MORFOLOGIA DO SÊMEN CRIOPRESERVADO DE
CURIMATÃ EM MÁQUINA DE CONGELAÇÃO
Pinheiro, J. P. S.(1); Melo-Maciel, M. A. P.(1); Almeida, P.S.(1); Pinheiro, R.R.R.(1);
Torres, T.M.(1); Leite, L.V.(1); Linhares, F.R.A.(1); Salmito-Vanderley, C.S.B.(1)
[email protected]
(1)
Universidade Estadual do Ceará – UFCE, Fortaleza – CE, Brasil.
RESUMO
O curimatã comum é um peixe de valor ecológico e econômico, entretanto, a
pesca predatória e a construção de barragens em rios impedem sua
reprodução. Por isso, a criopreservação do sêmen pode auxiliar na reprodução
artificial. Para avaliar a qualidade do sêmen descongelado, um dos parâmetros
analisados é a morfologia espermática. Portanto, o objetivo do trabalho foi
avaliar a morfologia espermática do sêmen de Prochilodus brevis
criopreservado em máquina de congelação programada (MCP) com diferentes
diluidores. Utilizaram-se doze machos induzidos hormonalmente. As amostras
seminais constituíram quatro pools, aliquotadas para morfologia e
criopreservação com Glicose ou Beltsville Thawing Solution (BTS) acrescido
Dimetilsulfóxido (DMSO) ou Metilglicol (MG). Após 10 dias, o sêmen foi
descongelado e fixado para morfologia, sendo assim comparado com o in
natura. Os dados foram submetidos à análise de variância e Teste de Tukey
(P<0,05). Na análise do sêmen in natura observou-se maior porcentagem de
espermatozoides normais em relação ao sêmen pós-descongelação (P<0,05).
Entretanto, não houve diferença (P>0,05) entre a porcentagem de normais e
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entre as patologias encontradas nos diferentes tratamentos. Logo, o sêmen de
P.brevis apresenta elevadas porcentagens de espermatozoides normais quando
criopreservado nas soluções diluidoras: Glicose ou BTS associados a DMSO
ou a MG em MCP.
Palavras-chave: Prochilodus brevis, Peixes, Criopreservação.
INTRODUÇÃO
A espécie Prochilodus brevis Steindachner, 1875 (=Prochilodus
cearensis), conhecida regionalmente por curimatã comum, é um peixe
pertencente à ordem dos Characiformes e nativo da região semiárida
(Nordeste) do Brasil (CE, PI, RN) sendo introduzido em alguns estados
da região sudeste (DOURADO, 1981).
O curimatã comum possui grande valor biológico e econômico, que de
acordo com Fontenele (1982) ocupa lugar de destaque pela precocidade,
prolificidade, regime alimentar e grande aceitação pelos habitantes do
Nordeste.
Contudo, a construção de barragens em rios impedindo a realização da
migração para a reprodução e a pesca predatória no período que
antecede a desova, afeta a sobrevivência dessa espécie (NASCIMENTO
et al., 2012).
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Devido a isso, surge nos pesquisadores o interesse sobre o estudo da
reprodução dessa espécie, e uma das áreas em ascensão para reprodução
artificial é a criopreservação do sêmen tanto para a produção em
aquicultura como para preservação de material genético em programas
de conservação (CAROLSFELD et al., 2003).
No entanto, para se obter o sucesso de tal técnica é necessária a
utilização e interação de diversos fatores, tais como: bom diluidor; taxa
de resfriamento, condições de congelação, temperatura e tempo de
descongelação apropriados, dentre outros (SALMITO-VANDERLEY
et al., 2012).
Dessa forma, há a necessidade da padronização de protocolos de
criopreservação, principalmente da técnica empregada, que pode ser
obtida com a utilização da máquina de congelação programada, que irá
permitir a queda homogênea e gradual da temperatura.
Quando a interação entre esses fatores supracitados não acontece,
podem ocorrer danos celulares, dessa maneira, havendo a necessidade
de que se analisem alguns parâmetros do sêmen pós-descongelação que
influenciam negativamente a taxa de fertilização, dentre eles a
morfologia espermática (RURANGWA et al., 2004).
