GRUPO HOSPITALAR CONCEIÇÃO
HOSPITAL NOSSA SENHORA DA CONCEIÇÃO
LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
VÍRUS RESPIRATÓRIO
ASPIRADO DE NASO-FARINGE
Imunofluorescência indireta
PVR
Elaborado por: Rosemeri Lugoch
Procedimento Operacional Padrão
Data da 1ª versão: 26/02/07
Versão 2.0
Data da efetivação: 26/05/14
POP n.º: I 44
Página 1 de 7
Revisado por: Tatiana Baccin
Aprovado por: Mara Rieck Silveira
1. Sinonímia
Pesquisa de Vírus Respiratórios, Triagem e Identificação de Vírus Respiratórios, MIPAS.
2. Aplicabilidade
Aos bioquímicos, auxiliares técnicos e estagiários do setor de imunologia.
3. Aplicação clínica
Os vírus respiratórios são responsáveis por uma série de doenças na população humana.
Até os dois anos de idade, a maioria das crianças já teve contato com o vírus respiratório
sincicial (RSV), principal causa das infecções sazonais do trato respiratório inferior.
O vírus Influenza causa doença respiratória altamente contagiosa associada com surtos e
epidemias. A infecção no adulto resulta em traqueobronquite e no desenvolvimento de rinite
e/ou faringite e pneumonia. Os tipos A e B causam o mesmo espectro de doença, sendo que o
A resulta mais em hospitalização e o B resulta mais em miosite e envolvimento
gastrointestinal. O tipo C causa esporadicamente doença do trato respiratório superior.
O vírus Parainfluenza, juntamente com o RSV, representa o patógeno mais significativo de
infecção no trato respiratório superior em crianças e recém-nascidos. Os tipos 1 e 2 são a
causa mais freqüente de laringotraqueobronquite (croup). O tipo 3 pode levar a croup, mas
também causa pneumonia e bronqueolite.
O Adenovírus está associado a um grande número de doenças (esporádicas ou surtos)
incluindo infecções do trato respiratório, ocular, e gastrointestinal. São comuns em crianças e
jovens causando principalmente bronquite/bronquiolite além de pneumonia.
4. Princípio do teste
A Imunofluorescência Indireta é um teste para triagem de um painel com 7 tipos de vírus
respiratórios em amostras nasofaríngeas (aspirados ou lavados) fixadas em lâminas de
imunofluorescência as quais são incubadas com um pool de anticorpos monoclonais
produzidos em rato contra adenovírus, influenza A e B, parainfluenza 1, 2 e 3 e RSV. Após a
incubação com os respectivos anticorpos monoclonais a lâmina é lavada para remoção do
material não reagente e incubada com anticorpos anti-IgG de rato conjugados com isocianato
de fluorsceína. A presença de vírus é detectada pela visualização da fluorescência nas células
infectadas. Sempre que a triagem for positiva, repete-se o teste usando anticorpos específicos
contra cada um dos vírus para a sua identificação.
5. Amostra
CÓPIA IMPRESSA NÃO CONTROLADA
GRUPO HOSPITALAR CONCEIÇÃO
HOSPITAL NOSSA SENHORA DA CONCEIÇÃO
LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
VÍRUS RESPIRATÓRIO
ASPIRADO DE NASO-FARINGE
Imunofluorescência indireta
PVR
Elaborado por: Rosemeri Lugoch
Procedimento Operacional Padrão
Data da 1ª versão: 26/02/07
Versão 2.0
Data da efetivação: 26/05/14
POP n.º: I 44
Página 2 de 7
Revisado por: Tatiana Baccin
Aprovado por: Mara Rieck Silveira
5.1 Preparo do paciente
Não necessário.
5.2 Tipo de amostra
Aspirado de nasofaringe.
Lavado de nasofaringe.
5.3 Colheita
Realizada pela enfermagem, em tubo estéril com 5mL de tampão PBS ou salina gelados.
5.4 Preservação e transporte
As amostras são estáveis por até 72 horas refrigeradas a 2-8 0C. Para o transporte observar as
normas de segurança legais.
