Controle da expressão gênica
Prof. Dr. José Luis da C. Silva
Controle da Expressão gênica
Procariotos
Princípios da regulação gênica
Organismos procariontes e eucariontes são
sensíveis à pequenas variações do meio ambiente, tais
como a disponibilidade de nutrientes, sinais hormonais,
etc.
Assim a regulação da expressão dos seus genes às
necessidades celulares objetiva uma melhor adaptação
às variações do meio.
Princípios da regulação gênica
Genes para os produtos que são requeridos durante
todo o tempo são expressos em níveis constantes. São
os
chamados
genes
da
economia
doméstica
(housekeeping).
A expressão invariável destes genes é denominada de
expressão gênica constitutiva. Ex. Enzimas do Ciclo de
Krebs
Genes que são expressos em resposta a sinais
moleculares enquadram-se na expressão gênica
regulada. Estes genes podem ser induzidos ou
reprimidos de acordo com as necessidades celulares
Alvos da regulação gênica
Os principais alvos da regulação estão no nível de
transcrição e tradução da informação do mRNA.
“O problema básico que a célula enfrenta é possuir mecanismos
para reprimir ou desligar a transcrição de todos os genes
codificantes de enzimas que não são necessárias e ativar a
transcrição destes genes quando as enzimas são necessárias”
Proteínas reguladoras da transcrição
(ativadores, repressores)
Proteínas reguladoras geralmente ligam-se a sequências específicas
do DNA. A afinidade para essas sequências alvo é de 104 a 106 vezes
maior do que para outras regiões do DNA.
Essas proteínas possuem domínios (regiões pequenas e delimitadas)
de ligação ao DNA que interagem com as sequências alvo.
A maioria dos contatos que permitem especificidade incluem grupos
químicos das bases do DNA expostos no sulco principal do DNA.
Interações entre proteínas-DNA
Hélice-volta-hélice
Este motivo de ligação ao DNA é crucial para a interação de muitas
proteínas reguladoras procarióticas. Este motivo engloba cerca de 20 aa
em dois segmentos α-helicoidais separados por uma volta do tipo β.
Este é o domínio do repressor
do Operon da Lactose,
denominado de repressor Lac
Zíper de Leucina
Este motivo é uma α-hélice anfipática com aa hidrofóbicos em um dos
lados do motivo. Neste motivo, a cada 7 resíduos de aa há um Leucina
(Leu) formando uma linha reta ao longo da superfície hidrofóbica. O
domínio de ligação é rico em resíduos básicos (Lys ou Arg) que
interagem com cargas negativas dos fosfatos do DNA. São encontrados
em muitas proteínas reguladoras de eucariotos.
GCN4 de levedura
Regulação Transcricional
Sistemas operons da E. coli:
Operon lac (controlador da síntese das enzimas do
metabolismo de lactose),
•Operon
trp
(controle
da
sintetizadores de triptofano)
síntese
das
enzimas
Muitos genes estão em complexos chamados OPERONS, e
nestes
complexos
normalmente
existe
uma
proteína
repressora e uma ativadora da transcrição de vários genes
que,
atuando
em
"parceria",
determinam
características.
Modelo de operon procariótico
certas
OPERON LAC
No metabolismo da lactose
por E. coli são necessárias
duas enzimas que fazem
parte de um operon chamado
lac. A primeira enzima é
capaz de clivar a lactose em
glicose e galactose que assim
servirão como fonte de
carbono para a célula.
A β-galactosidase é dita uma enzima indutível, ou seja,
sua expressão varia com as necessidades celulares.
• Caso a bactéria esteja crescendo em meio rico em
lactose, sua expressão será alta;
• Caso a fonte de carbono seja outro carboidrato, sua
expressão será reduzida.
O Operon Lac está sujeito a regulação negativa
O gene I codifica o repressor Lac que é uma molécula com dois sítios
de reconhecimento, um que pode reconhecer a sequência operadora
específica para o operon Lac e outro que pode reconhecer a lactose
e alguns análogos da lactose. Na ausência da Lactose, os genes do
operon Lac estão reprimidos pela ligação do repressor Lac.
