NUCLÉOLO
Profa. Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira
Pós Graduanda Priscila Pasqüetto Mendonça
NUCLÉOLO
- Estrutura + facilmente visível (sem qualquer coloração):
↑ índice de refração
- Descrito por Fontana (1781) e denominado por Valentin
(1839)
- Organela celular, cuja função é a de produzir ribossomos
- Geralmente ovalada
- Ausência de membrana ao redor (sem barreira de difusão)
Tamanho, forma e número
depende do estado funcional da célula
- Tamanho
- Grandes: glândulas e neurônios
- Pequenos: céls da glia e endotélio
- Número
- Normalmente 1 (linfócitos humanos)
- +1: hepatócitos, céls vegetais (tulipas: 6-13)
- Ovócitos de anfíbios: 3000
Composição Química
- RNA: 3-17% (pp RNAr) (RNP)
- DNAr: até 17% (seqüências altamente repetidas)
- Proteínas: até 85%
- histonas
- acídicas: Numatrina, Nucleolina,
Ribogranulina
- enzimas: RNA polimerase I,
DNA topoisomerase I e II
Métodos de Estudo
Microscopia de Luz
- Métodos citoquímicos de basofilia (AgNOR, Azul de Toluidina
e Variante da Concentração Eletrolítica Crítica)
Cromatina
↓ esverdeada
<
←
Nucléolo - azul
*
D1, D2 - T. infestans ♂
D3 - T. infestans ♂
Métodos de Estudo
Microscopia de Luz
-Acridina Orange (RNA avermelhado, DNA esverdeado)
- Microscopia de contraste de fase
Métodos de Estudo
Impregnação por íons prata no cito diagnóstico do câncer
Nucléolo x Citodiagnóstico
Parâmetros:
• Tamanho
• Número
• Forma
• Razão área N
nu
Métodos de Estudo
Microscopia Eletrônica
- Método de Bernhard
→ RNA + proteínas: elétrondensos
→ DNA: eletronlúcidos
Métodos de Estudo
Além de...
- Análises bioquímicas e microespectrofotometria
- Autorradiografia
- Agentes inibidores do RNAr
- Análises moleculares
L Rd
Rn
Rr
Tb
Ti
Tv
L
Experimento realizado na
região espaçadora ITS-1
- Estudaram as regiões
espaçadoras ITS-1 da Região
Organizadora Nucleolar
(RON)
A
L
Ph
Pm
Tb
Ti
Tv Rd Rn
Rr
L
2.036
163 6
1018
- Migração das moléculas de
RNAr
506
B
Figura 1. (A) e (B) Polimorfismo de tamanho para a
região ITS-1 do DNAr de triatomíneos.Os valores
aproximados em pares de base são: Ph 600 pb, Pm
800 pb, Tb 850 pb, Ti 750 pb e Tv 1000 pb, Rd e Rn
300 pb, Rr 250 pb. Letra L designa os marcadores de
tamanho molecular (1Kb Ladder, Gibco).
Tartarotti,E & Ceron, C. R, 2002
Morfologia do Nucléolo
No microscópio de luz: simples
- ovalada, no máximo alguns vacúolos
No microscópio eletrônico: três grandes regiões
Centro Fibrilar (CF)
Componente Fibrilar Denso
(CFD)
Componente Granular (CG)
Morfologia do Nucléolo (MET)
1) Centro Fibrilar (CF)
- Conjunto de finas fibrilas (4-8nm)
- ↑ atividade transcricional, ↑ n° e tamanho dos CFs
- Composição Química: DNAr,
DNA topoisomerase I, RNA
polimerase I, RNP, Nucleolina,
Numatrina, Fibrilarina
Centro Fibrilar (CF)
Morfologia do Nucléolo (MET)
2) Componente Fibrilar Denso (CFD)
- Fibrilas densamente empacotadas → redes
- Ao redor dos CFs
- Composição Química: DNAr , RNA polimerase I, Fibrilarina,
Nucleolina, Numatrina
Componente Fibrilar Denso
(CFD)
Morfologia do Nucléolo (MET)
3) Componente Granular (CG)
- Estruturas granulares de 10 a 15nm de diâmetro
- Periferia, ao redor do CFD
- Local de armazenamento das pré unidades ribossômicas
- Composição Química: RNP, Fibrilarina, Nucleolina,
Ribogranulina
Componente Granular (CG)
Morfologia do Nucléolo
Morfologia do Nucléolo (MET)
Vários Centros Fibrilares
Alta transcrição
Morfologia do Nucléolo (MET)
4) Esqueleto Nucleolar
- Região amorfa relacionada com o esqueleto nuclear
- Composição Química: Proteínas acídicas
5) Vacúolos Nucleolares
- Áreas “vazias”????