5.5 Identificação da amostra
Etiqueta com código de barras gerado pelo sistema de gerenciamento de dados do LAC
Armazenamento
Enviar as amostras, imediatamente, para a Imunologia. Se não for possível, manter entre 28ºC por até 72 horas.
5.6 Amostras inadequadas
Amostras mal identificadas e amostras entreguem fora do prazo de recebimento estipulado.
6. Reagentes e materiais
Reagentes do kit
Anticorpo para Adenovírus
Anticorpo para Influenza A
Anticorpo para Influenza B
Anticorpo para Parainfluenza 1
Anticorpo para Parainfluenza 2
Anticorpo para Parainfluenza 3
Anticorpo para RSV
Pool de anticorpos para triagem (reagente screen)
Controle Negativo
Conjugado anti IgG de rato
Lâminas controle
Fluido de Montagem
PBS
6.1 Preparo
PBS: diluir o envelope em 1 litro de água destilada.
6.2 Estabilidade
Os reagentes do kit são estáveis até o vencimento. O PBS para uso é estável por 2 semanas.
6.3 Armazenamento
CÓPIA IMPRESSA NÃO CONTROLADA
GRUPO HOSPITALAR CONCEIÇÃO
HOSPITAL NOSSA SENHORA DA CONCEIÇÃO
LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
VÍRUS RESPIRATÓRIO
ASPIRADO DE NASO-FARINGE
Imunofluorescência indireta
Procedimento Operacional Padrão
Data da 1ª versão: 26/02/07
Versão 2.0
Data da efetivação: 26/05/14
POP n.º: I 44
Página 3 de 7
PVR
Elaborado por: Rosemeri Lugoch
Revisado por: Tatiana Baccin
Aprovado por: Mara Rieck Silveira
A acetona deve ser conservada a 4ºC (2-8ºC). Todos os reagentes do kit devem ser mantidos
entre 2-8ºC.
7. Equipamentos
Vórtex, centrífuga, estufa 37ºC, câmara úmida, jarra de Couplin, microscópio para IFI.
8. Calibração
Não se aplica.
9. Procedimento (passo a passo)
Preparação da amostra
Obs: A preparação deve ser feita na cabine de fluxo laminar. Ligar a lâmpada germicida
por no mínimo 10 minutos. Desligar.
Ligar a lâmpada fluorescente e a operação.
Após o uso desligar estes botões e ligar a lâmpada germicida por no mínimo 10 minutos.
a) Homogeneizar a amostra no vórtex e completar o volume até 10 ml com PBS.
b) Centrifugar a 1800 rpm por 10 minutos.
c) Desprezar o sobrenadante em recipiente contendo hipoclorito 0,5 %.
d) Ressuspender o precipitado no vórtex e completar o volume até 10 ml com PBS.
e) Repetir as etapas b, c e d de 2 a 3 vezes, ou mais se o material tiver muito muco.
f) Após a última lavagem ressuspender o material precipitado com PBS (volume depende
da quantidade de material obtido no precipitado) uma suspensão levemente turva e
homogênea.
Preparação das lâminas
a) Selecionar 2 lâminas de IFI e limpar com álcool.
b) Identificar com o n. º do paciente.
c) Colocar as lâminas sobre um suporte rígido (papelão ou plástico).
d) Pipetar 10 uL da suspensão de células em 3 círculos da 1ª lâmina (Triagem) e em 8
círculos da 2ª lâmina (Identificação) conforme esquema abaixo:
O
O
Ø
Ø
O
Ø
Triagem Ø
Ø
Ø
Ø
O
O
O
O
Ø Identificação Ø
O
O
O
O
e) Deixar secar em estufa a 37ºC por 1 hora ou com secador de cabelos na velocidade fraca
por 10 a 15 minutos. O secador deve estar a uma distância de aproximadamente 50 cm das
lâminas.
e) Fixar em acetona gelada por 10 minutos.
