UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BIOLÓGICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOPROSPECÇÃO MOLECULAR
MESTRADO ACADÊMICO EM BIOPROSPECÇÃO MOLECULAR
GERLÂNIA DE OLIVEIRA LEITE
ATIVIDADES ANTIINFLAMATÓRIA TÓPICA E ANTINOCICEPTIVA
VISCERAL DO ÓLEO ESSENCIAL DO CAULE DE Vanillosmopsis
arborea BAKER E DO SEU PRINCIPAL CONSTITUINTE, (-)-αBISABOLOL
CRATO
2011
GERLÂNIA DE OLIVEIRA LEITE
ATIVIDADES ANTIINFLAMATÓRIA TÓPICA E ANTINOCICEPTIVA
VISCERAL DO ÓLEO ESSENCIAL DO CAULE DE Vanillosmopsis
arborea BAKER E DO SEU PRINCIPAL CONSTITUINTE, (-)-αBISABOLOL
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação
em
Bioprospecção
Molecular
da
Universidade Regional do Cariri como requisito parcial
para obtenção de título de mestre em Bioprospecção
Molecular (Área de concentração: Bioprospecção de
Produtos Naturais).
Orientadora: Profª. Drª. Adriana Rolim Campos Barros
Co-Orientador: Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa
CRATO
2011
Leite, Gerlânia de Oliveira.
L533 Atividades antiinflamatória tópica e antinociceptiva visceral do óleo
essencial do caule de vanillosmopsis arborea Baker e do seu principal
constituinte, (-)-α-bisabolol/ Gerlânia de Oliveira Leite. - Crato-CE, 2011.
112p.; il.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Mestrado em
Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri – URCA
Orientadora: Profª. Drª. Adriana Rolim Campos Barros
Co-Orientador: Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa
1. Vanillosmopsis arborea Baker, propriedades antiinflamatórias
2. (-)-α-bisabolol, óleo essencial do caule. 3. nocicepção visceral.
I. Título.
CDD: 615.323
Ana Paula Saraiva de Sousa CRB- 3/1000
GERLÂNIA DE OLIVEIRA LEITE
ATIVIDADES ANTIINFLAMATÓRIA TÓPICA E ANTINOCICEPTIVA
VISCERAL DO ÓLEO ESSENCIAL DO CAULE DE Vanillosmopsis
arborea BAKER E DO SEU PRINCIPAL CONSTITUINTE, (-)-αBISABOLOL
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação Stricto
Sensu em Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri – URCA,
como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Bioprospecção
Molecular. Área de Concentração: Bioprospecção Molecular. Linha de Pesquisa:
Bioprospecção de Produtos Naturais.
Aprovada em 14/03/11.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________________
Prof. Drª. Adriana Rolim Campos Barros
Universidade de Fortaleza
____________________________________________________
Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho
Universidade Regional do Cariri
____________________________________________________
Prof. Dr. Roberto César Pereira Lima Júnior
Universidade Federal do Ceará
AGRADECIMENTOS
A Deus, dono de todo conhecimento e sabedoria, por conceder essa conquista,
por estender suas mãos nos momentos de desânimo e por me apresentar a
pessoas tão especiais e auxiliadoras no decorrer do mestrado.
Aos pais, Lourival Leite (in memorian) e Gesilda, pois sempre encontrei apoio e
proteção nos momentos que eu mais precisei. Pelos momentos de
confraternização familiar que adoçam nossas vidas e fortificam nossos laços.
Aos meus irmãos Gervânia, Geane, Gehilde e Lourival Filho pelo apoio
incondicional e incentivo no decorrer deste curso.
A grande amiga e orientadora Adriana Rolim Campos Barros, pelo respeito,
instrução, paciência e confiança na minha capacidade e no meu trabalho. Você
foi imprescindível na minha formação. Por sua culpa, vislumbrei um ideal na
área científica.
Ao Prof. e co-orientador Dr. José Galberto Martins da Costa pelo fornecimento
e análise do óleo essencial do caule da Vanillomopsis arborea utilizado nas
pesquisas, pela amizade e colaboração no trabalho.
Ao Prof. Dr. Irwin Rose Alencar de Menezes e a Profª. Drª. Marta Regina
Kerntopf Mendonça pelo incentivo e apoio na realização do trabalho.
Ao Prof. Dr. João Batista Teixeira da Rocha, pelo suporte experimental e pelo
companheirismo no tempo em que passei em Santa Maria.
Aos colegas do grupo de pesquisa em Farmacologia e Química Molecular:
Alaiane Abreu, Andreza Guedes, Daniele Oliveira, Heloísa Souza, Kleber
Dackson, Laura Hévila, Mariana Andrade, Norma Fernandes, Paula Denise,
Renata Sampaio e Romagna Castro, Rogério Aquino, pela disponibilidade nos
testes e pela amizade conquistada e os quais, junto com as “Crises”,
participaram diretamente ou indiretamente neste trabalho e, além disso,
proporcionaram momentos memoráveis.
iv
Aos colegas do grupo de pesquisa em Bioquímica Toxicológica: Albys
“Cubana”, Alessandra, Alessandro, Bruna, Carol, Clea, Cris, Daia, Daniel,
Diones, Emmilly, Fernanda, Jessie, Jefferson, Mohammad Ibrahim, Nilda,
Pablo, Romaina, Rose, Rodrigo, Silvio, Syed Mubasher, Tade, Tiago, Thais,
Waseem pela amizade conquistada e por proporcionarem momentos
memoráveis. Pelo grande acolhimento em Santa Maria.
Aos amigos Magaly, Milena, Aldeni, Janiele, Jussara e Glauberto pelo incentivo
e apoio durante toda a minha caminhada.
A todos os bolsistas do Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais que de
alguma forma colaboraram para a realização deste trabalho.
Aos meus colegas de mestrado pela convivência, paciência, ensinamentos,
reflexões, estudos e que participaram de vários momentos importantes que
superamos com determinação.
À Profª. Drª. Glauce Socorro de Barros Viana da Faculdade de Medicina do
Juazeiro pelo fornecimento dos animais.
Aos funcionários-amigos Silvânia, Luiz, Marcos, Fernando, Lenira, que são
exemplos de pessoas com uma forma toda especial de ser e incentivar.
À coordenação do Curso de Pós-Graduação em Bioprospecção Molecular e
aos professores responsáveis pela minha formação.
À secretaria Andercieli pela atenção e gentileza com que sempre me atendeu
quaisquer que fossem minhas necessidades em relação à pós-graduação.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram de maneira significativa para
a concretização desse estudo, meus sinceros agradecimentos.
Por fim, agradeço ao CNPq, FUNCAP e CAPES pelo apoio financeiro.
v
“Se eu pudesse deixar algum presente à você, deixaria aceso o sentimento de
amar a vida dos seres humanos.
A consciência de aprender tudo o que foi ensinado pelo tempo a fora.
Lembraria os erros que foram cometidos para que não mais se repetissem.
A capacidade de escolher novos rumos.
Deixaria para você, se pudesse o respeito àquilo que é indispensável.
Além do pão, o trabalho.
Além do trabalho, a ação.
E, quando tudo mais faltasse, um segredo: o de buscar no interior de si
mesmo a
resposta e a força para encontrar a saída.”
Mahatma Gandhi
vi
RESUMO
Vanillosmopsis arborea Baker é uma Asteraceae de reconhecido valor
econômico que possui propriedades antiinflamatórias, provenientes do
sesquiterpeno (-)-α-bisabolol (BISA), presente em teores elevados no óleo
essencial de sua madeira (OEVA). O BISA é um álcool sesquiterpeno muito
utilizado numa grande variedade de produtos dermatológicos. Este estudo teve
como objetivo identificar o efeito antiedematogênico local e antinociceptivo
visceral do OEVA e BISA, além do possível mecanismo de ação
antinociceptivo. O efeito antiinflamatório local do OEVA e BISA foi avaliado
através dos modelos de edema de orelha induzido por óleo de Croton, ácido
araquidônico, histamina, capsaicina e fenol em camundongos. O efeito
antinociceptivo visceral foi detectado através da observação de
comportamentos relacionados à nocicepção visceral nos modelos de
nocicepção induzida por ácido acético, ciclofosfamida, capsaicina, formalina e
óleo de mostarda. O OEVA e BISA apresentaram atividade antiinflamatória nos
modelos de edema de orelha induzido por óleo de Croton, ácido araquidônico e
fenol, no entanto não foram eficazes nos modelos de histamina e capsaicina.
Estes resultados sugerem que o OEVA e BISA demonstram comportamento
semelhante a drogas que reduzem a produção de metabólitos do ácido
araquidônico. O OEVA e o BISA apresentaram atividade antinociceptiva
visceral de forma não dose-dependente em todos os modelos testados. O
estudo do mecanismo de ação demonstrou que o efeito do OEVA foi resistente
a todos os antagonistas utilizados. No entanto, em relação ao BISA verificou-se
que o vermelho de rutênio (antagonista dos receptores TRPV1), Naloxona
(antagonista opióide), L-NAME (inibidor da óxido nítrico sintase) e
ondansentrona (antagonista dos receptores 5-HT3) potencializaram o efeito
antinociceptivo do sesquiterpeno, indicando que estas vias podem contribuir
para o efeito antinociceptivo do BISA. A atividade locomotora não foi alterada
pelo pré-tratamento com OEVA 200 mg/kg e BISA 50 mg/Kg, sugerindo que o
efeito antinociceptivo não está relacionado a um efeito relaxamento muscular.
Em conjunto os dados nos mostram uma atividade antiinflamatória tópica e
antinociceptiva visceral do OEVA e BISA. Contudo, o mecanismo de ação pelo
qual OEVA e BISA exercem a atividade antinociceptiva visceral não foi
determinado.
Palavras-chave: Vanillosmopsis arborea, (-)-α-bisabolol, edema de orelha,
nocicepção visceral.
vii
ABSTRACT
Vanillosmopsis arborea Baker is a Asteraceae of recognized economic value
that has antiinflammatory properties related to the sesquiterpene (-)-α-bisabolol
(BISA), that is present in high levels in the bark essential oil (EOVA). BISA is a
sesquiterpene alcohol widely used in a variety of skin care products. This study
aimed to evaluate the topical antiinflammatory and visceral antinociceptive
effects of EOVA and BISA, and to establish the probably mechanism of
antinociceptive action. The topical antiinflammatory effect of EOVA and BISA
was evaluated using mouse models of ear edema induced by croton oil,
arachidonic acid, histamine, capsaicin and phenol. The visceral antinociceptive
effect was observed through the visceral nociception-related behaviors in
models of acetic acid-, cyclophosphamide-, capsaicin-, formalin- and mustard
oil-induced visceral nociception. EOVA and BISA presented antiinflammatory
activity in croton oil, arachidonic acid and phenol models of ear edema.
However, EOVA and BISA were not able to inhibit the ear edema induced by
histamine and capsaicin . These results suggest that the EOVA and BISA
possess activity similar to drugs that decrease arachidonic acid metabolites.
EOVA and BISA presented a dose-indepedent visceral antinociceptive effect in
all models tested. The antinociceptive effect of EOVA was resistant to all the
antagonists used. However, ruthenium red (TRPV1 antagonist), naloxone
(opioid antagonist), L-NAME (nitric oxide synthase inhibitor) and ondansetron
(5-HT3 antagonist) potentiated the antinociceptive effect of BISA, indicating that
these pathways may contribute to its antinociceptive effect. The locomotor
activity was not altered by EOVA 200 mg/kg and BISA 50 mg/kg pretreatments,
therefore, eliminating a nonspecific muscle relaxation effect of EOVA and BISA
at the doses used. Taken together, the data show a topical antiinflammatory
and visceral antinociceptive EOVA and BISA. However, their precise
antinociceptive mechanism of action have not been determined.
Key-words: Vanillosmopsis arborea, (-)-α-bisabolol, ear edema, visceral
nociception
viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA – ácido araquidônico
AINEs – antinflamatórios não esteróides
AMPc – adenosina 3’, 5’ – monofosfato cíclica
ANOVA – Analysis of Variance (Análise de variância, inglês)
BISA – (-)-α-bisabolol
C3a, C3b e C5a – proteínas do sistema complemento
Ca2+ - cátion cálcio bivalente
CAP – capsaicina
CEUA – Comissão de Ética em Uso de Animais
CGRP – peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
COX – ciclooxigenase
E.P.M. – erro padrão da média.
DEX – dexametasona
DCA – Dermatite de Contato Alérgica
DCI – Dermatite de Contato Irritativa
EIM – efeito inibitório médio da inflamação
et al. – e outros; e colaboradores (latim, abrev. de et allii)
GPMc – adenosina 3’, 5’ – monofosfato cíclica
g – grama(s)
h – hora(s)
5-HT – serotonina
IgE – Imunoglobulina E
IL-1 α– interleucina-1-alfa
IND – indometacina
i.p. – via intraperitoneal
iNOS – óxido nítrico sintetase induzível
K+ATP – canais de potássio ATP-dependentes
L-NAME – N-nitro-L-arginina metil ester
LOX – lipoxigenase
5-LOX – 5-lipoxigenase
LTC4 – leucotrieno C4
ix
LTD4 – leucotrieno D4
MAPK – proteína quinase ativada por mitógeno
mg – miligrama(s)
mg/kg – miligramas de concentração da solução por quilograma de massa
corpórea do animal
min – minuto(s)
n – número da amostra
NaCl – cloreto de sódio
NO – óxido nítrico
OC – óleo de Croton
OEVA – Óleo essencial do caule da Vanillomopsis arborea
PAF – fator de ativação plaquetária
PE – percentual de edema
PGs – prostaglandinas
PGE2 – prostaglandinas E2
PKC – proteína quinase C
PLA2 – fosfolipase A2
ROS – reative oxygen species (espécie reativa de oxigênio, inglês)
SNC – Sistema Nervoso Central
SP – Substância P
TRPV1 – Transient receptor potential vanilloide 1
TPA – 12-o-tetracanoilforbol-13-acetato
TNFα – tumor necrosis factor – alpha (fator de necrose tumoral-alfa, inglês)
v.o. – via oral
VR1 – Receptores Vanilóides do tipo 1
x
LISTA DE SÍMBOLOS
α Receptor alfa-adrenérgico
± Mais ou menos
< Menor que
> Maior que
p – significância estatística (erro)
® - marca registrada
xi
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01 Representação esquemática dos mecanismos da dor
21
Figura 02 Vanillosmopsis arborea Baker (A) e estrutura química do
(-)-α-bisabolol (B)................................................................
25
Figura 03 Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha
induzido pela aplicação única de óleo de Croton (OC) em
camundongos.....................................................................
37
Figura 04 Curva tempo-resposta do efeito do OEVA e BISA sobre o
edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de OC
em camundongos...............................................................
39
Figura 05 Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha
induzido pela aplicação múltipla de óleo de Croton (OC)
em camundongos.
40
Figura 06 Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha
induzido por ácido araquidônico (AA) em camundongos.
41
Figura 07 Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha
induzido por capsaicina em camundongos.
42
Figura 08 Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha
induzido por histamina em camundongos.
43
Figura 09 Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha
induzido por fenol em camundongos.
44
Figura 10 Efeito antinociceptivo do OEVA e BISA no modelo de
nocicepção visceral induzida por ácido acético em
camundongos.
45
Figura 11 Efeito antinociceptivo do OEVA e BISA no modelo de
nocicepção visceral induzida por ciclofosfamida em
camundongos.
46
Figura 12 Efeito antinociceptivo do OEVA e BISA no modelo de
nocicepção visceral induzida por capsaicina em
camundongos.
47
Figura 13 Efeito antinociceptivo do OEVA e BISA no modelo de
nocicepção visceral induzida por formalina em
camundongos.
48
Figura 14 Efeito antinociceptivo do OEVA e BISA no modelo de
nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda em
camundongos.
49
Figura 15 Efeito da Naloxona, L-NAME, Ioimbina, Glibenclamida,
Ondasentrona e Vermelho de Rutênio no efeito
antinociceptivo visceral.
50
xii
Figura 16 Estudo do envolvimento do sistema opióide no
mecanismo de ação antinociceptivo visceral do OEVA e
BISA.
51
Figura 17 Estudo do envolvimento do óxido nítrico no mecanismo
de ação antinociceptivo visceral do OEVA e BISA.
52
Figura 18 Estudo do envolvimento dos receptores noradrenérgicos
α2 no mecanismo de ação antinociceptivo visceral do
OEVA e BISA.
53
K+ATP
Figura 19 Estudo do envolvimento dos canais de
no
mecanismo de ação antinociceptivo visceral do OEVA e
BISA.
54
Figura 20 Estudo do envolvimento dos receptores serotoninérgicos
no mecanismo de ação antinociceptivo visceral do OEVA
e BISA.
55
Figura 21 Estudo do envolvimento dos receptores TRPV1 no
mecanismo de ação antinociceptivo visceral do OEVA e
BISA.
56
Figura 22 Efeito do OEVA e BISA sobre a atividade motora
espontânea de camundongos no teste do campo aberto.
57
xiii
SUMÁRIO
RESUMO
vii
ABSTRACT
viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ix
LISTA DE SÍMBOLOS
xi
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
xii
1.
1.1
1.1.1
1.1.1.1.
1.1.1.1.1
1.1.1.1.2.
1.2.
1.2.1.
1.2.2.
1.2.3.
1.2.4.
1.3.
1.4.
INTRODUÇÃO
Doenças inflamatórias cutâneas
Dermatite
Dermatites de contato
Dermatite de contato irritativa
Dermatite de contato alérgica
Nocicepção
Definição de dor
Classificação do tipo de dor
Mecanismos da dor
Dor visceral
Vanillosmopsis arborea Baker
(-)-α-bisabolol
16
16
16
17
17
18
19
19
20
20
21
24
26
2.
2.1.
2.2.
OBJETIVOS
Objetivo geral
Objetivos específicos
27
27
27
3.
3.1.
3.1.1.
3.1.2.
3.2.
3.3.
3.4.
3.4.1.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais utilizados
Drogas, reagentes e soluções
Material permanente e equipamentos utilizados
Animais
Obtenção do óleo essencial e (-)-α-bisabolol
Avaliação da atividade antiinflamatória tópica
Edema de orelha induzido pela aplicação única de óleo de
Croton
Quantificação do edema e do efeito inibitório médio
Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de
Croton
Edema de orelha induzido por ácido araquidônico
Edema de orelha induzido por capsaicina
Edema de orelha induzido pela injeção subcutânea de
histamina
Edema de orelha induzido por fenol
28
28
28
29
29
29
30
30
3.4.2.
3.4.3.
3.4.4.
3.4.5.
3.4.6.
3.4.7.
31
31
31
32
32
33
xiv
3.5.
3.5.1.
3.5.2.
3.5.3.
3.5.4.
3.5.5.
3.5.6.
3.6.
Estudo da atividade antinociceptiva visceral
Nocicepção visceral induzida por ácido acético
Nocicepção visceral induzida por ciclofosfamida
Nocicepção visceral induzida por capsaicina
Nocicepção visceral induzida por formalina
Nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda
Teste do campo aberto
Análise Estatística
33
33
33
34
35
35
36
36
4.
4.1.
37
37
4.2.5.2.
4.2.5.3.
4.2.5.4.
4.2.5.5.
