O Acaso na
Natureza
Guia do Aluno
Simulação de uma Análise Genética
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De uma árvore genealógica ao ADN – e voltar
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Nesta simulação prática, irás investigar a hereditariedade de um único gene
envolvido numa característica genética em
particular. A história base da investigação é a
seguinte:
Amostras individuais de ADN foram doadas
por membros de uma grande família (em
baixo). De cada amostra, parte do gene em
estudo foi amplificado usando a reacção em
cadeia da polimerase (PCR). Isto proporciona
milhões de cópias do ADN para que se
consiga uma detecção mais fácil. O gene em
questão tem dois alelos diferentes (variantes
do gene).
Receberás uma ou mais amostras de ADN
amplificado. A tua tarefa é detectar quais os
alelos presentes em cada amostra cortando o
ADN
com
examinando
uma
os
enzima
de
fragmentos
restrição
de
e
ADN
resultantes usando electroforese em
gel. Estes dados genéticos podem ser
Legenda:
Sample – Amostra; Restriction Enzyme Treatment – Tratamento com
combinados com a árvore genealógica
Enzima de Restrição; Autosomal – Autossómica; Sex-linked – Ligada ao
para que possas determinar como é
sexo; Dominant allele – Alelo dominante; Recessive Allele – Alelo
herdada a característica genética. O
– pares de bases (pb); Gel electrophoresis – Electroforese em gel; Trait –
processo está resumido ao lado.
Característica; No trait – Sem característica; Carrier – Portador;
recessivo; DNA cut by enzima – ADN cortado pela enzima; base pairs (bp)
Movement of DNA fragments – Movimento dos fragmentos de ADN.
Neste exercício, a característica pode ter sido herdada numa de duas maneiras:
como um característica autossómica recessiva ou como uma característica ligada ao
sexo.
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Características Autossómicas Recessivas
Um membro da família que é homozigótico para o alelo dominante (genótipo DD)
terá apenas ADN do tipo D. Ele não terá a característica. No entanto, alguém que
seja homozigótico para o alelo associado à característica (genótipo dd) só terá ADN
do tipo d. Manifestará, assim, a característica. Indivíduos heterozigóticos (genótipo
Dd) têm ADN dos dois tipos, mas o alelo recessivo (d) estará ocultado pelo alelo
dominante (D) e a característica não se manifestará.
A diferença na sequência do ADN dos alelos D e d é tal que, no alelo d, há uma
sequência de pares de bases que pode ser reconhecida e cortada por uma enzima
de restrição. No entanto, o alelo dominante (D) não tem zona de restrição e, por
isso, não será cortado pela enzima.
Indivíduos que são homozigóticos para o alelo dominante (DD) apenas têm ADN do
tipo D, que não é afectado pelo tratamento com a enzima de restrição. A
electroforese em gel separa fragmentos de ADN pelo tamanho, assim, nestas
amostras, todos os fragmentos de ADN por cortar mover-se-ão em conjunto para
formar uma banda única no gel.
Indivíduos que são homozigóticos para o alelo recessivo (dd) têm apenas ADN do
tipo d, por isso, todo o seu ADN será cortado pela enzima. Isto cria fragmentos de
dois tamanhos diferentes que irão produzir duas bandas no gel depois da
electroforese.
Indivíduos heterozigóticostos (Dd) terão ADN dos dois tipos. Metade dos fragmentos
de ADN (do tipo D) permanecerão por cortar e metade dos fragmentos serão
cortados em dois. Assim, depois da incubação com a enzima de restrição, amostras
de ADN de uma pessoa que é heterozigótica conterão fragmentos de três tipos
diferentes, o que produzirá três diferentes tipos de bandas na electroforese em gel.
Árvore genealógica demonstrativa
das relações entre os sujeitos deste
exercício
Legenda:
Male – Sexo Masculino
Female – Sexo Feminino
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Características ligadas ao sexo
O padrão de hereditariedade que detectas ao analisares as amostras de ADN
poderá mostrar que a característica que estás a estudar é transportada nos
cromossomas sexuais (X e Y). Essas características dizem-se ligadas ao sexo.
