Estudos granulométricos e de ...
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AVALIAÇÃO TEÓRICA DO PERFIL DE PROTONAÇÃO DA TRÍADE
CATALÍTICA DA ACETILCOLINAESTERASE HUMANA E DE
DROSOPHILA MELANOGASTER
NAILTON MONTEIRO DO NASCIMENTO JÚNIOR1
CARLOS MAURICIO R. SANT’ANNA2
1. Bolsista de Iniciação Científica PIBIC/CNPq/UFRuralRJ, Discente do Curso de Química;
2. Professor do Departamento de Química, Instituto de Ciências Exatas,Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
RESUMO: NASCIMENTO JÚNIOR, N. M., SANATANNA, C. M. R. Avaliação teórica do perfil de
protonação da tríade catalítica da acetilcolinaesterase humana e de Drosophila melanogaster.
Revista Universidade Rural: Série Ciências Exatas e da Terra, Seropédica, RJ: EDUR, v.23, n.1-2,
p. 134-138, jan.- dez., 2004. Neste trabalho é apresentada a comparação do perfil de protonação das
tríades catalíticas da acetilcolinaesterase humana e de Drosophila melanogaster na presença e na
ausência de água, obtido por meio de cálculos de calor de formação com o método de orbital molecular
semi-empírico. Não foi observada diferença significativa entre os modelos das duas enzimas. A importância
do uso do modelo de solvente nos cálculos foi observada, pois houve modificação na ordem de estabilidade
entre estados de protonação diferentes da tríade na presença e na ausência do solvente.
Palavras chave: acetilcolinaesterase, hidrólise,semi-empírico.
ABSTRACT: NASCIMENTO JÚNIOR, N. M., SANATANNA, C. M. R. Theoretical evaluation of the
protonation profile in human and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase catalytic
triads. Revista Universidade Rural: Série Ciências Exatas e da Terra, Seropédica, RJ: EDUR,
v.23, n.1-2, p. 134-138, jan.- dez., 2004. TThis work relates a comparison of the protonation profile of
human and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase in the presence and absence of water solvent,
obtained with semiempirical molecular orbital calculations. No significant difference was observed between
human and insect enzyme models. The importance of the solvent model during calculations was evidenced
by a modification in the stability order of different protonation states of the catalytic triad.
Key words: acetylcholinesterase, semiempirical, hydrolises.
INTRODUÇÃO
Desde as primeiras tentativas de cultivo
de plantas e criação de animais, o homem
tem se defrontado com a ação de pragas
que reduzem a produtividade e a oferta de
alimentos. Dos meios usados na busca do
controle da ação de pragas, o uso de
pesticidas é ainda o mais adequado para a
produção em larga escala. A maior parte
do mercado mundial de pesticidas pertence
às classes químicas dos organofosforados
e dos carbamatos [Casida e Quistad, 1998].
Os pesticidas destas classes agem por
inibição da enzima acetilcolinaesterase (EC
3.1.1.7, AChE). A AChE catalisa a hidrólise
do neurotransmissor acetilcolina (ACh),
interrompendo a transmissão de impulsos
nervosos nas sinapses dos neurônios
colinérgicos do sistema nervoso.
A principal unidade funcional da AChE é
a chamada tríade catalítica, composta de
um resíduo de serina (Ser203, na
numeração da AChE humana), um de ácido
glutâmico (Glu334) e um de histidina
(His447). Na primeira etapa do mecanismo
de hidrólise, His447 atua como uma base,
desprotonando Ser203 e tornado-a mais
nucleofílica frente à carbonila do substrato
(Qian e Kovach, 1993), mas a função de
Glu334 ainda não foi esclarecida. Glu334
pode atuar tanto por estabilização
eletrostática, na forma de glutamato, da
histidina protonada quanto como uma base,
abstraindo o próton desse resíduo (Zhang
et al., 2002). Após essa etapa de adição, o
intermediário tetraédrico formado elimina o
fragmento de colina e o resíduo Ser203 fica
acetilado; o grupo acetil é eliminado na
forma de ácido acético em uma segunda
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Amaral Júnior, A. F., et al.
etapa do mecanismo, liberando o resíduo
de serina para reiniciar o processo. Tanto
os organofosforados quanto os carbamatos
são análogos do substrato natural, mas
ligam-se de modo essencialmente
irreversível ao resíduo de serina da tríade,
inativando-a.
