Anita de Oliveira Silva
Caracterização eletrofisiológica de canais
iônicos sensíveis a variação do volume em
células GH3.
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Fisiologia e Biofísica
Belo Horizonte- Minas Gerais
2008
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Anita de Oliveira Silva
Caracterização eletrofisiológica de canais iônicos
sensíveis a variação do volume em células GH3.
Dissertação submetida ao curso de Pós- graduação em Fisiologia e
Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas - Fisiologia e
Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Miguel José Lopes
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Fisiologia e Biofísica
Belo Horizonte - Minas Gerais
2008
Dedicatória
Dedico esse trabalho ao meu pai, Olavo Gomes da Silva, por me apoiar e
acreditar em mim e à minha mãe, Ana Maria de Oliveira Silva, por ser meu
exemplo de dedicação e perseverança.
Agradecimentos
Agradeço ao meu orientador, Miguel José Lopes, pelos ensinamentos, pela
paciência e pelo seu exemplo profissional.
À minha família por contribuir sempre com minha formação.
Aos meus amigos pelo privilégio de poder participar de suas vidas.
Aos colegas e professores pela convivência diária.
Lista de Abreviaturas
9-AC: antraceno-9-carboxilato
ATP: trifosfato de adenosina
CaCC: canais para cloreto ativados por cálcio
CFTR: regulador da condutância transmembrana modificado pela fibrose
cística
ClC: canais para cloreto dependentes de voltagem
CPP: ácido 2-(p-clorofenoxi)propiônico
DNDS: ácido 4,4´-dinitroestilbene-2,2´-disulfônico
DPC: difenilaminocarboxilato
FFA: ácido flufenamínico
IAA: ácido indaniloxiacético
NFA: ácido niflúmico
NPPB: ácido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino)benzóico
VRAC: canais aniônicos regulados por volume ou canais mecano-sensíveis
SITS: ácido 4-acetoamido-4´-isotiocianoestilbene-2,2´disulfônico
Lista de Figuras
Figura 1- Corrente bruta de células com Alto (142mM) Cloreto Intracelular.....................25
Figura 2- Corrente bruta de células com Baixo (42 mM) Cloreto Intracelular...................26
Figura 3- Curva de ativação estacionária dos canais para cloreto ativados pelo aumento
do volume celular...................................................................................................................27
Figura 4- Registro representativo das correntes brutas após o pré-pulso positivo.........30
Figura 5- Seqüência de Permeabilidade...............................................................................31
Figura 6- Efeito do Gadolínio nas correntes VRACs...........................................................32
Figura7- Efeito da Glibenclamida nas correntes VRACs....................................................33
Figura 8- Efeito do Ácido Niflúmico nas correntes VRACs................................................34
Figura 9-- Efeito do NPPB nas correntes basais.................................................................35
Figura10- Diminuição da corrente em resposta ao NPPB..................................................36
Figura 11- Efeito do NPPB nas correntes ativadas por volume.........................................37
Figura 12- Efeito do Tamoxifeno nas correntes ativadas por volume na presença de Alto
Cloreto intracelular................................................................................................................39
Figura 13- Efeito do Tamoxifeno nas correntes ativadas por volume na presença de Baixo
Cloreto intracelular................................................................................................................40
Figura 14- Medida da liberação de ATP ...............................................................................42
Sumário
Resumo ................................................................................................................7
Abstract ................................................................................................................8
1- Introdução..........................................................................................................9
2- Justificativa.......................................................................................................17
3- Objetivo Geral...................................................................................................18
4- Materiais e métodos..........................................................................................18
5- Resultados........................................................................................................23
6- Discussão.........................................................................................................43
7- Conclusões.......................................................................................................48