4.2.5.6.
4.2.5.7.
4.2.6.
RESULTADOS
Avaliação da atividade antiinflamatória tópica através de
modelos de edema de orelha induzido por agentes irritantes em
camundongos
Edema de orelha induzido pela aplicação única de óleo de
Croton
Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de
Croton
Edema de orelha induzido por ácido araquidônico
Edema de orelha induzido por capsaicina
Edema de orelha induzido pela injeção subcutânea de
histamina
Edema de orelha induzido por fenol
Estudo da atividade antinociceptiva visceral
Nocicepção visceral induzida por ácido acético
Nocicepção visceral induzida por ciclofosfamida
Nocicepção visceral induzida por capsaicina
Nocicepção visceral induzida por formalina
Nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda
Efeito da Naloxona, L-NAME, Ioimbina, Glibenclamida,
Ondasentrona e Vermelho de Rutênio
Estudo do envolvimento do sistema opióide
Estudo do envolvimento do óxido nítrico
Estudo do envolvimento dos receptores noradrenérgicos α2
Estudo do envolvimento dos canais K+ATP
Estudo do envolvimento dos receptores serotoninérgicos 5-HT3
Estudo do envolvimento dos receptores TRPV1
Teste do campo aberto
5.
DISCUSSÂO
58
6.
CONCLUSÕES
72
7.
BIBLIOGRAFIA
74
APÊNDICE
85
4.1.1.
4.1.2.
4.1.3.
4.1.4.
4.1.5.
4.1.6.
4.2.
4.2.1.
4.2.2.
4.2.3.
4.2.4.
4.2.5.
4.2.5.1
37
38
39
41
42
43
44
44
45
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
xv
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Doenças inflamatórias cutâneas
As doenças dermatológicas que têm em sua etiologia componentes
inflamatórios e/ou imunológicos, nas quais incluem as dermatites, eczemas e
psoríase, caracterizam - se por envolver componentes emocionais, nos quais
promovem recidivas ou exacerbação das lesões e alterações cutâneas que
conferem um aspecto desagradável à pele e que necessitam de tratamento
prolongado. As doenças inflamatórias da pele como dermatites e psoríase tem
prevalência dessas doenças duplicadas nos últimos 10 a 15 anos (RUSSEL-JONES
et al., 2005; LJUBOJEVIC et al., 2002). Os mecanismos envolvidos na patogênese
das doenças inflamatórias cutâneas podem ser distintos, sendo algumas doenças
iniciadas por um processo alérgico ou irritativo. Assim, as doenças inflamatórias
cutâneas não envolvem necessariamente o mesmo perfil e, conseqüentemente o
mesmo tipo de tratamento (FIRESTEIN, 2004; LEUNG et al., 2004).
1.1.1. Dermatite
As
dermatites
são
dermatoses
inflamatórias mediadas por
fatores
imunológicos locais ou sistêmicos, embora as causas de muitas delas continuem
desconhecidas. Geralmente, as lesões agudas continuam por alguns dias a
semanas e se caracterizam por inflamação, edema e, em algumas, lesão
epidérmica, vascular ou subcutânea. Por outro lado, as lesões crônicas persistem
por meses a anos e, freqüentemente, exibem componentes significativos de
crescimento epidérmico alterado (atrofia ou hiperplasia) ou fibrose dérmica
(MURPHY; MIHM Jr., 2000).
Como exemplos das dermatoses mais encontradas no contexto da lesão
aguda tem-se a úrticaria, a dermatite eczematosa aguda (que inclui a dermatite de
contato, a dermatite atópica, dermatite eczematosa relacionada a drogas, erupção
fotoeczematosa e dermatite irritante primária) e o eritema multiforme. Como
exemplos de dermatoses crônicas, podem-se citar a psoríase, o líquen plano e o
lúpus eritematoso (MURPHY; MIHM Jr., 2000).
17
1.1.1.1. Dermatites de contato
A dermatite de contato é uma desordem caracterizada por inflamação e
prurido na pele (BÁNVÖLGYI et al., 2005). A dermatite de contato é dividida em dois
tipos distintos:
• dermatite de contato irritativa: resultantes de dano direto à pele, produtos químicos
e/ou irritantes físicos (por exemplo, eczema da mão pelo excesso de exposição aos
sabões e detergentes).
• dermatite de contato alérgica: é uma dermatite imunomediada, tipo IV
caracterizada por uma reação de hipersensibilidade a um alérgeno específico (por
exemplo, eczema do couro cabeludo e da face por tintura de cabelo, eczema do pé
por calçado de couro) (STONE, 2005; ENGLISH, 2004).
A maioria dos agentes freqüentemente causadores de dermatite de contato
são produtos químicos de borracha e materiais (14,1% dos casos relatados por
dermatologistas); sabões e produtos de limpeza (12,7%); níquel (11,9%); trabalhos
úmidos (11,1%); equipamentos de proteção individual (6,2%); produtos petrolíferos
(6,3%); óleos de corte e refrigerantes (5,6%); epóxi e outras resinas (6,1%). De
1608 casos de câncer de pele estimados, 4% foram atribuídos à radiação
ultravioleta. Casos de urticária de contato são atribuídos ao látex que atingiu o pico
em 1996, com uma redução dos casos desde aquela época (CHERRY el al., 2000).
1.1.1.1.1. Dermatite de contato irritativa
A dermatite de contato irritativa (DCI) é uma resposta da pele a uma
variedade de estímulos externos que induzem a liberação de citocinas próinflamatórias a partir de células da pele (principalmente queratinócitos), em resposta
a estímulos químicos sem, no entanto promover a produção de anticorpos
específicos. As lesões levam a perda da integridade da pele e podem permitir
absorção das proteínas e sensibilização posterior. Este tipo de dermatite
proporciona as mesmas características morfológicas de outras dermatites, com
menos vesículas e, mais infiltrado neutrofílico (SMITH et al., 2002).
18
As três principais alterações fisiopatológicas observadas são rompimento da
barreira da pele, mudanças epidérmicas celulares e liberação de citocinas (SMITH et
al., 2002).
A DCI pode ser causada por fatores internos e externos. Os fatores externos
são as características da molécula causadora, o tempo de exposição, o efeito
cumulativo com outro irritante e as condições ambientais. E as características
internas dizem respeito à susceptibilidade individual dos pacientes, como raça,
idade, sexo, e história prévia de dermatite (LEVIN; MAIBACH, 2002).
1.1.1.1.2. Dermatite de contato alérgica
A dermatite de contato alérgica (DCA) é um problema comum de saúde
ocupacional e ambiental. Em comum com outras formas de alergia a doença evolui
em duas fases: uma fase inicial em que a sensibilização é adquirida, seguido mais
tarde (após exposição subseqüente à mesma substância química alergênica) pela
indução da reação cutânea inflamatória. Essa hipersensibilidade de contato, é uma
desordem da pele dependente de células T com a cinética de uma resposta de
hipersensibilidade do tipo tardia (KIMBER et al., 2002).
Os antígenos sensibilizantes, também conhecidos como haptenos, são
moléculas instáveis, de baixo peso molecular que não são imunogênicas e ligam - se
as proteínas da epiderme do hospedeiro. Os haptenos potentes induzem uma
irritação cutânea dose-dependente que é independente de sua antigenicidade
(BELSITO, 2000; SMITH et al., 2002).
Muitas substâncias químicas podem causar DCA, incluindo substâncias
químicas da resina epoxy, acrilatos, produtos químicos de borracha, emulsionantes
e certos corantes. Destes, a maior parte das DCAs que ocorrem resultam da
exposição ocupacional. Entretanto, a exposição não ocupacional, por exemplo, a
alérgenos em cosméticos, em vestuário e calçado, em medicamentos e nas plantas,
representa causa importante da DCA (KIMBER et al., 2002).
A seguir, evidenciam-se os principais aspectos clínicos que diferenciam os
tipos de dermatite de contato em irritativa e alérgica (ELIAS et al.,1998).
Dermatite de contato irritativa (DCI) – Ressecamento da pele na área de
contato e descamação com ou sem eritema. Pode evoluir com fissuras e
19
sangramentos. É importante lembrar que o processo irritativo irá depender do agente
causador.
Dermatite de contato alérgica (DCA) – Presença de eritema, edema e
vesiculação. Ao se cronificar, verifica-se a presença de crostas serosas podendo
ocorrer infecção secundária e, às vezes, liquenificação.
O screening de compostos com propriedades anti-inflamatórias é possível
graças a uma infinidade de técnicas in vitro (cultura de células e dosagem de
mediadores inflamatórios; inibição de enzimas) e in vivo (indução de inflamação por
substâncias denominadas agentes flogísticos ou irritantes em modelos animais
variados), amplamente utilizados na pesquisa pré-clínica. O modelo in vivo de
edema de orelha é amplamente utilizado para demonstrar a atividade tópica de
substâncias bioativas em inflamações cutâneas (BLAZSÓ; GÁBOR, 1995; GÁBOR,
2000). Esse modelo caracteriza - se por demonstrar resultados rápidos, simplicidade
da técnica, reprodutibilidade e baixas possibilidades de erros quando bem aplicado,
além de ser um modelo que minimiza uso de animais e de substâncias (GÁBOR,
2000).
Os agentes flogísticos ativam quimicamente um processo inflamatório.
Diferentes substâncias com esse potencial podem ativar vias diversas da cascata
inflamatória, desencadeando os sinais característicos como edema, aumento de
permeabilidade, vasodilatação, eritema. Por ativar vias diversas, a aplicação de
diferentes agentes flogísticos (óleo de Croton, ácido araquidônico, capsaicina, fenol
e histamina) é justificada por seus mecanismos específicos, já conhecidos, na
indução do processo inflamatório, cujos resultados obtidos podem sugerir um
provável mecanismo da ação antiinflamatória da substância em estudo (GÁBOR,
2000).
1.2.
Nocicepção
1.2.1. Definição de dor
Dor é uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a uma
lesão tissular potencial ou real ou mesmo a nenhuma lesão, embora ainda assim
20
descrita com termos sugestivos de que o dano tecidual tivesse de fato ocorrido
(IASP, 1979).
A dor é uma das grandes preocupações da humanidade. Desde os
primórdios do ser humano, conforme sugerem alguns registros gráficos da préhistória, o homem sempre procurou esclarecer as razões que justificassem a
ocorrência de dor e os procedimentos destinados para seu controle.
Estudos demonstram que a dor afeta os mais variados domínios da
qualidade de vida humana, primariamente físicos e emocionais. O efeito depende da
extensão, duração, intensidade, significando que a dor, bem como a doença
relacionada, são características individuais (NIV; KREITLER, 2001).
1.2.2. Classificação do tipo de dor
A dor pode ser classificada temporalmente em dois grandes grupos: dor
aguda (estímulo nociceptivo dando origem a uma sensação intensa e desagradável)
e dor crônica (dor que ultrapassa em duração a lesão tecidual precipitante) (RANG
et al., 2007).
A dor pode ser classificada quanto a sua fisiopatologia em (PORTENOY,
2007):
 Nociceptiva: se os mecanismos de sustentação da dor envolvem lesão
tecidual e pode envolver tanto estruturas somáticas como viscerais. Esta
última sendo referida em outros locais, sendo pouco localizada;
 Neuropática: é resultante do processamento somatossensorial anormal ao
nível periférico ou central, como, por exemplo, a dor do membro fantasma e
neuralgia pós-herpética;
 Psicogênica: quando existe uma dor persistente com evidências de distúrbios
psicológicos sem evidência de uma desordem que poderia causar dor.
1.2.3. Mecanismos da dor
Dor é uma sensação que compreende três mecanismos básicos:
Transdução, que é a ativação dos nociceptores por transformação de um estímulo
21
nóxico – mecânico, térmico e químico – em potencial de ação; Transmissão, que é o
conjunto de vias que permitem que o impulso nervoso, gerado ao nível de
nociceptor, seja conduzido para o SNC; e Modulação, vias responsáveis pela
supressão da dor ativadas pelas próprias vias nociceptivas (PORTO, 2004).
Figura 01 – Representação esquemática dos mecanismos da dor
(http://www.dol.inf.br/Html/compreendendoDor.html.)
1.2.4. Dor visceral
A dor visceral é causada por alterações internas de órgãos ocos e cápsulas
de vísceras sólidas, tais como o estômago, rim, bexiga, vesícula biliar, cápsula
hepática, e intestinos, entre outros. Os principais fatores que estimulam as fibras
nociceptivas viscerais são: estiramento (tensão) na parede muscular das vísceras
ocas e capsulas das vísceras sólidas (anormalidades motoras intestinais que geram
pressões intraluminais exageradas são causas comuns), processo inflamatório
(colites, pancreatites, entre outras), isquemia e neoplasias (KRAYCHETE;
GUIMARÃES, 2003).
22
A dor visceral é uma das mais comuns formas de dor produzidas por um
estado patológico (angina, cólica, dispepsia, dismenorréia, etc).
A dor visceral resulta da ativação de fibras sensoriais aferentes que inervam
órgãos internos e é descrito em termos de cinco características clinicas
(GIAMBERARDINO, 1999):
1) Não tem origem em todos os órgãos viscerais (órgãos sólidos como fígado e
parênquima pulmonar não são sensíveis a dor);
2) Nem sempre está relacionada a uma lesão, e sim às propriedades funcionais
e não-estruturais da dor visceral (um estímulo de baixo limiar pode provocar
ativação de neurônios aferentes da víscera, como a pressão gasosa
intraluminal);
3) É referida em outras partes do corpo, o que pode ser explicado pela
convergência central das vias viscerais e somáticas ao se conectarem no
corno dorsal da medula espinhal;
4) É difusa e pouco localizada como conseqüência da baixa densidade de
terminais aferentes periféricos, compensados pela divergência central das
vias aferentes;
5) É geralmente acompanhada por acentuados reflexos motores e autonômicos,
o que é conhecido como reação do sistema de alerta.
Diversos estímulos têm sido empregados no estudo da dor visceral e podem
ser categorizadas em quatro grupos (NESS, 1999):
 Estímulos elétricos: onde eletrodos são implantados nos neurônios que
inervam as estruturas viscerais e a estimulação elétrica reproduz estados de
dor em humanos, porém a falta de especificidade restringe seu uso;
 Estímulos mecânicos: onde a distensão de órgãos ocos usando fluidos ou
corpos estranhos permitem a fácil quantificação e controle de estímulo,
estando relacionados a estímulos naturais. Como exemplos, citam-se a
distensão do sistema biliar e cálculos renais artificiais;
 Isquemia: produzida pela oclusão da vasculatura, o que produz estímulos
mecânicos, como a oclusão da artéria coronária, sendo dependente de
circulação colateral e da atividade metabólica do órgão selecionado;
 Estímulos químicos: têm sido aplicados topicamente, por via endovenosa ou
por vias fisiológicas, como a administração sistêmica de ciclofosfamida na
23
indução de cistite hemorrágica e a administração intracolônica de óleo de
mostarda.
Estes estímulos, quando aplicados a espécie de camundongos transgênicos
“Knock-out”, ou mutantes (que têm alterações no comportamento nociceptivo devido
à destruição de genes específicos codificadores de receptores, neurotransmissores
ou de moléculas de segundo mensageiros) têm sido descritos como uma potencial
ferramenta para a investigação molecular do processo nociceptivo (CAO et al., 1998;
SIMONINI et al., 1998). A baixa densidade de inervação do tecido visceral reduz o
potencial para mecanismos compensatórios, o que torna válido o uso destes animais
(LAIRD, 1999).
As terminações nervosas de neurônios aferentes que percebem a sensação
dolorosa são chamadas “nociceptores”. Os neurônios aferentes nociceptivos podem
ser de dois tipos diferentes, um que possui condução lenta com axônios
amielinizados (fibra C) e outro com axônios mielinizados (fibras Aδ). Os corpos
destes neurônios nociceptivos aferentes somáticos e viscerais encontram-se
localizados no glângio da raiz dorsal da medula. Os estímulos nociceptivos são
propagados através destas fibras primárias para neurônios no corno dorsal da
medula espinhal. Após a integração na medula espinhal, a informação nociceptiva é
transmitida a estruturas talâmicas antes de atingir o córtex. Cada um destes níveis
centrais possui mecanismos modulatórios.
Os receptores mecânicos ou mecanorreceptores existentes na musculatura
lisa de todas as vísceras ocas são do tipo Aδ e C, e respondem a estímulos
mecânicos leves, tensão aplicada ao peritônio, contração e distensão da
musculatura lisa (KRAYCHETE; GUIMARÃES, 2003).
Na presença de inflamação, os nociceptores adquirem novas características
ficando “sensibilizados”. Eles começam a disparar estímulos espontaneamente e
seu limiar de ativação fica reduzido. Esta sensibilização pode ser produzida por:
alterações físicas como pressão decorrente da formação de edema; alterações
químicas como a síntese/liberação de prostaglandinas, 5-HT, bradicinina e
aminoácidos excitatórios, e pela participação de citocinas (RANG et al., 2007;
AKBAR et al., 2009).
As estimulações viscerais, tais como hipóxia e inflamação tecidual, resultam
em sensibilização de receptores de alto limiar e de nociceptores “silenciosos”
previamente não-responsivos os quais perfazem 40% a 45% da inervação visceral
24
aferente do cólon. Estes nociceptores estão envolvidos na percepção da dor visceral
crônica. A sensibilização desses receptores persiste mesmo após a cessação do
estimulo nociceptivo, traduzida por alterações das funções motora e sensitiva
(hiperalgesia visceral) (BRIDGES et al., 2001; CERVEJO, 2000; RANG et al., 2007).
Embora o mecanismo de sensibilização visceral central não seja totalmente
conhecido, acredita-se que alguns mediadores como a substância P, peptídeo
relacionado
ao
somatostatina,
gene
e
da
calcitonina,
peptídeo
intestinal
aspartato,
glutamato,
vasoativo
estejam
neurocininas,
envolvidos
no
desenvolvimento e manutenção da sensibilização central induzida pela inflamação.
A ação destes neuromediadores em receptores específicos ativa segundos
mensageiros para a abertura de canais de cálcio e o influxo celular desse íon.
Ocorre então produção de outros mediadores (como NO e metabólitos do ácido
araquidônico) que provavelmente alteram a transmissão do potencial de ação e
ultra-estrutura dos nervos e suas sinapses, e causam sensibilização medular e
fenômeno de wind up (aumento da duração da resposta de certos neurônios)
(BRIDGES et al., 2001; AKBAR et al., 2009; GOLD; GEBHART, 2010; RANG et al.,
2007).
1.3.
Vanillosmopsis arborea Baker
O gênero Vanillosmopsis é representado por sete espécies nativas do Brasil,
algumas delas de valor econômico devido ao teor de óleo, que é muito similar ao
óleo de camomila. (MATOS et al., 1988).