Numa fêmea existem dois cromossomas X, por isso, um único alelo recessivo (a)
pode ser mascarado por um alelo dominante (A) no outro cromossoma. Isto é
semelhante à expressão de características nos cromossomas autossómicos
descritos acima. No entanto, muito poucos genes do cromossoma X, que é maior,
têm um gene correspondente no cromossoma Y, mais pequeno. Assim, num macho
com um cromossoma X e um Y, é improvável que um alelo recessivo no
cromossoma X seja mascarado por um no Y. Assim, características ligadas ao sexo
recessivas são extremamente raras em fêmeas, mas são mais facilmente
encontradas em machos.
Enzimas de restrição: cortando o ADN
Enzimas que cortam sequências específicas de ADN chamam-se endonucleases ou enzimas de
restrição. Têm este nome porque são feitas por bactérias para restringir a proliferação de vírus
invasores. Diferentes tipos de enzimas de restrição cortam diferentes sequências de bases no ADN.
Estas enzimas podem ser usadas para ajudar a detectar a presença de diferentes formas de
determinados genes (alelos).
Imagem 1: A enzima de restrição (uma proteína) BamHI ligada a uma
porção de ADN, vista ao longo do eixo do ADN. A representação
esquemática da enzima é feita a amarelo, magenta e cinzento. O ADN, no
centro, é representado como um modelo de linhas.
Imagem 2: A BamHI ligada a uma pequena porção de ADN. A proteína está
representada por uma fita com diferentes tons de azuis para as duas cadeias
que a constituem. Desta vez, o ADN está representado por um modelo cheio.
Estes modelos em computador foram produzidos utilizando RASMOL. A informação de ambos os modelos provém do Banco
de Dados de Proteínas (Protein Data Bank Æ http://www.rcsb.org/pdb). Para procurar esta informação, introduza o código de
identificação: 1BHM
Electroforese em gel do ADN
A electroforese em gel é usada para separar fragmentos de ADN de diferentes
tamanhos. Primeiro, obtém-se um gel a partir de agarose – uma forma muito pura de
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agar, obtida de algas marinhas. Numa das extremidades do tanque onde é colocado
o gel, há vários pequenos orifícios (poços) feitos pelos dentes de um pente que foi
introduzido no gel antes de ele ter solidificado. Uma solução tampão é vertida sobre
o gel, para que encha os orifícios e entre em contacto com os eléctrodos em cada
extremidade do gel. São os Iões presentes na solução tampão que vão conduzir a
electricidade. Esta solução também impede o gel de secar.
Os fragmentos invisíveis de ADN são misturados com um pequeno volume tampão
de amostra que contém uma solução densa de açúcar, de modo que, quando é
adicionada aos pequenos orifícios, afunda-se, levando o ADN consigo.
Uma corrente eléctrica é aplicada aos eléctrodos, criando um campo eléctrico ao
longo do gel. Os grupos fosfato conferem carga eléctrica negativa aos fragmentos de
ADN, de modo que o ADN migra através do gel em direcção ao eléctrodo positivo.
Os fragmentos mais pequenos movimentam-se rapidamente através do gel poroso –
fragmentos maiores viajam mais lentamente. Deste modo, os pedaços de ADN são
separados pelo tamanho. O tampão de amostra também se move através do gel,
para que se possa acompanhar a progressão da electroforese. Depois da
electroforese, o gel é corado de modo a revelar a presença do ADN. Cada banda
individual no gel é constituída por milhões de fragmentos de ADN do mesmo
tamanho.
Legenda:
Buffer solution (over gel) – Solução tampão (sobre o gel); Loading Dye – Tinta contrastante; DNA
fragments are in this area – Os fragmentos de ADN estão nesta área; Wells – Orifícios; Electrode –
Eléctrodo; Direction of DNA movement – Sentido do movimento do ADN
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Utilização das microsseringas
As microsseringas deste kit estão desenhadas de modo a serem usadas com pontas
descartáveis. Cada ponta deve ser usada uma única vez e a seguir ser colocada no
lixo. As pontas estão marcadas com 2 e 10 microlitros (µL), permitindo que
pequenos volumes de líquido sejam medidos com precisão. Obterás melhores
resultados se adoptares as respectivas precauções:
• Nunca puxes o êmbolo para fora da seringa – quando o re-inserires, o selo pode
ficar danificado;
• Antes de encheres a microsseringa, puxa o êmbolo um pouco para fora (1-2mm).
