Biofilmes Microbianos
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Introdução
Comportamento coletivo
Comunidades associadas às superfícies
Estrutura dos Biofilmes
Por que formar um biofilme?
Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metabólica
Aquisição de novas características genéticas
Papel dos biofilmes nas doenças
Genética da formação dos biofilmes
Introdução
Nossa percepção de bactérias como organismos unicelulares baseia-se
essencialmente no conceito de culturas puras, nas quais as células
podem ser diluídas e estudadas a partir de culturas líquidas. Como
praticamente todos os conceitos e conhecimentos microbiológicos
foram adquiridos a partir do estudo de organismos em culturas puras,
somente há alguns anos começamos a entender que, na realidade, a
maioria das bactérias se encontra na natureza vivendo em
comunidades, de maior ou menor estruturação.
O tipo de "ecologia" que imaginávamos em relação aos procariotos, ou
seja, células individuais crescendo de maneira planctônica (livres, em
suspensão), raramente é encontrado na natureza. Sabe-se atualmente
que, quando em seus habitats naturais, via de regra as bactérias são
encontradas em comunidades de diferentes graus de complexidade,
associadas a superfícies diversas, geralmente compondo um biofilme,
isto é, um ecossistema estruturado altamente dinâmico, que atua de
maneira coordenada.
Assim, embora possam ter uma existência planctônica independente,
este tipo de vida parece ser eventual.
Os biofilmes, complexos ecossistemas microbianos, podem ser
formados por populações desenvolvidas a partir de uma única, ou de
múltiplas espécies, podendo ser encontrados em uma variedade de
superfícies bióticas e/ou abióticas. Desta maneira, muitos autores
definem biofilmes como associações de microrganismos e de seus
produtos extracelulares, que se encontram aderidos a superfícies
bióticas ou abióticas.
Geralmente, a dinâmica de formação de um biofilme ocorre em etapas
distintas. Inicialmente temos or organismos denominados
colonizadores primários, que se aderem a uma superfície, geralmente
contendo proteínas ou outros compostos orgânicos. As células aderidas
passam a se desenvolver, originando microcolônias que sintetizam
uma matriz exopolissacarídica (EPS), que passam a atuar como
substrato para a aderência de microrganismos denominados
colonizadores secundários. Estes colonizadores secundários podem se
aderir diretamente aos primários, ou promoverem a formação de
coagregados com outros microrganisos e então se aderirem aos
primários.
Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonização primária de um substrato; (b)
crescimento, divisão celular e produção do exopolissacarídeo (EPS), com o
desenvolvimento de microcolônias; (c) coadesão de células individuais, de células
coagregadas e grupos de células idênticas, originando um biofilme jovem, de
múltiplas espécies; (d) maturação e formação de mosaicos clonais no biofilme
maduro.
(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)
Assim, o biofilme corresponde a uma "entidade" dinâmica pois, de
acordo com os microrganismos que o compõem, teremos consições
físicas, químicas e biológicas distintas. Estas alterações fazem com que
cada biofilme seja único, de acordo com os microrganismos presentes.
Neste sentido, ao longo do tempo a composição microbiana dos
biofilmes geralmente sofre alterações significativas. A figura abaixo
ilustra não somente a estruturação fisico-química de um biofilme, mas
também sua evolução e amadurecimento, dependendo das relações
estabelecidas pelos microrganismos presentes.
Estágios de formação e vida de um biofilme, determinados por fatores
físicos, biológicos e ambientais
(Adaptado de Jenkinson & Lappin-Scott, Trends Microbiol., 9:9-10, 2001)
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Comportamento coletivo
Há várias décadas, foi proposto que as bactérias poderiam
corresponder a organismos interativos, capazes de atuar
coletivamente, facilitando sua adaptação às alterações ambientais.
Para que um biofilme de uma ou várias espécies seja formado, é
necessário o estabelecimento de um comportamento multicelular, que
se reflete em atividades coordenadas de interação e comunicação dos
vários organismos. Assim, os biofilmes não são simples camadas
viscosas contendo organismos. Estes representam sistemas biológicos
altamente organizados, onde as bactérias estabelecem comunidades
funcionais estruturadas e coordenadas.
Um dos mecanismos de comunicação interbacteriana que vem se
mostrando extremamente importante na formação e desenvolvimento
de biofilmes corresponde ao quorum sensing.
