ESCOLA COOPERATIVA VALE SÃO COSME
Fevereiro de 2010
DESAFIO BACTÉRIA
Evolução da resistência da bactéria Escherichia coli aos antibióticos
EQUIPA
As borboletas
PROFESSOR RESPONSÁVEL
Manuela Fonseca
ANO
12º
ALUNOS
Adriana Maria Campos Alves
Carina Salomé Seara Magalhães
Joana Filipa Oliveira
DESAFIO BACTÉRIA -Evolução da resistência da bactéria
Escherichia coli aos antibióticos
2010
Índice
Introdução--------------------------------------------------------------------------------------pág.1
Escherichia coli--------------------------------------------------------------------------------pág.1
Material-----------------------------------------------------------------------------------------pág.2
Procedimento-----------------------------------------------------------------------------------pág.3
Registo dos resultados------------------------------------------------------------------------pág.3
Conclusões-------------------------------------------------------------------------------------pág.4
Escherichia Coli
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DESAFIO BACTÉRIA -Evolução da resistência da bactéria
Escherichia coli aos antibióticos
2010
Introdução
Com a realização desta actividade experimental, pretendemos estudar de forma
pormenorizada a forma como evolui o crescimento de uma população de bactérias. A
Escherichia coli será a bactéria que nos permitirá a realização deste estudo. Assim,
veremos o crescimento e a evolução das mesmas num meio com antibiótico e num outro
meio, este, por sua vez, sem antibiótico. Nesta actividade laboratorial, o antibiótico
utilizado será a ampicilina que terá como principal função constituir um ambiente
selectivo onde apenas as bactérias resistentes se irão desenvolver. É importante referir
que esta característica será verificável como resultado de uma mutação e estará também
directamente relacionada com os princípios de selecção natural.
Como sabemos, as mutações são mudanças na sequência dos nucleotídeos do
material genético de um organismo. Neste caso em particular, prevê-se que ocorram
mutações favoráveis e vantajosas que resultarão em mudanças adaptativas para que a E.coli
sobreviva.
A selecção natural é um processo de evolução proposto por Charles Darwin
(1809-1882), que escolhe os indivíduos com variações mais favoráveis, permitindo que
tenham uma descendência maior. Tanto a mutação como a selecção natural explicam o
processo de evolução dos seres vivos.
Escherichia coli
A bactéria utilizada, a Escherichia coli, é uma
bactéria bacilar que juntamente com o Staphylococcus
aureus é a mais comum e uma das mais antigas
bactérias simbiontes do homem.
A E. coli assume a forma de um bacilo e
pertence à família das Enterobacteriaceae. É aeróbia e
anaeróbia facultativa. Predominam na zona do lúmen
intestinal dos seres humanos e de outros animais de
sangue quente. Possui múltiplos flagelos dispostos em
volta da célula.
Escherichia Coli
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Escherichia coli aos antibióticos
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A presença da E.coli em água ou alimentos é indicador de contaminação com
fezes humanas (ou mais raramente de outros animais). A quantidade de E.coli em
cada mililitro de água é uma das principais medidas usadas no controlo da higiene da
água potável municipal, preparados alimentares e água de piscinas.
A maioria das doenças deve-se a E.coli vindas de indivíduos diferentes e
portanto de estirpe diferente, não reconhecida pelos linfócitos. As intoxicações
alimentares em particular são devidas a bactérias de estirpes totalmente diferentes.
Na nossa actividade prática laboratorial, ao falarmos da E.coli, temos também
de falar sobre o nosso antibiótico, a ampicilina.
A ampicilina é, como já foi referido, um antibiótico beta-lactâmico com grande
importância na medicina. Sendo assim, é fundamental referirmos que os antibióticos
podem actuar de formas diferentes. De acordo com a sua forma de actuar, as bactérias
vão desenvolvendo resistência aos mesmos. De um modo geral, a resistência bacteriana
aos antibióticos pode dar-se de três formas diferentes: quando há uma mudança na
permeabilidade da membrana celular que, posteriormente, impedirá a entrada do
antibiótico na célula ou fará com que ele seja bombeado para o exterior da célula;
quando as bactérias alcançam a capacidade de degradar ou então, inactivar o antibiótico
e, finalmente também podem criar resistência quando adquirirem uma mutação que
altera o alvo do antibiótico de modo a que esse alvo não seja afectado. E é precisamente
esta última hipótese que prevemos acontecer na realização da nossa actividade.
Material

E.coli

Ampicilina

Agar

1,5L 1X PBS (solução tampão – phosphate buffered saline – utilizado: 12g
NaCl, 0,3g KCl, 2,16 g Na2HPO4, 0,36g KH2PO4 em 1,5L de água)

Meio de Cultura Luria- Bertani (LB)
Escherichia Coli
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Escherichia coli aos antibióticos

Placas de Petri (plástico, 90 mm de diâmetro)