A chapada do Araripe destaca-se no Nordeste brasileiro pela sua
geomorfologia e geologia e estende-se nos limites de Pernambuco ao Ceará. A
biodiversidade da chapada com suas riquezas naturais atrai uma intensa atividade
antrópica que resulta em degradação e risco de extinção. Entre elas, podemos citar
a espécie Vanillosmopsis arborea Baker, uma Asteraceae de reconhecido valor
econômico
que
possui
propriedades
antiinflamatórias,
provenientes
do
sesquiterpeno α-bisabolol, presente em teores elevados no óleo essencial de sua
madeira (Figura 02). Trata-se de uma madeira de boa qualidade, muito resistente às
intempéries e com alto teor de óleo essencial, atributo que promove sua queima
provocando chama intensa, justificando o nome popular “Candeeiro” (CAVALCANTI;
NUNES, 2002). Na cultura popular são atribuídas ao Candeeiro propriedades
25
repelentes contra mosquitos (FURTADO et al., 2005). Devido o α-bisabolol ter
propriedades antiinflamatórias, recentemente nosso grupo estudou o potencial
gastroprotetor do óleo essencial do caule de Vanillosmopsis arborea (LEITE et al.,
2009).
Existem poucos estudos sobre os efeitos farmacológicos do óleo essencial
do caule de V. arborea. A pesquisa bibliográfica revela estudos mostrando atividade
antiinflamatória (MENEZES et al., 1990), larvicida (FURTADO et al., 2005), atividade
gastroprotetora (LEITE et al., 2009), atividade bacteriostática, potencial antioxidante,
antiinflamatória, analgésica, ansiolítica, sedativa, depressora do Sistema Nervoso
Central, hipnótica (SANTOS, 2009) e antimicrobiana (SANTOS et al., 2010).
Recentemente, resultados mostraram que a potencialidade do óleo essencial
do caule de V. arborea (OEVA) pode estar relacionado ao alto teor de (-)-α-bisabolol,
uma vez que os estudos químicos mostraram que o OEVA contém 80,43% de (-)-αbisabolol (SANTOS et al., 2010).
A análise química do óleo essencial do caule demonstrou a presença de
estragol, p-elemeno, metil-eugenol, p-cubebeno, p-himachaleno, p-maalieno, 6guaieno, p-bisaboleno, elemicino, a-cadinol e α-bisabolol – (principal constituinte)
(MATOS et al., 1988).
A
Fonte: Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais - URCA
B
Figura 02 – Vanillosmopsis arborea Baker (A) e estrutura química do (-)-αbisabolol (B).
26
1.4.
(-)-α-bisabolol
O (-)-α-bisabolol é um terpenóide insaturado e hidroxilado, com 1677
citações, sendo que destas, 459 correspondem a patentes de vários países do
mundo. Seu uso principal é em produtos dermatológicos, pois além de apresentar
atividades antimicrobiana, antifúngica e antiinflamatória, possui também baixa
toxicidade (LIMA et al., 2006). É um álcool sesquiterpeno encontrado no óleo de
camomila e outras plantas e tem sido utilizado numa grande variedade de produtos
dermatológicos (GOMES-CARNEIRO et al., 2005). O alto teor de (-)-α-bisabolol no
óleo essencial de V. arborea torna este óleo um possível sucessor ao óleo de
Matricaria chamomila L (CAVALCANTI et al., 2002).
(-)-α-Bisabolol é um álcool sesquiterpeno monocíclico que foi isolado pela
primeira vez em 1951 por Isaac e colaboradores de flores de camomila (Matricaria
chamomilla, Asteraceae). Desde então, tem sido demonstrado que o α-bisabolol
pode existir em quatro estereoisômeros possíveis. O (-)-α-bisabolol tem sido
amplamente
utilizado
como
ingrediente
em
formulações dermatológicas
e
cosméticas, tais como cremes pós-barba, loções de corpo-e-mão, desodorantes,
batons, cuidados com o sol e depois do sol, produtos de cuidados com o bebê e
cremes esporte. A mais importante atividade biológica do (-)-α-bisabolol são
atividades antiinflamatória, antiirritante, antimicrobiana e propriedades não-alergicas.
(KAMATOU;VILJOEN, 2010).
Os
estudos
mostram
que
o
(-)-α-bisabolol
apresenta
atividade
mutagênica/antimutagênica (GOMES-CARNEIRO et al., 2005), inibição do sistema
P450 humano (GANZERA et al., 2006), induz apoptose em células de glioma, em
células endoteliais, em células tumorais, em células HepG2 via Fas e mitocondrial
envolvendo p53 e NFkB, permeabilidade mitocondrial induz apoptose (CAVALIERI et
al., 2004; DARRA et al., 2008; CAVALIERI et al., 2009; CHEN et al., 2010;
MAGNELLI et al., 2010), cicatrizante (VILLEGAS et al., 2001), proteção à toxicidade
gástrica induzida por ácido acetilsalicílico (TORRADO et al., 1995), antioxidante
(BRAGA et al., 2009), antiulcerogênico (BEZERRA et al., 2009; ROCHA et al., 2010),
clareamento da pele (LEE et al., 2010), antinociceptiva periférica, antiinflamatória
com suas ações sobre a serotonia, efeito gastroprotetor evidenciando por suas
ações antioxidantes (ROCHA, 2009), atividade antitumoral (SILVA et al., 2010),
indução a tumores mamários (COSTARELLI et al., 2010) e leishmanicida
(MORALES-YUSTE et al., 2010).
27
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Verificar o efeito antiinflamatório tópico e antinociceptivo visceral do óleo
essencial do caule da Vanillosmopsis arborea Baker (OEVA) e (-)-α-bisabolol (BISA)
em modelos experimentais.
2.2. Objetivos específicos
 Avaliar a atividade antiinflamatória do OEVA e BISA por via tópica utilizando os
modelos de edema de orelha induzido por óleo de Croton (modelo agudo e crônico),
ácido araquidônico, capsaicina, fenol e histamina;
 Estabelecer a eficácia do OEVA e BISA nos modelos de nocicepção visceral
induzida por ácido acético, ciclofosfamida, capsaicina, formalina e óleo de mostarda;
 Avaliar
a
participação
dos
sistemas
opióde,
nitrérgico,
noradrenérgico,
setotoninérgico, vanilóide e dos canais K+ATP no efeito antinociceptivo visceral do
OEVA e BISA.
28
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais utilizados
3.1.1. Drogas, reagentes e soluções
As substâncias utilizadas nos ensaios encontram-se relacionadas, com suas
respectivas procedências:
SUBSTÂNCIA
ORIGEM
Dinâmica, Brasil
 Acetona P.A.
Fluka, Alemanha
 Ácido acético P.A.
Sigma, USA
 Ácido araquidônico
Sigma-Aldrich, USA
 (α) – bisabolol
Sigma, USA
 Capsaicina
Asta Médica, Brasil
 Ciclofosfamida
 Cloridrato de cetamina 10% Syntec, Brasil
(Cetamin®)
 Cloridrato
de
xilazina
2% Syntec, Brasil
(Xilazin®)
Ache, Brasil
 Dexametasona (Decadron®)
Dinâmica, Brasil
 Etanol P.A.
Dinâmica, Brasil
 Éter etílico
Sigma-Aldrich, USA
 Fenol 99%
Fluka, Alemanha
 Formol
Sigma, USA
 Glibenclamida
Sigma, USA
 Histamina
Merck Sharp & Dohme, Brasil
 Indometacina (Indocid®)
Sigma, USA
 Ioimbina
Cristália, Brasil
 Morfina
Sigma, USA
 Naloxona
 N-nitro-L-arginina-metilester
(L- Sigma, USA
NAME)
Sigma, USA
 Óleo de Croton
Ride-de-Haen, Alemanha
 Óleo de Mostarda
FARMACE, Brasil
 Ondasentrona
AVD, Brasil
 Vaselina
Aldrich, USA
 Vermelho de Rutênio
FARMACE, Brasil
 Solução fisiológica NaCl 0,9%
Sigma-Aldrich, USA
 Tween 80
29
3.1.2. Material permanente e equipamentos utilizados
 Balança analítica de precisão (Metler Toledo AB204)
 Cronômetros digitais (LivStar)
 Cânulas de gavagem para camundongos
 Materiais de biossegurança
 Material cirúrgico
 Paquímetro digital (Jomarca, Ref. Nº 205509)
 Perfurador de couro (circunferência de 6 mm Ø)
 Pipetas automáticas (Maxipette)
 Campo aberto (LFQM-CE)
 Seringas estéreis (1 mL, 3 mL e 5 mL)
 Tubos Eppendorffs
 Vidrarias em geral
3.2. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss, machos e fêmeas (20-30g), oriundos
da Universidade Regional do Cariri e Faculdade de Medicina de Juazeiro. Os
animais foram acondicionados em gaiolas apropriadas e mantidos sob temperatura
média de 26oC, em ciclos claro/escuro de 12/12 horas, recebendo ração padrão e
água à vontade. Todos os protocolos seguiram estritamente as normas
internacionais de cuidados com animais de laboratório. O projeto foi submetido e
aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade de
Fortaleza - UNIFOR, com parecer nº 006/2009.
3.3. Obtenção do óleo essencial e (-)-α-bisabolol
O óleo essencial do caule de V. arborea (OEVA) foi fornecido pelo professor
José Galberto Martins da Costa, da Universidade Regional do Cariri. O (-)-αbisabolol foi obtido da SIGMA- Aldrich, St. Louis, Estados Unidos.
Os componentes químicos identificados no óleo essencial foram: propanoato
de etila (5,87%), etanoato de propila (9,00%), o-metil-eugenol (2,39%), óxido-
30
bisabolol (2,31%) e α-bisabolol (80,43%), totalizando 100% na identificação do óleo
essencial.
O OEVA foi diluído em água destilada e Tween 80 3% para gerar as doses
de 100, 200 e 400 mg/kg. O (-)-α-bisabolol foi diluído em água destilada e Tween 80
3% para gerar as doses de 50, 100 e 200 mg/kg. Como o OEVA foi diliuído em
acetona para gerar as doses de 50 e 100 mg/mL e o (-)-α-bisabolol foi diliuído em
acetona para gerar as doses de 35 e 70 mg/mL.
3.4. Avaliação da atividade antiinflamatória tópica
O modelo in vivo de edema de orelha é amplamente utilizado para
demonstrar a atividade tópica de substâncias bioativas em inflamações cutâneas
(BLAZSÓ; GÁBOR, 1995; GÁBOR, 2000).
3.4.1. Edema de orelha induzido pela aplicação única de óleo de Croton
O óleo de Croton é um agente flogístico que possui como constituintes
químicos ésteres de forbol, sendo o TPA (ácido 13-acetato de 12-o-tetracanoilforbol)
o agente com potencial irritante. Sua aplicação estimula a liberação de vários
mediadores da inflamação, como as aminas vasoativas e derivados do ácido
araquidônico (LAPA, 2003). Esse modelo também é bem representativo de
dermatites como a psoríase (GABOR, 2000).
Para avaliar a atividade tópica por tratamento agudo do OEVA e BISA neste
modelo, grupos (n=7) de animais tiveram suas orelhas direitas tratadas,
topicamente, com 20 μL de salina, dexametasona 4 mg/mL (0,08 mg/orelha), OEVA
em acetona nas concentrações 50 e 100 mg/mL (1 e 2 mg/orelha, respectivamente)
ou BISA em acetona nas concentrações 35 e 70 mg/mL (0,7 e 1,4 mg/oelha),
esperando 1 h para absorção. Em seguida, 20 μL de óleo de Croton 5% (v/v) em
acetona foram aplicados topicamente na orelha direita e 20 μL do veículo acetona na
orelha esquerda. Após 6 horas, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical e discos de 6 mm de diâmetro foram obtidos das orelhas através de um
punch (perfurador de couro metálico) para avaliação do edema, conforme item 3.4.2.
(TUBARO et al., 1985).
31
3.4.2. Quantificação do edema e do efeito inibitório médio
Para quantificar o percentual de inflamação em cada animal analisado,
foram obtidos discos de 6 mm de diâmetro: um da orelha direita (tratada com o
agente flogístico) e outro da orelha esquerda (tratada com veículo do agente
flogístico). Em seguida, cada disco obtido teve sua massa mensurada com a
utilização de balança analítica (Metler Toledo AB204). O edema de orelha, expresso
em percentual de aumento da massa da orelha, foi calculado diminuindo a massa da
orelha direta pela massa da orelha esquerda.
3.4.3. Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de Croton
No intuito de avaliar o efeito antiinflamatório do OEVA e BISA em um
processo inflamatório crônico, já estabelecido, foi utilizado um modelo com a
aplicação múltipla do óleo de Croton. O processo inflamatório crônico foi induzido
pela aplicação de 20 μL de óleo de Croton 5% (v/v) em acetona em dias alternados,
durante 9 dias, em camundongos (n = 7/grupo). O OEVA em acetona nas
concentrações 50 e 100 mg/mL (1 e 2 mg/orelha, respectivamente) ou BISA em
acetona nas concentrações 35 e 70 mg/mL (0,7 e 1,4 mg/oelha) e a dexametasona 4
mg/mL (0,08 mg/orelha, controle positivo), foram aplicados por via tópica durante 4
dias (2 vezes ao dia) a partir do 5º dia do experimento, sendo o edema avaliado
diariamente através de medição da espessura das orelhas. No 9° dia do
experimento, os animais foram sacrificados e círculos de 6 mm de tecido das orelhas
foram coletados para avaliação do edema (STANLEY et al., 1991).
3.4.4. Edema de orelha induzido por ácido araquidônico
O ácido araquidônico é um ácido graxo importante na produção de
eicosanóides
mediadores
da
inflamação
(prostaglandinas,
tromboxanos
e
leucotrienos). Drogas, como os AINEs (antiinflamatórios não-esteroidais) ou
inibidoras da 5-lipoxigenase (5-LOX), demonstram redução significativa no
percentual de inflamação induzido por este agente. Para avaliar a atividade tópica do
OEVA e BISA neste modelo, as orelhas direitas dos animais (n = 7 / grupo) foram
tratadas, topicamente, com 20 μL de solução salina (controle negativo),
32
indometacina 100 mg/mL (controle positivo), OEVA 50 e 100 mg/mL ou BISA 35 e
70 mg/mL,
esperando 15 minutos para absorção. Em seguida, 20 μL de ácido
araquidônico 0,1 mg/μL diluído em acetona foram aplicados na orelha direita e 20 μL
do veículo acetona foram aplicados na orelha esquerda. Após 1 hora, os animais
foram sacrificados por deslocamento cervical e discos de 6 mm de diâmetro foram
obtidos das orelhas para avaliação do edema, conforme item 3.4.2. (YOUNG et al,
1984; CRUMMEY et al, 1987).
3.4.5. Edema de orelha induzido por capsaicina
A capsaicina (uma substância ativa da pimenta vermelha, Capsicum ssp),
quando aplicada topicamente, induz a liberação de vários mediadores próinflamatórios neurogênicos, que promovem vasodilatação e eritema como resposta
imediata, seguido da formação de edema (HOLZER, 1991).
Na avaliação da atividade tópica do OEVA e BISA nesse modelo, as orelhas
direitas de animais (n = 7/grupo) foram tratadas, topicamente, com 20 μL de salina,
dexametasona 4 mg/mL, OEVA (50 e 100 mg/mL) ou BISA (35 e 70 mg/mL),
esperando 15 minutos para absorção. Em seguida, 20 μL de capsaicina 0,01 mg/μL
diluída em acetona foram aplicadas na orelha direita e 20 μL do veículo acetona
foram aplicadas na orelha esquerda. Após 30 minutos (pico máximo de formação de
edema), os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e discos de 6 mm
de diâmetro foram obtidos das orelhas para avaliação do edema, conforme item
3.4.2. (GÁBOR; RAZGA,1992).
3.4.6. Edema de orelha induzido pela injeção subcutânea de histamina
Este modelo visa a avaliação do efeito do OEVA e BISA na reação de
hipersensibilidade imediata. Inicialmente, os
animais (n = 7/grupo) foram
anestesiados com cloridrato de cetamina 10 mg/kg, i.p. e cloridato de xilazina 10
mg/kg, i.p. Em seguida, os animais foram pré-tratados topicamente com 20 μL de
salina, dexametasona 4 mg/mL, OEVA (50 e 100 mg/mL) ou BISA (35 e 70 mg/mL).
Após 30 minutos, administrou-se um volume de 5 μL de uma solução de histamina
(100 mg/mL de salina), intradermicamente, na região ventral da orelha direita dos
camundongos com o auxílio de uma agulha hipodérmica 29 G, enquanto que a
33
orelha esquerda recebeu o mesmo volume de salina, também intradermicamente.
Após 2 horas, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e para
posterior avaliação do edema a partir das massas dos discos obtidos, conforme item
3.4.2. (BRAND et al, 2002).
3.4.7. Edema de orelha induzido por fenol
O fenol é um irritante cuja aplicação tópica desencadeia uma inflamação
semelhante à dermatite de contato irritativa. (LIM et al., 2004).
Nessa avaliação, as orelhas direitas de animais (n = 7/grupo) foram prétratadas, topicamente, com 20 μL de solução salina, dexametasona 4 mg/mL, OEVA
(50 e 100 mg/mL) ou BISA (35 e 70 mg/mL), esperando 15 minutos para absorção.
Em seguida, 20 μL de fenol 10% (v/v) diluído em acetona foram aplicados na orelha
direita e 20 μL do veículo acetona foram aplicados na orelha esquerda. Após 1 hora,
os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e discos de 6 mm de
diâmetro das orelhas foram obtidos para análise do edema conforme item 3.4.2.
(GÁBOR, 2000).
3.5. Estudo da atividade antinociceptiva visceral
3.5.1. Nocicepção visceral induzida por ácido acético
Os animais foram divididos em grupos de 8 animais e tratados com o veículo
(10mL/Kg; v.o.), OEVA (100, 200 ou 400 mg/kg, v.o.) ou BISA (50, 100 ou 200
mg/kg, v.o.) 1h antes de receberem uma injeção intraperitoneal de ácido acético
0,6% (10 mL/kg). Os comportamentos relacionados à nocicepção visceral foram
observados (lamber o abdômen, piloereção, arrastar o abdômen contra o solo,
contorção e retração abdominais) por um período de 20 min começados a contar 10
min após a administração do ácido acético. (KOSTER et al., 1959)
3.5.2. Nocicepção visceral induzida por ciclofosfamida
Os animais foram divididos em grupos de 8 animais e tratados com o veículo
(10mL/Kg; v.o.), OEVA (100, 200 ou 400 mg/kg, v.o.) ou BISA (50, 100 ou 200
34
mg/kg, v.o.) 1h antes da injeção de Ciclofosfamida (400 mg/kg, i.p.). Imediatamente
após a injeção de Ciclofosfamida, os animais foram observados por 4h quanto ao
tempo total (em minutos) da expressão dos seguintes comportamentos relacionados
à nocicepção visceral: lamber o abdômen, piloereção, arrastar o abdômen contra o
solo, contorção e retração abdominais (OLIVAR; LAIRD, 1999). Os animais foram
colocados individualmente em caixas plásticas e observadas em 8 intervalos de 30
min, para o registro de crises transitórias, em minutos. Um grupo controle normal,
que recebeu apenas salina por via intraperitoneal, foi incluído no estudo. Além do
tempo de crises, a cada intervalo de 30 min os animais foram observados por 2 min
para que fosse aferido um escore ao seu comportamento de acordo com a seguinte
escala: 0 = comportamento normal, 1 = piloereção fraca, 2 = piloereção forte, 3 =
respiração forçada e arrastar o abdômen, 4 = lambedura do abdômen, 5 = contração
e retração abdominal. Quando observados mais de um destes comportamentos
durante o período de 2 min de observação, foi registrado o somatório dos pontos
correspondentes a cada um dos comportamentos.