Isto dar-te-á algum ar extra para no fim conseguires expulsar a última gota de líquido
da ponta da microsseringa;
• Ao administrares líquidos, segura a microsseringa o mais próximo possível da
posição vertical e ao nível dos teus olhos, para que possas ver aquilo que estás a
fazer;
• Remove a gota de líquido da ponta da microsseringa tocando na parede interior do
microtubo;
• Não toques na ponta da microsseringa com os teus dedos. Existem proteases e
DNAses no teu suor que podem contaminar e degradar os reagentes que estás a
pipetar.
Legenda:
Microsyringe – Microsseringa; Important hold
here don’t touch the tip! – Importante segura
aqui. Não toques na ponta!; Calibrated tip –
Ponta calibrada
Unidades de volume
Um microlitro corresponde à milionésima parte
do litro
1 litro (L) = 1 000 mililitros
1 mililitro (mL) = 1 000 microlitros (µl)
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Distribuição da amostra de ADN
a. Coloca uma ponta limpa na microsseringa. Coloca 20µL da solução de ADN
que recebeste num tubo contendo uma enzima de restrição liofilizada. Mistura
o líquido e a enzima liofilizada com cuidado, arrastando o líquido para cima e
para baixo, na ponta, algumas vezes. O líquido no tubo da enzima deverá
apresentar uma distinta tonalidade azul, mas não deverá haver uma
concentração de corante no fundo do tubo.
b. Fecha bem o tubo com uma tampa.
c. Escreve o número da amostra no tubo usando uma caneta com tinta à prova
de água. Escreve perto da borda do tubo, onde é mais improvável que a tinta
se apague.
d. Coloca o teu tubo num suporte flutuante junto das outras amostras de ADN
(provavelmente de outros estudantes).
Notas
• A enzima liofilizada foi conservada com uma solução tampão apropriada e um corante azul. É
essencial acrescentar o volume correcto de líquido no tubo e garantir que os seus componentes se
misturam bem. Isto porque as enzimas de restrição podem ser menos eficazes se forem usadas em
excesso ou com uma concentração errada de solução tampão. Por exemplo, numa concentração
inapropriada de solução tampão, a enzima EcoRI pode cortar moléculas de ADN na sequência AATT
em vez de cortar a longa e mais específica sequência GAATTC.
• As enzimas de restrição providenciadas no kit trabalham melhor a 37ºC. A maior parte das enzimas
de restrição estão acabadas de desnaturar e, uma vez rehidratadas, devem ser utilizadas
imediatamente.
Legenda:
Important Mix well after dispensing – Importante Mexer bem
depois de colocar o ADN; Numbered DNA sample – Amostra
de ADN numerada; Label here – Identifica o tubo aqui; Dried
restriction enzyme – Enzima de restrição liofilizada
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Incubação
a. Confirma que os tubos contendo o ADN estão bem tapados e, de seguida,
incuba-os num banho de água ou numa incubadora a 37ºC, durante 30 a 45
minutos.
Durante a incubação, a enzima de restrição cortará as moléculas de ADN numa zona específica, se
essa
zona
estiver
presente.
Isto
produzirá,
dos
fragmentos originais de 6500 pares de bases que te
foram fornecidos, fragmentos de 2500 e 4000 pares de
bases. Se não existir uma zona apropriada para a
restrição, os fragmentos de ADN permanecerão inteiros.
Depois de algumas horas, a acção enzimática acabará.
Legenda:
Foam block that floats – Suportes de espuma que
flutuam; Incubate for 30-45 minutes – Incubar
durante 30-45 minutos
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Preparação do gel
a. Se ainda não foi feito, usa um forno microondas ou um banho de água a
ferver para derreter algum gel de agarose gel (0.8% p/v feito na solução
tampão TBE). Agita o líquido e certifica-te que não há aglomerados ou fibras
de agarose que permaneçam por dissolver. Guarda a agarose derretida num
banho de água ou numa incubadora a 55-60ºC até ser necessária.
b. Corta dois pedaços do tecido de fibra de carbono, cada um com
aproximadamente 42mm x 22mm. Estes serão os eléctrodos de cada lado do
tanque do gel. Verifica se os eléctrodos encaixam correctamente em cada
extremidade do tanque, depois retira-os e coloca-os de lado.
c. Coloca um pente de 4 ou 6 dentes na ranhura de uma das extremidades do
tanque do gel e depois coloca-o numa superfície direita. Isto é necessário
porque, se o gel solidifica num determinado ângulo, os fragmentos de ADN
não se moverão uniformemente pelo gel.