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Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar a morfologia
espermática do sêmen de Prochilodus brevis criopreservado em
máquina de congelação programada com diferentes soluções diluidoras.
MATERIAL E MÉTODOS
Os reprodutores foram provenientes do plantel do Laboratório de
Biotecnologia da Reprodução de Peixes (LBRP) (-3.793218, 38.558250) do Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB) da
Universidade Estadual do Ceará (UECE). O projeto foi aprovado pelo
Comitê de Ética (CEUA) com o seguinte número de processo:
12776936-6.
Para o estudo foram utilizados doze machos de curimatã comum
(P.brevis) induzidos hormonalmente com única dose de extrato
hipofisário de carpa comum (EHC: 2mg/Kg de peso vivo) na base da
nadadeira peitoral, via intracelomática. Após 18 horas da indução foi
realizada a coleta seminal, para isso, os animais foram capturados
individualmente e sedados em solução à base de óleo de cravo
(Eugenol; União Vegetal Suplementos Nutricionais Ltda) (1ml de óleo
de cravo : 10ml de álcool absoluto : 10000ml de água do tanque) até
que se observasse a perda do equilíbrio do animal (ventre voltado para
cima). Em seguida, a papila urogenital enxuta com papel toalha e
realizada uma massagem abdominal no sentido crânio-caudal com o
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cuidado do sêmen não ser contaminado com água, sangue, fezes ou
urina.
O sêmen foi coletado em tubos graduados de polietileno, identificados e
mantidos em caixa térmica de poliestireno (~ 10 ºC). As alíquotas
contaminadas e que apresentaram motilidade espermática subjetiva
inferior a 80%, quando ativadas com água do tanque, não foram
utilizadas.
As amostras selecionadas formaram quatro pools de sêmen (três
machos por pool), em que uma alíquota de 5 µL do sêmen in natura foi
fixada em 50µL de formol citrato para análise da morfologia
espermática e a restante foi destinada a criopreservação.
No processo de criopreservação utilizaram-se os diluentes: Beltsville
Thawing Solution - BTS (Minitub, 318 mOSM) e Glicose comercial
(Fresenius Kabi Brasil Ltda, 252 mOsm); e os crioprotetores:
Dimetilsulfóxido – DMSO e Metilglicol – MG.
Dessa forma, constituídos os seguintes tratamentos: T1) Glicose +
DMSO; T2) Glicose + MG; T3) BTS + DMSO; e T4) BTS + MG.
O sêmen de cada pool (n = 4) foi diluído 1:6 (sêmen:diluidor) em todos
os tratamentos, sendo essa solução envasada em palhetas de 250µL,
identificadas, seladas nas extremidades com álcool polivinilico e
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colocadas em freezer (~10 ºC) por 10 minutos. Após esse período,
transferidas para máquina de congelação programada (Dominium K,
BIOCOM®, Brasil), em que as amostras foram resfriadas a temperatura
inicial de 10 ºC, e submetidas a duas rampas de congelação durante o
processo (rampa 1: -12 ºC/min.; rampa 2: -3 ºC/min) até atingir
temperatura final de -60 ºC, e finalmente as palhetas transferidas para o
botijão de nitrogênio líquido.
Após 10 dias, o sêmen foi descongelado em banho-maria a 25 oC por
30s, sendo essas amostras fixadas com a mesma metodologia para o
sêmen in natura.
Em seguida, misturou-se 20µL da solução fixada com 10 µL de corante
Rosa Bengala. Dessa mistura, retirou-se 4µL e feito o esfregaço em
lâmina de vidro, realizando essa operação duas vezes (duas lâminas) e
feita a análise de 100 espermatozoides em cada lâmina com auxílio de
microscópio óptico a 400x, totalizando 200 espermatozoides por
tratamento. As patologias foram observadas e classificadas de acordo
com Galo et al. (2011).
Todos os dados obtidos foram comparados entre amostras frescas e pósdescongeladas.