3.5.3. Nocicepção visceral induzida por capsaicina
Os animais foram divididos em grupos de 8 animais e tratados com veículo
(10mL/Kg; v.o.), OEVA (100, 200 ou 400 mg/kg, v.o.) ou BISA (50, 100 ou 200
mg/kg, v.o.) 1h antes de receberem uma aplicação intracolônica de Capsaicina
(0,3%, 50 µl) através de uma fina cânula com ponta arredondada (1mm de
diâmetro). Foram introduzidos 4 cm de comprimento da cânula pela via intracolônica
para administração da Capsaicina. Foi utilizada vaselina sólida na região perianal
para
evitar
estimulação
local
pela
administração.
Imediatamente
após
a
administração da Capsaicina, foi registrado, durante 30 minutos, o número de
comportamentos nociceptivos dos animais relacionados com a nocicepção visceral
(LAIRD et al, 2001): lamber o abdômen, piloereção, arrastar o abdômen contra o
solo, contorção e retração abdominais. Um grupo controle normal, que recebeu
apenas salina por via intracolônica, foi incluído no estudo.
35
3.5.4. Nocicepção visceral induzida por formalina
Os animais foram divididos em grupos de 8 animais e tratados com veículo
(10mL/Kg; v.o.), OEVA (100, 200 ou 400 mg/kg, v.o.) ou BISA (50, 100 ou 200
mg/kg, v.o.) 1h antes de receberem uma aplicação intracolônica de Formalina (10%,
10 µl) através de uma fina cânula com ponta arredondada (1mm de diâmetro).
Foram introduzidos 4 cm de comprimento da cânula pela via intracolônica para
administração da Formalina. Foi utilizada vaselina sólida na região perianal para
evitar estimulação local pela administração. As respostas comportamentais foram
analisadas durante 1h. Cada animal foi colocado em uma caixa de acrílico 20 min
antes do início do teste. Durante uma hora, os diversos comportamentos
relacionados à dor foram classificados por ordem de intensidade (MIAMPAMBA et
al., 1994): (1) lambida e grooming (L), (2) tropeços (H), (3) alongamento e contração
do corpo inteiro (C). A resposta nociceptiva (S) foi então calculada, utilizando a
fórmula: S = 1L + 2 H + 3 C. Um grupo controle normal, que recebeu apenas salina
por via intracolônica, foi incluído no estudo.
3.5.5. Nocicepção visceral induzida por óleo de mostarda
Os animais foram divididos em grupos de 8 animais e tratados com veículo
(10mL/Kg; v.o.), OEVA (100, 200 ou 400 mg/kg, v.o.) ou BISA (50, 100 ou 200
mg/kg, v.o.) 1h antes de receberem uma aplicação intracolônica de Óleo de
Mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50µL/animal) através de uma fina cânula com
ponta arredondada (1mm de diâmetro). Foram introduzidos 4 cm de comprimento da
cânula pela via intracolônica para administração do Óleo de Mostarda. Foi utilizada
vaselina sólida na região perianal para evitar estimulação local pela administração.
O número total de comportamentos relacionados à dor (lamber o abdômen,
piloereção, arrastar o abdômen contra o solo, contorção e retração abdominais)
foram contados por 20 min, imediatamente após a instilação do Óleo de Mostarda
(LAIRD et al., 2001). Um grupo controle normal, que recebeu apenas salina por via
intracolônica, foi incluído no estudo.
Com o propósito de investigar um possível envolvimento dos receptores
opiódes, do óxido nítrico, receptores noradrenergico α2, canais K+ATP, receptores
serotoninérgicos 5-HT3 e receptores TRPV1 na atividade antinociceptiva visceral do
36
OEVA e BISA, este modelo experimental foi utilizado em outras ocasiões.
Primeiramente, os animais divididos em grupos (n=8), foram tratados com veículo
(10mL/Kg; v.o.), OEVA (200 mg/kg, v.o.), BISA (50 mg/kg, v.o.), Naloxona (2 mg/kg,
i.p.), L-NAME (20 mg/kg, i.p.), Ioimbina (2 mg/kg; i.p.), Glibenclamida (5 mg/kg, i.p.),
Ondasentrona (0,5 mg/kg; i.p.), Vermelho de Rutênio (3 mg/kg, s.c.) 1h ou 30 min
antes da administração do Óleo de Mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50µL/animal).
O envolvimento dos receptores foi avaliado pela administração de antagonistas 30
min antes da administração do OEVA ou BISA. Após 1 h, os animais receberam o
Óleo de Mostarda, como descrito anteriormente.
3.5.6. Teste do campo aberto
A capacidade motora dos animais foi verificada por meio de um campo
aberto quadrangular confeccionado em acrílico com 30 cm de lado, tendo em sua
base 9 quadrados iguais de 10 cm de lado. Os animais foram separados em grupos
de 8 animais e tratados com veículo (10mL/Kg; v.o.), OEVA (200 mg/kg, v.o.) ou
BISA (50 mg/kg, v.o.). Uma hora após o tratamento, todos os animais foram levados
individualmente ao campo aberto, ambientados por 1 min e, em seguida, observados
por 4 min, quanto ao número de campos explorados (CAPAZ et al., 1981).
3.6. Análise Estatística
A análise estatística foi realizada com auxílio do programa Graph Pad Prism
5.0. (USA). Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média
(e.p.m.). A comparação entre as médias foi realizada utilizando-se análise de
variância (ANOVA) seguida pelo teste de Student Newman Keul, teste de ANOVA de
duas vias seguido do Teste de Bonferroni e Teste T não-pareado para dados
paramétricos. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas
quando p < 0,05.
37
4. RESULTADOS
4.1. Avaliação da atividade antiinflamatória tópica através de modelos de
edema de orelha induzido por agentes irritantes em camundongos
4.1.1. Edema de orelha induzido pela aplicação única de óleo de Croton
O OEVA na concentração de 50 mg/mL aplicado por via tópica demonstrou
redução no edema de orelha após 6 horas em contato com óleo de Croton,
comparada com o grupo controle veículo (edema: 10,09 ± 0,33 mg). A
dexametasona aplicada topicamente, também demonstrou redução significativa
comparada com o controle veículo, (3,73 ± 1,05 (mg) versus 14,19 ± 1,12 (mg) do
grupo oc, p < 0,001). (Figura 03 e Apêndice 01). O BISA, na concentração de 35
mg/mL reduziu a inflamação tópica expressa pelos animais (9,75 ± 1,29 (mg))
quando comparado ao grupo controle veículo (14,19 ± 1,12 (mg)). (Figura 03 e
Apêndice 02).
Figura 03 – Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha induzido
pela aplicação única de óleo de Croton (OC) em camundongos. Os animais
foram pré-tratados com solução salina (controle veículo); Dexametasona 4 mg/mL
(controle positivo), OEVA 50, 100 mg/mL ou BISA 35, 70 mg/mL e após 1 h,
receberam topicamente solução de óleo de Croton 5% (v/v) em acetona. O efeito
antiedematogênico das substâncias foi analisado através do edema calculado a
partir das massas de discos de 6 mm de diâmetro obtidos das orelhas após 6 horas
de aplicação do óleo de Croton. Cada grupo representa a média de 7 animais e as
barras verticais o E.P.M. As médias foram comparadas com o grupo controle veículo
e foram consideradas significativamente diferentes para cp < 0,05; bp < 0,01 e ap <
0,001 comparadas ao controle veículo; Análise estatística: ANOVA de uma via
seguido do teste de Student-Newmann- Keuls).
38
4.1.2. Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de Croton
A aplicação do OEVA (50 mg/mL), (2 vezes a o dia, 4 dias) após 96 horas do
início do ensaio e em um processo inflamatório já estabelecido, demonstrou redução
significativa, comparado ao grupo veículo (20 μL/orelha, no mesmo período de
tratamento) após 24 (p < 0,001), 48 (p < 0,001), 72 (p < 0,001) e 96 horas (p <
0,001) do início do tratamento (correspondendo aos tempos 120, 144, 168 e 192
horas após a primeira aplicação de óleo de Croton). A dexametasona (4 mg/ mL,
mesmo período de tratamento) foi efetiva em reduzir significativamente o edema
estabelecido após 24, 48, 72 e 96 horas (p < 0,001) do início do tratamento
(correspondendo aos tempos 120, 144, 168 e 192 horas após a primeira aplicação
de óleo de Croton) (Figura 04), sendo comparado pela avaliação do percentual de
edema – PE e efeito inibitório médio da inflamação - EIM no último dia do
experimento (Figura 05 e Apêndice 03). A aplicação do BISA (35 mg/mL), reduziu
significativamente nos tempos 120 e 192 após a primeira aplicação de óleo de
Croton. A dexametasona (4 mg/mL) foi efetiva em reduzir significativamente nos
tempos 120, 168 e 192 horas após a primeira aplicação de óleo de Croton. (Figura
04), sendo comparado pela avaliação do PE e EIM no último dia do experimento
(Figura 05 e Apêndice 04).
39
Figura 04 - Curva tempo-resposta do efeito do OEVA e BISA sobre o edema de
orelha induzido pela aplicação múltipla de OC em camundongos. O experimento
foi conduzido em 9 dias. Os animais receberam OEVA e BISA em acetona na orelha
direita em dias alternados e veículo acetona na orelha esquerda. A espessura da
orelha desafiada com o agente flogístico foi mensurada com paquímetro digital antes
da aplicação do tratamento, quatro horas após a primeira aplicação do OC (fase
aguda) e nos tempos 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 e 192 horas após a primeira
aplicação do OC. No 5º dia do experimento (96 horas após a primeira aplicação de
OC), a orelha dos animais recebeu veículo salina (controle negativo), dexametasona
(DEX), OEVA e BISA (20 μL, 2 vezes ao dia), prosseguindo o tratamento durante os
3 dias posteriores (setas apontam os dias em que houve tratamento). O efeito
antiedematogênico das substâncias foi analisado através da variação da espessura
da orelha, calculado pela diferença entre a espessura final e a inicial. Os pontos
representam a média de 7 animais e as barras verticais o E.P.M. As médias foram
comparadas com o grupo controle negativo e foram consideradas significativamente
diferentes para p < 0,05 (bp < 0,05; ap < 0,001; comparadas ao controle veículo,
ANOVA de duas vias seguido do Teste de Bonferroni).
40
Figura 05 – Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha induzido
pela aplicação múltipla de óleo de Croton (OC) em camundongos. A aplicação
de OC foi conduzida em dias alternados, durante 9 dias. No 5º, 6º, 7º e 8º dias do
experimento, a orelha dos animais recebeu salina (controle veículo), dexametasona
(DEX), OEVA e BISA (20 μL, 2 vezes ao dia). O efeito antiedematogênico das
substâncias foi analisado através do edema calculado a partir das massas de discos
de 6 mm de diâmetro obtidos das orelhas após 192 horas da primeira aplicação do
OC. Cada grupo representa a média de 7 animais e as barras verticais o E.P.M. As
médias foram comparadas com o grupo controle veículo e foram consideradas
significativamente diferentes para p < 0,05 (bp < 0,05; ap < 0,01; comparadas ao
controle veículo. Análise estatística: ANOVA de uma via seguida do teste de
Student-Newmann-Keuls).
4.1.3. Edema de orelha induzido por ácido araquidônico
O OEVA nas concentrações de 50 e 100 mg/mL aplicado por via tópica
demonstraram redução significativa no edema de orelha após 1 hora em contato
com ácido araquidônico, comparada com o grupo controle veículo (edema: 3,86 ±
0,73; 6,38 ± 0,71 mg, respectivamente). A indometacina aplicada topicamente,
também demonstrou redução significativa comparada com o controle veículo, (9,81 ±
1,45 (mg) versus 2,37 ± 0,65 (mg), p < 0,001). (Figura 06 e Apêndice 05). O BISA
também reduziu de forma significativa nas concentrações de 35 e 70 mg/mL e
Indometacina (100 mg/mL) a inflamação tópica expressas pelos animais (4,89 ±
0,97; 4,53 ± 0,99; 2,37 ± 0,65 mg, respectivamente) quando comparados ao grupo
controle veículo (9,81 ± 1,45 (mg)). (Figura 06 e Apêndice 06).
41
Figura 06 – Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha induzido
por ácido araquidônico (AA) em camundongos. Os animais foram pré-tratados
com solução salina (controle veículo); Indometacina 100 mg/mL (controle positivo),
OEVA 50, 100 mg/mL ou BISA 35, 70 mg/mL. Após 15 minutos, receberam
topicamente ácido araquidônico (AA) 0,1 μg/mL em acetona. O efeito
antiedematogênico das substâncias foi analisado através do edema calculado a
partir das massas de discos de 6 mm de diâmetro obtidos das orelhas após 1 hora
de aplicação do AA. Cada grupo representa a média de 7 animais e as barras
verticais o E.P.M. As médias foram comparadas com o grupo controle veículo e
foram consideradas significativamente diferentes para p < 0,05 (cp < 0,05; bp < 0,01
e ap < 0,001 comparadas ao controle veículo. Análise estatística: ANOVA de uma via
seguido do teste de Student-Newmann-Keuls).
4.1.4. Edema de orelha induzido por capsaicina
O OEVA e BISA aplicados por via tópica não demonstraram redução
significativa no edema de orelha após 30 minutos da aplicação tópica de capsaicina,
comparada com o grupo tratado com solução salina (controle veículo). O grupo
tratado com dexametasona não demonstrou redução significativa comparada com o
controle veículo (Figura 07, Apêndice 07 e Apêndice 08).
42
Figura 07 – Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha induzido
por capsaicina em camundongos. Os animais foram pré-tratados com solução
salina (controle veículo); Dexametasona 4 mg/mL (controle positivo), OEVA 50, 100
mg/mL ou BISA 35, 70 mg/mL. Após 15 minutos, receberam topicamente capsaicina
0,01 μg/mL em etanol 90%. O efeito antiedematogênico das substâncias foi
analisado através do edema calculado a partir das massas de discos de 6 mm de
diâmetro obtidos das orelhas após 30 minutos de aplicação da capsaicina. Cada
grupo representa a média de 7 animais e as barras verticais o E.P.M. As médias
foram comparadas com o grupo controle veículo (salina) e foram consideradas
significativamente diferentes para p < 0,05 (Análise estatística: ANOVA de uma via
seguido do teste de Student-Newmann-Keuls).
4.1.5. Edema de orelha induzido por histamina
O OEVA e BISA aplicado por via tópica não demonstraram redução
significativa no edema de orelha após 2 horas da aplicação intradérmica de solução
de histamina, comparada com o grupo tratado com solução salina (controle veículo).
No caso do OEVA, o grupo tratado com dexametasona demonstrou redução
significativa comparada com o controle veículo. (Figura 08, Apêndice 09 e Apêndice
10).
43
Figura 08 – Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha induzido
por histamina em camundongos. Os animais, previamente anestesiados, foram
pré-tratados com solução salina (controle veículo); Dexametasona 4 mg/mL (controle
positivo), OEVA 50, 100 mg/mL ou BISA 35, 70 mg/mL. Após 15 minutos, receberam
intradermicamente na orelha direita uma injeção de 5 μL de solução de histamina
100 mg/mL. O efeito antiedematogênico das substâncias foi analisado através do
edema calculado a partir das massas de discos de 6 mm de diâmetro obtidos das
orelhas após 2 horas de aplicação da histamina. Cada grupo representa a média de
7 animais e as barras verticais o E.P.M. As médias foram comparadas com o grupo
controle veículo e foram consideradas significativamente diferentes para p < 0,05 (ap
< 0,01 comparadas ao controle veículo. Análise estatística: ANOVA seguida do teste
de Student-Newmann-Keuls).
4.1.6. Edema de orelha induzido por fenol
O OEVA nas concentrações de 50 e 100 mg/mL aplicado por via tópica
demonstraram redução significativa no edema de orelha após 1 hora da aplicação
tópica de fenol 10% em acetona, comparada com o grupo tratado com salina
(controle negativo), com edema de 11,86 ± 3,45; 6,60 ± 1,96 mg, respectivamente.
O grupo tratado com dexametasona também demonstrou redução significativa (EIM
de 9,38 ± 2,56 (mg)) comparada com o controle negativo (Figura 09 e Apêndice 11).
O BISA também reduziu de forma significativa nas concentrações de 35 e 70 mg/mL
e Dexametasona (4 mg/mL) a inflamação tópica expressas pelos animais (9,84 ±
1,67; 7,60 ± 2,15; 9,38 ± 2,56 mg, respectivamente) quando comparados ao grupo
controle veículo (24,78 ± 5,61) (Figura 09 e Apêndice 12).
44
Figura 09 – Efeito tópico do OEVA e BISA sobre o edema de orelha induzido
por fenol em camundongos. Os animais foram pré-tratados com solução salina
(controle veículo); Dexametasona 4 mg/mL (controle positivo), OEVA 50, 100 mg/mL
ou BISA 35, 70 mg/mL. Após 15 minutos, receberam topicamente 20 μL de fenol
10% (v/v) em acetona. O efeito antiedematogênico das substâncias foi analisado
através do percentual de edema calculado a partir das massas de discos de 6 mm
de diâmetro obtidos das orelhas após 1 hora de aplicação do fenol. Cada grupo
representa a média de 7 animais e as barras verticais o E.P.M. As médias foram
comparadas com o grupo controle negativo (salina) e foram consideradas
significativamente diferentes para p < 0,05 (bp < 0,05; ap < 0,01 comparadas ao
controle veículo. Análise estatística: ANOVA seguida do teste de Student-NewmannKeuls).
4.2. Estudo da atividade antinociceptiva visceral
4.2.1. Nocicepção visceral induzida por ácido acético
O OEVA nas concentrações de 100, 200 e 400 mg/Kg reduziram
significativamente (p < 0,01) o número de comportamentos de nocicepção visceral
expressos pelos animais (20,25 ± 2,17; 18,25 ± 6,08; 18,63 ± 3,86, respectivamente)
quando comparados ao grupo controle veículo (46,63 ± 7,96) (Figura 10 e Apêndice
13). O BISA também reduziu de forma significativa nas concentrações de 50, 100 e
200 mg/Kg o número de comportamentos de nocicepção visceral expressos pelos
animais (10,50 ± 2,94; 8,50 ± 3,20; 8,43 ± 2,57, respectivamente) quando
comparados ao grupo controle veículo (48,63 ± 10,81) (Figura 10 e Apêndice 14).
45
Figura 10 – Efeito antinociceptivo do OEVA e BISA no modelo de nocicepção
visceral induzida por ácido acético em camundongos. Veículo (10mL/Kg; v.o.),
OEVA (100, 200 ou 400 mg/kg, v.o.) ou BISA (50, 100 ou 200 mg/Kg, v.o.) 1 h antes
de receberem uma injeção intraperitoneal de ácido acético 0,6% (10 mL/kg). Os
valores representam a média ± E.M.P. do númerro de comportamentos de
nocicepção visceral exibidas pelos animais durante 20 min, começados a contar 10
min após a injeção de ácido acético 0,6% (10mL/Kg). Foram utilizados 8 animais por
grupo. bp < 0,01; ap < 0,001; vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul).