Repressão do Operon Lac
Operador principal
promotor do repressor Lac
Pseudo-operadores
A ligação dor repressor reduz a
transcrição por um fator de 100x,
mas não é absoluta
Repressor ligado aos operadores
O alívio da repressão é chamado de indução. Os derivados de lactose
que inativam o repressor e levam a expressão dos genes lac são
chamados de indutores.
Os indutores de lac são efetores alostéricos e quando se ligam
ao sítio alostérico, causam uma alteração conformacional na
proteína reguladora, alterando a estrutura do domínio de
ligação ao DNA
Regulação positiva do Operon Lac
A alta concentração do cAMP é necessária para a
ativação do operon lac.
Os mutantes que não podem converter ATP em cAMP
não podem ser induzidos a produzir β-galactosidase,
pois a concentração de cAMP não é grande o suficiente
para ativar o operon lac.
Em bactérias, o AMPc liga-se ao CAP ou
CRP (catabolite gene activator protein proteína ativadora de genes por
catabólitos; codificada pelo gene crp),
uma
proteína
dimérica
com
2
subunidades idênticas de 22Kd. Cada
subunidade possui um domínio de
ligação ao DNA e ao AMPc. Somente o
complexo CAP-AMPc é capaz de
estimular a transcrição e se ligar a
determinados promotores.
No operon lac, CAP se liga próximo a
região que se liga a RNA polimerase e
interage com a RNA polimerase.
Mas como se dá essa modulação da transcrição via
cAMP?
A ativação da transcrição exige duas condições
Com alta [glicose] não há
formação do complexo
CRP-AMPc
A Lactose não é suficiente
para induzir a ativação do
operon Lac
Mas como se dá essa modulação da transcrição via
cAMP?
Na ausência de lactose para servir de indutor, o repressor lac é
capaz de se ligar ao operador; independente dos níveis de cAMP
e da presença de CAP, a produção de mRNA é reprimida.
Com lactose presente para se ligar ao repressor, este é incapaz de
se ligar ao operador. Entretanto, apenas pequenas quantidades de
mRNA são produzidos, pois a presença de glucose mantém os
níveis de cAMP baixos e, portanto, não se forma o complexo
cAMP-CAP e não há ligação ao promotor.
Com o repressor inativado pela lactose e com altos níveis de
cAMP presentes (devido a ausência de glucose), cAMP liga-se à
CAP. O complexo cAMP-CAP é então capaz de se ligar ao
promotor e aumentar a trancrição em 50x. O operon lac é então
ativado e são produzidos grandes quantidades de mRNA.
Resposta estringente na síntese de rRNA
Em procariotos a síntese dos rRNA a partir dos 7 operons, responde à
taxa do crescimento celular e às alterações na disponibilidade dos
nutrientes cruciais, particularmente os aminoácidos.
Essa regulação coordenada é chamada de resposta estringente. Quando
as concentrações dos aa são baixas, a síntese do rRNA é interrompida.
A carência dos aa leva à ligação dos tRNAs não carregados no sítio A dos
ribossomos e isso desencadeia a ligação de uma enzima chamada de
fator de estringência (proteína RelA) ao ribossomo.
Mecanismo da resposta estringente
A proteína RelA catalisa a formação do
nucleotídeo não usual à Guanosina
Tetrafosfato
(ppGpp),
adicionando
pirofosfato à posição 3’ do GTP:
GTP + ATP
ppGpp + AMP
A elevação abrupta do ppGpp, em
resposta à carência dos aa, leva a uma
grande redução na síntese do rRNA,
medido em parte pela ligação do
ppGpp à RNA polimerase e inibição.
ppGpp e cAMP são nucleotídeos
modificados que atuam como 2°
mensageiros intracelulares.
Resposta SOS requer a destruição de proteínas
repressoras
A lesão abrangente do DNA no cromossomo bacteriano
desencadeia a indução de muitos genes envolvidos na resposta
SOS de reparo do DNA. Os elementos chave são a proteína RecA
e o repressor LexA.
O repressor LexA inibe a trancrição de todos os genes SOS e a
indução requer a remoção do LexA. O mecanismo é a autoclivagem do LexA com o auxílio da RecA produz 2 fragmentos
peptídicos inativos.
