presente ao redor do
ovócito ou rodeando completamente o ovócito, com menos de três camadas
celulares. O plasma apresenta granulações distribuídas heterogeneamente,
podendo essas granulações estarem mais concentradas no centro e mais
claras na periferia ou condensada em só local, aparentando um mancha
escura. O plasma preenche o espaço interno da zona pelúcida.
Qualidade 3: O plasma apresenta-se contraído, com espaço entre a
membrana celular e a zona pelúcida, preenchendo de forma irregular o espaço
perivitelino, degenerado, vacuolizado ou fragmentado. O cumulus está
presente com duas camadas ou menos.
Qualidade 4: Ovócito desnudo, com ausência de cumulus ou presença de
cumulus expandido.
A disponibilidade de oócitos de “boa” qualidade é um dos pré-requisitos
mais importantes para o sucesso (BOLS et. al., 2005).
Segundo Konishi et. al. (1996), não se deve subestimar a importância da
integridade das células do cummulus para a maturação oocitária e para o
desenvolvimento “in vitro”.
Oócitos desnudos apresentam uma taxa de fertilização significativamente
inferior quando comparados aos CCO´s com um cummulus denso, gerando
altas taxas de clivagem (SHIOYA et. al., 1998).
Oócitos bovinos imaturos são divididos em diferentes categorias de
qualidade, tendo como base a avaliação da compactação das células do
cummulus e a transparência do citoplasma observada através da microscopia
de luz (HAZELEGER et. al., 1995).
xlvii
Oócitos de boa qualidade apresentam um ooplasma homogêneo e são
circundados por uma multicamada compacta de revestimento do cummulus.
Quanto menos compacta as células do cummulus, maior a irregularidade do
citoplasma e pior a qualidade (BOLS et. al., 2005).
Blondin e Sirard (1995) mostraram que, oócitos com sinais de expansão
inicial das camadas exteriores das células do cummulus e com ooplasma
levemente granulado, desenvolveram-se de forma mais significativa, além do
estágio de 16 células, quando comparados a outros oócitos.
Hafez e Hafez (2004) classificam os complexos cumulus-ovócito da
seguinte forma: A – mais de 5 camadas de células do cumulus; B – entre 3-5
camadas de células do cumulus; C – entre 1-3 camadas de células do cumulus;
D – oócitos desnudos; E – oócitos com cumulus expandindo ou atrésicos.
2.9 – Vantagens e desvantagens associadas a OPU
2.9.1 - Vantagens
Ball et. al. (2006) afirmam que uma vantagem adicional da aspiração
folicular guiada por ultra-sonografia, é que ela pode ser utilizada durante o
primeiro trimestre da gestação e também nos animais pré-púberes, incluindo
fetos. Os resultados encontrados nos animais pré-puberes são piores e mais
variáveis do que nos animais adultos, mas existe potencial para melhora
substancial no ganho genético através da redução acentuada do intervalo entre
as gerações.
xlviii
Bols et. al. (2005) atribuem como vantagem da aspiração folicular a sua
alta repetibilidade. Ainda para esses autores, constituem vantagens da
aspiração folicular a possibilidade de estimulação ovariana antes da aspiração,
bem como as variações de combinações nos acasalamentos “in vitro” com
oócitos provenientes de uma mesma sessão de aspiração folicular transvaginal
por doadora, abreviando o processo de seleção.
Para Viana e Bols (2005) também são vantagens da OPU o fato de ser
pouco invasiva, não depender de pré-estimulação hormonal, poder ser utilizada
em qualquer fase do ciclo estral, em animais pré-puberes ou em gestação
inicial. Além disso, foi contornado o principal obstáculo ao uso comercial da
fertilização “in vitro”, que era a recuperação de complexos cummulus-ovócitos
em doadoras vivas, sendo considerada a melhor alternativa aos programas
clássicos de produção de embriões por superovulação
2.9.2 - Desvantagens
Consideram-se como desvantagens dessa técnica a possibilidade de
ocorrência de nascimentos de bezerros com o peso acima do normal (síndrome
do bezerro grande). Além disso, podem ocorrer maiores índices de absorção,
natimortos e abortos (CENATTE EMBRIÕES, 2006).
De acordo com Gonçalves et. al. (2001), a punção folicular apresenta
desvantagens como a exigência de uma equipe de trabalho altamente
especializada, equipamentos de elevado custo e com o tempo necessário para
o desenvolvimento da técnica, limitando sua ampla difusão para trabalhos no
xlix
campo. Além disso, ainda são obtidos baixos índices de produção “in vitro” de
embriões, baixa qualidade e congelabilidade dessas estruturas decorrentes da
PIVE, anormalidades fetais associadas à distocia, tempo restrito de transporte
dos ovócitos (cerca de 10-12 horas).