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Comunidades associadas às superfícies
Os procariotos podem habitar qualquer ambiente adequado às formas
de vida superiores, assim como vários ambientes inóspitos à maioria
das formas de vida. Tal fato é decorrente de sua inigualável
diversidade metabólica e plasticidade fenotípica. Um dos importantes
aspectos associados a esta ubiqüidade está relacionado à capacidade
destes organismos migrarem para diferentes nichos, onde podem se
propagar. O mecanismo mais comum que permite a migração dos
procariotos corresponde à motilidade, seja de origem flagelar,
deslizante, ou de outro tipo. No entanto, são conhecidos mecanismos
que também permitem a migração bacteriana. Por exemplo, algumas
espécies podem sintetizar celulose, originando uma película que
mantém as células próximas à interface ár-água, ou na superfície de
plantas. Bactérias fotossintetizantes podem se posicionar nas colunas
de água, em resposta à intensidade luminosa, pela produção de
vesículas de gás. Outras, apresentam magnetossomos, permitindo
movimentações ao longo dos campos magnéticos da Terra. Um
importante mecanismo na formação de comunidades corresponde à
agregação ou aderência, que otimiza tanto as interações celulares
como também as taxas de sedimentação dos organismos.
As comunidades bacterianas têm importantes papéis na natureza, seja
na produção e degradação de matéria orgânica, na degradação de
poluentes, ou na reciclagem de nitrogênio, enxofre e vários metais. A
maioria destes processos requer o esforço coletivo de organismos com
diferentes capacidades metabólicas. Assim, os biofilmes participam
metabolizando esgotos e águas contaminadas com petróleo, na
nitrificação, na reciclagem de enxofre oriundo de drenados ácidos de
minas (onde o pH é 0) e em vários outros processos. Outro tipo de
biofilme está associado às partículas em suspensão, muitas vezes
denominadas neve marinha, extremamente importante nas
transformações biogeoquímicas do carbono em ambientes pelágicos,
na metanogênese, fixação de nitrogênio e produção de enxofre. Estes
achados revelam que nos biofilmes podem ser criadas condições de
anaerobiose, em ambientes normalmente aeróbios.
Exemplo da ecologia de comunidades microbianas. As quatro microcolônias centrais
correspondem a organismos que geram e consomem hidrogênio. Os fermentadores
utilizam açúcares e produzem ácidos orgânicos, utilizados pelos produtores de
hidrogênio. Além das interações metabólicas, a comunicação intra e intercelular pode
ser mediada por moléculas sinalizadoras.
(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)
As interações que permitem a agregação de diferentes espécies, ou
mesmo gêneros microbianos em um biofilme geralmente envolvem a
participação de adesinas (moléculas de adesão presentes em fímbrias
ou dispersar ao longo da superfície celular), que reconhcem receptores
específicos na superfície de outras células, ou em diversos tipos de
substratos. Assim, a figura abaixo esquematiza a formação de um
biofilme aquático, revelando a complexidade tanto estrutural como
temporal deste ecossistema. As horas correspondem ao tempo médio
necessário à adesão dos diferentes microrganismos, revelando a
dinâmica de formação e estruturação deste biofilme.
Esquema de coagregações envolvendo bactérias aquáticas.
(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)
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Estrutura dos Biofilmes
A maioria dos biofilmes exibe uma certa heterogeneidade, existindo
conjuntos de agregados celulares distribuídos ao longo da matriz
exopolissacarídica, que exibem densidades variáveis, originando
aberturas e canais por onde a água pode trafegar.
Corte lateral, revelando a estrutura de um biofilme artificial de V. cholerae.
A intensidade da cor está associada à densidade celular.
(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)
As microcolônias que compõem um biofilme podem ser de uma ou
várias espécies, dependendo das condições ambientais. Por exemplo,
em locais de grande stress mecanico, tais como a superfície dental, o
biofilme é bastante compactado e estratificado. Os espaços intersticiais
(canais) também são parte importante dos biofilme, pois permitem a
circulação de nutrientes e a troca de metabólitos.
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Por que formar um biofilme?
Acredita-se que a formação de biofilmes esteja associada, por
exemplo, à proteção contra o ambiente, ou seja, bactérias em um
biofilme encontram-se abrigadas e em relativa homeostase, graças à
presença da matriz exopolissacarídica. A matriz contém vários
componentes: exopolissacarídeo, proteínas, ácidos nucléicos, entre
outros. O exopolissacarídeo é secretado para o meio externo, sendo de
diferentes composições. Ao que parece, o EPS tem diferentes
estruturas e funções, dependendo das comunidades e/ou condições
ambientais. Este polímero pode impedir fisicamente a penetração de
agentes antimicrobianos no biofilme, principalmente aqueles
hidrofílicos e carregados positivamente. Em alguns casos o EPS é
capaz de sequestrar cátions, metais e toxinas. Por estas razões, os
biofilmes podem corresponder a excelentes mecanismos de
transferência de metais nos ecossistemas, pois vários organismos
marinhos pastadores se alimentam de biofilmes. Foi também descrito
que o EPS teria papel de proteção contra radiações UV, alterações de
pH, choques osmóticos e dessecação.
