UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO
ESPECIALIZAÇÃO latu sensu
PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO EM BOVINOS
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM BOVINOS, SUPEROVULAÇÃO, COLHEITA,
SELEÇÃO E IMPLANTAÇÃO DOS EMBRIÕES
Paulo Ramos da Silva
Rio de Janeiro, nov. 2007
PAULO RAMOS DA SILVA
Aluno do Curso de Especialização latu sensu Produção e Reprodução em Bovinos
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÔES EM BOVINOS. SUPEROVULAÇÃO, COLHEITA,
SELEÇÃO E IMPLANTAÇÃO DOS EMBRIÕES
Trabalho monográfico de conclusão do
curso
de
Especialização
latu
sensu
Produção e Reprodução em Bovinos
(TCC), apresentado à UCB como requisito
parcial para a obtenção do título de
Especialista em Produção e Reprodução
em Bovinos, sob a orientação do Prof. Dr.
Domingos de Faria Junior
Rio de Janeiro, nov. 2007
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM BOVINOS, SUPEROVULAÇÃO, COLHEITA,
SELEÇÃO E IMPLANTAÇÃO DOS EMBRIÕES
Elaborado por Paulo Ramos da Silva
Aluno do Curso de Especialização latu sensu Produção e Reprodução em
Bovinos
Foi analisado e aprovado com
grau: ...................................
Rio de Janeiro, ____ de _______________ de ______.
___________________________
Membro
___________________________
Membro
___________________________
Professor Orientador
Presidente
ii
Rio de Janeiro, nov. 2007
Dedico este trabalho aos meus
Pais, meus avós e minha tia, que
não mediram esforços para me
ajudar na conclusão deste curso
de especialização.
iii
Agradecimentos
Á minha família, pelo apoio e pela
ajuda; Ao Prof. Dr. Domingos de
Faria Junior, que me orientou na
realização deste trabalho. A todos
amigos e colegas que de forma
direta ou indireta me ajudaram. E
principalmente a Deus, que nos
deu capacidade e inteligência para
iv
realizar sonhos e alcançar nossos
objetivos.
RESUMO
A técnica de transferência de embriões (TE) foi um grande avanço nas
biotecnologias ligas a reprodução animal, sendo utilizada como importante
instrumento na seleção de animais com alto valor genético e econômico. A
técnica promove a multiplicação deste material genético e aumenta a freqüência
gênica de características desejáveis, explorando com grande intensidade a
capacidade genética de cada animal. Isto é possível graças ao processo de
superovulação, o que permite a produção de vários embriões de um mesmo
acasalamento, e a possibilidade de serem realizadas várias coletas ao ano,
permitindo uma variação muito grande de acasalamentos, acelerando assim o
processo de seleção dos animais.
ABSTRACT
Embryo transference bovine technics, was a great advance in the animal
reproduction biotechnology, been used how an important mode in the animals
selection, and multiplication of genetic material. With the superovulation
programme, who will produce many ovule, many products in one bout. With this
technics is possible do sundry products with diferents crossing during the year,
accelerating the system of animal selection.