- Dúvidas... Artefatos??? ... Áreas menos densas???
Morfologia do Nucléolo (MET)
6) Cromatina associada ao Nucléolo
- Ao redor – envia ramificações intranucleolares
- Cromatina perinucleolar – não faz parte do nucléolo
- Segmentos cromossômicos específicos - RONs
Tipos de Nucléolo
a) Nucléolos Reticulados
(nucleolonemas)
- Região granular periférica + Região
fibrilar central
EX: Triatoma infestans
b) Compactos
- Essencialmente granulosos (massa
celular compacta e anastomosada)
EX: Allium cepa
c) Em anel
Camadas concêntricas:
- central filamentosa
- cortical granulosa
EX: Anfíbios
Fisiologia do Nucléolo
- Biogênese dos RIBOSSOMOS
- Função bem estabelecida com observações de Brown em 1964
(Xenopus laevis)
- Defeito cromossômico: formação dos nucléolos (perda de DNAr)
- Número de nucléolos: 2 (AA), 1 (Aa), e nenhum (aa)
Aa X Aa
¼ AA: ½ Aa: ¼ aa
Experimento de Miller e Beatty (1967)
- Ovócitos de Triturus viridescens
- Choque osmótico – separação das regiões nucleolares
- CF: filamento axial de DNA recoberto, a intervalos regulares,
por RNA 45S transcrito
- CG: moléculas de RNA precursor da grande subunidade 32S
Experimento de Miller e Beatty (1967)
Experimento de Miller e Beatty (1967)
- DNAr em tandem
- Muitas moléculas de RNAr transcritas
- Regiões de DNA espaçador
- “Árvore de Natal”
Experimento de Miller e Beatty (1967)
- Cada RNA polimerase se associa ao promotor , e se move ao
longo do DNAr
Metabolismo Nucleolar
RON: motivo genético altamente redundante
DNA Espaçador; ITS: Segmentos intercalares transcritos; ETS: Seqüência externa transcrita
Metabolismo Nucleolar
Metabolismo Nucleolar
Subunidade maior (60S):
RNAr 28S + RNAr 5,8S
+ RNAr 5S + proteínas
nucleolares
Subunidade menor (40S):
RNAr 18S + proteínas
nucleolares
Proteínas nuleolares: Importadas do citoplasma
S = Unidade de Sweedberg – é a unidade que se utiliza na medida da velocidade com
a qual se sedimentam as partículas no campo de centrifugação. Ocorre influência do
tamanho, densidade e forma da partícula e também do meio no qual as partículas estão
suspensas.
Metabolismo Nucleolar
Processamento do RNA:
RNA 45 S
RNA 32 S
RNA 28 S
+
RNA 5,8 S
+ RNA 5 S
RNA 20 S
RNA 18 S
Subunidade
menor
Subunidade
maior
Metabolismo Nucleolar
As proteínas nucleolares (ou ribossomais) são importadas para o nucléolo a partir do
citoplasma e começam a unir-se ao pré-RNAr (RNA 45 S) antes de sua clivagem.
Enquanto o pré-RNAr é processado, proteínas nucleolares adicionais e o RNAr 5 S
(transcrito de uma outra região que não pertence à RON) unem-se para formar partículas
pré-ribossomais. Os passos finais da maturação seguem a exportação de partículas préribossomais para o citoplasma, produzindo as subunidades ribossomais 40 S e 60 S
Regiões Organizadoras Nucleolares (RONs)
- Moldes de DNA relacionados com a síntese de estruturas
nucleolares – zonas de constricções secundárias que
apresentam regiões satélites
- RONs: local do cromossomo responsável pela codificação do
RNA 45S
Cromossomos Humanos
- zonas de constricções secundárias (ativamente transcritos)
- regiões satélites
Representação esquemática da metade
do cariótipo
Biogênese do Nucléolo
- Como o nucléolo se organiza??!!
- Presente durante intérfase e início da prófase
- “Desaparece”: final da prófase (mitose) e no
diplóteno (meiose)
- “Reaparece” na telófase
Biogênese do Nucléolo
No Homem: após a mitose, dez pequenos
nucléolos são formados, que rapidamente se
fundem, formando um único e grande nucléolo
A aparência do nucléolo muda
dramaticamente durante as diferentes fases
do ciclo celular
Dez pontinhos, representando os
dez cromossomos portadores das
RONs
Biogênese do Nucléolo
Três hipóteses:
1) Reconstrução do nucléolo a partir dos corpúsculos prénucleolares que estão agrupados junto as RONs
2) Reconstrução a partir de uma Matriz pré-existente
3) Formação de estrutura totalmente nova a partir da RON