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d. Tendo cuidado para não te queimares, agita a garrafa de novo e verte cerca
de 10mL de agarose derretida no tanque do gel de modo a que encha a
cavidade central e flua por debaixo e entre os dentes do pente. Tenta não
adicionar agarose em demasia – precisarás de um gel liso e não com curvas.
Se derramares solução de agarose nas áreas perto das extremidades do
tanque, deixa-a repousar – poderás retirá-la mais tarde quando estiver
repousada.
e. Deixa o tanque em repouso por 20-30 minutos, até o gel ficar duro (o gel
ficará opaco assim que estiver sólido).
Legenda:
Molten agarose can scald – Agarose derretida
pode queimar; Flat side of the comb – Lado liso
do pente; Molten agarose – Agarose derretida;
Carbon fibre tissue – Tecido de fibra de carbono;
Cut two electrodes – Corta dois eléctrodos
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Carregamento do gel
a. Verte ligeiramente cerca de 10mL da solução tampão TBE no tanque de gel.
O líquido deverá cobrir a superfície do gel e escorrer para as áreas de cada
extremidade.
b. Com extremo cuidado, remove o pente do gel, permitindo que a solução
tampão encha os orifícios deixados pelo pente. Tem cuidado para não
rasgares os orifícios ao puxares o pente.
c. Coloca o tanque do gel num local onde possa permanecer em repouso
enquanto decorre a electroforese.
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Verás mais facilmente aquilo que vais fazer a seguir se colocares o tanque do gel
numa superfície escura, por exemplo, um pedaço de papel preto. Como alternativa,
podes colar uma fita preta no fundo do tanque, debaixo dos orifícios.
d. Coloca uma ponta nova na microsseringa.
Acrescenta 2µL de tampão de amotra ao
tubo contendo o ADN que queres carregar.
Mistura a tinta e a amostra de ADN
agitando vigorosamente a mistura para
cima
e
para
baixo
na
ponta
da
microsseringa.
e. Pipeta a mistura de tampão de amostra e
ADN para dentro de um dos poços,
segurando a ponta acima do orifício mas
debaixo
da
solução
tampão
(vê
a
ilustração). Tem muito cuidado para não
perfurares o fundo do orifício com a ponta
Legenda:
TBE buffer over gel – Solução tampão TBE
sobre o gel; Loading dye – Corante de ADN;
da microsseringa.
DNA sample – Amostra de ADN; Black card
f. Anota qual o ADN que colocaste dentro de
under gel tank reveals the wells – Um papel
cada orifício (escreve no lado de fora do
escuro debaixo do tanque permite que se
vejam os orifícios; Electrodes – Eléctrodos.
tanque de gel com um marcador, se
necessário).
g. Repete os passos d-f com as outras
amostras de ADN digerido (talvez de outros
estudantes
da
tua
turma).
Para
evitar
contaminação cruzada, usa sempre uma
ponta nova para cada amostra.
h. Se estás a utilizar um pente de quatro dentes
para fazer os orifícios, acrescenta 2µL de ADN marcador num dos orifícios no
gel. Se utilizaste um pente de 6 dentes, acrescenta apenas 1µL ADN
marcador a um dos orifícios.
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Correr o gel
a. Coloca
um
eléctrodo
em
cada
extremidade do tanque, como mostra
a ilustração. Junta os eléctrodos a
pilhas usando fios com molas de
crocodilo.
Deverão
ser
utilizadas
pilhas suficientes (em série) para
fornecer uma voltagem total de não
Legenda:
Electrodes – Eléctodos
mais de 36 volts. Certifica-te que o terminal positivo da
bateria está ligado ao eléctrodo mais afastado dos orifícios.
b. Certifica-te que há contacto entre a solução tampão e os eléctrodos
(acrescenta um pouco mais de tampão TBE se for necessário). Se a corrente
estiver a passar, deverás ver bolhas vindo de ambos os eléctrodos.
c. Deixa o gel a correr em repouso durante algumas horas. Numa sala mais
quente, talvez seja necessário colocar o tanque de gel num saco de plástico
para reduzir a evaporação da solução tampão. Como alternativa, poderás
usar um pente com seis dentes para tapar o tanque.
d. Desliga as pilhas assim que o corante azul alcançar o fim do gel. Se deixares
as baterias ligadas, o ADN ultrapassará o fim do gel.
e. Limpa as molas de crocodilo com água da torneira e seca-os bem para
prevenir a corrosão.