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Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metabólica
Os canais aquosos dos biofilmes podem ser comparados a um sistema
circulatório primitivo, permitindo a troca de nutrientes e metabólitos,
assim como a remoção de metabótilos potencialmente tóxicos. Em um
biofilme, torna-se possível a cooperação metabólica. Por exemplo, a
degradação de compostos orgânicos complexos, originando metano e
CO2 durante uma digestão anaeróbia, requer pelo menos três grupos
de organismos. As bactérias fermentativas iniciam o processo, gerando
ácidos e álcoois, que são utilizados por bactérias acetogênicas.
Finalmente, as metanogênicas convertem o acetato, CO2 e hidrogênio,
produzindo metano.
Os biofilmes são ambientes ideais para o desenvolvimento de relaçoes
sintróficas, que é um tipo de simbiose onde dois tipos de organismos
metabolicamente distintos dependem um do outro para utilizarem
certos substratos, na produção de energia.
Sintrofia em um grânulo de lodo de um reator metanogênico. Corantes
fluorescentes revelam organismos metanogênicos (em verde) e bactérias que
oxidam propionato (em vermelho). A cor amarela resulta da combinação verde e
vermelho, revelando microcolônias sintróficas interligadas a cadeias de
metanogênicos.
(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)
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Aquisição de novas características genéticas
Várias bactérias possuem plasmídeos, conferindo as mais diversas
características. Estes podem ser transferidos horizontalmente por
conjugação, para diferentes espécies presentes em um bioflme. Estudo
foram realizados com placas dentais artificiais, formadas inicialmente
por bactérias do gênero Streptococcus. Uma linhagem de Bacillus,
contendo um transposon conjugativo albergando genes de resistência
à tetraciclina, foi inserida no sistema e transferiu este transposon para
células de Streptococcus.
A transdução pode, teoricamente, ser responsável pela transferência
horizontal de genes em biofilmes. Tal hipótese baseia-se no fato de
sistemas marinhos e de água doce contêm uma enorme abundância de
bacteriófagos (cerca de 108/ml), sendo responsáveis pela lise de um
grande número de bactérias. Diariamente, de 10 a 20% da população
bacteriana é lisada por fagos, os quais têm relevante impacto na
cadeia alimentar microbiana uma vez que podem aumentar as taxas
de mortalidade e/ou reduzir as taxas de crescimento em todos os
níveis tróficos. Estudos recentes revelam que os fagos podem
estruturar ou restruturar comunidades microbianas. Em uma análise,
onde uma população de cianobactérias foi praticamente exterminada
pelos fagos, observou-se a presença de novas espécies capazes de
degradas os compostos orgânicos que surgiram.
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Papel dos biofilmes nas doenças
Até o momento, a vasta maioria das doenças infecciosas vem sendo
tratada eficientemente com antibióticos entretanto, de acordo com as
pesquisas mais recentes, sabemos que tal tipo de estratégia pode ser
ineficaz em duas situações: 1) com organismos exibindo resistência
inata à droga e 2) em bactérias presentes em biofilmes. Em um
biofilme, as bactérias podem ser 1000 vezes mais resistente a um
antibiótico, quando comparadas às mesmas células planctônicas,
embora os mecanismos envolvidos nesta resistência sejam ainda
pouco conhecidos. Dentre os possíveis mecanismos, acredita-se que
possa haver a inativação da droga por polímeros ou enzimas
extracelulares, ou a ineficiência da droga em decorrência de taxas de
crescimento muito lentas no interior dos biofilmes.
Infecções assciadas a biofilmes geralmente são de natureza
recorrente, visto que as terapias antimicrobianas convencionais
eliminam predominantemente as formas planctônicas, deixando as
células sésseis livres para se reproduzir e propagar no biofilme após o
tratamento. Para tornar o quadro ainda mais grave, as bactérias
presentes nos biofilmes encontram-se mais protegidas contra o
sistema imune do hospedeiro.
Exemplos típicos de doenças associadas a biofilmes incluem as
infecções de implantes tais como válvulas cardíacas, catéteres, lentes
de contato, etc.
Os biofilmes podem ainda promover doenças se formados em tecidos,
tais como nas infecções pulmonares provocadas por Pseudomonas
aeruginosa, em pacientes com fibrose cística, que são suscetíveis a
infecções crônicas por esta bactéria. A periodontite é outro exemplo de
doença provocada por biofilmes. O principal microrganismo associado
a esta doença, Porphyromonas gingivalis, coloniza uma grande de
superfícies orais direta ou indiretamente, sendo então capaz de invadir
as células das mucosas e liberar toxinas.