Pipetas

Balão de Erlenmeyer

Conta-gotas

Ansas

Lamparina de álcool.
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Procedimento
1. Esterilizar o vidro.
2. Preparar o meio líquido.
2.1.Medir o volume necessário de água desionizada para um balão de
Erlenmeyer.
2.2.Pesar o extracto de levedura, a triptona e o cloreto de sódio.
2.3.Adicionar ao balão e agitar até dissolver.
2.4.Perfazer o volume final desejado, adicionando água e agitar.
2.5.Esterilizar o meio de cultura na autoclave a 120º durante 20 minutos.
3. Preparar a diluição PBS blanks (solução tampão)
4. Preparar placas com agar.
5. Preparar a cultura-mãe.
Registo dos Resultados
Cultura
Placas
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
Mãe
+Ap
3
3
3
0
0
n.a
n.a
n.a
n.a
Grupo A
+Ap
3
1
0
0
0
n.a
n.a
n.a
n.a
Grupo A
+Ap
n.a
n.a
n.a
n.a
3
2
1
2
0
Grupo B
-Ap
3
3
0
0
0
n.a
n.a
n.a
n.a
Grupo B
-Ap
n.a
n.a
n.a
n.a
1
0
0
0
0
Escherichia Coli
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Escherichia coli aos antibióticos
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Conclusões
Com a realização desta actividade prática, concluímos que, tal como era
esperado inicialmente, se verificou uma maior resistência das bactérias na cultura-mãe
com o meio sem antibiótico. Tudo isto ocorreu porque tendo em conta que não existe
ampicilina, não subsiste qualquer tipo de obstáculo que ponha em causa a reprodução
e sobrevivência da bactéria E. coli. Exactamente pelo mesmo motivo, verificou-se
com menor frequência a resistência das bactérias na cultura com meio +Ap. Sabemos
que o nosso medicamento tem como principal objectivo aniquilar as bactérias,
diminuindo o seu número e afectando claramente a sua reprodução e posterior
sobrevivência. Também verificamos que há uma maior resistência por parte das
bactérias pertencentes ao meio de cultura +Ap comparativamente às bactérias do meio
de cultura – Ap. Mais uma vez, obtivemos o que era esperado numa fase inicial e isto
porque no meio de cultura com ampicilina, somente as bactérias resistentes ao
antibiótico conseguem reproduzir-se e sobreviver, passando estas características às
suas gerações futuras, aumentando cada vez mais a sua frequência. Todos estes
resultados se verificam graças ao processo de evolução proposto em tempos por
Charles Darwin - o processo da selecção natural. De acordo com o processo de
selecção natural sobrevivem os indivíduos que estiverem mais bem adaptados, isto é,
os que possuírem as características que lhes conferem qualquer vantagem em relação
aos restantes. Os menos aptos ao longo do tempo serão eliminados progressivamente.
Existe, pois, uma selecção natural, processo que ocorre na natureza e pelo qual só os
indivíduos mais bem dotados relativamente a determinadas condições do ambiente
sobrevivem – “sobrevivência do mais apto”.
O número total de células presentes não é o mesmo na cultura com e sem
antibiótico. Concluímos que o número de células no meio +Ap é inferior ao número
de células existentes no meio de cultura -Ap. Como no meio –Ap não se verificou a
morte quase que imediata das células sem resistência ao antibiótico utilizado, a sua
proliferação começa imediatamente e a partir do número de células inicialmente
presentes. Tendo em conta que o período de tempo nos dois meios é igual, a
quantidade de bactérias é inferior à inicialmente presente no meio sem antibiótico.
Escherichia Coli
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Escherichia coli aos antibióticos
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Posteriormente, torna-se então importante referir que seria altamente provável
não existir ampicilina na cultura-mãe não se torna necessário criar resistência para que a
célula da cultura-mãe não fosse resistente à ampicilina, pois tendo em conta que a sejam
capazes de se reproduzirem e de sobreviver, mas sabemos que tal não aconteceu.
Na reprodução da célula mãe, é possível que tenham existido mutações, estas
mesmas mutações poderão ter permitido às células descendentes criarem resistência ao
antibiótico. Seguidamente, de acordo com o processo de selecção natural, no meio de
cultura com +Ap, somente estas células mutantes sobreviveram e esta mesma
característica foi posteriormente transmitida às gerações seguintes, acabando por se
extinguirem todas aquelas que não possuíam esta resistência.
Pode ainda concluir-se que diferentes concentrações de ampicilina influenciam
de forma distinta a sobrevivência das bactérias; através da analise dos resultados,
observa-se uma maior incidência de colónias no meio mais concentrado, o que nos leva
a concluir que quanto maior a concentração de antibiótico, maior é a probabilidade de as
bactérias lhe criarem resistência.
Esta experiência constitui uma situação paralela à evolução das plantas e dos
animais porque tendo em conta a ocorrência de mutações, os descendentes obtêm
resistência a certas condições externas. Devido à selecção natural, os indivíduos mais
aptos relativamente ao meio em que estão inseridos, são aqueles que se reproduzem e
sobrevivem.
Por outro lado, esta actividade também constitui uma situação diferente em
relação à evolução das plantas e dos animais. Como as bactérias em causa são seres
bastante simples na sua constituição e com um ciclo de vida muito breve, as nossas
observações ao longo de toda a actividade laboratorial e também a próprias alterações
induzidas, são de muito mais fácil execução. Se, por exemplo, o organismo alvo de
estudo fosse o do ser humano, para além de a resistência à ampicilina ser muito mais
lenta, também as observações seriam muito menos visíveis.
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