Perigo de choques eléctricos sérios se o equipamento for
ligado directamente a uma tomada
Notas
• Os iões na solução tampão TBE usada no gel
conduzem a electricidade. Esta solução tampão é
alcalina. Em condições alcalinas, os grupos fosfato
do ADN têm carga negativa e, assim, o ADN movese na direcção do eléctrodo positivo (ânodo) quando
em presença de corrente eléctrica. O EDTA (ácido
etilenodiaminotetracético)
presente
na
solução
tampão “aniquila” iões divalentes (tal como o Mg2+).
Legenda:
Isto ajuda a prevenir danos no ADN, uma vez que
Warning! Use no more than 36 volts – Aviso! Não
esses iões são necessários (como co-factores) às
usar mais de 36 volts; Place the comb over the tank to
enzimas (DNases) que degradam o ADN.
reduce evaporation – Colocar um pente sobre o
tanque para reduzir a evaporação
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• O tampão de amostra não afecta o ADN mas desloca-se através do gel ligeiramente à sua
frente (como se fosse um fragmento de ADN de, aproximadamente, 300 pares de bases).
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Coloração do ADN
a. Retira e coloca de parte os eléctrodos. Verte a solução tampão para fora do
tanque (esta pode ser guardada e reutilizada várias vezes, mas não
indefinidamente).
b. Calça umas luvas de protecção para
prevenir que o corante manche a tua
pele.
c. Deixa
o
gel
no
tanque.
Verte
aproximadamente 10mL de corante
de ADN (Azure A) na superfície do
gel.
d. Deixa-o
durante
exactamente
4
minutos e, de seguida, coloca a tinta
numa
frasco
para
reutilização.
(Assim como a solução tampão, o
corante de ADN pode ser reutilizado
diversas vezes antes de precisares
de o substituir. No entanto, poderás
Legenda:
Azure A moves down through the gel staining the DNA – O
reparar que a tinta velha pode
azure A desloca-se através do gel corando o DNA; 1 kb ruler
precisar de ficar no gel durante um
– régua de 1 kb;
pouco mais de 4 minutos).
milimétrico debaixo do gel é uma boa maneira de medir as
Millimetre graph beneath the gel is a
convenient way to measure distances – Colocar papel
e. Limpa a superfície do gel com água
distâncias; Wells – Orifícios; DNA bands: the patterns you
destilada ou água deionizada com
padrões que vais observar coincidem com os aqui ilustrados;
extrema precaução. Verte a água e
Loading dye – Corante de DNA
see will match those shown here – Bandas de ADN: os
deita-a fora.
f. Coloca o tanque de gel num saco de plástico para prevenir que o gel seque e,
de seguida, deixa o gel “revelar” durante a noite.
g. No símbolo (quadrado ou círculo) de cada pessoa na árvore genealógica,
grava o número de bandas visíveis no gel que contém o ADN dessa pessoa.
Os resultados de todas as amostras ajudar-te-ão a determinar o padrão de
hereditariedade do gene em estudo.
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Notas
• Géis manchados podem ser guardados indefinidamente num saco de plástico selado e guardado
num frigorífico. Não os exponhas a luz solar forte nem uses água com cloro, uma vez que a cor
desaparecerá.
• O ADN marcador presente neste kit contém fragmentos dos seguintes tamanhos (em kb): 12 216;
11 198; 10 180; 9 162; 8 144; 7 126; 6 108; 5 090; 4 072; 3 054; 2 036; 1 636; 1 018; 506; 517. Os
fragmentos mais pequenos do marcador desaparecerão no fim do gel.
ADN e enzimas de restrição
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O ADN e as enzimas de restrição contidas nesta simulação são seguras para
manuseamento nas escolas. Não provêm de humanos e o seu uso não apresenta
quaisquer tipos de preocupações éticas ou de segurança. Não foram utilizados
nenhuns seres vivos. No entanto, a limpeza é importante para prevenir a
contaminação cruzada e assegurar o sucesso da experiência. Salpicos de enzimas
d
e
ou de solução de ADN devem ser limpos com prontidão.