v
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 7
2. HISTÓRICO ....................................................................................................... 8
3. SELEÇÃO DA DOADORA ................................................................................. 8
3.1. SINAIS CLÍNICOS E REPRODUTIVOS.................................................................... 9
3.2. CONTROLE SANITÁRIO EFETIVO ........................................................................ 9
3.3. GENÉTICA ...................................................................................................... 9
3.4. NÍVEL DE RESPOSTA À SUPEROVULAÇÃO ......................................................... 10
4. SUPEROVULAÇÃO ......................................................................................... 10
4.1. TIPOS E DOSAGEM DE HORMÔNIOS...................................................... 12
4.1.1. ECG (ou PMSG)................................................................................... 12
4.1.2 .FSH ...................................................................................................... 12
4.2. PROTOCOLOS PARA SUPEROVULAÇÃO............................................... 13
5. COLHEITA DOS EMBRIÕES........................................................................... 14
5.1. LOCAL .......................................................................................................... 15
5.2. PREPARAÇÃO DA DOADORA............................................................................ 16
5.3. MATERIAIS PARA COLETA ............................................................................... 16
6. BUSCA DOS EMBRIÕES ................................................................................ 17
7. AVALIAÇÃO DOS EMBRIÕES ........................................................................ 17
7.1. CATEGORIAS ............................................................................................ 18
7.1.2. Mórula Compacta ................................................................................. 19
7.1.3. Blastocisto Inicial .................................................................................. 19
7.1.5. Blastocisto Expandido .......................................................................... 20
7.1.6. Blastocisto em Eclosão ........................................................................ 21
7.1.7. Blastocisto Eclodido ............................................................................. 21
7.2. QUALIDADE............................................................................................... 21
8. SELEÇÃO DAS RECEPTORAS ...................................................................... 22
9. TRANSFERÊNCIA OU IMPLANTAÇÃO DOS EMBRIÕES.............................. 23
10. CRIOPRESERVAÇÃO DOS EMBRIÕES....................................................... 24
10.1. CONGELAÇÃO ........................................................................................ 24
10.2. DESCONGELAÇÃO ................................................................................. 25
vi
11. CONCLUSÃO................................................................................................. 26
12. BIBLIOGRAFIA .............................................................................................. 27
7
1. INTRODUÇÃO
Os índices reprodutivos e produtivos da pecuária brasileira estão muito
abaixo do desejado. Os aumentos na produção de leite e carne, nas últimas
décadas, ocorreram, em parte muito mais devido à expansão das áreas
exploradas e aumento do efetivo de rebanho do que pelo aumento real da
produtividade. Quanto mais maximizada for a produção, através da utilização
de
biotecnologias
como
inseminação
artificial,
sincronização
estral,
transferência de embriões e fecundação in vitro, tanto maior será a exigência
de eficiência reprodutiva (NEVES et al., 2002).
A transferência de embriões (T.E.) é técnica que visa aumentar o
número de descendentes de uma fêmea durante a sua vida. Devido ao período
de gestação dos bovinos ser de ± 275 dias e aos problemas pós parto, só
conseguimos de cada vaca no máximo um bezerro a cada ano, isso com
trabalho e controle reprodutivo excelente. Com a TE pode-se obter vários
produtos ao ano. A técnica em si, consiste na administração de hormônio
folículo estimulante FSH (hormônio hipofisário) possibilitando que a doadora
produza várias ovulações, num processo denominado de superovulação .
Em função do importante papel econômico e social dos rebanhos
zebuínos na pecuária brasileira e do interesse nacional e internacional na
aquisição e multiplicação de animais de elevado valor genético, o mercado de
embriões cresceu bastante nos anos noventa (FONSECA et al., 2001).
Cabe ressaltar que a T.E., por si só, não promove o melhoramento
genético de nenhuma raça, ela apenas multiplica o material genético de uma
doadora e do reprodutor utilizado. Desse modo, nos critérios utilizados para a
escolha de uma doadora, além do econômico, sanitário e reprodutivo, deve
8
estar obrigatoriamente, o valor genético que o animal representa para o
criatório, em particular, e para toda a raça em geral.
2. HISTÓRICO
A primeira transferência de embriões (TE) com sucesso foi realizada em
1951 na Universidade de Cornell, nos Estados Unidos (KANAGAWA et al.,
1995), sendo que a primeira transferência de embriões foi feita em coelhos, no
ano de 1891. No decorrer destes anos, a técnica foi se aprimorando, sendo que
no início, os procedimentos eram quase todos cirúrgicos.
Com a evolução da técnica, os procedimentos foram sendo simplificados
e, hoje em dia quase não se utiliza mais a cirurgia. Outro evento que
possibilitou o grande salto para o desenvolvimento da técnica foi a descoberta
das propriedades crioprotetoras do glicerol, no início da década de 50, o que
possibilitou a congelação dos embriões excedentes.
Em coseqüência disso, houve grande difusão de material genético
através de sêmen e embriões congelados que passaram a ser comercializados.
Também a técnica de congelação de embriões evoluiu muito, sendo que hoje
temos a técnica da transferência direta, utilizando o etilenoglicol .