Devido aos danos que os
organofosforados e carbamatos causam à
saúde humana, vem se buscando
compostos que sejam mais seletivos contra
as pragas e mais seguros para o homem.
O objetivo do presente projeto é propor
novos protótipos de pesticidas, mais ativos
e com maior seletividade para as espécies
alvo, usando a aproximação do
planejamento racional de ligantes bioativos.
Esta aproximação consiste no estudo por
métodos de modelagem molecular do
mecanismo de interação entre os
pesticidas com seu alvo bioquímico. Como
etapa prévia na busca deste objetivo,
apresentamos neste trabalho um estudo
preliminar com a comparação do perfil de
protonação das tríades catalíticas da AChE
humana (HuAChE) e de um inseto, D.
melanogaster (DmAChE), obtido por meio
de cálculos de calor de formação com o
método quântico semi-empírico PM3
(Stewart, 1989).
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o de ácido glutâmico na forma desprotonada
(sistema 1, fig. 1). As coordenadas internas
dos átomos das ligações peptídicas foram
mantidas fixas para se evitar
deslocamentos entre os aminoácidos
durante a otimização das estruturas. Com
o programa Mopac 2002 (Stewart, 2002),
foram realizados cálculos com o método
semi-empírico PM3 (Stewart, 1989) da
transferência de próton entre os
aminoácidos. A influência de água foi
avaliada com o método COSMO, que
considera o sistema molecular imerso em
um contínuo com constante dielétrica igual
a da água.
O
H
NH
N
O
O
Ser
Glu
His
Sistema 1
O
H
N
N
H
O
O
Ser
Sistema 2
O
Glu
His
HN
O
N
O
H
Ser
Glu
Sistema 3
His
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas duas estruturas
cristalográficas depositadas no Protein
Data Bank, 1QO92 para DmAChE e1B411
para a HuAChE . Selecionamos com o
programa Rasmol 2.7.2.1 (Sayler) os
resíduos Ser203, His447 e Glu334 para
HuAChE e Ser238, His480 e Glu367 para
DmAChE. Esses arquivos foram
convertidos em arquivos de entrada para os
cálculos semi-empíricos com o programa
Babel 1.6 (Walters e Stahl, 1996), com
adição de átomos de hidrogênio,
considerando-se inicialmente os resíduos
de serina e de histidina no estado neutro e
Figura 1. Mecanismo de transferência de próton
avaliado neste trabalho.
Variou-se o comprimento da ligação OH da serina com passos de 0,1 Å até que o
próton fosse transferido para o Ng da
histidina (sistema 2, fig. 1). O mesmo foi
feito com a ligação Ne-H da histidina até
que o próton se ligasse ao glutamato
(sistema 3, fig. 1). Os três sistemas foram
reotimizados até um gradiente menor do
que 0,1 kcal/( Å ou rad).
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
HuAChE
DmAChE
-365
-370
∆Hf (kcal/mol)
Nas figuras 2 e 3 são apresentados os
perfis calculados da entalpia da
transferência de próton na ausência de
solvente e, nas figuras 4 e 5, na presença
de água.
-375
-380
-385
-390
-240
1,6
1,4
1,2
1,0
Distância H(Ser)----N(His) Angstrom
Figura 4. Perfil de ∆H f para a transferência de
próton entre a Ser e a His, em água.
-245
-250
∆Hf (kcal/mol)
1,8
HuAChE
DmAChE
-255
-260
-265
HuAChE
DmAChE
-270
-350
-275
-355
-280
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
∆Hf (kcal/mol)
Distância H(Ser)----N(His) Angstrom
Figura 2. Perfil de ∆Hf para a transferência de
próton entre a Ser e His.
-360
-365
-370
-375
-380
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
Distância N(His)----H(His) Angstrom
HuAChE
DmAChE
-238
Figura 5. Perfil de ∆Hf para a transferência de próton
entre His e Glu, em água.
-240
-242
Os valores de ∆Hf para os sistemas
reotimizados estão apresentados nas
Tabelas 1 (sem solvente) e 2 (em água).
∆Hf (kcal/mol)
-244
-246
-248
-250
-252
-254
-256
-258
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
Tabela 1. Cálculos para os três estados de
protonação referentes a AChE sem a presença de
solvente.
