Tópicos em bioquímica:
DNA E CROMOSSOMOS
CROMOSSOMOS E
SUBDOMÍNIOS
CROMOSSOMICOS
CONSTITUEM UNIDADES
DISTINTAS NO NÚCLEO
INTERFÁSICO
INTRODUÇÃO


Os cromossomos formam territórios
distintos no núcleo interfásico, delimitando
domínios formados pelos seus braços
Recentemente, relações espaciais e
funcionais tem sido descritas entre
domínios e territórios cromossômicos
(fábricas de DNA e RNA, fatores de
splicing, etc)
Territórios cromossômicos e
seus domínios:
Territórios
cromossômicos
Domínios
cromossômicos


Antes de fazer inferências entre estrutura e
função da cromatina, deve-se então
compreender como é a organização
espacial da cromatina.
A QUESTÃO ENTÃO É:
OS CROMOSSOMOS NO NÚCLEO
INTERFÁSICO ESTÃO SOBREPOSTOS OU
FORMAM TERRITÓRIOS MUTUAMENTE
EXCLUSIVOS?
MATERIAL E MÉTODOS:
Cultura das células:
As células das linhagens HA-1 e V79 foram
incubadas em MEM com Sais de Hanks contendo
FCS, glutamina, penicilina, streptomicina a 37 °C
e 2% CO2.
Marcação das células:
A replicação foi marcada com IdUrd (iodo-desoxiuridina) e com CldUrd (cloro-desoxi-uridina) por
meio de dois métodos:
– FUSÃO DE NÚLCEOS
– MARCAÇÃO SEQUENCIAL
Timidinas Análogas:
substituição
Br
I
Cl
MÉTODO DE MARCAÇÃO I: FUSÃO DAS CÉLULAS
Consistiu em obter núcleos com diferentes
cromossomos marcados a partir da fusão de
núcleos de duas populações de células
marcadas diferentemente
Plaqueamento das células
IdUrd
Shake-off +fusão
(das mitóticas)
CldUrd
Núcleo das células
fundidas
MÉTODO DE MARCAÇÃO II: MARCAÇÃO
SEQUENCIAL
Na 1ª fase S, IdUrd foi incorporado
As células foram lavadas e cultivadas durante
uma 2ª fase S em meio contendo CldUrd.
As células passaram por uma 3ª fase S sem
marcação
Esquema da marcação
seqüencial:

VERIFICAÇÃO DA REPLICAÇÃO MARCADA:
Os marcadores foram detectados por anticorpos
específicos (originalmente para BrdUrd) e um
anticorpo derivado de rato
Coloração não-específica foi bloqueada

CONTROLE:
As células foram comparadas com células não
marcadas e coradas com o marcador de DNA
TROPO-3
Detecção da marcação
por imunofluorescencia:
Reconhecem
os anticorpos
Reconhecem os
marcadores

VISUALIZAÇÃO E ANÁLISE:
Utilizou-se um microscópio de fluorescência e o
registro foi feito com uma câmera CCD
Foram feitas imagens das fusões e marcações
seqüenciais utilizando o CLSM
Para determinar se havia sobreposições
espaciais realizou-se a marcação com FICT e
Texas Red e registrou-se e analisou-se as
elevações cromáticas
RESULTADOS


O experimento controle
mostrou que a
morfologia nuclear e a
estrutura da cromatina
não foi alterada.
Todos os cromossomos
foram uniformemente
marcados



Os núcleos fundidos
apresentaram um mosaico
de domínios com ou outro
marcador, com pouca
sobreposição.
As bordas entre os
cromossomos estavam
bem definidas
Confirmando assim a
discrição dos territórios e
domínios
CldUrd
(em verde)
IdUrd (em vermelho)
+ IdUrd


A marcação seqüencial revelou
um mosaico de domínios
distintos contendo
exclusivamente IdUrd, CldUrd ou
nenhuma marcação. Indicando
também a idéia de unidades
discretas
Revelou também subdomínios
formados por (SCEs) formando
um arlequim
1ª fase S
+ CldUrd
2ª fase S
3ª fase S


Os sinais utilizados para verificar o cruzamento
da área de borda, mostrou que havia limitada
sobreposição
Para verificar se ocorria um erro na técnica de
visualização foi feito um experimento controle e
visualização com linescan
Comparações com
linescan:
Experimento:
Controle:

Admitiu-se que
houve uma
pequena
sobreposição
Sobreposição

A Cromatina
apresentou regiões
semelhantes a fibras
que admitiam
disposições irregulares
e nunca contendo
ambas as marcações.
DISCUSSÃO



Baseando-se nas duas abordagens
amostradas, os territórios cromossômicos
são estruturas distintas e contém
subdomínios discretos
Os cromossomos podem penetrar em
regiões de outros, mas sem se misturar,
tomando formas irregulares
Não se pode, porem excluir a possibilidade
alguma sobreposição, com pequena
quantidade de DNA envolvida



Esta parece ser uma característica comum a
todos os eucariotos
Nos locais onde ocorreu as SCEs ocorreu
súbita mudança de marcação indicando que
há um alto grau de compartimentalização
nos territórios
Estruturas similares às fibras observadas
foram relatadas em estudos in vivo. Onde
especula-se que elas possam corresponder a
um alto grau de dobramento da cromatina
Não se pode, porem excluir a possibilidade
alguma sobreposição, com pequena quantidade
de DNA envolvida
 Processos raros de mistura pode ocorrer em
regiões de SCEs ou união de dois domínios
(ex: duas fábricas de cromossomos diferentes se
unirem).

União de
domínios (raro)



Experimentos com vimentina corroboram
com a idéia de territórios
Experimentos com FISH não são tão
eficientes pois marcam apenas alguns
cromossomos
No leptóteno da espermatogênese
poderia ocorrer mistura dos domínios
Por fim:

Uma questão sobre este tema ainda
permanece: Como as fibras estão
organizadas dentro de um território?
– Cromatina dobrada e altamente misturada
– Subdomínios não se sobrepõem
– Teorias de organização funcional (não espacial)

Os resultados do trabalho sugerem que há
uma organização estrita da cromatina em
unidades discretas, promovendo uma base
para elucidar estudos de relações entre
estrutura e função.
MORAL DA HISTÓRIA:
Sua visão de
cromatina antes da
aula:
Sua visão de
cromatina depois
da aula: