Fotos: Rodrigo Arruda
Faz Bom Jardim
BiotécnicaS avanÇaDaS
na reprodução de equídeos
Por:
Rodrigo Arruda de Oliveira - M.V. Dr. em Reprodução Animal
Ivo Pivato - Prof. Departamento de Reprodução Animal FAV/UnB – Brasília/DF
M
uitos avanços são notados em todas
as áreas da reprodução dos equídeos,
desde a avaliação seminal até a clonagem, o que implica em uma produção mais tecnificada e com resultados superiores. Esses avanços podem ser aproveitados tanto em animais
de excelente qualidade genética e de esporte,
quanto para conservação de recursos genéticos
e ampliação de plantéis nacionais com importância sócio-economica (raça Pantaneiro, Campeiro,
Baixadeiro, Marajoara, Lavradeiro, etc).
utilizada na reprodução de equídeos no Brasil.
Esse material pode ser enviado para diversos lugares do País, o que permite que égua e garanhão estejam, até mesmo, em estados diferentes.
inseminação artificial
O sêmen pode ser armazenado em recipientes específicos, disponíveis com vários nomes comerciais, em duas diferentes temperaturas, 15ºC
e 5ºC, o que mantém a sua viabilidade, na maioria dos casos, em 24 e 48h, respectivamente. O
ideal, antes da comercialização de doses, é que
seja feito um teste de refrigeração para decidir
em qual recipiente transportar e qual a vida útil
do material.
A inseminação artificial com sêmen refrigerado
e transportado é, sem dúvida, a biotécnica mais
A utilização do sêmen congelado vem
crescendo bastante, devido à liberação do seu
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uso, por grande parte das associações de criadores e à incorporação de novos diluentes de
congelamento e crioprotetores alternativos. Um
exemplo disso é a redução do glicerol em combinação com as amidas nos meios comerciais
de congelação. Esse crioprotetor em altas concentrações, como utilizado para a criopreservação do sêmen de bovinos, apresenta toxicidade
superior, o que resulta em um congelamento de
baixa qualidade.
O sêmen pode ser congelado com animal ainda vivo, utilizando a vagina artificial para colheita.
Em casos de animais impossibilitados de saltar
no manequim, pode-se lançar mão da colheita
farmacológica com a utilização de alguns medicamentos, com um índice de sucesso em torno
de 40 a 50%. A última alternativa para se obter
sêmen de um reprodutor é a colheita dos espermatozoides da cauda do epidídimo, que apresenta um excelente resultado. Para isso, o testículo
deve ser retirado imediatamente após o óbito do
animal, e transportado refrigerado (5ºC) ao laboratório, em um intervalo de, no máximo, 24 horas.
Sabe-se que espermatozoides danificados,
além de apresentarem padrões inadequados
para fecundação do ovócito, geram substâncias
que podem prejudicar os demais, entre esses elementos, temos os radicais livres.
Alguns procedimentos de manipulação seminal podem ser utilizados em uma tentativa
de selecionar os melhores espermatozoides,
excluindo ao máximo os danificados, seja imediatamente pós-colheita ou após refrigeração/
criopreservação. Para tanto, podemos utilizar a
centrifugação amortecida, a centrifugação em
gradiente ou a filtração.
A centrifugação amortecida pode ser aplicada ao sêmen de garanhões para maximizar a
colheita de espermatozoides sem causar lesões.
Um composto iodado não iônico, chamado iodixanol, é utilizado como gradiente de densidade ou como amortecedor na centrifugação do
sêmen. Pesquisas envolvendo a centrifugação
do sêmen equino com este produto mostraram
rendimentos excelentes em número de espermatozoides e ausência de lesões causadas pelo
processo de centrifugação.
A centrifugação com solução de partículas de
sílica silanizada mostrou-se promissora para a
“seleção” de espermatozoides com boa motilidade, morfologia e qualidade da cromatina. O uso
desse material poderia resultar em maiores taxas
de prenhez. Essa biotécnica não deve ser utilizada no sêmen de garanhões de qualidade normal,
uma vez que uma porcentagem relativamente alta
da população espermática pode ser perdida após
a centrifugação.
A retirada do plasma seminal é necessária para
criopreservação e, em alguns casos, mostrou-se
benéfica para refrigeração, principalmente para
o sêmen de garanhões considerados de “baixa
refrigeração”. A utilização da centrífuga para a retirada do plasma seminal pode interferir negativamente na motilidade, integridade de membrana
plasmática e recuperação dos espermatozoides.
Uma recente técnica que permite esse processo em substituição a centrifugação, é a
utilização de um filtro específico feito de membrana hidrofílica sintética. Esse material faz a retenção e preservação da viabilidade espermática, permitindo somente a passagem do plasma
seminal. Após a filtragem, os espermatozoides
retidos são ressuspensos no diluente específico, de refrigeração ou congelamento, de acordo
com a concentração desejada.