4.2.2. Nocicepção visceral induzida por ciclofosfamida
No modelo de nocicepção visceral induzida por ciclofosfamida, houve uma
elevação significante (p < 0,001) no tempo de crises transitórias do grupo controle
veículo (27,82 ± 0,77 min), quando este valor foi comparado ao grupo controle
normal (10,89 ± 1,48 min) (Figura 11). O OEVA nas concentrações de 200 e 400
mg/Kg foi capaz de reduzir de forma significativa o tempo de crises para (18,02 ±
1,11; 23,78 ± 0,70, respectivamente) (Figura 11 e Apêndice 15). O BISA também
reduziu de forma significativa nas concentrações de 100 e 200 mg/Kg (p < 0,001) o
tempo de crises para (20,73 ± 1,06; 18,90
± 1,60, respectivamente) quando
comparados ao grupo controle veículo (29,42 ± 0,44) (Figura 11 e Apêndice 16).
Quanto aos escores para comportamento nociceptivo, registrados a cada 30
min durante um período de 2 min de observação, o grupo controle veículo mostrou
uma elevação significante em relação ao grupo controle normal. O OEVA nas
concentrações de 200 e 400 mg/Kg reduziu significativamente os escores (39,00 ±
2,46; 50,00 ± 2,42, respectivamente) em relação ao grupo controle veículo (Figura
11 e
Apêndice 17). O BISA também reduziu de forma significativa nas
concentrações de 50, 100 e 200 mg/Kg, (p < 0,001) os escores (52,17 ± 2,60; 30,33
46
± 1,15; 25,50 ± 3,01, respectivamente) quando comparados ao grupo controle
veículo (68,83 ± 2,92) (Figura 11 e Apêndice 18).
Figura 11 – Efeito antinociceptivo do OEVA e BISA no modelo de nocicepção
visceral induzida por ciclofosfamida em camundongos. Veículo (10mL/Kg; v.o.),
OEVA (100, 200 ou 400 mg/kg, v.o.) ou BISA (50, 100 ou 200 mg/Kg, v.o.) 1 h antes
da injeção de Ciclofosfamida (400 mg/kg, i.p.). Os animais foram observados por 4 h
quanto ao tempo total (em minutos) da expressão dos comportamentos relacionados
à nocicepção visceral. Além do tempo de crises, a cada intervalo de 30 min os
animais foram observados por 2 min para que fosse aferido um escore ao seu
comportamento. Os valores representam a media ± E.M.P. o tempo de crises
transitórias ou os escores do número de comportamentos de nocicepção visceral
exibidas pelos animais. Foram utilizados 8 animais por grupo. bp<0,001 vs controle
normal; cp<0,05; ap<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman
Keul).
47
4.2.3. Nocicepção visceral induzida por capsaicina
A administração da Capsaicina (0,3%, 50 µl) por via intracolônica elevou de
forma significativa (p < 0,001) o número de comportamentos relacionados à
nocicepção visceral no grupo controle veículo (37,25 ± 5,97), em relação ao grupo
controle normal (10,25 ± 6,21) (Figura 12). O OEVA reduziu a freqüência destes
comportamentos expressos pelos animais de forma significativa nas concentrações
de 100, 200 e 400 mg/Kg (5,75 ± 2,02; 9,25 ± 2,24; 5,88 ± 2,24, respectivamente)
quando comparadas ao grupo controle veículo (37,25 ± 5,97) (Figura 12 e Apêndice
19). O BISA também reduziu de forma significativa nas concentrações de 100 e 200
mg/Kg (p < 0,01) o número de comportamentos de nocicepção visceral expressos
pelos animais (31,00 ± 13,11; 15,33 ± 10,82, respectivamente) quando comparados
ao grupo controle veículo (84,38 ± 12,99 ) (Figura 12 e Apêndice 20).
Figura 12 - Efeito antinociceptivo do OEVA e BISA no modelo de nocicepção
visceral induzida por capsaicina em camundongos. Veículo (10mL/Kg; v.o.),
OEVA (100, 200 ou 400 mg/kg, v.o.) ou BISA (50, 100 ou 200 mg/kg, v.o.) 1 h antes
de receberem uma aplicação intracolônica de Capsaicina (0,3%, 50 µl).
Imediatamente após a administração da Capsaicina, foi registrado, durante 30
minutos, o número de comportamentos nociceptivos dos animais relacionados com a
nocicepção visceral: lamber o abdômen, piloereção, arrastar o abdômen contra o
solo, contorção e retração abdominais. Um grupo controle normal, que recebeu
apenas salina por via intracolônica, foi incluído no estudo. Foram utilizados 8
animais por grupo. bp<0,001; cp<0,01; vs controle normal; dp<0,01; ap<0,001 vs
controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul)
48
4.2.4. Nocicepção visceral induzida por Formalina
A administração da Formalina por via intracolônica elevou de forma
significativa (p < 0,001) o número de comportamentos relacionados à nocicepção
visceral no grupo controle veículo (98,00 ± 16,65), quando este valor foi comparado
ao registrado o grupo controle normal (22,63 ± 5,86) (Figura 13). O OEVA reduziu a
freqüência destes comportamentos de forma significativa nas concentrações de 100,
200 e 400 mg/Kg expressos pelos animais (20,00 ± 5,80; 33,75 ± 8,68; 28,57 ± 5,32,
respectivamente) quando comparados ao grupo controle veículo (98,00 ± 16,65)
(Figura 13 e Apêndice 21). O BISA também reduziu de forma significativa nas
concentrações de 50, 100 e 200 mg/Kg o número de comportamentos de
nocicepção visceral expressos pelos animais (103,0 ± 16,21; 140,4 ± 25,51; 75,13 ±
13,44, respectivamente) quando comparados ao grupo controle veículo (344,6 ±
50,21) (Figura 13 e Apêndice 22).
Figura 13 - Efeito antinociceptivo do OEVA e BISA no modelo de nocicepção
visceral induzida por formalina em camundongos. Veículo (10mL/Kg; v.o.),
OEVA (100, 200 ou 400 mg/kg, v.o.) ou BISA (50, 100 ou 200 mg/Kg, v.o.) 1h antes
de receberem uma aplicação intracolônica de Formalina (10%, 10 µl). As respostas
comportamentais foram analisadas durante 1 h. Cada animal foi colocado em uma
caixa de acrílico 20 min antes do início do teste. Durante uma hora, o animal
apresentou diversos comportamentos relacionados à nocicepção classificados por
ordem de intensidade: (1) lambida e grooming (L), (2) tropeços (H), (3) alongamento
e contração do corpo inteiro (C). A resposta nociceptiva (S) foi então calculada,
utilizando a fórmula: S = 1L + 2H + 3C. Um grupo controle normal, que recebeu
apenas salina por via intracolônica, foi incluído no estudo. Foram utilizados 8
animais por grupo. bp<0,001; cp<0,01; vs controle normal; ap<0,001 vs controle
veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul)
49
4.2.5. Nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
O OEVA nas concentrações de 100, 200 ou 400 mg/kg, atuaram reduzindo o
número total de comportamentos de nocicepção visceral expressos pelos animais
(10,71 ± 1,48; 6,13 ± 1,16; 4,20 ± 1,46, respectivamente) de forma significativa
(p<0,001), comparados ao grupo controle do óleo de mostarda (45,00 ± 11,02). Este
induziu nocicepção visceral caracterizada pela diferença estatística observada
(p<0,001) entre este grupo normal (4,29 ± 1,09), que recebeu somente salina por via
intracolônica (Figura 14 e Apêndice 23). O BISA também reduziu significativamente
nas concentrações de 50, 100 e 200 mg/Kg, o número de comportamentos de
nocicepção visceral expressos pelos animais (21,67 ± 7,99; 33,83 ± 10,28; 27,17 ±
11,05, respectivamente) quando comparados ao grupo controle veículo (107,8 ±
25,01) (Figura 14 e Apêndice 24).
Figura 14 - Efeito antinociceptivo do OEVA e BISA no modelo de nocicepção
visceral induzida por óleo de mostarda em camundongos. Veículo (10mL/Kg;
v.o.), OEVA (100, 200 ou 400 mg/kg, v.o.), ou BISA (50, 100 ou 200 mg/Kg, v.o.) 1 h
antes de receberem uma aplicação intracolônica de Óleo de Mostarda (0,75% em
salina 0,9%; 50µL/animal). O número total de comportamentos relacionados à
nocicepção (lamber o abdômen, piloereção, arrastar o abdômen contra o solo,
contorção e retração abdominais) foram contados por 20 min, imediatamente após a
instilação do Óleo de Mostarda. Um grupo controle normal, que recebeu apenas
salina por via intracolônica, foi incluído no estudo. Foram utilizados 8 animais por
grupo. bp<0,001; vs controle normal; ap<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste
de Student Newman Keul)
50
4.2.5.1. Efeito da Naloxona, L-NAME, Ioimbina, Glibenclamida, Ondasentrona e
Vermelho de Rutênio
O tratamento dos animais com Ioimbina (2 mg/Kg, i.p.) e Naloxona (1 mg/Kg,
i.p.) promoveu uma inibição significativa (p<0,05 e p<0,001) do número de
comportamentos de dor expressos (22,88 + 3,53; 2,63 + 0,46) quando comparados
ao grupo controle veículo (44,17 + 5,59) (Figura 15 e Apêndice 25).
1-Normal
2-Veículo
3-Ioimbina 2mg/kg
4-Ondasentrona 0,5mg/kg
5-L-NAME 20mg/kg
6-Glibenclamida 5mg/kg
7- Vermelho de Rutênio 3mg/kg
8-Naloxona 1mg/kg
Figura 15 – Efeito da Naloxona, L-NAME, Ioimbina, Glibenclamida,
Ondasentrona e Vermelho de Rutênio no efeito antinociceptivo visceral.
Veículo (Tween 80 a 3% em água destilada, 10mL/Kg; v.o.), Naloxona (1 mg/kg,
i.p.), L-NAME (20 mg/Kg, i.p.), Ioimbina (2 mg/Kg, i.p.), Glibenclamida (5 mg/kg, i.p.),
Ondasentrona (0,5 mg/kg; i.p.), Vermelho de Rutênio (3 mg/kg, s.c.) 30 min antes da
administração do Óleo de Mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50µL/animal). Os
valores representam a média ± E.M.P. do número de comportamentos de
nocicepção visceral exibidas pelos animais. Foram utilizados 8 animais por grupo.
b
p<0,05; ap<0,01; vs controle normal; dp<0,05; cp<0,001 vs controle veículo (ANOVA
e Teste de Student Newman Keul)
51
4.2.5.2. Estudo do envolvimento do sistema opióide
O tratamento dos animais com OEVA (200 mg/Kg, v.o.) promoveu uma
inibição significativa (p<0,001) do número de comportamentos nociceptivos
expressos (3,75 + 1,52) quando comparados ao grupo controle veículo (32,38 +
3,09). O pré-tratamento com Naloxona (1 mg/Kg, i.p.) não conseguiu reverter a
inibição dos comportamentos nociceptivos do OEVA (Figura 16 e Apêndice 26). O
tratamento dos animais com BISA (50 mg/Kg, v.o.) promoveu uma inibição
significativa (p<0,05) do número de comportamentos nociceptivos expressos (115,7
± 25,33) quando comparados ao grupo controle veículo (181,9 ± 24,07). O prétratamento com Naloxona (1 mg/Kg, i.p.) não conseguiu reverter a inibição dos
comportamentos nociceptivos do BISA. (Figura 16 e Apêndice 27).
Figura 16 - Estudo do envolvimento do sistema opióide no efeito
antinociceptivo visceral do OEVA e BISA. Veículo (Tween 80 a 3% em água
destilada, 10mL/Kg; v.o.), OEVA (200 mg/kg, v.o.) ou BISA (50 mg/kg, v.o.) 1 h ou
30 min antes da administração do Óleo de Mostarda (0,75% em salina 0,9%;
50µL/animal). O envolvimento do sistema opióide foi avaliado pela administração de
Naloxona 30 min antes da administração do OEVA. Após 1 h, os animais receberam
o Óleo de Mostarda. Os valores representam a média ± E.M.P. do número de
comportamentos de nocicepção visceral exibidas pelos animais. Foram utilizados 8
animais por grupo. cp<0,01; bp<0,001 vs controle normal; dp<0,05; ap<0,001 vs
controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul)
52
4.2.5.3. Estudo do envolvimento do óxido nítrico
O tratamento dos animais com OEVA (200 mg/Kg, v.o.) promoveu uma
inibição significativa do número de comportamentos nociceptivos expressos (10,50 ±
3,86) quando comparados ao grupo controle veículo (45,38 ± 5,73). O prétratamento com L-NAME (20 mg/Kg, i.p.) não conseguiu reverter a inibição dos
comportamentos nociceptivos do OEVA. (Figura 17 e Apêndice 28). No tratamento
dos animais com BISA (50 mg/Kg, v.o.) ocorreu uma inibição significativa (p<0,05)
do número de comportamentos de dor expressos (115,7 ± 25,33) quando
comparados ao grupo controle veículo (181,9 ± 24,07). O pré-tratamento com
L-NAME (20 mg/Kg, i.p.) não conseguiu reverter a inibição dos comportamentos
nociceptivos do BISA. (Figura 17 e Apêndice 29).
Figura 17 - Estudo do envolvimento do óxido nítrico no efeito antinociceptivo
visceral do OEVA e BISA. Veículo (Tween 80 a 3% em água destilada, 10mL/Kg;
v.o.), OEVA (200 mg/kg, v.o.), BISA (50 mg/kg, v.o.) 1 h antes da administração do
Óleo de Mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50µL/animal). O envolvimento do óxido
nítrico foi avaliado pela administração de L-NAME 30 min antes da administração do
OEVA. Após 1 h, os animais receberam o Óleo de Mostarda. Os valores
representam a média ± E.M.P. do número de comportamentos nociceptivos exibidos
pelos animais. Foram utilizados 8 animais por grupo. ep<0,05 vs Bisa 50mg/kg;
c
p<0,01; bp<0,001 vs controle normal; dp<0,05; ap<0,001 vs controle veículo
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul)
53
4.2.5.4. Estudo do envolvimento dos receptores noradrenérgicos α2
O tratamento dos animais com OEVA (200 mg/Kg, v.o.) promoveu uma
inibição significativa (p<0,001) do número de comportamentos nociceptivos
expressos (2,50 ± 1,09) quando comparados ao grupo controle veículo (28,50 ±
4,00). O pré-tratamento com Ioimbina (2 mg/Kg, i.p.) não conseguiu reverter a
inibição dos comportamentos nociceptivos do OEVA. (Figura 18 e Apêndice 30). No
tratamento dos animais com BISA (50 mg/Kg, v.o.) ocorreu uma inibição significativa
(p<0,001) do número de comportamentos nociceptivos expressos (1,29 ± 0,75)
quando comparados ao grupo controle veículo (28,50 ± 4,00). O pré-tratamento com
Ioimbina (2 mg/Kg, i.p.) não conseguiu reverter a inibição dos comportamentos
nociceptivos do BISA. (Figura 18 e Apêndice 31).
Figura 18 - Estudo do envolvimento dos receptores noradrenérgicos α2 no
efeito antinociceptivo visceral do OEVA e BISA. Veículo (Tween 80 a 3% em
água destilada, 10mL/Kg; v.o.), OEVA (200 mg/kg, v.o.), BISA (50 mg/kg, v.o.) 1 h
antes da administração do Óleo de Mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50µL/animal).
O envolvimento do óxido nítrico foi avaliado pela administração de Ioimbina 30 min
antes da administração do OEVA. Após 1 h, os animais receberam o Óleo de
Mostarda. Os valores representam a média ± E.M.P. do número de comportamentos
nociceptivos visceral exibidos pelos animais. Foram utilizados 8 animais por grupo.
b
p<0,001 vs controle normal; ap<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de
Student Newman Keul)
54
4.2.5.5. Estudo do envolvimento dos canais K+ATP
O tratamento dos animais com OEVA (200 mg/Kg, v.o.) promoveu uma
inibição não significativa do número de comportamentos nociceptivos expressos
(10,50 ± 3,86) quando comparados ao grupo controle veículo (45,38 ± 5,73). O prétratamento com Glibenclamida (5 mg/kg, i.p.) não conseguiu reverter a inibição dos
comportamentos nociceptivos do OEVA. (Figura 19 e Apêndice 32). No tratamento
dos animais com BISA (50mg/Kg, v.o.) ocorreu uma inibição significativa (p<0,05) do
número de comportamentos nociceptivos expressos (115,7 ± 25,33) quando
comparados ao grupo controle veículo (181,9 ± 24,07). O pré-tratamento com
Glibenclamida (5 mg/kg, i.p.) não conseguiu reverter a inibição dos comportamentos
nociceptivos do BISA. (Figura 19 e Apêndice 33).
Figura 19 - Estudo do envolvimento dos canais de K+ATP no efeito
antinociceptivo visceral do OEVA e BISA. Veículo (Tween 80 a 3% em água
destilada, 10mL/Kg; v.o.), OEVA (200 mg/kg, v.o.), BISA (50 mg/kg, v.o.) 1 h antes
da administração do Óleo de Mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50µL/animal). O
envolvimento dos K+ATP foi avaliado pela administração de Glibenclamida 30 min
antes da administração do OEVA. Após 1 h, os animais receberam o Óleo de
Mostarda. Os valores representam a média ± E.M.P. do número de comportamentos
nociceptivos visceral exibidos pelos animais. Foram utilizados 8 animais por grupo.
c
p<0,01; bp<0,001 vs controle normal; dp<0,05; ap<0,001 vs controle veículo
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul)
55
4.2.5.6. Estudo do envolvimento dos receptores serotoninérgicos 5-HT3
O tratamento dos animais com OEVA (200 mg/Kg, v.o.) promoveu uma
inibição significativa (p<0,001) do número de comportamentos nociceptivos
expressos (10,50 + 3,86) quando comparados ao grupo controle veículo (45,38 +
5,73). O pré-tratamento com Ondasentrona (0,5 mg/kg; i.p.) não conseguiu reverter
a inibição dos comportamentos nociceptivos do OEVA (Figura 20 e Apêndice 34). No
tratamento dos animais com BISA (50 mg/Kg, v.o.) promoveu uma inibição
significativa (p<0,05) do número de comportamentos nocicepção expressos (115,7 ±
25,33) quando comparados ao grupo controle veículo (181,9 ± 24,07). O prétratamento com Ondasentrona (0,5 mg/kg; i.p.) não conseguiu reverter a inibição dos
comportamentos nociceptivos do BISA. (Figura 20 e Apêndice 35).