RecA não é uma protease, mas sua interação com LexA facilita a
reação de auto-clivagem, sendo chamada de atividade coprotease. A RecA fornece a ligação entre o sinal biológico (lesão
no DNA) e a indução dos genes SOS.
Mecanismo da resposta SOS
Lesões extensas no DNA
levam a ligação da proteína
RecA ao DNA fita simples,
quando RecA estiver ligada
facilitará a auto-clivagem
de LexA.
CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA EM
EUCARIOTO
Estrutura da Cromatina e regulação da expressão
Os cromossomos eucarióticos são maiores e têm um grau
mais complexo de organização estrutural do que os
procarióticos. Os genomas de levedura, mosca das frutas e
humanos contêm cerca de 4, 40 e 1000 vezes mais DNA,
respectivamente que o genoma de Escherichia coli. Esta
abundância dota os eucariontes de potencialidades que estão
ausentes nos procariontes e adiciona desafios à replicação e à
expressão.
Estado basal transcricional restritivo em eucariotos
Diferentemente de procariotos, os promotores fortes de eucariotos são
geralmente inativos in vivo na ausência de sequências regulatórias, ou
seja, o estado transcricional é restritivo.
Os genes eucarióticos requerem ativação para serem transcritos, o
que não ocorre em procariotos.
Em procariotos, não havendo repressores ligados os genes são
transcritos (não-restritivo)
Quatro características importantes que distinguem a
regulação da expressão em eucariotos do procariótico:
1: o acesso aos promotores eucarióticos é restrito pela
estrutura da cromatina, e a ativação da transcrição é
associada com alterações múltiplas na estrutura da
cromatina na região transcrita.
2: embora os elementos regulatórios positivos e negativos
sejam encontrados nas células eucarióticas, os mecanismos
positivos predominam em todos os sistemas caracterizados
até agora estudados. 3: As células eucarióticas possuem proteínas reguladoras
multiméricas maiores e mais complexas do que as
bactérias.
4: A transcrição no núcleo eucariótico está separada tanto
no espaço quanto no tempo da tradução no citoplasma.
Estrutura do gene eucariótico
CROMATINA
Como as histonas se combinam com o DNA para formar
a fibra de CROMATINA? Em 1974, Roger Kornberg
propôs que a cromatina é feita de unidades repetidas,
cada uma consistindo de 200pb de DNA e duas de cada
H2A, H2B, H3 e H4. Essas unidades repetidas são hoje
conhecidas como nucleossomos. A maior parte do DNA
envolve externamente um cerne de histonas. O restante
do DNA, chamado DNA ligante, une nucleossomos
adjacentes e contribui para a flexibilidade da fibra de
cromatina. Portanto, uma fibra de cromatina é uma
cadeia flexível de nucleossomos.
Estrutura da cromatina
Cromatina ativa e inativa
A transcrição de um gene eucariótico é fortemente reprimida quando o
DNA está condensado na forma de cromatina. Nucleases, como a DNase I
clivam o DNA em fragmentos com múltiplos de 200 pb, refletindo a
estrutura regular dos nucleossomos.
Nas regiões transcricionalmente ativas, os fragmentos produzidos pela
DNase I são menores e mais heterogêneos em tamanho. São regiões
chamadas de sítios de hipersensibilidade a DNase I, consistindo em cerca
de 100 a 200 pb dentro de 1000 pb que flanqueiam as extremidades 5’ dos
genes transcritos. Em alguns genes são encontradas na região 3’ e
dentro do gene.
Remodelagem da cromatina
As histonas possuem dois domínios estruturais distintos. Um
deles envolvido na interação histona-histona e um segundo
domínio aminoterminal rico em Lisina na superfície exterior
da partícula do nucleossomo montada. Esses resíduos de
Lisina são acetilados por histona acetiltransferases (HATs).
As HATs tipo B acetilam as histonas para montagem do
nucleossomo, a montagem das histonas também é facilitada
por proteínas adicionais: CAF1 e NAP.
As HATs tipo A auxiliam na acetilação no evento da
transcrição. As histonas deacetilases atuam no silenciamento
da transcrição gênica.
A cromatina é remodelada pela acetilação e por
deslocamentos nucleossomais
A cromatina transcricionalmente ativa tende a ser deficiente em
Histona H1 e as outras histonas são modificadas por acetilação
ou ubiquitinação.