8- Referências Bibliográficas................................................................................49
7
Resumo
O aumento do volume celular induz ao aumento na condutância aniônica
em todos os tipos celulares de vertebrados que têm sido examinados. Neste
estudo, utilizando técnicas de medida de corrente iônica através da membrana
celular, buscamos identificar canais aniônicos envolvidos na regulação do
volume de células GH3 submetidas ao estresse hipotônico, e seu possível
papel como via condutiva do ATP, que é liberado para o espaço extracelular
nesta condição. Para a medida das correntes de cloreto ativadas por aumento
de volume, utilizamos a técnica de “patch-clamp” na modalidade “whole-cell”,
investigando o papel do cloreto intracelular na modulação deste evento, sua
sensibilidade farmacológica a diferentes bloqueadores de canais aniônicos, e a
sequência de seletividade destes canais, através da medida de potenciais biiônicos. As medidas de ATP liberado foram realizadas empregando o método
da reação com o sistema luciferina/luciferase. Nossos resultados demonstram
que a liberação de ATP pelas células, e a ativação da corrente aniônica ativada
por volume, estão defasadas em pelo menos 2 minutos. Além disso, a
presença de gadolínio bloqueou a liberação de ATP celular, mas não os canais
para cloreto ativados por volume.. Eletrofisiologicamente as correntes
demonstram forte retificação para fora e inativam em voltagens positivas, mas
estes processos dependem da concentração de cloreto intracelular. A
seqüência de permeabilidade foi: PCl- > PAsp- = PBr -; e são insensíveis à
Glibenclamida, Ácido Niflúmico, e NPPB. Tamoxifeno não modifica a liberação
de ATP, nem a corrente de cloreto ativada por volume na presença de baixo
cloreto intracelular. Porém, quando alta concentração de cloreto foi utilizada na
solução de pipeta, o efeito observado foi o aumento da corrente. As
características
biofísicas
e
farmacológicas
desse
canal
apresentam
semelhanças com o ClC-3. Concluímos que os ânions ATP e Cloreto permeiam
a membrana celular por caminhos diferentes, defasados no tempo e
farmacológicamente distintos.
8
Abstract
Anionic conductances are activated in all vertebrate cell types when submitted
to a hyposmotic challenge, resulting in a regulatory volume decrease. In this
study, we sought to identify such anionic conductances in GH3 cells and
determine their permeability to ATP. Using the patch-clamp technique in the
whole-cell mode, we tested the intracellular chloride regulatory role by loading
the cell with different chloride concentrations through the patch pipette. In
addition, we characterized the pharmacological sensitivity to known anion
channel blockers, and determined the and anionic selectivity sequence by
measuring bi-ionic reversal potential shifts. Bath ATP measurements were
performed in luminometer by using the firefly luciferin-luciferase system. Our
results showed a 2 minutes delay in anion current activation after ATP cell
release. Moreover, gadolinium completely blocked the cell ATP release, but not
the anionic currents activated by volume increase. Those currents were strongly
outward rectifing and inactivated at positive voltages in an intracellular chloridedependent manner, displayed the selectivity sequence PCl- > PAsp- = PBr -, and
also exhibited insensitivite to Glibenclamide, Niflumic acid, and NPPB.
Tamoxifen did not affect either cell ATP release and chloride currents measured
in presence of low Cl- pipette solution, but displayed the opposite effect on the
currents when high Cl- was used in the pipette solution. The pharmacological
and biophysical characteristics of this channel have similarities to the ClC-3. We
conclude that ATP and Cl- anions permeate the GH3 cell membrane by different
pathways with distinct time course and pharmacological profile.
9
1- Introdução
Os canais para cloreto são encontrados em todos os tipos de células
eucarióticas, tais como células de animais, de plantas e de protozoários, além
da presença em células procarióticas como bactérias. Eles constituem vias
condutivas de baixa seletividade, presentes nas membranas plasmáticas e de
organelas intracelulares, permeáveis a ânions como o iodeto, brometo, nitrato,
fosfato e aminoácidos carregados negativamente. A maioria dos canais
aniônicos são denominados canais para cloreto, por esse íon ser o ânion mais
abundante nos seres vivos.
Diferenças na concentração de cloreto através de membranas são
geradas por transporte ativo secundário, utilizando energia proveniente do
gradiente eletroquímico de sódio. As principais famílias de transportadores de
cloreto incluem o Na+-K+2Cl- (NKCC), Na+-Cl-(NCC), o K+-Cl- (KCC) e o
trocador aniônico Cl- -HCO3- (AE) (revisado por Nilius & Droogmans, 2003).