Quase 90% das transferências de embriões com finalidade comercial em
todo mundo, são feitas em bovinos (leiteiros e de corte). São nessas espécies
que as técnicas estão mais desenvolvidas (CARDELLINO & OSÓRIO, 1999).
3. SELEÇÃO DA DOADORA
O uso de biotécnicas intensificadoras das taxas reprodutivas tem como
principal conseqüência, devido ao uso de menor número de pais para a
9
formação das próximas gerações, uma significativa mudança nas freqüências
gênicas das populações. Se essas técnicas se utilizarem de material genético
de alta e comprovada qualidade, um expressivo aumento no ganho genético
será obtido (Ferraz, et al. 2001).
O primeiro passo para iniciar um programa de T.E. é a seleção das doadoras
que podem ser vacas ou novilhas, devendo ser os melhores animais da criação
no caso dos animais já existentes no plantel, ou aquisições de animais com
boa avaliação genética. Um critério importante, na compra de doadora, é optar
sempre que possível por novilhas, ou no caso de vacas provadas, que elas
tenham um histórico reprodutivo onde não conste nenhum problema,
apresentado filhos com bom desempenho de produção. Estes animais devem
possuir as características que queremos transmitir aos descendentes. Existem
alguns critérios que devemos considerar e avaliar para selecionar uma
receptora como:
3.1. Sinais clínicos e reprodutivos:
A performance reprodutiva
das matrizes doadoras está relacionada profundamente aos resultados e dá-se
preferência aos animais com fertilidade comprovada, regularidade no intervalo
entre cios, ausência de patologias uterinas e ovarianas.
3.2. Controle sanitário efetivo:
Deve ser rígido, com exames
frequêntes de brucelose e tuberculose, além de testes regulares de IBR, BVD e
leptospirose. Esse controle deve ser realizado tanto na doadora quanto na
receptora.
3.3. Genética:
deve prevalecer a orientação técnica rigorosa aos
acasalamentos, uma vez que os produtos devem ser melhorados em
10
relação aos progenitores. O teste de progêne constitui o principal papel na
seleção de doadoras e touros para o programa de T.E. (NICOLAU, 2001)
3.4. Nível de resposta à superovulação:
A variação do
número de embriões após diferentes tratamentos superovulatórios tem sido
atribuída a fatores individuais, utilizando tratamentos idênticos, dão obtidas
respostas altamente variáveis. (Prado, 2005).
4. SUPEROVULAÇÃO
Denomina-se superovulação ao aumento do número fisiológico de
ovulações próprias da espécie, provocada mediante a administração de
gonadotrofinas. No bovino, se considera que houve resposta ao tratamento
quando se produzem mais de duas ovulações. A superovulação deve ser
complementada com um regime ótimo de inseminação artificial, utilizando
sêmen de excelente qualidade (CABODEVILA & TORQUATI, 2001).
O
hormônio
folículo
estimulante
(FSH)
tem
função
essencial
no
desenvolvimento dos folículos. O uso de FSH exógeno para induzir a
superovulação é baseado nessa função fisiológica. Folículos em vários
estágios de desenvolvimento estão normalmente presentes nos ovários, em
qualquer tempo. Grupos consecutivos de folículos pequenos crescem, maturam
e se degeneram ou ovulam. O FSH estimula o crescimento dos folículos
pequenos. FSH exógeno reverte a atresia de folículos acima de 1,7mm. O
hormônio luteinizante (LH) estimula a produção de andrógenos na teca interna.
Andrógenos tecais são usados como precursores para a produção de
estrógenos pelas células granulosas que foram estimuladas pelo FSH (BÉNYEI
& BARROS, 2000).
11
O crescimento dos folículos ovarianos em bovinos ocorre em padrão
denominado ondas de crescimento folicular, onde em um ciclo há normalmente
a emergência de duas ou três ondas de crescimento folicular. Durante o ciclo
estral uma onda de folículos emerge entre os dias 1 e 3 após o estro. São
geralmente, em torno de 10 a 50 folículos neste grupo com o tamanho de 2 à
3mm cada. Nos dias subseqüentes, parte desses folículos crescem para 4 à
6mm, sendo que 2 à 5 folículos maiores do grupo continuarão a crescer
enquanto que os outros regridem. Neste grupo de folículos pelo menos um
continuará a crescer e se torna dominante, momento este denominado
divergência, após isso essa onda na maioria das vezes inicia sua atresia
(MOREIRA, 2002).