Devido à menor viabilidade do sêmen equino
criopreservado, é necessário um acompanhamento mais restrito do controle folicular. Deve-se
inseminar o mais próximo possível da ovulação,
em virtude da pequena viabilidade do ovócito.
Para isso utilizamos hormônios indutores da ovulação, como Gonadotrofina Coriônica Humana
(hCG) e análogos do hormônio liberador de gonadrofinas (GnRH), como a desorelina.
Com o intuito de aumentar o número de produtos obtidos por dose inseminante, técnicas alternativas de inseminação, como a utilização de
pipetas flexíveis para depositar os espermatozoides na extremidade do corno uterino, têm sido
utilizadas. Essa técnica permite a deposição de
uma dose inseminante menor e incrementa os índices de prenhez.
transferência de embrião
O Brasil responde por 41% dos embriões equinos transferidos no mundo, seguido da Argentina (31%). A transferência de embrião (TE), assim
como qualquer outra biotécnica, apresenta aplicações e limitações. A principal limitação desta
técnica diz respeito à eficiência do programa. Em
função da dificuldade de se obter receptoras de
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qualidade e da inconsistência dos protocolos de
superovulação, os custos para a produção de um
potro proveniente de TE são bastante elevados.
Também existe uma maior dificuldade em se
criopreservar embriões equinos, devido à menor
viabilidade pós-descongelamento e aos índices
de prenhez relativamente menores do que com
embriões frescos. Pesquisas são direcionadas
para a vitrificação do embrião, que consiste na
exposição do embrião a concentrações maiores
de crioprotetores e diminuição do tempo exposição, o que possibilita a não formação de cristais
de gelo, resultando em viabilidade superior. A
técnica mais utilizada é a refrigeração do embrião
no meio de manutenção, para transportá-lo até o
local da receptora, ou para aguardar a ovulação
de uma receptora atrasada.
ultrassonografia
Apesar da ultrassonografia (US) não ser uma
biotécnica recente na reprodução de equídeos,
seja para controle folicular, patologias do trato reprodutor ou diagnóstico de gestação, com o advento da US colorida Doppler ou Power Doppler,
foi possível reavaliar conceitos antes considerados definitivos quanto à fisiologia da reprodução.
Essa técnica demonstrou ser efetiva e prática
para a avaliação não invasiva e em tempo real da
perfusão vascular do trato reprodutor, tanto masculino quanto feminino. Esse tipo de avaliação
permite inúmeras aplicações, entre elas, o auxílio
na escolha da receptora no momento da inovulação do embrião, e a decisão para esmagamento
de uma vesícula embrionária em casos de gestação gemelar.
Embora as técnicas de sexagem fetal tenham
sido descobertas e aprimoradas anos atrás, ainda são pouco utilizadas na rotina dos criatórios. A
identificação do sexo do feto pelo tubérculo genital (60 a 70 dias), como é realizada em bovinos,
é de difícil execução em equinos, já que o feto
dessa espécie apresenta uma mobilidade muito
grande, extenso cordão umbilical e maior quantidade de líquidos placentários. O procedimento
mais realizado com éguas é a identificação da
gônada fetal (ovários ou testículos) por volta de
110 a 120 dias.
A mais moderna técnica de identificação do
sexo fetal em equinos é por meio de exame laboratorial (PCR), com a colheita de sangue da égua
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no terço final de gestação. Estudos estão sendo
desenvolvidos para antecipar a sexagem, assim
esse protocolo poderá estar disponível em fases
mais precoces da prenhez.
transferência de ovócitos (to) e
transferência intrafalopiana de
gametas (GiFt)
Essas técnicas são utilizadas com o intuito de
se obter gestações de éguas impossibilitadas de
produzir embriões devido a várias condições reprodutivas patológicas adquiridas (éguas idosas,
éguas com patologias no oviduto, útero ou cérvix).
O ovócito (gameta feminino) é retirado do ovário
dessas éguas, através de punção folicular guiada
por ultrassom, e transferido, via acesso cirúrgico
pelo flanco, para o oviduto (tuba uterina) de outra
égua (receptora). A receptora é inseminada com
o sêmen do garanhão de escolha, de modo convencional (intrauterino) e gestará o potro.
Se a deposição do sêmen ocorrer diretamente na tuba uterina, junto com o ovócito, temos o
que denominamos de GIFT, que apresenta como
vantagem o uso de baixas quantidades de espermatozoides móveis.
