Genética Molecular
em Análises Clinicas
TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO
DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Prof.Doutor José Cabeda
Genética
Técnicas de amplificação de
ácidos nucleicos
PCR
 Real Time PCR
 NASBA/TMA

PCR
OPTIMIZAÇÃO DO PCR
[MgCl2]
 Th
 [dNTP]
 [primers]
 [DNA]
 [inibidores]

Variações
RT-PCR
 Multiplex PCR
 Nested PCR

Técnicas de amplificação de
ácidos nucleicos
PCR
 Real Time PCR
 NASBA/TMA

Principio de funcionamento do
Real-Time PCR
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Genética
Detecção dos
produtos
de PCR
Montar uma reacção
Químicas Utilizáveis
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Genética
SYBR-Green I
3’
5’
Excitation
SG
SG
SG
3’
5’
SG
SG
SYBR-Green I
Excitation
Emission
5’
3’
SG
SG
SG
SG
SG
3’
5’
Detcção com SybGreen
Sybr-Green Detection





Intercalates to dsDNA
Inhibits DNA amplification
so concentration is critical
Detects specific and nonspecific targets
Low starting background
with large increase in
signal
Can run a melt curve to
look at product specificity
Detecção com sondas
Quimicas utilizáveis:
sondas taqman
Sequence specific probes: Dual labeled probes
5’
3’
5’
3’
3’
5’
Excitation
Excitation
3’
R
Q
Q
5’
Quimicas utilizáveis:
molecular beacons
Molecular Beacons I
FAM
DabCyl
10mer
25mer
Molecular Beacons II
Excitation
Emission
R
Q
Molecular Beacons II
Excitation
Emission
R
Q
Molecular Beacons III
Can be used to quantitation and
mutation detection
 Need beacons for the normal and
mutation sequence
 Design is difficult due to nature of
folding structure
 Expensive when compared to FRET

Quimicas utilizáveis:
sondas FRET
TM
Hyb-Probes
Oligo 1: Fluorescein
Oligo 2: Quencher
Transfer
Excitation
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Emission
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Genética
Quenched FRET analysis
5’ 3’




Two labeled probes, FAM at the 5’ and
BH1 on the 3’
When the probes hybridize the FAM
energy is quenched by the BH1
After the product is amplified run a melt
curve to determine genotype
Different melt points are seen for normal
and mutation
Quimicas utilizáveis:
sondas Eclipse
F
Q
MGB
F
Q
Aplicações
Quantificação
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Genética
End Point
versus
Real-Time
Quantificação
Aplicações
Detecção de Mutações / SNP
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Genética
Detecção de mutações
Aplicações
Multiplex Detection
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Genética
Detecção simultânea de
vários produtos
Os equipamentos
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Genética
Light Cycler
Smartcycler
Rotorgene





The samples spin continually during
a run at 500 rpm
The samples are heated and cooled
in a low mass air oven
Tubes are illuminated as they pass
the detector
On data acquisition energy is
averaged over 20 revolutions to give
the fluorescence of each sample
Four Channels
•
•
•
•
Ch1: ex 470nm, det 510nm
Ch2: ex 530nm, det 550nm
Ch3: ex 585nm, det 610nm
Ch4: ex 625nm, det 660nm
O Futuro próximo
Detecção com sondas
Detcção com SybGreen
Quantificação
Detecção de mutações
Detecção simultânea de dois
produtos
Técnicas de amplificação de
ácidos nucleicos
PCR
 Real Time PCR
 NASBA/TMA

NASBA/
NUCLISENS
Amplification:
schematic diagram
Primer 1
Legend:
• sense RNA
• antisense RNA
• sense DNA
• antisense DNA
Reverse Transcriptase
RNase H
Primer 2
Reverse Transcriptase
T7 RNA polymerase
Primer 2
Reverse Transcriptase
Reverse Transcriptase
RNase H
Primer 1
Técnicas de amplificação de
Sinal

bDNA (Quantiplex)
bDNA (I)
bDNA (II)
bDNA (III)
bDNA (IV)
bDNA (V)