Estes folículos a mais que se tornam “ovulatórios” pertencem a uma
onda de desenvolvimento, e normalmente sofrem atresia. Com a indução
hormonal fornecemos também a estes folículos condição para ovular. Não
utilizamos hormônios visando a ovulação dos mesmos; a onda pré-ovulatória
de LH que provocaria a ovulação de um folículo único no caso de um ciclo
normal, é suficiente para induzir a ovulação de todos os que estiverem em
condições para tal, após o processo de indução hormonal.
Independente do tipo ou dose do hormônio utilizado, os mesmos não
desenvolvem os folículos que já sofreram atresia, ou seja, o protocolo de
superovulação deve ser iniciado numa fase da onda de desenvolvimento
folicular onde o folículo dominante não tenha provocado o início da atresia dos
folículos subordinados.
O crescimento folicular pode ser sincronizado com diferentes drogas tal
como progesterona, estradiol, uma combinação de progesterona e estradiol,
12
GnRH. O emprego de progesterona ou progestágenos em doses elevadas
pode suprimir o suporte de LH para o folículo dominante induzindo assim
atresia do folículo (THATCHER et al., 2001).
4.1. TIPOS E DOSAGEM DE HORMÔNIOS
4.1.1. ECG (ou PMSG): Trata-se de um hormônio denominado
Gonadotrofina Coriônica Eqüina. É obtido do soro de éguas entre o 40o e o
100o dia de gestação e possui ação semelhante ao FSH e LH na mesma
molécula. Atualmente não é muito utilizado devido os problemas de
hiperestimulação (age por muito tempo devido a meia vida muito longa) e dos
efeitos indesejáveis do LH, que pode provocar uma luteinisação prematura dos
folículos antes da ovulação.
A dose recomendada é uma única aplicação, do 9o ao 11o dia do ciclo e
a aplicação de prostaglandina (PGF) dois dias mais tarde.
4.1.2 .FSH: É a preparação hormonal mais utilizada na superovulação
de bovinos. A maioria dos produtos disponíveis hoje no mercado é de origem
suína, sendo extraída da hipófise dos mesmos obtidos em matadouros. Um dos
maiores problemas enfrentados por quem usa este produto é a variação
existente entre as partidas, pois parece que os fabricantes não conseguiram
padronizar a potência biológica destes hormônios de origem animal, problema
este que será solucionado com a produção em laboratório deste produto
(NICOLAU, 2001).
Outro problema desta preparação comercial é que existe uma
“contaminação” do FSH pelo LH que também é produzido pela hipófise do
13
suíno, possui uma semelhança estrutural com o FSH sendo difícil à separação
de ambos. Como já foi dito um excesso de LH pode causar uma luteinisação
precoce dos folículos. A literatura considera a relação máxima permitida entre
FSH e LH seja de 5:1.
A dose utilizada varia de acordo com o produto comercial, porém cabe ao
técnico adequar a dose e o produto à cada animal em questão, infelizmente
não existem padrões para a utilização dos mesmos nas diferentes raças
existentes no país.
Na tabela abaixo estão relacionados os principais produtos a base de
FSH disponíveis no mercado nacional.
Nome
Laboratório
Dosagem / Animal
Schering
25 a 40 mg
comercial
FSH-p
Plough
FOLLTROPIN
Leivas Leite
12 a 18 mg
SUPER – OV
Tyler (EUA)
75 UI
OVAGEN
ICP
12 a 18 mg
PLUSET
Serono
200 a 400 UI
4.2. PROTOCOLOS PARA SUPEROVULAÇÃO
Existem diversos protocolos de superovulação, utilizando o cio natural
ou em qualquer fase do ciclo estral. No cio natural inicia-se o tratamento préovulatório entre 8 à 12 dias após a manifestação do estro, coincidindo com o
início da segunda onda folicular. Realizam-se 8 aplicações de FSH com
intervalos de 12 horas, para aumentar o recrutamento dos folículos. No terceiro
14
dia da superovulação realizam-se 2 aplicações de prostaglandina com o intuito
da luteólise do corpo lúteo, para que haja redução da progesterona e
conseqüente pico de LH, correndo assim a ovulação (BÓ, 2002). Como se
segue o protocolo abaixo.