Figura 20 – Estudo do envolvimento dos receptores serotoninérgicos no efeito
antinociceptivo visceral do OEVA e BISA. Veículo (Tween 80 a 3% em água
destilada, 10mL/Kg; v.o.), OEVA (200 mg/kg, v.o.), BISA (50 mg/kg; v.o.) 1 h antes
da administração do Óleo de Mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50µL/animal). O
envolvimento dos receptores serotoninérgicos foi avaliado pela administração de
Ondasentrona 30 min antes da administração do OEVA. Após 1 h, os animais
receberam o Óleo de Mostarda. Os valores representam a média ± E.M.P. do
número de comportamentos nociceptivo visceral exibidas pelos animais. Foram
utilizados 8 animais por grupo. cp<0,01; bp<0,001 vs controle normal; dp<0,05;
a
p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul)
56
4.2.5.7. Estudo do envolvimento dos receptores TRPV1
O tratamento dos animais com OEVA (200 mg/Kg, v.o.) promoveu uma
inibição significativa (p<0,001) do número de comportamentos nociceptivo expressos
(7,38 + 1,59) quando comparados ao grupo controle veículo (26,00 + 2,94). O prétratamento com Vermelho de Rutênio (3 mg/kg, s.c.) não conseguiu reverter a
inibição dos comportamentos nociceptivos do OEVA (Figura 21 e Apêndice 36). No
tratamento dos animais com BISA (50mg/Kg, v.o.) promoveu uma inibição
significativa (p<0,05) do número de comportamentos nociceptivo expressos (115,7 ±
25,33) quando comparados ao grupo controle veículo (181,9 ± 24,07). O prétratamento com Vermelho de Rutênio (3 mg/kg, s.c.) não conseguiu reverter a
inibição dos comportamentos nociceptivos do BISA. (Figura 21 e Apêndice 37).
Figura 21 – Estudo do envolvimento dos receptores TRPV1 no efeito
antinociceptivo visceral do OEVA e BISA. Veículo (Tween 80 a 3% em água
destilada, 10mL/Kg; v.o.), OEVA (200 mg/kg, v.o.), OEVA (50 mg/kg, v.o.) 1 h antes
da administração do Óleo de Mostarda (0,75% em salina 0,9%; 50µL/animal). O
envolvimento dos receptores TRPV1 foi avaliado pela administração do Vermelho de
Rutênio antes da administração do OEVA. Após 1 h, os animais receberam o Óleo
de Mostarda. Os valores representam a média ± E.M.P. do número de
comportamentos nociceptivo visceral exibidos pelos animais. Foram utilizados 8
animais por grupo. cp<0,01; bp<0,001 vs controle normal; ep<0,01; dp<0,05; ap<0,001
vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul)
57
4.2.6. Teste do campo aberto
No teste de campo aberto, o OEVA, na dose de 200 mg/Kg não alterou de
forma significativa o número de secções transpassadas pelos animais (33,67 ± 5,46),
quando este valor foi comparado ao grupo controle veículo (55,25 ± 6,41). (Figura 22
e Apêndice 38). A figura 22 mostra que o bisabolol, na dose de 50 mg/kg, não
interfere com a locomoção espontânea dos animais, quando comprada ao grupo
controle veículo (13,57 ± 3,22; 23,50 ± 5,05, respectivamente). (Figura 22 e
Apêndice 39)
Figura 22. Efeito do OEVA e BISA sobre a atividade motora espontânea de
camundongos no teste do campo aberto. Veículo (Tween 80 a 3% em água
destilada, 10mL/Kg; v.o.), OEVA (200 mg/kg, v.o.), BISA (50 mg/kg, v.o.) 1 h após o
tratamento todos os animais foram levados individualmente ao campo aberto e, após
1 min de ambientalização, observados durante 4 min, sendo registrado o número de
secções transpassadas pelos animais. Os valores representam a média ± E.M.P. do
número de secções transpassadas pelos animais durante o período de observação.
Foram utilizados 8 animais por grupo (Teste T não-pareado).
58
5. DISCUSSÃO
No Brasil, especialmente no Nordeste, o uso de plantas medicinais e
preparações caseiras assume importância fundamental no tratamento de patologias
que afetam as populações de baixa renda, tendo em vista a deficiência de
assistência médica, a influência da transmissão oral dos hábitos culturais e a
disponibilidade da flora (MATOS, 1989). Tendo em vista o uso popular das plantas
medicinais, foi investigado no presente estudo, o efeito antiinflamatório tópico e
antinociceptivo visceral do óleo essencial do caule da Vanillosmopsis arborea Baker
e de seu principal constituinte o (-)-α-bisabolol.
O potencial antiinflamatório tópico do OEVA e do BISA foi determinado com
a aplicação do modelo de edema de orelha induzido por vários agentes irritantes
(GÁBOR, 2000). Esses testes tendem a verificar o potencial antiedematogênico de
substâncias aplicadas por via tópica. Além de verificar possíveis propriedades
terapêuticas de substâncias no tratamento de inflamações cutâneas agudas, esses
modelos fornecem indícios de propriedades importantes, como a absorção e a
provável ação local da substância em estudo, devido a sua aplicação direta no foco
inflamatório (VANE, 2000).
Justifica-se a utilização de diferentes agentes irritantes (óleo de Croton,
capsaicina, AA, histamina, fenol) devido ao seu mecanismo de ação edematogênica
distintos, simulando afecções cutâneas características ou sugerindo o possível
mecanismo de ação antiedematogênica da substância em estudo (BLAZSÓ;
GÁBOR,
1995).
Com
o
propósito
de
investigar
uma
possível
atividade
antinociceptiva do OEVA e do BISA na nocicepção visceral que justificasse mais
fortemente a utilização terapêutica do mesmo, foram testados cinco modelos de
nocicepção visceral: ácido acético, ciclofosfamida, capsaicina, formalina e óleo de
mostarda.
O óleo de Croton, extraído da planta Croton tiglum, tem como princípios
irritantes ésteres de forbol, destacando-se como majoritário o 13-acetato de 12otetracanoilforbol (TPA, do inglês 12-o-tetracanoilphorbol-13-acetate) que é um
modelo empregado para avaliar a resposta inflamatória, uma vez que esse agente
flogístico induz inflamação cutânea e hiperproliferação celular em animais,
semelhantes a diversas doenças de pele como, por exemplo, a psoríase (GÁBOR,
2000).
59
Estudos afirmam que a inflamação aguda induzida pela aplicação tópica de
TPA ocorre devido ao aumento da permeabilidade vascular e vasodilatação,
resultando
em
migração
de
leucócitos
polimorfonucleares
(principalmente
neutrófilos), liberação de histamina e serotonina e moderada síntese de
eicosanoides (6-ceto-PGF1α, PGE2 e LTB4) (PUNGERÓ et al., 1998; BADILLA et
al., 2007).
O mecanismo pelo qual o TPA exerce seu efeito é decorrente da ativação da
proteína quinase C (PKC), bem como da ativação seqüencial de outros grupos
enzimáticos, como as proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK) e a
fosfolipase A2 (PLA2), que induz a liberação de Fator de Ativação Plaquetária (PAF)
e Àcido Araquidônico (AA) que, consequentemente, desencadeia a produção de
eicosanoides inflamatórios via enzimas ciclooxigenase (COX) e lipoxigenase (LOX)
(FERRANDIZ et al., 1996; WANG et al., 2001; MURAKAWA et al., 2006). O TPA
também parece induzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias em queratinócitos
da pele, desencadeando o processo inflamatório (WILMER et al.,1994; REDONDO
et al., 1997).
O edema de orelha induzido por óleo de Croton é um modelo bem
estabelecido para a investigação dos efeitos de compostos antiinflamatórios
esteroidais e não esteroidais (TOWBIN et al., 1995). Fármacos inibidores da COX e
5-LOX, antagonistas de leucotrienos (LTB4), inibidores seletivos de iNOS e
corticosteróides podem demonstrar ação tópica, com redução significativa do edema
em modelos animais de inflamação cutânea induzida por óleo de Croton ou TPA
(MURAKAWA et al., 2006; MEDEIROS et al., 2009).
A aplicação tópica do OEVA e BISA inibiu o edema de orelha, induzido pelo
óleo de Croton bem como o glicocorticóide utilizado como controle positivo
(dexametasona). Estes dados sugerem, em parte, que o tratamento poderia estar
interferindo na expressão de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α, inibindo a
síntese ou atividade da COX-2 e conseqüentemente a inibição da síntese/liberação
de prostaglandinas (PGs) ou ainda estar agindo diretamente na via da COX-2 e LOX
(BOLLER, 2007).
Enquanto uma aplicação única de óleo de Croton fornece dados quanto à
atividade antiedematogênica de uma substância num processo inflamatório agudo, a
aplicação múltipla de óleo de Croton, em dias alternados, avalia a atividade
antiedematogênica num processo inflamatório já estabelecido, com características
60
semelhantes a uma inflamação crônica. A aplicação múltipla de óleo de Croton
promove uma reação inflamatória persistente acompanhada do aumento da massa
das orelhas, intensa migração de neutrófilos, macrófagos e linfócitos T (CD4+ e
CD8+) e hiperproliferação epidérmica (acantose), demonstrando características
encontradas em algumas doenças inflamatórias crônicas da pele (STANLEY et
al.,1991). Corticosteróides e inibidores da LOX demonstram atividade nesse modelo,
enquanto os inibidores da COX e anti-histamínicos demonstram pouco ou nenhum
efeito (GREEN; SHUSTER, 1987). Por isso, esse modelo demonstra ação de
fármacos que influenciam a liberação de leucotrienos (STANLEY et al., 1991). O
OEVA 50 mg/mL foi capaz de inibir significativamente o efeito edematogênico da
aplicação múltipla de óleo de Croton na orelha de camundongos após 48 horas do
início do tratamento enquanto o OEVA 100 mg/mL inibiu significativamente apenas
após 96 horas do início do tratamento. O BISA 35 mg/mL inibiu significativamente o
efeito edematogênico da aplicação múltipla de óleo de Croton na orelha de
camundongos após 48 horas do início do tratamento.
Para auxiliar na investigação sobre o mecanismo pelo qual o OEVA e BISA
promovem seu efeito antiinflamatório tópico, foram utilizados outros agentes
flogísticos que desencadeiam processos inflamatórios agudos por mecanismos
distintos, como o ácido araquidônico, capsaicina, histamina e fenol.
O ácido araquidônico (AA) e seus metabólitos estão associados a uma
grande gama de doenças inflamatórias cutâneas como dermatite atópica e psoríase.
Young et al. (1984) observaram, pela primeira vez, que a aplicação tópica de ácido
araquidônico foi capaz de provocar uma intensa resposta inflamatória. A
vasodilatação e a hiperemia provocadas pelo AA foram observadas após 5 minutos,
enquanto o edema pôde ser visualizado após 15 minutos com pico máximo de 60
minutos, coincidindo com extravasamento de proteínas e leucócitos.
Os principais produtos metabólicos do AA que estão envolvidos com
processos inflamatórios são a prostaglandina (PGE2) e os leucotrienos C4 e D4
(LTC4/LTD4) (CHANG et al., 1986). A PGE2 é um potente vasodilatador e atua de
modo sinérgico com outros vasodilatadores inflamatórios, como a histamina e a
bradicinina. A PGE2 intensifica a formação de edema e a infiltração de leucócitos,
pelo aumento do fluxo sanguíneo no sítio inflamatório (LEE et al., 2003). Sanches e
Moreno (1999) mostraram que a aplicação tópica do AA ou PGE2 induz um aumento
da expressão de COX-2. Em adição a esses resultados, Fischer (2002) mostrou que
61
o tratamento de queratinócitos com PGs, aumenta a expressão das duas isoformas
de COX através de vias de sinalização de AMPc. Os leucotrienos, produtos da
lipooxigenase (LOX), também participam do processo inflamatório causando
extravasamento vênular, mudanças no fluxo sangüíneo e eritema. Estudos
realizados por Crummey et al. (1987) demonstraram que inibidores da LOX foram
capazes de reverter o edema de orelha induzido pelo ácido araquidônico.
Vale ressaltar que há metabólitos do AA também responsáveis por
degranulação dos mastócitos, liberando histamina: isso significa afirmar que o
modelo de edema induzido por AA não é específico para identificar compostos que
inibem exclusivamente a COX ou LOX, pois antagonistas da histamina e
antioxidantes também são capazes de reduzir o edema induzido por AA (YOUNG et
al, 1984; CRUMMEY et al, 1987; BLASZÓ; GÁBOR, 1995).
De acordo com os resultados obtidos, assim como no modelo do óleo de
Croton, o OEVA e BISA inibiram a resposta inflamatória produzida pelo ácido
araquidônico de forma semelhante à indometacina (inibidor da atividade da enzima
COX). Esses dados sustentam os resultados obtidos no modelo do edema de orelha
induzido pelo óleo de Croton, sugerindo que o tratamento parece interferir na
biossíntese dos eicosanóides, pela inibição da COX ou ainda na biossíntese dos
leucotrienos, pela inibição da LOX.
A capsaicina (8-metil-N-vanilil-6-nonenamida) é um alcaloide irritante
presente em plantas do gênero Capsicum (pimentas) e é responsável pelo sabor
picante dos frutos dessas espécies. Quando em contato com a pele, a capsaicina
exerce efeito imediato sobre um alvo específico, os receptores vaniloides TRPV1,
também localizados em fibras aferentes primárias do tipo C e parte das fibras do tipo
Aδ, que produz resposta rápida através da liberação de neuropeptídeos, como o
peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), substância P (SP),
taquicininas e as monoaminas como a histamina e a serotonina (GÁBOR; RAZGA,
1992; INOUE et al., 1993; 1995), que aumentam a resposta inflamatória neurogênica
imediata, caracterizada por vasodilatação das arteríolas, aumento do fluxo
sanguíneo e conseqüente extravasamento plasmático e sensibilização a dor
(GÁBOR, 2000).
O OEVA e BISA não demonstraram redução significativa do edema de
orelha induzido por capsaicina, sugerindo não influenciar as vias inflamatórias
62
ativadas pela capsaicina, como a ativação dos receptores vanilóides ou da própria
capsaicina.
A histamina causa vasodilatação e um aumento na permeabilidade vascular,
promovendo uma resposta edematogênica em poucos minutos (BRAND et al.,
2002). Além dessas ações, a histamina ainda estimula fibras nervosas sensitivas
através de mecanismos H1-dependentes que resulta em prurido. Uma das principais
funções fisiopatológicas da histamina é a sua ação como mediador das reações de
hipersensibilidade do tipo I, como a urticária (RANG et al., 2007; BRAND et al.,
2002).
A histamina é uma amina vasoativa liberada por mastócitios ativados pelas
proteínas do complemento C3a e C5a, por leucócitos, por IgE, sendo responsável
pelo aumento da permeabilidade vascular e ação vasodilatadora (RANG et al., 2007;
KINDT et al., 2008). Anti-histamínicos e corticosteróides apresentam redução do
edema induzida por histamina.
De acordo com o presente estudo, o OEVA e BISA não foram capazes de
reduzir significativamente o edema induzido por histamina, comparada ao controle
negativo salina. Este dado sugere não haver envolvimento do OEVA e BISA em vias
relacionadas com a histamina, acreditando-se não haver envolvimento do OEVA e
BISA na inibição do efeito da histamina produzida na ação edematogênica induzida
por AA, e sim na influência da produção de eicosanoides inflamatórios.
O edema de orelha induzido por fenol é um bom modelo para simular uma
dermatite de contato. Quando há o contato do fenol com a pele, os queratinócitos
produzem mediadores químicos importantes na irritação primária de contato,
incluindo citocinas associadas a propriedades pró-inflamatórias, tais como IL-1α,
TNF-α e IL-8 (LIM et al., 2004). Essas citocinas pró-inflamatórias são produzidas por
um mecanismo diferente das vias dependentes da PKC (como ocorre na inflamação
induzida por óleo de Croton). É provável que a irritação cutânea seja desencadeada
pela ruptura da membrana plasmática dos queratinócitos, e de outros mediadores
inflamatórios como os metabólitos do AA e de espécies reativas de oxigênio (ROS),
estes últimos também formados devido ao estresse oxidativo (WILMER et al., 1994;
MURRAY et al., 2007).
O OEVA e BISA reduziram de maneira significativa o edema induzido por
fenol quando comparado com o grupo controle. Esse dado também sugere a
possível utilização do tratamento em dermatites de contato irritativas. O BISA tem
63
atividade antiinflamatória devido à inibição da síntese de leucotrienos. (KAMATOU et
al., 2010)
De acordo com os modelos de edema de orelha induzidos por óleo de
Croton, AA, capsaicina, histamina e fenol, observa-se que o OEVA e BISA
demonstraram comportamento semelhante a fármacos que reduzem a produção de
metabólitos do AA. Sugere-se, portanto, que a ação antiedematogênica esteja ligada
a fatores que modifiquem a produção de eicosanoides inflamatórios, podendo sua
ação estar relacionada à inibição das enzimas COX e LOX e a produção de
eicosanoides antiinflamatórios (PGE2, lipoxinas ou outros). Dando continuidade aos
nossos estudos, vários modelos de nocicepção visceral podem ser utilizados para
avaliar a atividade antinociceptiva visceral.
O
modelo
de
nocicepção
visceral
mais
comumente
utilizado
em
camundongos é o teste de contorções abdominais. Este teste envolve a injeção
intraperitoneal de substâncias químicas, como o ácido acético. O efeito
antinociceptivo do OEVA e BISA já tinha sido demonstrado neste modelo
experimental e também no modelo de dor induzida pela administração intraplantar
de formalina.
Em animais, muitas substâncias algogênicas, como o ácido acético,
ciclofosfamida, capsaicina, formalina e óleo de mostarda, quando aplicadas a
estruturas viscerais induzem a expressão de comportamentos relacionados à dor
envolvendo fibras aferentes sensíveis à capsaicina. (JORDT et al., 2004;
KOBAYASHI, 2003; MAGGI et al., 1992).
Essas substâncias algogênicas induzem dor, bem como uma reação
inflamatória, quando fibras aferentes viscerais são sensibilizadas ou neurônios
centrais sofrem uma mudança em sua excitabilidade (sensibilidade central) após
persistente ativação visceral (GEBHART, 1995).
Tem sido bem estabelecido que muitas substâncias algogênicas induzem
comportamentos nociceptivos relacionados à dor em roedores após a aplicação
intraperitoneal ou intracolônica, e vários trabalhos revelam que compostos naturais,
como os terpenóides, cetonas insaturadas dialdeídos e fenólicos pode suprimir
esses comportamentos. (OLIVEIRA et al., 2005)
Desconforto e dor são as principais sensações expressas pelas vísceras e
ambas aumentam em freqüência e intensidade em pacientes com uma desordem
funcional. Nociceptores viscerais sensibilizados podem contribuir para estas
64
sensações alteradas e poucas são as drogas disponíveis para o tratamento da dor
de origem visceral (LIMA JÚNIOR, 2005).
O OEVA e BISA, nas doses utilizadas, reduziram significativamente o
número de comportamentos nociceptivos induzidos por ácido acético em relação ao
grupo tratado com veículo, confirmando assim sua atividade antinociceptiva. Embora
a inibição das contorções abdominais induzidas por ácido acético represente uma
antinocicepção periférica (WEI et al., 1986), o modelo não possui especificidade,
desde que uma diversidade de compostos farmacológicos, como antidepressivos
tricícliclos (TAKAHASHI; PAZ, 1987), anti-histaminicos (YEH, 1986) e antidepressivos (PETTIBONE; MUELLER, 1981) inibem as contorções abdominais
induzidas por ácido acético e mostram uma antinocicepção que pode ser
questionada. Estes resultados estão de acordo com o trabalho realizado por
SANTOS, 2009 e ROCHA, 2009.