Em genes ribossomais geralmente não são associadas as
histonas.
Estrutura do DNA e atividade gênica
Quatro níveis nos quais a expressão gênica pode ser
controlada:
1. Transcrição
2. Processamento
3. Estabilidade do mRNA
4. Tradução
O nível mais importante da regulação é o início de transcrição. A
partir de determinados sinais, sequências regulatórias são
reconhecidas, possibilitando a ativação de um gene ou grupo de
genes, havendo a transcrição, e posterior tradução do mRNA.
Nível transcricional da regulação
A iniciação da transcrição é dependente de fatores
ativadores (proteínas), transativadores.
A estruturação da cromatina é a provável razão para a
necessidade de regulação positiva, de forma que os
genes estão inativos na ausência de regulação.
Na regulação positiva, a maioria dos genes está
normalmente inativa (ou seja, a RNA pol não se liga
aos promotores) e a célula sintetiza apenas as
proteínas ativadoras necessárias para a transcrição de
um conjunto de genes.
Enhancers e UASs
A maioria das RNA pol II de eucariotos requerem além das sequências
TATA e Inr (Iniciadora), outras sequências adicionais requeridas para a
regulação da transcrição.
Enhancers são sequências intesificadoras nos eucariotos superiores e
UASs (sequências ativadoras a montante) em Leveduras. A localização
do enhancer pode ser à montante, jusante ou mesmo dentro do gene.
Quando proteínas reguladoras estão ligadas nestas sequências adicionais,
aumentam a transcrição dos promotores próximos, independentemente da
sua orientação no DNA.
Os
silenciadores
são
seqüências
de
ação
cis
que
são
ligadas
repressores, inibindo assim os ativadores e reduzindo a transcrição.
a
Alguns genes apresentam o enhancers (reforçador ou acentuador), localizados a
uma distancia maior do sítio de transcrição, tanto upstream como downstream (a
jusante), e que são capazes de estimular o nível de transcrição.
Tanto os promotores como os enhancers podem apresentar elementos que
respondam a estímulos, como choque de calor (heat shock), hormônios ou
metais.
Classes de proteínas ativadoras da Transcrição
Fatores basais de transcrição: requeridos pela RNA pol II
Transativadores:Ligam-se
facilitando a transcrição.
aos
Enhancers
e
UASs
Co-ativadores: Não agem diretamente no DNA, mas atuam
em interações proteínas-proteína. Proteínas repressoras
podem impedir estas interações.
Proteína de ligação à TATA (TBP)
Esta é a primeira proteína a se ligar no complexo de pré-iniciação na
sequência TATA de um promotor típico da RNA pol II.
Nesse complexo, estão vários fatores de transcrição gerais, que
pode não se formar na ausência de transativadores e co-ativadores.
Formadoras de alças
O modelo para ação a
distância inclui algum tipo
de dobra do DNA. Neste
modelo, uma alça de DNA
coloca
proteínas
ativadoras
ligadas
a
elementos
acentuadores
distantes em proximidade
a complexos protéicos
associados a seqüências de
ação cis proximais a
promotores.
Animação
Muitos promotores eucarióticos são regulados
positivamente
RNA polimerases eucarióticas possuem pouca ou nenhuma afinidade
intrínseca para os seus promotores: a iniciação da transcrição é, quase
sempre, dependente de múltiplas proteínas ativadoras (regulação positiva).
O armazenamento do DNA, dentro da cromatina, efetivamente torna a
maioria dos promotores inacessíveis. De forma que os genes estão
normalmente silenciosos na ausência de outra regulação.
Regulação do metabolismo da Galactose em Leveduras
Os genes das enzimas do metabolismo
da galactose em
leveduras estão dispersos em vários cromossomos e não estão
organizados em um operon como em bactérias. Entretanto, todos
os genes GAL possuem promotores semelhantes e são regulados
coordenadamente por um conjunto de proteínas comuns.
Repressão
Gal4p + Gal80p
Sinalização
Galactose + Gal3p
Genes do metabolismo da Galactose em Leveduras
A regulação pode ocorrer por meio da fosforilação de fatores de transcrição nuclear
em mamíferos