Em epitélios, a força motriz para o íon cloreto é regulada através da
expressão assimétrica das vias condutivas e dos transportadores nas
membranas apical e basolateral. Nos rins, por exemplo, a reabsorção de
cloreto é efetuada pelo transportador NKCC na membrana apical do ramo
ascendente da alça de Henle, e pelo canal para cloreto ativado por voltagem,
modulado pela subunidade Barttin (ClC-Kb) na membrana basolateral. No
intestino, ao contrário, a secreção de cloreto depende da entrada deste íon na
membrana basolateral, via transportador NKCC, e o efluxo do mesmo via canal
CFTR na membrana apical (revisado por Nilius & Droogmans, 2003).
Funcionalmente, esses canais desempenham papéis importantes em
diversos processos como na regulação da pressão sanguínea, diferenciação
celular e apoptose, tônus muscular, regulação de volume, regulação do pH em
organelas, eletrogênese, transmissão sináptica e excitabilidade celular. Os
canais para cloreto são cruciais para o transporte transepitelial e para o
controle do fluxo de água, além de freqüentemente fornecerem uma via de
permeação para uma variedade de ânions grandes. Conseqüentemente, esses
canais surgem como potenciais alvos farmacológicos para o tratamento de
muitas doenças (revisado por Nilius & Droogmans, 2003; Puljak & Kilie, 2006).
10
Segundo Jentsch et al., (2002), os inibidores importantes dos canais
para cloreto da membrana plasmática são: DPC, difenilaminocarboxilato;
NPPB, ácido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino)benzóico; FFA, ácido flufenamínico;
NFA,
ácido
indaniloxiacético;
niflúmico;
CPP,
9-AC,
ácido
antraceno-9-carboxilato;
2-(p-clorofenoxi)propiônico,
IAA,
ácido
Glibenclamida,
Suramina e Tamoxifeno, além dos íons metálicos zinco e cádmio.
Do ponto de vista funcional, os canais para cloreto têm sido classificados
de acordo com o seu mecanismo de ativação (revisado por Nilius &
Droogmans, 2003), os quais podem ser:
a) dependentes de mudanças no campo elétrico transmembrana (canais
para cloreto dependentes de voltagem, como a família ClC);
b) dependentes de ATP (por exemplo, regulador da condutância
transmembrana modificado na fibrose cística - CFTR);
c) dependentes do aumento da concentração do cálcio intracelular
(canais para cloreto ativados por cálcio, CaCC);
d) ativados por ligante (canais ativados por glicina ou γ-ácido
aminobutírico- GABA);
e) dependentes do aumento do volume celular (canais aniônicos
regulados por volume - VRAC ou canais mecano-sensíveis, que respondem ao
estiramento da membrana);
Desses, os canais para cloreto ativados pelo aumento do volume celular
são o objeto de nosso estudo. Eles apresentam o seguinte perfil biofísico:
corrente com moderada retificação para fora; inativação dependente de tempo
em potenciais altamente positivos; e seletividade aniônica com a seqüência de
permeabilidade: SCN- > I- > Br- > Cl- >> aspartato. São modulados por cascatas
de sinalização como através das proteínas quinases (PKA e PKC) e por
fosfatases serina-treonina.
Não existem bloqueadores específicos para esses canais e as
concentrações podem variar de acordo com o tipo celular estudado. Os
principais bloqueadores desses canais são Tamoxifeno, DIDS, SITS e NPPB,
sendo também inibidos por DPC, FFA, NFA, 9-AC, IAA-04, Glibenclamida e
DNDS (Jentsch et al, 2002, Nilius et al, 1996).
A estrutura molecular da proteína que forma o canal para cloreto
ativado pelo aumento do volume celular ainda não é conhecida, então a
11
caracterização farmacológica desta corrente é normalmente feita em células
nativas. Como os bloqueadores para esses canais podem afetar outras
moléculas, incluindo as envolvidas na transdução de sinal que leva a ativação
da corrente, é difícil estabelecer uma interação específica entre o bloqueador e
o canal. Além disso, correntes similares ativadas por volume podem ser
mediadas por canais iônicos distintos molecular e farmacologicamente (Puljak
& Kilie, 2006).