Protocolo 1
Dia
Manhã
0
Estro
Tarde
10
FSH
11
FSH
12
FSH
13
FSH
14
Cio
FSH
FSH
FSH +
PGF2α
FSH
IA
15
IA
A introdução do benzoato de estradiol em protocolos de superovulação
tem a função de suprimir o desenvolvimento folicular e sua resposta em
tratamentos superovulatórios, sendo mais eficaz quando combinado com
aplicação intramuscular de progesterona (P4) intramuscular na introdução de
implante vaginal, CIDR®3, ou auricular, CRESTAR®4, de progesterona. Segue
o protocolo abaixo. (Prado, 2005)
Protocolo 2
Dia
Manhã
Tarde
0
4
P4 + E2 FSH
? CIDR
FSH
5
FSH
6
FSH
FSH
FSH +
PGF2α
7
FSH
? CIDR
FSH
8
Cio
9
IA
IA
5. COLHEITA DOS EMBRIÕES
Os embriões bovinos, destinados a um programa de TE são obtidos por
métodos não cirúrgicos. Sua recuperação e transferência com êxito dependem
de vários fatores. Entre estes fatores estão:
A vitalidade, pois os embriões precisam ser resistentes para suportarem
a colheita do trato genital da doadora, a avaliação “in-vitro” e a transferência
15
para a doadora, passando meios e temperaturas variadas. O método utilizado
na colheita dos embriões é o circuito fechado com fluxo descontínuo. Neste
método se utiliza um cateter de duas vias, um tubo em “Y”de PVC estéril
(Sonda de Foley), uma bolsa com líquido de lavagem (PBS de Dulbecco) e um
filtro coletor de embriões estéril. A sonda de Foley utilizada é a de uso humano,
devido ao seu baixo custo em relação ao de uso animal. Esta sonda possui
vários tamanhos onde sua utilizada de acordo com o diâmetro da luz cervical.
(Prado, 2005).
A colheita de embriões bovinos é feita através de uma lavagem uterina,
com auxílio da referida sonda instalada no corpo do útero. O líquido para coleta
dos embriões é introduzido e recuperado do útero por gravidade e,
posteriormente, filtrado (CNPT.EMBRAPA, 2001). É uma etapa relativamente
simples do programa de TE que realmente depende do técnico. Envolve
equipamento adequado, boa contenção da doadora, e sobre tudo sensibilidade
e o conhecimento do profissional, executando os procedimentos com
segurança e tranqüilidade. O processo de coleta tem algumas exigências:
5.1. Local: O local da coleta deve ser coberto, dispor de eletricidade, água
corrente, possuir um tronco adequado para contenção da doadora e
principalmente possuir uma condição boa de higiene.
16
5.2. Preparação da doadora: Primeiramente é feita a higienização da região
perineal doadora com água, sabão e um anti-séptico,. Após a higiene é feita
uma anestesia epidural baixa com Lidocaína (5 ml), que provocará uma
paralisia nas contrações retais facilitando a manipulação dos equipamentos e
do útero, além de auxiliar na contenção.
5.3. Materiais para coleta: Cateter de Foley, meio PBS de Dulbecco,
mangueiras de silicone com “ Y ” para conexão no cateter, filtros, ambos
esterelizados, além de placas de tomcat, seringa de 20 ml, agulhas 4x10
(epidural), pipetador automático ou seringa de insulina para manipular os
embriões, placas de Petri (de vidro esterelizadas ou descartáveis) grandes e
pequenas, meio SFB (soro fetal bovino) para “lavagem” dos embriões, paillet
para envasamento, aplicador e bainha 0,25mm para implantação dos embriões.
