XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
INFLUÊNCIA DO EXTRATO METANÓLICO DO LÁTEX DE
Calotropis procera SOBRE ATIVIDADE BACTERICIDA DO SISTEMA
COMPLEMENTO
Ana Camily Oliveira da Costa1, Cynthia Priscylla Leão Pereira2, Danielle Cristina de Oliveira Nascimento 3, Maria
Taciana Ralph4, Nelito Jorge Andrade Monteiro2, Jaqueline Ellen Camelo Batista5, José Vitor Moreira Lima Filho 6

Introdução
Como parte da defesa do sistema antimicrobiano inato, o sistema complemento consiste de um conjunto de 30
proteínas séricas produzidas pelo fígado e encontradas no soro sanguíneo e nos tecidos de todo o corpo. Estas proteínas
agem de forma regulada, por meio de reações em cascata, sendo capazes de destruir os microrganismos que
ultrapassarem a primeira linha de defesa do hospedeiro (Tortora et al., 2012). Essa defesa pode se dar por meio de
citólise, inflamação e fagocitose. O ponto alto da ação do sistema complemento é a formação de um canal
transmembrana denominado complexo de ataque à membrana (MAC), que promove o rompimento da célula microbiana
devido ao influxo de fluido extracelular por meio destes canais. O MAC, formado pelos fragmentos de proteínas C5b a
C8 mais múltiplos fragmentos de C9, pode ser ativado em três vias: a via clássica, dependente da ligação de anticorpos
ao antígeno; a via alternativa, dependente da ligação dos fragmentos da proteína C3 ao patógeno; e a via da lectina,
ativada quando há liberação de citocinas pelo fígado, produzindo lectinas, que irão se ligar a carboidratos (Abbas et al.,
2008).
Quando ocorre invasão por meio de patógenos, os padrões moleculares associados aos microrganismos (PAMP) são
reconhecidos através dos receptores de conhecimento padrão (PRP) das células de defesa, ocasionando a ativação de
uma ou mais vias do sistema complemento, com propósito de eliminar a possível ação do patógeno. Os mecanismos para
essa eliminação podem ser a opsonização, quando há uma intensificação da fagocitose por meio do fragmento C3b,
liberação de mediadores inflamatórios (como, por exemplo, a histamina, que aumenta a permeabilidade vascular),
mobilização de células do sistema imunológico e fagocitose (Ricklin et al., 2010).
A Calotropis procera, vulgarmente chamada de algodão-de-seda (PE), é uma planta da família Asclepiadaceae,
originária da Índia e África Tropical, a qual foi introduzida em várias regiões como planta ornamental, podendo ser
encontrada em quase todas as regiões tropicais semiáridas da América, incluindo o Brasil onde é amplamente encontrada
no Estado do Ceará. Uma série de estudos tem comprovado que C. procera possui um conjunto de propriedades, o qual
inclui: anticancerígeno, antipirético, analgésico, bem como propriedades inflamatórias e anti-inflamatórias (Lima-Filho et
al., 2010; Freitas et al., 2007). O látex de C. procera atua no sistema complemento de forma a reduzir a liberação de
mediadores inflamatórios, o que explica o fato de atuar como agente anti-inflamatório (Kumar and Roy, 2007).
Escherichia coli é uma bactéria Gram-negativa do tipo bacilo, pertencente à família das Enterobacteriaceae. Ela pode
ser encontrada no intestino grosso dos vertebrados, como componente da microbiota normal do organismo. Sua
presença é geralmente benéfica, auxiliando na produção de certas vitaminas e participando da digestão de alguns
alimentos. Apesar disso, algumas linhagens da E. coli podem ser patogênicas, havendo produção de toxinas que causam
distúrbios gastrintestinais, que, em alguns casos, podem levar à morte. Estes microrganismos patogênicos podem ser
ingeridos a partir de carnes mal cozidas, bebidas não pasteurizadas, vegetais mal higienizados ou água de má qualidade
(Tortora et al., 2012).
Quando o complemento é ativado, sua capacidade destrutiva tem de ser rapidamente inibida, de modo a minimizar os
danos às células hospedeiras. Essa função se dá por proteínas reguladoras, que estão presentes em concentrações mais
altas que as proteínas do complemento (Tortora, et al., 2012). Quando essa regulação se dá de forma ineficaz, o sistema
complemento se volta contra as células hospedeiras e a morte destas é inevitável, acometendo o hospedeiro a uma série
de doenças autoimunes. O sistema complemento também é responsável por rejeição de transplantes. (Belkin et al., 2002).
Sendo assim, o objetivo deste estudo é avaliar a influência do extrato metanólico extraído do látex de C. procera na
atividade bactericida do sistema complemento.
1
Ana Camily Oliveira da Costa é estudante do Bacharelado em Ciências Biológicas, Bolsista do Programa de Educação Tutorial/MEC/SESu (PETBiologia/UFRPE), Universidade Federal Rural de Pernambuco. R. Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos Recife - PE, CEP: 52171-900. Email: [email protected]
2
Estudante do Bacharelado em Ciências Biológicas, Universidade Federal Rural de Pernambuco. R. Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois
Irmãos Recife - PE, CEP: 52171-900.
3
Doutoranda do Programa de Pós-Graduação RENORBIO e Bolsista da CAPES, Universidade Federal Rural de Pernambuco. R. Dom Manoel de
Medeiros, s/n, Dois Irmãos Recife - PE, CEP: 52171-900.
4
Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco. R. Dom Manoel de Medeiros,
s/n, Dois Irmãos Recife - PE, CEP: 52171-900.
5
Doutoranda do Programa de Pós-Graduação RENORBIO e Bolsista da CAPES, Universidade Federal Rural de Pernambuco. R. Dom Manoel de
Medeiros, s/n, Dois Irmãos Recife - PE, CEP: 52171-900.