CÓPIA IMPRESSA NÃO CONTROLADA
GRUPO HOSPITALAR CONCEIÇÃO
HOSPITAL NOSSA SENHORA DA CONCEIÇÃO
LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
VÍRUS RESPIRATÓRIO
ASPIRADO DE NASO-FARINGE
Imunofluorescência indireta
PVR
Elaborado por: Rosemeri Lugoch
Procedimento Operacional Padrão
Data da 1ª versão: 26/02/07
Versão 2.0
Data da efetivação: 26/05/14
POP n.º: I 44
Página 4 de 7
Revisado por: Tatiana Baccin
Aprovado por: Mara Rieck Silveira
f) Se as lâminas não forem testadas no mesmo dia, enrolá-las em papel manteiga e envolver
em papel laminado ou em campo escuro.
g) Congelar a –20º C quando o armazenamento for maior que 24 horas ou a 2-8º C quando
for inferior.
Triagem
Utilizar a lâmina contendo 3 círculos da amostra. Deixar que ela atinja a temperatura
ambiente.
a) Colocar a lâmina na câmara úmida.
b) Adicionar 10uL do reagente Screen (Pool) nos 2 primeiros círculos da lâmina e 10uL do
Controle Negativo no terceiro círculo.
c) Incubar na estufa a 37ºC por 30 minutos.
d) Lavar a lâmina com jato leve de PBS. Mergulhar a lâmina em cuba contendo PBS por 10
minutos. Aplicar leve jato de água destilada. Bater levemente a lâmina para retirar o
excesso de líquido. Secar em estufa 37ºC ou TA.
e) Adicionar 10uL do conjugado nos três círculos da lâmina e repetir os passos de c e d.
f) Montar a lâmina para leitura usando glicerina alcalina preparada no laboratório ou o
líquido de montagem do kit.
g) Fazer a leitura no microscópio.
Identificação
Utilizar a lâmina contendo 8 círculos da amostra. Deixar que ela atinja a temperatura
ambiente.
a) Colocar a lâmina na câmara úmida
b) Colocar 10uL de cada anticorpo específico sobre as amostras:
RSV
ADN
IFA IFB
Ø Identificação Ø
PI1
PI2
PI3
Pool
c) Incubar a 37ºC por 30 minutos.
d) Lavar a lâmina com jato leve de PBS. Mergulhar a lâmina em cuba contendo PBS por 10
minutos. Aplicar leve jato de água destilada.
e) Bater levemente a lâmina para retirar o excesso de líquido. Secar em estufa 37ºC ou TA.
f) Adicionar 10uL do conjugado sobre os 8 círculos da lâmina e repetir os passos de c e d.
g) Montar a lâmina para leitura usando glicerina alcalina preparada no laboratório ou o
líquido de montagem do kit.
h) Fazer a leitura no microscópio.
10. Controle de qualidade
10.1 Interno
CÓPIA IMPRESSA NÃO CONTROLADA
GRUPO HOSPITALAR CONCEIÇÃO
HOSPITAL NOSSA SENHORA DA CONCEIÇÃO
LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
VÍRUS RESPIRATÓRIO
ASPIRADO DE NASO-FARINGE
Imunofluorescência indireta
PVR
Elaborado por: Rosemeri Lugoch
Procedimento Operacional Padrão
Data da 1ª versão: 26/02/07
Versão 2.0
Data da efetivação: 26/05/14
POP n.º: I 44
Página 5 de 7
Revisado por: Tatiana Baccin
Aprovado por: Mara Rieck Silveira
Lâminas Controle do kit - testar ao abrir um kit novo e quando houver discrepância entre
resultados da triagem e da identificação. Testam os anticorpos monoclonais para cada vírus.
Lâminas preparadas e armazenadas no setor de Imunologia. Freqüência: a cada rotina.
Estabilidade: 1 ano a -20ºC.
10.2 Externo
Vide Tabela PCIQ/PAEQ.
11. Resultados
11.1 Unidades
Não se aplica.
11.2 Cálculos
Não se aplica.
11.3 Critérios de aceitação
Os controles positivo e negativo devem apresentar padrão satisfatório para liberação dos
resultados do ensaio.