5.4. Procedimento da coleta: Antes de introduzir a sonda, esta deve ser
enxaguada com solução de lavagem uterina (PBS). Isto ajuda a lubrificar e
eliminar as impurezas que poderiam ficar retidas depois da esterilização com
óxido de etileno, que possui ação embriotóxica. Após a anestesia epidural, é
feita a limpeza do reto, em seguida é introduzido o cateter de Foley e inflado o
balão logo após o final do colo do útero, com o cateter em posição correta
libera-se o PBS de Dulbecco até encher os cornos, faz-se uma massagem para
movimentar o líquido e drena-se pela mangueira que está ligada ao filtro, não
deixando o filtro esvaziar completamente, porém o líquido não pode encostar
na tampa do filtro. Podemos também desprezar o líquido do lavado dentro de
um recipiente graduado (1000 ml ou mais) para verificar se todo líquido que foi
utilizado foi eliminado. É muito importante não deixar líquido no útero. Se a
17
lavagem ocorreu de maneira correta e sem problemas, o balão é esvaziado e o
cateter retirado.
6. BUSCA DOS EMBRIÕES
A busca é realizada com o auxílio de um Estereomicroscópio (lupa com
aumento de 40x a 60x). Após a coleta se deixa apenas o mínimo de PBS
necessário no filtro, que deve ser cuidadosamente lavado com mais PBS,
epositando em seguida, o líquido em uma placa de Petri, esperar alguns
minutos para a sedimentação dos embriões no fundo da placa para iniciar a
busca e manipulação dos embriões com auxílio da lupa e do Tomcat.
Simultaneamente devem estar preparadas as placas de Petri pequenas com
soro fetal, onde são depositados todos os embriões encontrados, sendo
necessária três passagens nos embriões pelo soro fetal. Após o terceiro banho
os embriões são avaliados e classificados antes da implantação.
7. AVALIAÇÃO DOS EMBRIÕES
Na avaliação morfológica de um embrião são considerados os seguintes
critérios sobre as estruturas:
Forma esferóide;
Simetria dos blastômeros;
Aparência clara e nítida dos blastômeros;
Tonalidade escura e uniforme;
Uniformidade da membrana celular;
Proporcionalidade entre o embrião e o espaço perivitelíneo;
18
Integridade da zona pelúcia;
Ausência de vacúolo no embrião e fragmentos celulares no espaço
perivitelíneo;
Ausência de fragmentos celulares aderidos à zona pelúcida;
Compactação dos blastômeros entre si.
As estruturas encontradas devem ser transferidas para outro recipiente,
procurando-se mantê-las sempre agrupadas, pois a avaliação se torna mais
apurada com a comparação entre as estruturas encontradas. A avaliação
morfológica é muito, subjetiva, e cada profissional acaba desenvolvendo critério
próprio de avaliação, pois nem sempre as estruturas que se encontram na
literatura são iguais às estruturas encontradas na prática. Os embriões podem
ser classificados por categorias e por qualidade de acordo com a SBTE
(Sociedade Brasileira de Transferência de Embriões).
7.1. CATEGORIAS
De acordo com a SBTE:
7.1.1. Mórula - Mo - Apresenta-se como uma massa de células com
separação nítida entre os blastômeros, e ocupa quase a totalidade do espaço
perivitelino.
19
Figura 2: Mórula – Fonte : SBTE
7.1.2. Mórula Compacta - Mo - Os blastômeros estão agregados entre si,
formando uma massa compacta de células e ocupam cerca de 70% do espaço
perivitelino.
Figura 2: Mórula compacta – Fonte: SBTE
7.1.3. Blastocisto Inicial - Bi - Nesta fase pode ser observado o início
da blastocele. Começa a ocorrer a diferenciação entre trofoblasto e botão
embrionário.
20
Figura 3: Blastocisto inicial – Fonte: SBTE
7.1.4. Blastocisto - Bl - Ocorre uma evidente diferenciação entre células do
trofoblasto e botão embrionário.
Figura 4: Blastocisto – Fonte : SBTE
7.1.5. Blastocisto Expandido - Bx - O embrião ocupa todo o espaço
perivitelino. O líquido da blastocele empurra o trofoblasto contra a
membrana pelúcida.
21
Figura 5: Blastocisto expandido – Fonte: SBTE
7.1.6. Blastocisto em Eclosão - Bn - Início da saída da membrana
pelúcida.