2.10 - Seqüelas associadas a OPU
A ultra-sonografia permite a colheita de oócitos pela utilização de um
sistema de biópsia por agulha, visto como pouco traumático e que pode se
empregado repetidas vezes em um mesmo animal (VIANA et. al., 2003).
Viana et. al. (2003), ainda, observaram, em seus estudos, uma baixa
incidência de irritações na mucosa do fundo de saco vaginal posteriormente as
punções. Além disso, não observaram processos clínicos inflamatórios ou
infecciosos em outras regiões da vagina ou no restante da porção tubular do
trato genital. A baixa incidência de alterações na mucosa provavelmente está
relacionada à sua alta taxa de renovação celular, possibilitando maior facilidade
de regeneração após traumas. Em contrapartida ao observado no fundo de
saco, a incidência de alterações de ovário foi significativa, constatando-se
alterações na consistência ou mobilidade dos ovários.
Continuando, Viana et. al. (2003) relacionaram as alterações de
mobilidade e consistência
ovariana com o número de sessões de punção
folicular a que o animal é submetido. Avaliaram o par de ovários de vários
animais e constataram que o grau médio de alterações foi menor nos animais
expostos a menos de 20 sessões de punção.
l
A avaliação macroscópica de ovários puncionados mostrou a presença de
coágulos nos folículos aspirados e variados graus de espessamento do epitélio
ovariano. Os ovários que foram aspirados por um número maior de vezes
tiveram um maior espessamento do epitélio ovariano, dificultando a
visualização externa dos folículos em crescimento. Foram observadas,
também, aderências entre o ovário e as fimbrias da tuba uterina, com provável
comprometimento da fertilidade (VIANA et. al, 2003).
Histologicamente, diferentes alterações morfológicas dos ovários são
observadas, como pontos de perfurações na túnica albugínea, áreas
hemorrágicas, infiltrados de células inflamatórias, fibrose no estroma ovariano,
cicatrizes no trajeto da agulha, folículos com hemorragia interna e diversos
graus de desorganização das camadas da parede folicular. Além disso, podemse encontrar áreas de tecido luteal ou de células luteais dispersas no estroma
ovariano (VIANA et. al., 2003).
Estudos feitos por Becker et. al. (1996) indicaram que o maior problema
do emprego da aspiração guiada por ultra-som era lesar o estroma ovariano,
principalmente em relação aos folículos de menores diâmetros. Outro distúrbio
salientado por esses autores, é a possibilidade da formação de aderências
entre o ovário e a tuba uterina e/ou ligamentos, como conseqüência da
passagem da agulha inúmeras vezes por diversas sessões.
Bols et. al. (2005) relataram ter encontrado em exames post-mortem, em
fêmeas submetidas a aspiração folicular, alterações como engrossamento da
túnica albugínea do ovário e endurecimento do ovário.
li
O número de sessões de aspirações não pode ser apontado como o único
fator causador de lesões no aparelho reprodutivo da fêmea. Outro aspecto
relacionado a lesões está ligado ao tipo de agulha utilizada. São encontrados
diversos tipos de agulha com diferentes calibres 17, 18, 19 e 20, além das
descartáveis ou não. Agulhas de menor calibre apresentam uma área menor de
corte, sendo potencialmente menos danosas ao tecido, enquanto agulhas
descartáveis, por possuírem bisel mais afiado, exercem uma pressão menor
sobre as estruturas aspiradas (BOLS et. al., 1997).
Para a Cenatte Embriões (2006), as lesões ovarianas, lesões de pedículo
e hemorragia interna podem ocorrer após a aspiração folicular, mas a
possibilidade de ocorrer alguma interferência na fertilidade é reduzida.
Pieterse et. al. (1991) não encontraram aderências após a punção
folicular, sugerindo que a técnica não afetaria a fertilidade futura da doadora.
Para Bols et. al. (1998), a aspiração folicular guiada por ultra-som, quando
utilizada repetidas vezes, parece induzir certo grau de aciclicidade, além de
acarretar sinais de cio ocasionais e desenvolver estruturas semelhantes ao
corpo lúteo, a partir do folículo puncionado.
A aspiração folicular auxiliada pelo ultra-som não causou efeitos negativos
exacerbados na arquitetura ovariana e nem na funcionalidade ovariana futura
(PETYIM et. al., 2001).
McEvoy et. al. (2002) concluíram que a função do ovário não foi
comprometida após 13 a 16 aspirações e que, depois de 16 a 20 coletas, não
ocorreu infecção ou inflamação no local da injeção anestésica epidural
associada com a punção folicular.
lii
De acordo com Viana et. al. (2003), as lesões induzidas pelo
procedimento de aspiração folicular guiada por ultra-sonografia, não interferem
diretamente no processo de punção folicular. Entretanto, folículos que
apresentam diâmetros inferiores a 2-3 milímetros podem ser perfurados pela
agulha durante o processo de aspiração, sem que o operador perceba. Isto
pode levar a perda de inúmeros folículos, por sessão.