Biofilmes e resistência às drogas, devido à densidade e tipos celulares, exclusão
física da droga, expressão de genes de resistência, quorum sensing e alterações da
superfície celular
(Adaptado de Mah & O’Toole, Trends Microbiol., 9:34-39, 2001)
Esquema do desenvolvimento temporal de uma placa dental.
(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)
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Genética da formação dos biofilmes
Quatro organismos, P. aeruginosa, P. fluorescens, E. coli e V. cholerae,
vêm sendo intensamente estudados, como modelos na formação de
biofilmes de espécies únicas. Este processo pode ser subdivido em
etapas: a) Aderência inicial à superfície, b) Formação das
microcolônias, c) maturação das microcolônias em um biofilme
contendo a matriz de EPS.
Estudo microscópico da formação de um
biofilme por V. cholerae
(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675–2679,
2000)
Etapas que uma nova espécie
bacteriana realiza, durante sua
incorporação em um biofilme
(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675–
2679, 2000)
Ao que parece, o processo se inicia quando as bactérias percebem
determinadas condições ambientais, que disparam o fenômeno de
transição de células planctônicas em sésseis. Assim, Pseudomonas
aeruginosa e P. fluorescens parecem ser capazes de formar bioflmes
sob quase todas as condições, enquanto E. coli somente os forma se
estiver em meios mínimos suplementados com aminoácidos, ou em
meios pobres em nutrientes.
Diferentes vias genéticas podem ser utilizadas na formação de
biofilmes. Por exemplo, V. cholerae parece ter diferentes vias para
realizar a aderência inicial, dependendo da superfície. Assim, quando
no intestino, este organismo utiliza a fímbria Tcp para realizar a
colonização, embora tal estrutura não tenha papel na etapa inicial de
formação de biofilmes em superfícies abióticas, sendo o processo
mediado por um outro tipo de fímbria, denominada Msh.
Início de formação do biofilme
A partir de estudos com linhagens mutantes de P. aeruginosa, foi
relatado que, quando as células não sintetizam flagelos, são incapazes
de realizar as interações iniciais com as superfícies. Mutantes que não
produzem a fímbria tipo IV (associada à movimentação das células em
uma superfície) são capazes de se aderir formando uma monocamada,
ao invés de microcolônias. Existem uma proteína, denominada Crc
que, além de atuar regulando o metabolismo das células, também
regula a expressão de dois genes que codificam proteínas importantes
na montagem da fímbria tipo IV. O LPS da membrana externa também
tem papel na adesão inicial. Em E. coli, os flagelos também são
importantes nesta primeira etapa de formação do biofilme. Há ainda a
participação de fímbrias do tipo I, uma proteína de membrana externa,
Ag43 e do LPS. Em V. chloreae acredita-se que o processo seja
bastante similar ao de E. coli.
Maturação do biofilme
Após a etapa de interações iniciais, começa a haver a formação das
microcolônias, normalmente associada à produção de EPS. Outra etapa
importante corresponde à organização da arquitetura do biofilme que,
em P. aeruginosa parece ter a participação do "quorum sensing".
Estágios iniciais na formação de biofilmes de Gram negativos (P.
aeruginosa, E. coli, e V. cholerae).
(A) Em P. aeruginosa, os flagelos são necessários para aproximar a bactéria da
superfície, enquanto o LPS media as primeiras interações, havendo talvez a
participação de proteínas da membrana externa. Quando formam monocamadas,
fímbrias tipo IV mediam o movimento pulsante, necessário à formação de
microcolônias. A produção destas fímbrias é regulada, em parte, por sinais
nutricionais (Crc), havendo ainda a ativação de genes envolvidos na síntese de
alginato e repressão de genes flagelares. A formação do biofilme maduro envolve a
participação de homoserina lactonas sinalizadoras. (B) Em E. coli, os flagelos
aproximam as células do substrato, enquanto as primeiras interações são mediadas
por fímbris tipo I e a proteína de membrana externa Ag43. O EPS, ácido colânico é
resonsável pela arquitetura do biofilme. (C) V. cholerae, também usa os flagelos na
aproximação, sendo a ligação mediada por fímbrias MshA e talvez outras proteínas.
(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)
Dispersão
Em determinados momentos, os biofilmes sofrem dispersão, liberando
microrganismos que podem vir a colonizar novos ambientes. Ós
mecanismos genéticos associados à dispersão não são ainda bem
conhecidos.
Existem três tipos de processos de dispersão: expansiva, quando
parte das células de uma microcolônia sofrem lise e outras retomam a
motilidade, sendo então liberadas da estrutura. Outro tipo de
dispersão envolve a fragmentação do biofilme, onde porções de
matriz extracelular associadas a microrganismos são liberadas.
Finalmente, o terceiro tipo de dispersão, denominada superficial,
ocorre pelo crescimento do próprio biofilme como um todo.
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Cynthia M. Kyaw