7.1.7. Blastocisto Eclodido - Be - O embrião está completamente livre da
membrana pelúcida.
Figura 7: Blastocisto eclodido – Fonte: SBTE
7.2. QUALIDADE
Além das categorias os embriões também são separados pela qualidade.
22
7.2.1. Embrião I (excelente): é o embrião ideal, esférico. Os blastômeros
estão bem agregados entre si e sua forma bem definida e homogênea e
nenhuma célula extrusa.
7.2.2. Embrião II (Bom): existem poucas imperfeições sem importância
com poucas células extrusas. Pode haver pequena alteração na forma e na
coloração dos blastômeros e/ou presença de vesículas.
7.2.3. Embrião III (Regular): algumas células apresentam forma e
coloração heterogênea, porém coesos. Células extrusas e a blastocele com
algumas vesículas.
7.2.4. Embrião IV (Pobre): forma e coloração heterogênea, distinção
celular confusa, degeneração e extrusão evidentes e grande número de
vesículas.
7.2.5. Embrião Degenerado - Dg: grande desorganização celular;
coloração tendendo a negra; sem forma definida.
7.2.6. Não fecundado - Nf: somente granulações. Sem nenhum contorno
celular.
8. SELEÇÃO DAS RECEPTORAS
As receptoras são de importância fundamental no processo de
transferência de embriões, pois são elas que farão com que o embrião
implantado se desenvolva durante o período da gestação. Deverão ser
selecioadas de modo a ter grande possibilidade de parto sem complicações. E
amamentação
adequada
do
bezerro,
propiciando
o
máximo
de
desenvolvimento do bezerro nesta fase. As receptoras utilizadas são,
23
normalmente, novilhas girolandas ou oriundas de cruzamento industrial (zebu x
europeu).
Normalmente utilizamos dois tipos de receptoras, sendo o primeiro tipo
mais utilizado o das girolandas, que são animais dóceis, com boa produção
leiteira e, dependendo da região, encontradas com facilidade. O segundo tipo
de receptora mais utilizada são os animais meio-sangue, resultantes do
cruzamento do nelore com alguma outra raça. Normalmente as raças mais
encontradas e utilizadas com bons resultados são as meio-sangue simental,
pardo suíço, etc. Estes animais têm como vantagem a facilidade de parto, por
se tratar de animais grandes, boa produção de leite, e dependendo da região,
encontradas com facilidade.
Todas as receptoras devem apresentar exame negativo para tuberculose e
brucelose, e também ser regularmente vacinadas contra leptospirose e IBR,
dependendo do esquema de vacinação adotado na região.
9. TRANSFERÊNCIA OU IMPLANTAÇÃO DOS EMBRIÕES.
Hoje em dia a transferência propriamente dita se dá de forma prática e
rápida, sem necessidade de procedimento cirúrgico, como era feito
inicialmente. O processo atual é semelhante ao procedimento de IA
(Inseminação Artificial) utilizando os seguintes materiais: palhetas de 0,25 mm,
seringa de 1 ml com adptador para palheta, aplicador com bainhas para
palheta 0,25 mm, camisa sanitária, seringa de 10 ml, agulha 40x16 e xilocaína
para anestesia epidural.
24
O procedimento é muito semelhante ao processo de IA. O embrião é
envasado na palheta com PBS, depois monta-se a palheta na bainha e colocase o aplicador, enquanto se monta o aplicador a receptora já foi anestesiada e
teve o reto limpo, a epidural é utilizada para facilitar a manipulação do útero
pois diminui as contrações retais. O embrião é implantado no corno uterino
epilateraltiver com Corpo Lúteo bem desenvolvido, ou seja, do lado que tenha o
ovário com folículo ovulado, devendo ainda se avaliar o tamanho deste CL, que
é critério utilizado para determinar a dispensa da receptora, devendo,para tanto
existir animais reservas para a substituição.
10. CRIOPRESERVAÇÃO DOS EMBRIÕES.
10.1. CONGELAÇÃO
A congelação de embriões é recurso utilizado o número de estruturas
viáveis obtidas na colheita excede o de receptoras, não possibilitando a
implantação de todos os embriões “a fresco”. Normalmente esses embriões
excedentes são congelados quando apresentam classificação tipo I e II e zona
pelúcida intacta.