12. Valores de referência
Se a lâmina for Negativa o resultado será reportado como “Não foram observados vírus”.
13. Valores críticos
Não se aplica.
14. Especificações de desempenho
Segundo informações do fabricante, quando realizada a comparação clínica da confirmação
por cultura celular os seguintes resultados foram obtidos em 646 amostras do trato
respiratório.
Anticorpo
Adeno
RSV
IA
IB
ParaI 1
ParaI 2
ParaI 3
Monoclonal
Sensibilidade 97,7
100
100
100
100
100
100
Especificidade 100
100
100
100
100
100
100
Total Positivo 43
66
11
4
11
5
28
15. Fontes Potenciais de Variabilidade
Degradação e/ou contaminação de reagentes e amostras.
CÓPIA IMPRESSA NÃO CONTROLADA
GRUPO HOSPITALAR CONCEIÇÃO
HOSPITAL NOSSA SENHORA DA CONCEIÇÃO
LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
VÍRUS RESPIRATÓRIO
ASPIRADO DE NASO-FARINGE
Imunofluorescência indireta
PVR
Elaborado por: Rosemeri Lugoch
Procedimento Operacional Padrão
Data da 1ª versão: 26/02/07
Versão 2.0
Data da efetivação: 26/05/14
POP n.º: I 44
Página 6 de 7
Revisado por: Tatiana Baccin
Aprovado por: Mara Rieck Silveira
Meio de transporte para vírus não pode ser inibidor das células de cultura de tecidos,
adenovírus, influenza A e B, parainfluenza 1,2 e 3 e RSV.
Acetona contaminada com água pode provocar uma aparência turva do substrato nos testes
de fluorescência.
Muitos vírus são instáveis e sensíveis a repetidos congelamentos e descongelamentos.
16. Linearidade
Não se aplica.
17. Limitações do método
Um resultado negativo não exclui infecção por vírus respiratório. Os resultados devem ser
cuidadosamente interpretados juntamente com avaliação do quadro clínico do paciente.
Amostras contaminadas por Staphylococcus aureus podem apresentar fluorescência amareloesverdeado devido à presença de grandes quantidades de Proteína A que se ligam aos
fragmentos Fc dos Anticorpos.
Os anticorpos monoclonais neste kit são grupo específicos para adenovírus e RSV, portanto,
não podem ser usados para diferenciar tipos.
18. Interpretação dos resultados
Positivo: presença de pelo menos 3 células com fluorescência.
Negativo: Ausência de células fluorescentes.
RSV: fluorescência verde brilhante no citoplasma associada com sincício - com pequenas
inclusões.
Adenovírus, Influenza A e Influenza B: fluorescência no núcleo, citoplasma ou ambos. O
padrão nuclear é uniformemente brilhante com pouca definição. O padrão citoplasmático é
freqüentemente pontilhado com grandes inclusões.
Parainfluenza tipos 1, 2 e 3: fluorescência no citoplasma com padrão pontilhado
apresentando inclusões irregulares.
19. Biossegurança
A preparação do material e lâminas deve ser feita na cabine de fluxo laminar.
Obedecer às normas de segurança vigentes no laboratório e usar equipamentos de proteção
individual
20. Anexos
CÓPIA IMPRESSA NÃO CONTROLADA
GRUPO HOSPITALAR CONCEIÇÃO
HOSPITAL NOSSA SENHORA DA CONCEIÇÃO
LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
VÍRUS RESPIRATÓRIO
ASPIRADO DE NASO-FARINGE
Imunofluorescência indireta
PVR
Elaborado por: Rosemeri Lugoch
Procedimento Operacional Padrão
Data da 1ª versão: 26/02/07
Versão 2.0
Data da efetivação: 26/05/14
POP n.º: I 44
Página 7 de 7
Revisado por: Tatiana Baccin
Planilhas de controle interno (Anexo 14).
21. Bibliografia
Bula do teste.
CÓPIA IMPRESSA NÃO CONTROLADA
Aprovado por: Mara Rieck Silveira