Produção in vitro de embriões
Essa biotécnica permite a produção in vitro
(em laboratório) de embriões de fêmeas que, por
diversos motivos, estão impossibilitadas de produzir embriões naturalmente. Contudo, sistemas
empregados em outras espécies para produção
de embriões (maturar ovócitos, capacitar espermatozoides e cultivar embriões) in vitro não se
adequam à espécie equina.
O único relato de potros nascidos por esta
técnica foi na França, na década de 90. Porém,
esses potros foram originados da fecundação de
um ovócito da égua doadora maturado in vivo
(dentro da própria égua), sendo posteriormente
introduzido um único espermatozoide intracitoplasmático, técnica denominada de “ICSI”.
injeção intracitoplasmática de
espermatozoides (icSi)
Biotécnica que utiliza ovócitos maduros, em
que, através de várias técnicas, um espermatozoide é injetado no seu citoplasma. Os ovócitos
fertilizados por ICSI podem ser imediatamente
Lavagem de embrião
transferidos para o oviduto da égua receptora,
ou ficarem em cultivo por 7-8 dias para atingir o
estádio de blastocisto, sendo então transferidos
por método não cirúrgico para o útero das receptoras. É uma alternativa bastante promissora
para a multiplicação de animais selecionados.
No Brasil, a empresa In Vitro Clonagem, por
meio da Dra. Perla Fleury, noticiou o primeiro nascimento de um equino (fêmea) por esta técnica no
ano de 2012. Os ovócitos foram obtidos do ovário
de uma égua quarto de milha, após sua morte.
clonagem
É definida como o processo que produz uma
cópia geneticamente idêntica de uma célula ou
organismo, por meio de reprodução assexuada.
No universo dos equinos, clonagem é a produção de potros que têm o mesmo material genético do animal doador da célula (seja égua, garanhão ou mesmo um equino castrado).
Para realização da clonagem, necessita-se
de uma célula do animal doador (uma amostra
de tecido da pele). Essa amostra vai para cultivo celular no laboratório, para estabelecer uma
linhagem de células. Também há necessidade
de um ovócito, que pode ser obtido de ovários
equinos de abatedouro ou por aspiração folicular de animal vivo. Esse ovócito é maturado e,
depois disso, tem seu material genético (DNA)
retirado. Nesse ovócito é inserida uma célula do
cultivo celular do animal a ser clonado (DNA do
doador). O ovócito reconstruído é estimulado a
se desenvolver, sendo cultivado por 6-7 dias em
incubadora. Nesse período, se tudo transcorreu
de forma esperada, essa estrutura se transforma
num embrião, que será transferida para éguas
receptoras. Se a gestação se desenvolve nor-
malmente, o potro nascido será geneticamente
idêntico ao animal que doou as células.
O primeiro registro de clones equídeos é da
Universidade de Idaho, nos Estados Unidos. A
equipe de pesquisadores utilizou células de feto
de mula, com 45 dias de idade, como células
doadoras de núcleo. Foram transferidos mais de
300 ovócitos reconstruídos e foram obtidos três
clones em 2003.
Poucas semanas depois, a equipe do Dr. Cesare Galli anunciou, na Itália, o nascimento de
uma potra clone da raça Haflinger. Foi o primeiro registro de nascimento de equino clonado da
história. As células que serviram como núcleos
eram de uma fêmea adulta. Foram transferidos
17 embriões.
Em 2004 não houve registros de nascimentos de clones equinos. Em 2005 foi noticiado o
nascimento de dois potros na Itália, resultado
do trabalho da equipe do Dr. Galli, sendo que
um veio a óbito com 48 horas de vida, em consequência de uma septicemia. O outro potro se
desenvolveu normalmente. Também em 2005,
o laboratório da Universidade do Texas (Texas
A&M University) produziu dois clones viáveis, a
partir da transferência de 11 embriões. No mesmo laboratório, em 2006, nasceram nove clones,
dos quais sete eram viáveis.
A partir de 2006 houve o nascimento de vários potros clonados, além de um aumento na
procura por este tipo de serviço, que é oferecido
comercialmente. A empresa líder mundial na produção de clones equinos é a ViaGen, com sede
no estado do Texas, e com um laboratório em Alberta, no Canadá.
No Brasil, os primeiros clones equinos nasceram em 2012, e são da raça Mangalarga. Foram
desenvolvidos pela empresa In Vitro Clonagem
Animal, de Mogi Mirim, SP. Um dos clones é do
lendário reprodutor Turbante JO, que renasce
aos 43 anos.
conclusão
No Brasil existem vários Centros especializados em reprodução de equídeos, o Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Agronomia da Universidade de
Brasília (FAV/UnB), é um deles e tem procurado
desenvolver e difundir várias destas Biotécnicas
ao sistema nacional de produção de equídeos.
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