Na técnica de congelação convencional ou de equilíbrio, os embriões
são colocados numa solução concentrada de glicerol (1,4M de PBS
suplementado com BSA) a temperatura ambiente e mantido por 20 minutos
para que ocorra o equilíbrio. Um embrião é colocado em uma palheta francesa
de 0,25 ou 0,5 ml. Durante o processo de resfriamento, as palhetas sofrem a
semeadura ou seeding (indução de cristalização, -4 a -7ºC), e o resfriamento é
25
continuado a uma taxa de 0,3 a 0,5ºC/min até -30ºC,quando os embriões
bovinos são mergulhados no nitrogênio líquido (N2L). (Hafez, 2004)
Esquema da disposição do embrião na palheta.
Bucha Meio
Ar
Embrião + Meio Ar
Meio
Ar
Meio
Bucha
10.2. DESCONGELAÇÃO
Na descongelação as palhetas contendo os embriões criopreservados
são transferidas do tanque de estoque de nitrogênio e colocadas em banhomaria a 37 ºC e delicadamente agitadas na água até que o gelo tenha
desaparecido. Quando descongelada a palheta, os embriões são retirados da
mesma e depositados em uma placa de Petri, que contém solução de
crioprotetor, onde podem ser facilmente observados com microscópio,
contados e removidos com micropipeta. (Hafez, 2004).
Os embriões devem ser re-hidratados por banhos em soluções de
crioprotetores sucessivamente menos concentrados, para retirada dos mesmos
interior do embrião. Após todo esse processo de descongelação e rehidratação dos embriões, eles estão prontos para serem transferidos. As
concentrações de crioprotetor são demonstradas nas diluições abaixo:
Solução 1 – PBS (BSA 0,4%) – 1 ml
10 ml
Sol. Glicerol 10% - 6 ml
Por 5 minutos
Sol. Sacarose 1 M – 3 ml
Solução 2 - – PBS (BSA 0,4%) – 4 ml
10 ml
Sol. Glicerol 10% - 3 ml
Por 5 minutos
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Sol. Sacarose 1 M – 3 ml
Solução 3 – PBS (BSA 0,4 %) – 7 ml
10 ml
Sol. Sacarose 1 M – 3 ml
Por 5 minutos
O aquecimento rápido do processo de descongelação, limita a
quantidade de crescimento de cristais de gelo o que em geral resulta na
sobrevivência do embrião. Os embriões são sensíveis ao aquecimento rápido,
presumivelmente como resultado de um grande estresse osmótico temporário
que ocorre durante o aquecimento. Esse estresse ocorre na medida que o gelo
e convertido em água livre, resultando na exposição temporária a uma solução
que é hipertônica em relação ao interior das células. Os embriões devem
absorver água de seu ambiente para permanecer em equilíbrio osmótico e para
retornar ao seu volume isotônico normal. Uma vez que a maior parte das
reações metabólicas é suspensa ou drasticamente reduzida durante a
criopreservação, os embriões são bastante suscetíveis ao aquecimento ou
choque de diluição nesse estágio.
11. CONCLUSÃO
As técnicas de Transferência de Embriões (T.E.) e Superovulação
(S.O.V.) se mostram muito eficientes na busca dos resultados desejados, como
maior
eficiência
produtiva
do
rebanho,
multiplicação
do
material
e
características genéticas desejadas, além de promover uma maior eficiência
reprodutiva das fêmeas, conseguindo produzir mais de um bezerro por ano.
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É uma técnica de fácil aplicação, no entanto requerem cuidados e
critérios, como de seleção das doadoras, das receptoras, principalmente
durante o processo de S.O.V. de implantação dos embriões colhidos e da
congelação e descongelação das estruturas excedentes, pois os resultados
podem não ser os desejados se esses critérios não forem seguidos
É de extrema importância um profissional capacitado para aplicação da
técnica, pois se a mesma for utilizada de forma errada vai causar grande perda
genética e econômica.
12. BIBLIOGRAFIA
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