A ciclofosfamida é um agente antitumoral utilizado no tratamento
quimioterápico do câncer e a cistite é um de seus efeitos colaterais importantes. A
ciclofosfamida por si é inerte, porém, após a ativação metabólica no fígado, são
geradas acroleína e mostarda fosfamida que parecem ser responsáveis pelos efeitos
tóxicos e citostáticos, respectivamente (FRAISER; KEHRER, 1993).
Desde a introdução da ciclofosfamida como agente terapêutico em 1958, a
cistite hemorrágica tem sido reconhecida como uma complicação que limita sua
utilização (PHILIPS et al., 1961). Essa patologia é resultado do acúmulo na bexiga
do produto tóxico do metabolismo microssomal hepático da ciclofosfamida,
acroleina, responsável pela urotoxicidade (COX, 1979).
Estudos demonstram que mediadores inflamatórios endógenos como o fator
de ativação plaquetária (PAF), fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina 1(IL-1)
estão envolvidos na cistite pelo fato de aumentarem a produção do óxido nítrico, um
radical livre orgânico, no tecido alvo (GOMES et al., 1995; LIMA, 1994; OTER et al.,
2004).
A liberação da substância P de neurônios aferentes primários atua
perifericamente estimulando a síntese local do óxido nítrico, o que promove um
incremento no dano tecidual na bexiga, precipitando a instalação do processo
inflamatório e dor, característicos nesta patologia (ALFIERI et al., 2001).
O OEVA, (200 mg/Kg e 400 mg/Kg) e BISA (100 mg/Kg e 200 mg/Kg) foram
capazes de reduzir de forma significativa o tempo de crises transitórias quando
65
comparado com o grupo controle veículo, assim como reduziu de forma significativa
os escores para comportamento nociceptivo em relação ao grupo citado.
Os receptores sensíveis à capsaicina, receptores vanilóides do tipo 1 (VR1),
encontram-se em neurônios sensoriais. Esta substância tem sido bastante utilizada
em estudos envolvendo dor por agir especificamente nas fibras primárias aferentes
dos tipos C e Aδ. Quando ativados estes neurônios evocam a sensação de dor em
queimação e liberam neuropeptídeos que induzem a inflamação neurogênica
(HOLZER, 1991).
Outro modelo de nocicepção visceral foi proposto, utilizando a administração
intracolônica de capsaicina, sem o uso de anestesia (LAIRD et al., 2001). Neste
modelo o pré-tratamento com OEVA, nas doses testadas, reduziu significativamente
a expressão de comportamentos nociceptivos relacionados à dor visceral em relação
ao grupo controle veículo. Tais resultados apontam para uma atividade
antinociceptiva visceral do OEVA. O BISA, nas doses de 100 mg/kg e 200 mg/Kg
reduziu o comportamento nociceptivo em relação ao grupo controle veículo. Como o
OEVA e BISA não conseguiram inibir o edema de orelha induzido por capsaicina,
podemos excluir uma relação direta da ativação de receptores TRPV1 pelo
tratamento. A atividade antinociceptiva visceral do OEVA e BISA pode estar
relacionada à inibição de sensibilização dos neurônios aferentes primários terminais
por prostaglandinas (LEITE el at., 2011).
O modelo de dor visceral da formalina assemelha-se a uma dor provocada
pela administração intracolônica de outras substâncias, tais como óleo de mostarda
e capsaicina (LAIRD et al., 2001). Sabetkasaie et al., 2004 forneceram evidências de
que a instilação intracolônica de formalina através do ânus evoca comportamentos
diferenciados, que refletem a dor visceral. Neste modelo de nocicepção visceral
induzida por formalina, o pré-tratamento com OEVA e BISA, nas doses testadas,
reduziu significativamente a expressão de comportamentos nociceptivos em relação
ao grupo controle veículo. Tais resultados apontam para uma atividade
antinociceptiva visceral do OEVA e BISA.
O óleo de mostarda é um potente ativador neuronal que promove alodinia
(resposta aumentada a estímulos não-nóxicos) e hiperalgesia (sensibilidade
aumentada a estímulos nóxicos) em poucos minutos após aplicação (nocicepção
neurogênica). Além disso, ele é capaz de induzir uma colite aguda e transitória
(nocicepção não-neurogênica).
66
O Alil-isotiocianato é o maior constituinte do óleo de mostarda, sendo
postulada uma ação sobre receptores da capsaicina TRPV1, além de desenvolver
lesão tecidual direta com produção de mediadores inflamatórios, como a bradicinina
e prostaglandinas. Muito se questiona quanto ao real mecanismo pró-nociceptivo
desta substância uma vez que camundongos “knock-out” para o receptor TRPV1
possuem sensibilidade para o óleo de mostarda, sugerindo que a capsaicina, um
reconhecido agonista destes receptores, e os isotiocinatos possuem mecanismos
moleculares diferentes. Contudo, respostas inflamatórias induzidas por esses
agentes irritantes relevam uma dessensibilização
cruzada, sugerindo uma
convergência entre as vias de sinalização celular (CATERINA et al., 2000).
Mais recentemente, um estudo realizado por Bautista et al. (2006), sugeriu a
ligação do óleo de mostarda com um receptor específico, denominado TRPA1.
Utilizando camundongos “knockout” para esse tipo de receptor, mostrou-se que o
TRPA1 é um importante receptor, no qual irritantes e agentes algésicos endógenos
se ligam despolarizando nociceptores para causar a dor inflamatória.
No
modelo
do
óleo
de
mostarda,
o
OEVA
e
BISA
reduziram
significativamente o tempo de crises transitórias quando comparado com o grupo
controle veículo. As vísceras expressam uma vasta gama de receptores de
membrana (incluindo receptores vanilóides, TRPV1) para estímulos químicos, que
estão envolvidos na sinalização sensorial desde a periferia até o sistema nervoso
central (WOOD, 2004).
Os resultados de nocicepção são inibidos, mas o efeito mais pronunciado
ocorre sobre o ácido araquidônico, formalina, óleo de mostarda. E o efeito sobre a
ciclofosfamida
e
capsaicina
é
parcial.
Este efeito antinociceptivo pode
relacionado ao alto teor de (-)-α-bisabolol encontrado no
OEVA,
estar
uma vez
que Alves et al. (2010) relatou que o (-)-α-bisabolol é capaz de reduzir a
excitabilidade neuronal de uma forma dependente da concentração e tem atividade
nociceptiva visceral (LEITE et al., 2011). Confirmando os dados do (-)-α-bisabolol.
O estudo do mecanismo de ação do OEVA releva que aparentemente não
existe o envolvimento do sistema opióide na ação antinociceptiva. A naxolona, um
antagonista
não
seletivo
do
receptor
opióde,
não
conseguiu
reverter
significativamente o efeito antinociceptivo do tratamento, caracterizando que pode
não existir participação deste sistema na modulação inibitória da dor visceral. Mas o
BISA em combinação com a naloxona potencializam a atividade nociceptiva. Estas
67
observações sugerem que o BISA não age como agonista do receptor opióde, mas
pode eventualmente induzir uma influência modulatória sobre receptores opiódes.
O óxido nítrico (NO) é um gás, de secreção parácrina, cuja ação se
restringe às proximidades do local onde foi produzido. Vários anos foram
necessários para identificar sua ação, já que ele é rapidamente degradado. Nos
tecidos, ele é sintetizado pela ação da enzima óxido nítrico sintase sobre o
aminoácido L - arginina. O NO se difunde para as células-alvo onde ele ativa a forma
citosólica da guanilil ciclase e promove a formação do segundo mensageiro GMPc.
(SILVERTHORN, 2003).
O NO é responsável pela ativação da guanilato ciclase solúvel e aumento da
GMPc intracelular, podendo então modular uma série de funções fisiológicas.
Também está envolvido na nocicepção central e periférica, agindo como prónociceptivo, bem como um agente antinociceptivo. Diversos estudos têm
evidenciado alguma participação do NO durante a transmissão nociceptiva
prolongada, notadamente medular, sugerindo importante papel do NO na dor
(DICKENSON, 1995). Entretanto, o mecanismo exato pelo qual o óxido nítrico
exerce esse duplo efeito ainda é incerto (MACHELSKA et al., 1997; ZAKARIA et al.,
2005).
O NO no cérebro atua como neurotransmissor e neuromodulador. Nos vasos
sanguíneos, é produzido pelas células endoteliais. Ele então se difunde para as
células da musculatura lisa adjacente promovendo o seu relaxamento e por
conseqüência a dilatação do vaso sangüíneo. (SILVERTHORN, 2003)
Estudos
recentes
mostraram
que
o
NO
estimula
a
síntese
de
prostaglandinas inflamatórias ao ativar a isoforma II da ciclooxigenase (COX-2). Por
conseguinte, a inibição da via do óxido nítrico pode exercer um efeito benéfico sobre
doenças inflamatórias. Os estudos que utilizam inibidores da COX-2 mostraram a
necessidade do óxido nítrico para a manutenção da expressão do gene da COX-2.
(KATZUNG, 2005).
O efeito antinociceptivo do OEVA não foi bloqueado na presença de LNAME, um inibidor da síntese do NO, sugerindo que o efeito nociceptivo parece não
estar relacionado do NO. Confome (LEITE el at., 2009), que o efeito gastroprotetor
não se relaciona com a via do NO. Mas o BISA em combinação com L-NAME
mostrou um efeito antinociceptivo mais pronuncciado. Estas observações sugerem
que o BISA pode eventualmente induzir uma influência modulatória sobre a via
68
nitrérgica. O L-NAME utilizado na gastroproteção não se relaciona com a via do
óxido nítrico (ROCHA et al., 2009).
A ativação dos receptores α2 por vias descendentes noradrenérgicas exerce
um efeito regulador inibitório importante na modulação da dor aguda e a hiperalgesia
inflamatória, possuindo um papel essencial não somente na dor de origem somática,
mas também na de origem visceral (MANSIKKA et al., 2004), atuando via proteína Gi
na inibição da enzima adenilato ciclase para aumentar o efluxo celular de K + e
suprimir as correntes de Ca+2, o que impede a continuidade da liberação de
substância P e glutamato pelos terminais nervosos (MILLAN, 2002).
Para avaliação do estudo do envolvimento dos receptores noradrenérgicos
α2, o efeito inibitório do OEVA sobre o comportamento dos animais não foi revertido
pela ioimbina, sugerindo a não participação dos receptores α2 em seu mecanismo de
ação. Contrariando (LEITE el at., 2009), que o efeito gastroprotetor possivelmente se
relaciona com os receptores α2. A ioimbina não poderia reverter a antinocicepção
produzida pela BISA, sugerindo que α2-adrenérgicos não desempenham qualquer
papel. O agonista dos receptores adrenérgicos α2 tem sido mostrado para induzir
efeito antinociceptivo no modelo experimental de colite induzida por formalina em
ratos e reduzir a hipersensibilidade visceral em ambientes clínicos (MIAMPAMBA et
al., 1992; BLACKSHAW e GEBHART, 2002).
Os canais K+ATP depentes demonstraram ter um envolvimento nos processos
de dor. A ativação desses canais levam a uma hiperpolarização celular, diminuindo
os níveis de Ca2+ intracelular e reduzindo a liberação de neurotransmissores, desse
modo levando à antinocicepção (ASSANO et al., 2000; OCANA et al., 2004).
Dependendo da localização, esses canais podem agir direta ou indiretamente nos
sinais de transmissão de dor. Atualmente, vários anestésicos usados clinicamente
agem por interagir com canais de potássio. Alguns produtos naturais também
possuem essa mesma ação (McCURDY; SCULLY, 2005).
Os canais de K+ATP - dependentes (K+ATP) pertencem a uma grande família
de proteínas de membrana. Estes canais regulados por ligantes são definidos tendo
por base a sua sensibilidade ao ATP intracelular, que inibe sua atividade.
(SILVERTHORN, 2003).
As sulfoniluréias exercem a sua principal ação sobre as células β,
estimulando a secreção de insulina, reduzindo, assim, o nível plasmático de glicose.
Existem receptores de alta afinidade das sulfoniluréias nos canais de K+ATP na
69
membrana plasmática das células β e a ligação de várias sulfoniluréias acompanha
sua potência na estimulação da liberação de insulina. O fármaco reduz a
permeabilidade das células β ao K+ ao bloquear os canais de K+ATP, causando
despolarização, entrada de Ca2+ e secreção de insulina (KATZUNG, 2005). O influxo
de Ca2+ pode ser o suficiente para causar degeneração das terminações nervosas,
que leva dias ou semanas para se recuperar (RANG, 2007).
O efeito antinociceptivo do OEVA e BISA não foi bloqueado de forma
significativa na presença de glibenclamida (5 mg/kg i.p.), um bloqueador dos canais
de potássio ATP - dependentes (K+ATP). Mostrando que possivelmente o efeito
nociceptivo não é dependente desta via. Confome (LEITE el at., 2009 e ROCHA et
al., 2009), que o efeito gastroprotetor não se relaciona com o bloqueador dos canais
de potássio ATP - dependentes (K+ATP).
A serotonina estimula as terminações nervosas sensitivas nociceptivas
(mediadoras da dor) um efeito mediado principalmente pelos receptores 5-HT3. A
ondansetrona – antagonistas de receptores 5-HT3, é utilizada como antieméticos,
particularmente para controlar náuseas e vômitos graves que ocorrem com muitas
formas de quimioterapia do câncer. Os receptores serotonérgicos 5-HT3 estão
presentes na periferia dos terminais nervosos vagais e no nível central da zona
quimiorreceptora disparadora da área postrema. (RANG, 2007).
O efeito antinociceptivo do OEVA não foi bloqueado de forma significativa na
presença de Ondasentrona. Mostrando que possivelmente o efeito antinociceptivo
não seja dependente desta via. Mas o BISA em combinação com a Ondasentrona
mostrou um efeito antinociceptivo mais pronunciado, sugerindo que o BISA pode
atuar modulando esta via.
O receptor da capsaicina (TRPV1) está presente tanto nos sistema nervoso
central (no corno dorsal da medula espinhal) como periférico, nos terminais dos
neurônios sensoriais aferentes exercendo funções integrativas de estímulos
químicos e físicos relacionados à dor. O receptor TRPV1 foi caracterizado como um
canal iônico não seletivo, que não discrimina cátions mono ou bivalentes, exercendo
uma notável preferência pelos últimos, principalmente Ca 2+ (TOMINAGA et al.,
1998).
Esses neurônios aferentes primários sensíveis à capsaicina estão envolvidos
não somente com a percepção da dor de origem somática e visceral, mas também
possuem funções efetoras sensoriais, onde promovem a liberação dos estoques
70
neuronais de neuropeptídios, substância P e CGRP (peptídeo relacionado ao gene
da calcitonina), através de um mecanismo dependente de Ca2+ pela ativação do VR1
(LIDDLE; NATHAN, 2004).
O vermelho de rutênio, um antagonista não-competitivo do receptor TRPV1
que atua mediante bloqueio do influxo de Ca 2+ através do canal associado ao
receptor, inibe a atividade excitatória mediada pela capsaicina, além de inibir a
liberação dos estoques intracelulares de Ca2+ por bloquear receptores de rianodina
(SZALLASI; BLUMBERG, 1999).
Para avaliação do envolvimento do receptor TRPV1, como parte do
mecanismo de ação do OEVA e BISA no modelo de dor visceral induzida por óleo
de mostarda, utiliza-se o vermelho de rutênio. O efeito antinociceptivo do OEVA não
foi bloqueado de forma significativa na presença de vermelho de rutênio (3 mg/kg,
s.c.). Mostrando que possivelmente o efeito nociceptivo não seja dependente desta
via. No entanto, quando os animais foram pré-tratados com BISA e vermelho de
rutênio, em combinação, houve potencialização do efeito antinociceptor do BISA.
Estas observações sugerem que possívelmente o BISA induz uma influência
modulatória sobre receptores vanilóides.
O bloqueio de ação de uma via inibitória, como a opióide, por exemplo,
poderia estar causando uma potencialização da transmissão da via nociceptiva,
como abertura de canais seletivos para sódio e cálcio. Isso poderia contribuir para o
aumento do potencial inibitório de um inibidor seletivo, como possivelmente o BISA
e, caso esse possua predileção por canais iônicos. Não diria nem inibidor, pois
antagonistas possuem afinidade pelo sítio receptor tanto na forma ativa, como na
forma inativa. Eles se ligam no sítio receptor e evitam que o agonista se ligue.
Chamaria de um potencial efeito agonista inverso, o qual tem afinidade pelo estado
inativo do receptor (canal). Seria o provável mecanismo de ação do BISA. Esse
fenômeno não acontece com o OEVA, pois neste caso, temos uma mistura de
constituintes, o que leva a uma inespecificidade de ação, mesmo que o BISA esteja
presente em concentração majoritária.
A dor relacionada aos testes comportamentais utilizados para selecionar
agentes potencialmente antinociceptivos pode ter algumas limitações. Por exemplo,
não está claro qual extensão de sedação ou alterações nas funções motoras podem
influenciar o resultado deste teste. Agonistas da adenosina, por exemplo, que
produzem efeitos comportamentais, como uma inibição da atividade locomotora,
71
demonstraram efeito antinociceptivo (KARLSTEN et al., 1992). Estudos sugerem
que a sedação do sistema nervoso central e o efeito músculo-relaxante nãoespecífico podem reduzir a resposta de coordenação motora (SOJA et al., 2002).
No presente estudo, o OEVA e BISA, não demonstraram diminuir a
movimentação espontânea dos animais no teste de campo aberto. Essas
observações sugerem que o OEVA e BISA não possuem ação depressora sobre o
SNC, ação esta que poderia influenciar o efeito antinociceptivo.
Evidências in vivo nos mostram que OEVA e BISA são agentes
antiinflamatórios tópicos eficazes em modelos experimentais de dermatite aguda e
crônica sugerem que isso pode servir como uma fonte para o desenvolvimento de
drogas eficazes em dermatoses inflamatórias, como dermatite atópica ou de contato
e psoríase. Além disso, inibem nocicepção visceral induzida por diversos agentes,
cujo mecanismo de ação necessita de mais estudos para ser elucidado.
72
6. CONCLUSÕES
 O OEVA e BISA possuem efeito antiinflamatório agudo e crônico quando
administrado topicamente em camundongos no modelo de edema induzido
por óleo de Croton;

A redução do edema induzido por ácido araquidônico sugere a diminuição
dos efeitos de metabólitos inflamatórios do AA, podendo sua ação estar
ligada à inibição de COX e LOX ou receptores de prostaglandinas e/ou à
produção de eicosanóides antiinflamatórios;

O OEVA e BISA não foram capazes de reduzir o edema induzido pela
capsaicina nem pela histamina, sugerindo que o tratamento não inibe a
liberação de mediadores vasoativos como CGRP, substancia P, taquicininas,
histamina e serotonina;
 A aplicação de OEVA e BISA em dermatites de contato irritativas
demonstraram ser eficaz pela redução de edema induzido por fenol;
 O OEVA e BISA revelaram uma atividade antinociceptiva nos modelos de dor
visceral induzida por ácido acético, ciclofosfamida, capsaicina, formalina e
óleo de mostarda;
 O estudo do mecanismo de ação antinociceptivo induzido por óleo de
mostarda do OEVA sugere que não há envolvimento dos sistemas opióide e
adrenérgico, dos receptores α2, 5-HT3, dos canais K+ATP, do óxido nítrico,
sobre os receptores TRPV1;
 O estudo do mecanismo de ação antinociceptivo induzido por óleo de
mostarda do BISA nos sistemas opióide e do óxido nítrico, 5-HT3, sobre os
receptores TRPV1 potencializaram a ação, podendo eventualmente induzir
uma influência modulatória. A inibição é inespecífica e o BISA pode ser
possivelmente um agonista inverso;
73
 A atividade locomotora não foi alterada pelo pré-tratamento com OEVA ou
BISA, sugerindo que o efeito antinociceptivo não está relacionado a um efeito
relaxamento muscular.