Os dados foram expressos como média ± desvio padrão e analisados por
meio de análise de variância seguida pelo Teste de Tukey ao nível de
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5% de significância, utilizando o programa estatístico ASSISTAT®
versão 7.6 beta (2013).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na análise morfológica do sêmen in natura observou-se grande
porcentagem de espermatozoides normais (96,88±5,60%) sendo
superior ao encontrado no sêmen pós-descongelação (P<0,05).
Entretanto, verificou-se que não houve diferença significativa (P>0,05)
entre a porcentagem de espermatozoides normais entre os diferentes
tratamentos (tabela 1).
Além disso, não se verificou diferença significativa (P>0,05) entre os
diferentes tratamentos (tabela 1) quanto às patologias encontradas
(cauda: dobrada, enrolada, quebrada e corrugada) (Figura 1), porém
dessas patologias, a única que foi encontrada no sêmen in natura foi a
patologia cauda dobrada, já no sêmen pós-descongelação observou-se
todas as patologias mencionadas.
Dentre as patologias observadas no sêmen criopreservado, a patologia
cauda dobrada apresentou uma maior porcentagem em relação às outras
patologias. Tal fato pode ser observado também em outros estudos,
como com a espécie Piaractus mesopotamicus (Streit Jr. et al., 2006) e
Prochilodus lineatus (Streit Jr. et al., 2003).
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De acordo com Streit Jr. et al. (2006), a presença de espermatozoides
com essas patologias pode ser em virtude da exposição destes à solução
crioprotetora e à congelação dos espermatozoides.
Tabela 1. Morfologia do sêmen criopreservado em diferentes tratamentos na máquina
de congelação programada (Dominium K, BIOCOM®, Brasil). T1: Glicose + DMSO;
T2: Glicose + MG; T3: BTS + DMSO; T4: BTS + MG. As médias seguidas pela
mesma letra entre as linhas não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste
de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
in natura
T1
T2
T3
T4
Normal (%)
Cauda dobrada (%)
Cauda
enrolada (%)
Cauda
quebrada (%)
96,88±5,60a
78,75±8,82b
79,25±6,81b
73,50±6,36b
79,00±6,18b
3,12 ± 5,60a
18,00±8,68b
16,00±6,54b
21,88±6,43b
17,63±6,76b
0,37 ± 0,48
0,87 ± 0,85
0,37 ± 0,48
0,87 ± 1,11
1,63 ± 0,48
2,75 ± 0,87
1,50 ± 0,91
1,63 ± 0,63
Cauda
corrugada
(%)
1,25 ± 0,65
1,13 ± 0,48
2,75 ± 1,04
0,88 ± 0,25
Segundo Galo et al. (2011) o decréscimo na motilidade após o processo
de criopreservação pode ser correlacionado com a deformação
estrutural durante o processo de congelação/descongelação do
espermatozoide.
Com isso, a presença dessas anormalidades espermáticas poderá
influenciar
negativamente
no
processo
de
fertilização
(LAHNESTEINER et al., 1996; LAHNSTEINER et al., 1998;
COSSON et al.,1999).
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Figura 1. Morfologia do sêmen criopreservado de curimatã
comum (P. brevis). Letras correspondem: a – cauda normal;
b – cauda enrolada; c – cauda corrugada; d – cauda
quebrada; e – cauda dobrada. Setas indicam o
espermatozoide que foi classificado.
O padrão normal de morfoanomalias dos espermatozoides é
preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA,
1998), sendo de 30% para mamíferos, bovinos e equinos, e de 20% para
ovinos e suínos, no entanto, em peixes, as referências ainda não foram
estabelecidas. Dessa maneira, os resultados encontrados nesse estudo
são superiores ao padrão estabelecido para outras espécies, ressaltando
assim a eficiência do protocolo empregado.
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CONCLUSÃO
Nas condições em que foram realizadas este experimento, o sêmen de
curimatã comum (P.brevis) apresenta elevadas porcentagens de
espermatozoides
normais
quando
criopreservado
nas
soluções
diluidoras: Glicose ou BTS associados a DMSO ou MG em máquina de
congelação programada Dominium K.
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