Distância N(His)----H(His) Angstrom
Figura 3. Perfil de DH f para a transferência de
próton entre His e o Glu.
∆Hf (kcal/mol)
Sistema
HuAChE
DmAChE
1
-274,2
-276,3
2
-246,2
-247,1
3
-256,0
-254,8
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Tabela 2. Cálculos para os três estados de
protonaçâo referentes a AchE com a presença de
solvente .
aminoácidos dos sítio ativo da AChE no
atual modelo. Estudos envolvendo estes
aminoácidos estão em andamento.
∆Hf (kcal/mol)
Sistema HuAChE
DmAChE
1
-386,6
-386,4
2
-375,9
-374,5
3
-368,6
-367,9
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1
CASIDA, J. E.; QUISTAD, G. B. Golden
age of insecticide research: Past, present
and future. Ann. Rev. Entomol., v. 43, p. 116, 1998.
2
Pode ser observado que a transferência
do hidrogênio de Ser para o nitrogênio de
His é um processo endotérmico tanto para
a enzima humana como para a de D.
melanogaster . Na presença de solvente, o
processo continuou sendo endotérmico,
porém houve uma significativa queda nos
valores de entalpia, o que se deve à
estabilização das cargas no sistema 2 pelo
dielétrico. Na transferência do próton de His
para Glu o processo foi exotérmico para
HuAChE e para DmAChE na ausência e
endotérmico na presença de solvente.
CONCLUSÃO
O estado entalpicamente mais estável
da tríade catalítica previsto é com a serina
protonada (sistema 1). Os resultados
mostram que a presença do modelo do
solvente altera significativamente os valores
de entalpia calculados, o que deve estar
associado à diferença na distribuição de
carga entre os 3 estados da tríade
catalítica. Na presença do solvente, o
modelo não prevê a transferência do próton
entre His e Glu como favorável, o oposto
do observado na ausência do solvente. Não
foi obsevada uma mudança significativa
quanto ao perfil de protonação na
comparação entre a tríade catalítica de
HuAChE e de DmAChE, mas isso pode ser
resultado da ausência dos demais
QUIAN, N. F.; KOVACH, I. M. Key activesite residues in the inhibition of
acetylcholinesterase by Soman. Febs
Letters, v. 336, p. 263-266, 1993.
3
ZHANG, Y.; KUA, J.; MCCAMMON, J. A.
Role of the catalytic triad and oxyanion hole
in the acetylcholinesterase catalysis: An ab
initio QM/MM study. J. Am. Chem. Soc., v.
124, p. 10572-10577, 2002.
4
HAREL,
M.;
KRYGER,
G.;
ROSENBERRY, T. L.; MALLENDER, W. D.;
LEWIS, T.; FLETCHER, R. J.; J. M. GUSS,
I.SILMAN, J. L.SUSSMAN. Threedimensional structures of Drosophila
melanogaster acetylcholinesterase and of
its complexes with two potent inhibitors.
Protein Sci. V. 9, p. 1063-1072, 2000
5
KRYGER, G., HAREL, M., GILES, K.,
TOKER, L., VELAN, B., LAZAR, A.,
KRONMAN, C., BARAK, D., ARIEL, N.,
SHAFFERMAN, A., SILMAN, I.,
SUSSMAN, J. L.: Structures of
Recombinant Native and E202Q Mutant
Human Acetylcholinesterase Complexed
with the Snake-Venom Toxin Fasciculin-II.
Acta Crystallogr., Sect.D, v. 56, p. 13851394, 2000.
6
SAYLE, R., Glaxo Wellcome Research and
Development, Stevenage, Hertfordshire, UK,
1993.
7
WALTERS, P.; STAHL, M., University of
Rev. Univ. Rural, Sér. Ci. Exatas e da Terra. Seropédica, RJ, EDUR, v. 23, n. 1-2, jan.- dez., 2004. p.134-138.
Estudos granulométricos e de ...
138
Arizona, Arizona, USA, 1996
8
STEWART, J. J. P., Fujitsu Ltd, Japão,
2002.
9
STEWART, J. J. P., Optimization of
parameters for semiempirical methods. J.
Comp. Chem., v. 10, p. 209-220, 1989.
Rev. Univ. Rural, Sér. Ci. Exatas e da Terra. Seropédica, RJ, EDUR, v. 23, n. 1-2, jan.- dez., 2004. p. 134-138.