74
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n. 2, p. 199-206, 2005.
85
APÊNDICE
86
Apêndice 01. Efeito do OEVA sobre o edema induzido pela aplicação única de óleo
de cróton (OC) em camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
14,19 ± 1,12
Dexametasona
4
3,73 ± 1,05a
OEVA
50
10,09 ± 0,33b
OEVA
100
11,77 ± 0,96
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,01; ap<0,001 vs controle); (ANOVA e
Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 02. Efeito do BISA sobre o edema induzido pela aplicação única de óleo
de cróton (OC) em camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
14,19 ± 1,12
Dexametasona
4
3,73 ± 1,05a
BISA
35
9,75 ± 1,29c
BISA
70
12,72 ± 0,85
Valores expressos em média + E.P.M. (cp<0,05; ap<0,001 vs controle); (ANOVA e
Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 03. Efeito do OEVA sobre o edema induzido pela aplicação múltipla de
óleo de cróton (OC) em camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
11,62 ± 1,92
Dexametasona
4
3,92 ± 0,33b
OEVA
50
8,38 ± 1,47
OEVA
100
15,02 ± 2,69
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,05 vs controle); (ANOVA e Teste de
Student-Newman-Keul).
87
Apêndice 04. Efeito do BISA sobre o edema induzido pela aplicação múltipla de
óleo de cróton (OC) em camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
13,74 ± 1,01
Dexametasona
4
5,23 ± 1,81a
BISA
35
10,93 ± 1,11
BISA
70
12,88 ± 1,33
Valores expressos em média + E.P.M. (ap<0,01 vs controle); (ANOVA e Teste de
Student-Newman-Keul).
Apêndice 05. Efeito do OEVA sobre o edema induzido pela aplicação de ácido
araquidônico (AA) em camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
9,81 ± 1,45
Indometacina
100
2,37 ± 0,65a
OEVA
50
3,86 ± 0,73a
OEVA
100
6,38 ± 0,71c
Valores expressos em média + E.P.M. (cp<0,05; ap<0,001 vs controle); (ANOVA e
Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 06. Efeito do BISA sobre o edema induzido pela aplicação de ácido
araquidônico (AA) em camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
9,81 ± 1,45
Indometacina
100
2,37 ± 0,65a
BISA
35
4,89 ± 0,97b
BISA
70
4,53 ± 0,99b
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,01; ap<0,001 vs controle); (ANOVA e
Teste de Student-Newman-Keul).
88
Apêndice 07. Efeito do OEVA sobre o edema induzido pela aplicação da Capsaicina
(CAP) em camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
3,84 ± 0,55
Dexametasona
4
2,84 ± 0,44
OEVA
50
3,57 ± 0,86
OEVA
100
3,46 ± 0,69
Valores expressos em média + E.P.M. (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 08. Efeito do BISA sobre o edema induzido pela aplicação da Capsaicina
(CAP) em camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
3,84 ± 0,55
Dexametasona
4
2,84 ± 0,44
BISA
35
3,87 ± 0,44
BISA
70
2,55 ± 0,74
Valores expressos em média + E.P.M. (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 09. Efeito do OEVA sobre o edema induzido pela aplicação intradérmica
de histamina em camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
4,78 ± 0,56
Dexametasona
4
2,84 ± 0,26a
OEVA
50
4,56 ± 0,33
OEVA
100
3,77 ± 0,25
Valores expressos em média + E.P.M. (ap<0,01 vs controle); (ANOVA e Teste de
Student-Newman-Keul).
89
Apêndice 10. Efeito do BISA sobre o edema induzido pela aplicação intradérmica de
histamina em camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
3,25 ± 0,53
Dexametasona
4
1,55 ± 0,36
BISA
35
1,84 ± 0,45
BISA
70
1,72 ± 0,46
Valores expressos em média + E.P.M. (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 11. Efeito do OEVA sobre o edema induzido pela aplicação de fenol em
camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
24,78 ± 5,61
Dexametasona
4
9,38 ± 2,56b
OEVA
50
11,86 ± 3,45b
OEVA
100
6,60 ± 1,96b
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,05 vs controle); (ANOVA e Teste de
Student-Newman-Keul).
Apêndice 12. Efeito do BISA sobre o edema induzido pela aplicação de fenol em
camundongos Swiss
Grupo
Dose (mg/mL)
Edema (mg)
Veículo
-
24,78 ± 5,61
Dexametasona
4
9,38 ± 2,56a
BISA
35
9,84 ± 1,67 a
BISA
70
7,60 ± 2,15 a
Valores expressos em média + E.P.M. (ap<0,01 vs controle); (ANOVA e Teste de
Student-Newman-Keul).
90
Apêndice 13. Efeito do OEVA sobre nocicepção visceral induzida por ácido acético
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/min
Veículo
-
46,63 ± 7,96
OEVA
100, v.o.
20,25 ± 2,17b
200, v.o.
18,25 ± 6,08 b
400, v.o.
18,63 ± 3,86 b
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,01 vs controle); (ANOVA e Teste de
Student-Newman-Keul).
Apêndice 14. Efeito do BISA sobre nocicepção visceral induzidas por ácido acético
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/min
Veículo
-
48,63 ± 10,81
BISA
50, v.o.
10,50 ± 2,94a
100, v.o.
8,50 ± 3,20a
200, v.o.
8,43 ± 2,57a
Valores expressos em média + E.P.M. (ap<0,001 vs controle); (ANOVA e Teste de
Student-Newman-Keul).
Apêndice 15. Efeito do OEVA sobre o tempo de crises transitórias no teste de
nocicepção visceral induzida por ciclofosfamida
Grupo
Dose (mg/Kg)
Tempo de crises
transitórias (min)
Normal
-
10,89 ± 1,48
Veículo
-
27,82 ± 0,77b
OEVA
100, v.o.
25,03 ± 1,10b
200, v.o.
18,02 ± 1,11ª,b
400, v.o.
23,78 ± 0,70b,c
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,05 vs normal; cp<0,05; ap<0,001 vs
controle); (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
91
Apêndice 16. Efeito do BISA sobre o tempo de crises transitórias no teste de
nocicepção visceral induzida por ciclofosfamida
Grupo
Dose (mg/Kg)
Tempo de crises
transitórias (min)
Normal
-
17,68 ± 2,17
Veículo
-
29,42 ± 0,44b
BISA
50, v.o.
30,19 ± 0,97b
100, v.o.
20,73 ± 1,06a
200, v.o.
18,90 ± 1,60a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,05 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 17. Efeito do OEVA sobre o escore de comportamento nociceptivo no
teste de nocicepção visceral induzida por ciclofosfamida
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/escore
Normal
-
22,20 ± 4,93
Veículo
-
60,43 ± 0,87b
OEVA
100, v.o.
53,80 ± 1,96b
200, v.o.
39,00 ± 2,46ª,b
400, v.o.
50,00 ± 2,42b,c
Valores expressos em média + E.P.M..(bp<0,05 vs normal; cp<0,05; ap<0,001 vs
controle); (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
92
Apêndice 18. Efeito do BISA sobre o escore de comportamento nociceptivo no teste
de nocicepção visceral induzida por ciclofosfamida
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/escores
Normal
-
26,83 ± 4,56
Veículo
-
68,83 ± 2,92b
BISA
50, v.o.
52,17 ± 2,60ª,b
100, v.o.
30,33 ± 1,15a
200, v.o.
25,50 ± 3,01a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,05 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 19. Efeito do OEVA sobre nocicepção visceral induzida por capsaicina
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/30min
Normal
-
10,25 ± 6,21
Veículo
-
37,25 ± 5,97b
OEVA
100, v.o.
5,75 ± 2,02a
200, v.o.
9,25 ± 2,24a
400, v.o.
5,88 ± 2,24a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,001 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
93
Apêndice 20. Efeito do BISA sobre nocicepção visceral induzida por capsaicina
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/30min
Normal
-
10,25 ± 6,21
Veículo
-
84,38 ± 12,99c
BISA
50, v.o.
87,00 ± 19,30c
100, v.o.
31,00 ± 13,11d
200, v.o.
15,33 ± 10,82d
Valores expressos em média + E.P.M. (cp<0,01 vs normal; dp<0,01 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 21. Efeito do OEVA sobre nocicepção visceral induzida por formalina
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/60min
Normal
-
22,63 ± 5,86
Veículo
-
98,00 ± 16,65b
OEVA
100, v.o.
20,00 ± 5,80a
200, v.o.
33,75 ± 8,68a
400, v.o.
28,57 ± 5,32a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,001 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
94
Apêndice 22. Efeito do BISA sobre nocicepção visceral induzida por formalina
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/60min
Normal
-
198,6 ± 47,87
Veículo
-
344,6 ± 50,21c
BISA
50, v.o.
103,0 ± 16,21a
100, v.o.
140,4 ± 25,51a
200, v.o.
75,13 ± 13,44a
Valores expressos em média + E.P.M. (cp<0,01 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 23. Efeito do OEVA sobre nocicepção visceral induzida por Óleo de
Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
4,29 ± 1,09
Veículo
-
45,00 ± 11,02b
OEVA
100, v.o.
10,71 ± 1,48a
200, v.o.
6,13 ± 1,16a
400, v.o.
4,20 ± 1,46a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,001 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
95
Apêndice 24. Efeito do BISA sobre nocicepção visceral induzida por Óleo de
Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
21,57 ± 7,13
Veículo
-
107,8 ± 25,01b
BISA
50, v.o.
21,67 ± 7,99a
100, v.o.
33,83 ± 10,28a
200, v.o.
27,17 ± 11,05a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,001 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 25. Efeito da Naloxona, L-NAME, Ioimbina, Glibenclamida, Ondasentrona
e Vermelho de Rutênio no modelo de nocicepção visceral induzida por Óleo de
Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
18,14 ± 3,44
Veículo
-
44,17 ± 5,59b
Ioimbina
2, i.p.
22,88 ± 3,53d
Ondasentrona
0,5, i.p.
44,75 ± 5,8a
L-NAME
20, i.p.
27,13 ± 3,74
Glibenclamida
5, i.p.
40,88 ± 8,39b
Vermelho de Rutênio
3, s.c.
29,25 ± 4,98
Naloxona
1, i.p.
2,63 ± 0,46b,c
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,05; ap<0,01 vs normal;
c
p<0,001 vs controle veículo); (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
d
p<0,05;
96
Apêndice 26. Efeito da Naxolona sobre a antinocicepção do OEVA no modelo de
nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
5,00 ± 0,33
Veículo
-
32,38 ±3,09b
OEVA
200, v.o.
3,75 ± 1,52ª
OEVA + Na
200, v.o. + 2, i.p.
5,00 ± 0,96a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,001 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 27. Efeito da Naxolona sobre a antinocicepção do BISA no modelo de
nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
88,25 ± 18,59
Veículo
-
181,9 ± 24,07c
BISA
50, v.o.
115,7 ± 25,33d
BISA + Na
50, v.o. + 2, i.p.
54,25 ± 11,83a
Valores expressos em média + E.P.M. (cp<0,01 vs normal; dp<0,05; ap<0,001 vs
controle); (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
97
Apêndice 28. Efeito do L-NAME sobre a antinocicepção do OEVA no modelo de
nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
3,88 ± 1,22
Veículo
-
45,38 ± 5,73b
OEVA
200, v.o.
10,50 ± 3,86a
OEVA + L-NAME
200, v.o. + 2, i.p.
8,13 ± 2,36a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,001 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 29. Efeito do L-NAME sobre a antinocicepção do BISA no modelo de
nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
88,25 ± 18,59
Veículo
-
181,9 ± 24,07c
BISA
50, v.o.
115,7 ± 25,33d
BISA + L-NAME
50, v.o. + 20, i.p.
31,25 ± 8,64ª,e
Valores expressos em média + E.P.M. (cp<0,01 vs controle normal; ep<0,05 vs BISA;
d
p<0,05; ap<0,001 vs controle); (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
98
Apêndice 30. Efeito da Ioimbina sobre a antinocicepção do OEVA no modelo de
nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
4,25 ± 1,77
Veículo
-
28,50 ± 4,00b
OEVA
200, v.o.
2,50 ± 1,09a
OEVA + Ioimbina
200, v.o. + 2, i.p.
3,75 ± 1,37a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,001 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 31. Efeito da Ioimbina sobre a antinocicepção do BISA no modelo de
nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
4,25 ± 1,77
Veículo
-
28,50 ± 4,00b
BISA
50, v.o.
1,29 ± 0,75a
BISA + Ioimbina
50, v.o. + 2, i.p.
5,75 ± 1,77a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,001 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
99
Apêndice 32. Efeito da Glibenclamida sobre a antinocicepção do OEVA no modelo
de nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
3,88 ± 1,22
Veículo
-
45,38 ± 5,73b
OEVA
200, v.o.
10,50 ± 3,86a
OEVA + Glibenclamida
200, v.o. + 5, i.p.
9,88 ± 2,33a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,001 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 33. Efeito da Glibenclamida sobre a antinocicepção do BISA no modelo
de nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
88,25 ± 18,59
Veículo
-
181,9 ± 24,07c
BISA
50, v.o.
115,7 ± 25,33d
BISA + Glibenclamida
200, v.o. + 5, i.p.
86,57 ± 15,61d
Valores expressos em média + E.P.M. (dp<0,05; cp<0,01 vs controle); (ANOVA e
Teste de Student-Newman-Keul).
100
Apêndice 34. Efeito da Ondasentrona sobre a antinocicepção do OEVA no modelo
de nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
3,88 ± 1,22
Veículo
-
45,38 ± 5,73b
OEVA
200, v.o.
10,50 ± 3,86a
OEVA + Ondasentrona
200, v.o. + 0,5, i.p.
5,38 ± 1,50a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,001 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 35. Efeito da Ondasentrona sobre a antinocicepção do BISA no modelo
de nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
88,25 ± 18,59
Veículo
-
181,9 ± 24,07c
BISA
50, v.o.
115,7 ± 25,33d
BISA + Ondasentrona
50, v.o. + 0,5, i.p.
57,13 ± 11,07a
Valores expressos em média + E.P.M. (cp<0,01 vs normal; dp<0,05; ap<0,001 vs
controle); (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
101
Apêndice 36. Efeito do Vermelho de Rutênio sobre a antinocicepção do OEVA no
modelo de nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
9,50 ± 3,82
Veículo
-
26,00 ± 2,40b
OEVA
200, v.o.
7,38 ± 1,59a
OEVA + Vermelho de Rutênio
200, v.o. + 3, s.c.
5,38 ± 1,10a
Valores expressos em média + E.P.M. (bp<0,001 vs normal; ap<0,001 vs controle);
(ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 37. Efeito do Vermelho de Rutênio sobre a antinocicepção do BISA no
modelo de nocicepção visceral induzida por Óleo de Mostarda
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de
Comportamento de
dor/20min
Normal
-
88,25 ± 18,59
Veículo
-
181,9 ± 24,07c
BISA
50, v.o.
115,7 ± 25,33d
BISA + Vermelho de Rutênio
50, v.o. + 3, s.c.
61,71 ± 8,41e
Valores expressos em média + E.P.M. (cp<0,01 vs normal; dp<0,05; ep<0,01 vs
controle); (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
Apêndice 38. Efeito do OEVA sobre teste de campo aberto em camundongos
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de Campos
explorados/4min
Veículo
-
55,25 ± 6,41
OEVA
200, v.o.
33,67 ± 5,46
Valores expressos em média + E.P.M. (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
102
Apêndice 39. Efeito do BISA sobre teste de campo aberto em camundongos
Grupo
Dose (mg/Kg)
Número de Campos
explorados/4min
Veículo
-
23,50 ± 5,05
BISA
50, v.o.
13,57 ± 3,22
Valores expressos em média + E.P.M. (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keul).
103
PUBLICAÇÕES
Artigos Publicados:
LEITE, G.O.; LEITE, L.H.I.; SAMPAIO, R.S.; ARARUNA, M.K.A.; MENEZES, I.R.A.;
COSTA, J.G.M.; CAMPOS, A.R. (−)-α-Bisabolol attenuates visceral nociception
and inflammation in mice. Fitoterapia, v. 82, p. 208 – 211, 2011.
LEITE, G.O.; SAMPAIO, R.S.; LEITE, L.H.I.; MENEZES, I.R.A.; COSTA, J.G.M.;
CAMPOS, A.R. Attenuation of visceral pain in mice by the essential oil from
Vanillosmopsis arborea bark. Revista Brasileira de DOR, 2011.
Apresentações de trabalhos em congressos:
1. LEITE, G.O.; SAMPAIO, R.S.; LEITE, L.H.I.; MENEZES, I.R.A.; COSTA,
J.G.M.; CAMPOS, A.R. EFEITO ANTINOCICEPTIVO VISCERAL DO ÓLEO
ESSENCIAL DE vanillosmopsis arborea NO MODELO DE DOR VISCERAL
INDUZIDA POR FORMALINA. X Encontro de Pós-Graduação e Pesquisa UNIFOR, Fortaleza, 2010.
2. LEITE, G.O.; SAMPAIO, R.S.; LEITE, L.H.I.; MENEZES, I.R.A.; COSTA,
J.G.M.;
CAMPOS,
VANILLOSMOPSIS
A.R.
O
ARBOREA
ÓLEO
ESSENCIAL
ATENUA
A
DOR
DO
CAULE
DE
VISCERAL
EM
CAMUNDONGOS. 9º Congresso Brasileiro de DOR, Fortaleza, 2010.
3. LEITE, G.O.; SAMPAIO, R.S.; LEITE, L.H.I.; MENEZES, I.R.A.; COSTA,
J.G.M.; CAMPOS, A.R. O BISABOLOL DIMINUI A DOR VISCERAL EM
CAMUNDONGOS. 9º Congresso Brasileiro de DOR, Fortaleza, 2010.
4. LEITE, G.O.; ARARUNA, M.K.A.; SARAIVA, R.A.; MENEZES, I.R.A.; COSTA,
J.G.M.; CAMPOS, A.R. EFEITO ANTIINFLAMATÒRIO DO ALFA-BISABOLOL
EM MODELOS DE INFLAMAÇÂO CUTÂNEA EM CAMUNDONGOS. 62/ª
Reunião Anual da SBPC, Natal, 2010.
104
5. LEITE, G.O.; ARARUNA, M.K.A.; SARAIVA, R.A.; MENEZES, I.R.A.; COSTA,
J.G.M.; CAMPOS, A.R. TOPICAL ANTIINFLAMMATORY EFFECT OF
VANILLOSMOPSIS ARBOREA BARK ESSENTIAL OIL IN MICE. V Simpósio
Iberoamericano de Plantas Medicinais, Itajaí, 2010.