6
José Vitor Moreira Lima Filho é pesquisador-orientador, Professor Adjunto IV – Departamento de Biologia. Universidade Federal Rural de
Pernambuco. R. Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos Recife - PE, CEP: 52171-900. E-mail: [email protected]
XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
Material e métodos
A. Micro-organismos e condições de cultivo
Escherichia coli foi obtida da coleção do Laboratório de Microbiologia e Imunologia da Universidade Federal Rural
de Pernambuco (UFRPE), como já descrito na literatura que E. coli é sensível ao sistema complemento está foi inserida
como micro-organismo teste. Esta foi mantida a -20°C até o momento de seu uso. Para ativação das células microbianas,
estas foram suspensas em caldo infusão cérebro coração (BHI) por 18-24 horas. Em seguida, uma suspensão bacteriana
foi semeada em ágar BHI, pelo método de esgotamento por estrias, a fim de obter colônias isoladas. Posteriormente,
estas colônias foram suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril, sendo comparada à escala de
MacFarland a fim de conter 1x107 UFC/mL.
B. Soro Ovino
O sangue ovino foi coletado a partir de um animal saudável, por punção venosa, com o auxílio de seringa a vácuo, no
Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE). O sangue foi
centrifugado por 10min /300 rpm para a separação do soro e conteúdo celular, segundo Samuelsen et al. (2004). O soro
obtido foi armazenado a -20°C até o momento do uso. Para obtenção do soro com o sistema complemento inativado,
uma alíquota de soro foi aquecida em banho-maria por 30 minutos a 56°C.
C. Desenho experimental
Em cada eppendorf® foram adicionados 180L do soro ovino, com o sistema complemento ativo ou não,
adicionados de 10L de uma solução 1000g /mL do extrato metenólico do látex de C. procera. O extrato metanólico
liofilizado do látex de C. procera foi gentilmente cedido pela Dr. Vijay Kumar, do Instituto Indiano de Ciências Médicas,
Nova Delhi, Indía. No grupo controle não foi adicionado a solução do extrato metanólico, foi adicionado 10L de
solução salina tamponada. Tanto os grupos controle, quanto experimental foram incubados por 5 minutos a 37 °C em
estufa microbiológica e, logo após, foi adicionado em todos os grupos 10L da suspensão bacteriana ajustada a 1x107 na
escala de MacFarland.
Alíquotas de 20L foram retiradas de cada amostra nos tempos 0, 60, 120, 240 e 360 minutos, para contagem de
células viáveis em placas (UFC/mL) contendo meio de cultura ágar MacConkey, após 18-24 horas de incubação a 37°C.
Resultados e Discussão
A parede celular mais delgada da E. coli faz com que o sistema complemento se insira facilmente em seu citoplasma,
tornando-a sensível a ele (Tortora et al., 2012), o que foi observado no grupo controle, quando as bactérias forma
expostas ao sistema complemento ativo (Figura 1).
Os resultados mostram que o extrato metanólico do látex de C. procera influencia a atividade bactericida do sistema
complemento sobre o microrganismo, desta forma a população bacteriana cresce gradativamente, comportando-se da
mesma forma quando a inativação do sistema complemento foi dada através da temperatura (Figura 1). Isto ocorre
porque a cascata de ativação desse sistema é catalisada por enzimas que desnaturam em temperaturas elevadas e a
similaridade de resultado com o grupo que recebeu o extrato metanólico caracteriza a inibição da capacidade bactericida
do complemento pelo extrato.
Tais resultados ressaltam a importância de novos estudos visando à determinação de novas concentrações do extrato
eficientes na inibição, bem como o esclarecimento do mecanismo de ação quanto à inibição do sistema complemento.
Tendo em vista que fármacos inibidores do complemento são essências de modo a promover a queda do
desenvolvimento de patologias e demais agressões autoimunes.
Referências
 Abbas, A. K.; Lichtman, A. H.; Pillai, S. Imunologia cellular e molecular. 6ª ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008.
 Belkin, Z.P., Kozlov, L.V., Andina, S.S., Mishin, A.A.,Guzova, V.A., and D’yakov, V.L., A Drop of Mink Complement
Kills the Mouse. Vopr. Med. Khim., vol. 48, pp. 373–377, 2002.
 Freitas, C.D., Oliveira, J.S., Miranda, M.R., Macedo, N.M., Sales, M.P., Villas-Boas, L.A., Ramos, M.V. Enzymatic
activities and protein profile of latex from Calotropis procera. Plant Physiology and Biochemistry, v. 45, p. 781-789.
2007.
 Kumar, V.L., Roy, S. Calotropis procera latex extract affords protection against inflammation and oxidative stress in
Freund’s complete adjuvant-induced monoarthritis in rats. Mediators of Inflammation. 2007.
 Lima-Filho, J.V., Patriota, J.M., Silva, A.F.B., Filho, N.T., Oliveira, R.S.B. Alencar, N. M.N., Ramos, M.V. Proteins
from latex of Calotropis procera prevent septic shock due to lethal infection by Salmonella enterica serovar
Typhimurium. Journal of Ethnopharmacology, 2010.
 Ricklin, D.; Hajishengallis, G.; Yang, K.; Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and
homeostasis. Nature Immunology, v. 11, p 785 – 797, 2010.
 Tortora, G.J.; Funke, B.R.; Case, C.L. Microbiologia. 10ª ed. Porto Alegre: Artmed, 2012.
XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
Figura 1. População de Escherichia coli após exposição ao sistema complemento, de soro ovino, ativo, inativo e com presença de
extrato metanólico do látex de Calotropis procera.