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Os tubos de plástico (polipropileno) usados e as pontas das microsseringas podem
ser colocadas no lixo normal ou recicladas sem qualquer tipo de precaução especial.
Gel de agarose
Se for usado um forno de microondas para derreter o gel de agarose, certifica-te de
que o gel é colocado num recipiente que não esteja selado. Se não estiver
disponível um forno de microondas, em substituição do mesmo, podem ser usados
um banho de água a ferver ou uma placa de aquecimento. Deves mexer o gel
enquanto este aquece para evitar que queime. Não se recomenda o uso do bico de
Bunsen para derreter o gel de agarose.
Cuidado! Agarose quente e derretida pode escaldar e, por isso, deve
ser manuseada com extrema precaução
Tampão TBE
(Tris-Borato-EDTA)
Quando usado conforme as indicações, este tampão não necessita de normas de
segurança especiais. O tampão usado pode ser eliminado directamente pelo cano.
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Tecido do Eléctrodo
O eléctrodo de fibra de carbono poderá libertar pequenas fibras, o que poderá
causar uma ligeira irritação da pele se manuseares o tecido durante muito tempo.
Será uma precaução sensata usares luvas se achares que o tecido é desagradável
de manusear. As fibras libertadas são, no entanto, demasiado grandes para
entrarem nos pulmões, por isso, não será necessário usares uma máscara. As fibras
são solúveis em fluídos corporais e são completamente biodegradáveis.
Energia eléctrica
Aviso! O equipamento para a electroforese em gel foi concebido para funcionar a
baixas voltagens (não excedendo os 36 volts) com pilhas secas. Esta voltagem
jamais deverá ser ultrapassada, uma vez que os componentes eléctricos em uso
não estão isolados do utilizador.
Aviso! Se se ligar este equipamento a uma fonte de electricidade
podem ocorrer choques eléctricos fatais
Corante de ADN
(Azure A em etanol)
A solução concentrada de corante de ADN concentrado é inflamável e deve ser
mantida longe de chamas. O corante é Azure A que, quando diluída como indicado,
forma uma solução de 0.04% em 20% de etanol. Nesta concentração, não apresenta
nenhum risco para a tua segurança, embora seja necessário o devido cuidado para
evitar derrames do líquido na pele ou nos olhos, como por exemplo, usar luvas e
óculos de protecção. O corante utilizado pode ser diluído em água e deitado fora
pelos canos.
Corante do tampão da amostra
(Azul de bromofenol/Sucrose)
Quando usado segundo as indicações, este corante contrastante não apresenta
quaisquer riscos. O corante usado pode ser deitado fora pelos canos.
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Mais informações de segurança
Mais informações sobre segurança envolvendo trabalho prático com ADN poderá ser
encontrada no seguinte artigo:
Delpech, R. And Madden, D. (2001): “Working with DNA” in Topic in
Safety (Third Edition) Association for Science Education. ISBN:
0863573169.
www.ase.org.uk
Este artigo e mais informação pode ser encontrada no sítio do NCBE:
www.ncbe.reading.ac.uk
DNA Science: A first course in recombinant DNA technology by D.A. Micklos and G.A. Freyer (1990)
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Cold Spring Harbor Laboratory Press / Carolina Biological Supply Company. ISBN: 0 89278 411 3.
Brown, N. (1995) Electrophoresis for the visually impaired: the modification of the Lambda protocol
and its use with visually impaired A-level students. Journal of Biological Education 29 (3) 166–169.
Illuminating DNA by Dean Madden (2000) National Centre for Biotechnology Education. ISBN: 0 7049
1370 4.
Recombinant DNA and biotechnology: A guide for students by Helen Kreuzer and Adrianne Massey
(2001) Second edition. American Society for Microbiology
Press. ISBN: 1 55581 176 0.
ABC of clinical genetics by Helen M. King (1997) BMJ Publishing Group. ISBN: 0 7279 1101 5.
Genome. The autobiography of a species in 23 chapters by Matt Ridley (2000) Fourth Estate. ISBN: 1
85702 835 X.
The Human Genome The Wellcome Trust Web site:
www.wellcome.ac.uk/genome
Exploring our molecular selves US National Institutes of Health Web site:
www.nhgri.nih.gov/educationkit/
The molecular modelling software RASMOL (mencionado na página 3) is available free-of-charge
from:
www.umass.edu/microbio/rasmol
15