2.11 - Preços do serviço de OPU
Atualmente, empresas de consultoria reprodutiva que realizam a OPU têm
cobrado, pela sessão de aspiração folicular por vaca, em média R$ 300,00. Os
valores foram obtidos de 5 empresas reconhecidas no Estado de Minas Gerais.
2.12 - Futuras pesquisas para ampliar e maximizar o emprego da OPU
O método de aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-som já está
bem estabelecido (GALLI et. al., 2001).
Para Singh et. al. (2003), melhorias devem ser realizadas em relação a
visualização do folículo, o que resultaria numa maior quantidade de oócitos
recuperados.
Estudos em relação a aspirações rotineiras de folículos pequenos devem
ser realizadas com o intuito de verificar a eficácia na taxa de recuperação de
ovócitos (SENEDA et. al., 2001).
liii
Segundo Bols et. al. (2005), as pesquisas devem ser direcionadas ao
melhoramento do equipamento de ultra-som. Equipamentos como os
desenvolvidos pela empresa Nutricell (Campinas, Brasil), que adaptou um
transdutor (probe) convexo de 7.5 MHz com um ângulo de 150° a um sistema
guiado por agulha descartável.
Pesquisas tem sido desenvolvidas em relação à aplicação de substâncias
intraovarianas utilizando o equipamento de aspiração folicular, com o objetivo
de modular e estudar a atividade ovariana. Substâncias como fator de
crescimento I são aplicadas com a intenção de superar deficiências de
desenvolvimento em oócitos de vacas pré-puberes e FSH tem sido aplicado
diretamente
no
ovário
com
o
objetivo
de
estimulação
ovariana
e
desenvolvimento de folículos. Além disso, técnica de biopsia tem sido
empregada com a finalidade de se definir o número de folículos primordiais em
ovários e estudar os efeitos hormonais sobre o ovário (BOLS et. al., 2005).
Atualmente os equipamentos de ultra-som utilizados na OPU determinam
que apenas folículos em fase antral e apresentando diâmetros superiores a
dois ou três milímetros, podem ser identificados e, consequentemente,
puncionados. Estes folículos representam apenas uma pequena fração do total
de folículos presentes nos ovários. Maximizar o número e a qualidade de
folículos em fase antral e, consequentemente, disponíveis para punção, é uma
das principais estratégias para melhorar a recuperação de complexos cumulusoócitos destinados a FIV, por isso, deve ser fonte de pesquisa e aprimoramento
para a técnica da OPU no futuro (VIANA e BOLS, 2005).
liv
De acordo com Seneda et. al. (2002), deve-se procurar avançar em
relação às técnicas utilizadas na OPU com o intuito de viabilizar a utilização de
animais bastante jovens, para diminuir o intervalo entre gerações, acelerar o
incremento genético e o estudo da competência de oócitos para o
desenvolvimento. Além disso, devem ser feitos estudos de protocolos de
estímulo gonadotrófico e melhorias na viabilidade dos embriões produzidos “in
vitro”.
lv
3 - Conclusão
A biotecnologia conhecida como aspiração folicular transvaginal orientada
pela ultra-sonografia é, entre as técnicas de reprodução assistida, a que tem
proporcionado maior quantidade de crias/vaca/ano. É importante salientar que
a OPU não é um processo isolado, mas, sim, a primeira etapa da PIVE e deve
ser encarada como fundamental para a obtenção de vários produtos ou crias
no final do processo.
São muitos os aspectos que envolvem a OPU e, indubitavelmente, todos
devem ser de compreensão do técnico que irá realizá-la. Qual o melhor folículo
a ser puncionado, quais instrumentos e materiais são necessários para o
emprego da técnica, qual a freqüência e momento de aspiração, qual a
fisiologia e condição corporal da doadora, qual o tempo de transporte dos
oócitos coletados até o laboratório, aspectos ligados à raça, idade e
lvi
individualidade
da
fêmea
doadora,
estimulação
ou
não
estimulação,
classificação morfológica dos ovócitos, vantagens e desvantagens da técnica,
seqüelas causadas pelo procedimento, valores cobrados pela sessão de
aspiração e a técnica de OPU, propriamente dita, são conhecimentos que o
técnico deverá ter previamente ao emprego da aspiração folicular transvaginal
utilizando o ultra-som.
A OPU existe há menos de 20 anos. Portanto, ainda consiste numa
biotécnica jovem, que precisa ser aperfeiçoada para que se possa usufruir
melhor do seu uso, obtendo maior quantidade de crias/vaca/ano. Por isso, é de
grande importância que mais pesquisas sejam realizadas. A utilização da OPU
já ultrapassou a barreira do uso científico e, atualmente, já é utilizada
comercialmente em escala considerável.
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