Diversas proteínas têm sido propostas na literatura como possíveis
proteínas formadora do canal, dentre elas, a proteína responsável pelo canal
para cloreto ativado por voltagem do tipo 3 (ClC-3). Por esse canal apresentar
características biofísicas e mecanismos de modulação semelhantes a dos
canais
VRACs.
Porém,
alguns
autores
discordam
dessa
hipótese,
argumentando que o ClC-3 apresenta uma seqüência de permeabilidade e
farmacologia distinta dos canais ativados por volume. Contudo, nos estudos
que apóiam a hipótese do ClC-3, os autores não excluem a possibilidade dos
VRACs serem heterodímeros ou possuírem uma subunidade reguladora.
Ainda existem muitas contradições na literatura e, portanto, a estrutura
molecular desses canais permanece desconhecida.
Não existem duvidas, entretanto, que esses canais têm uma função
importante na regulação do volume celular (Niemeyer et al, 2001; Nilius et al,
1996). Sendo essa uma função essencial que as células têm conservado ao
longo da evolução para manter o volume celular constante.
Mudanças no volume celular influenciam no metabolismo celular e a taxa
de transporte de substratos que é estritamente dependente da manutenção da
força eletroquímica e é influenciada pela concentração intracelular de íons;
proliferação celular e morte celular. Situações patológicas como danos no
tecido cerebral e apoptose são também dependentes do volume celular. Por
exemplo, em conseqüência de um trauma ou isquemia, a perda do controle do
volume seguida do aumento do volume da célula neuronal em uma estrutura
rígida como a coluna, demonstra que essa regulação fina do volume celular é
de grande importância não só para o bom funcionamento, como para a sua
sobrevivência (Jiao et al, 2006; Klatzo, 1987; Haussinger, 1996; Lang et al,
1998; Maeno et al, 2000; Pasantes-Morales et al, 2000).
12
Em condições isotônicas, as células tendem a inchar por conter
macromoléculas aniônicas impermeantes, a maioria proteínas e fosfatos
orgânicos, os quais criam uma pressão osmótica: o efeito Donnan. As células
contêm esse aumento do volume pela via de efluxo de osmólitos através da
bomba de Na+-K+ (Hoffmann & Simonsen, 1989). Em conseqüência de rápidas
alterações na tonicidade do meio intra ou extracelular, o fluxo passivo de água
causa o aumento ou a diminuição do volume celular. A manutenção do volume
constante
diante
de
perturbações
osmóticas
demanda
mecanismos
compensatórios que requerem respostas rápidas e de grande precisão para
manter a função celular (Inoue et al, 2005; Strange, 2004).
A maioria das células de mamíferos enfrenta mudanças da osmolaridade
intra e extracelular constantemente. Por exemplo, células do epitélio intestinal,
durante a absorção, são expostas a fluídos com diferentes osmolaridades no
lúmen, e células na medula renal passam por longos períodos expostas ao
meio com alta osmolaridade e mudanças rápidas na osmolaridade extracelular
(Lang et al, 1998). Mudanças nas concentrações intracelulares de osmólitos,
como conseqüência do transporte de substratos ou alterações da taxa
metabólicas também contribuem com mudanças no volume celular (Inoue et al,
2005; Gónczi et al, 2007). Por exemplo, hepatócitos mudam seu volume em
resposta ao aumento da quantidade de grandes aminoácidos e outros
nutrientes, e células epiteliais, envolvidas no transporte transepitelial, têm o
balanço de substratos diminuído. Além disso, a concentração de osmólitos
pode ser afetada por mudança na taxa metabólica como a quebra de glicogênio
em hepatócitos (Li & Weinman, 2002; MacLeod et al, 1992; Haussinger & Lang,
1991).
A célula retorna ao seu volume inicial pela ativação de canais ou
transportadores para perder ou ganhar osmólitos conforme o necessário,
principalmente K+, Cl- e osmólitos orgânicos. Desse modo, induz ao
direcionamento do fluxo de água de forma a restaurar o volume celular. Os
processos pelos quais células túrgidas ou murchas retornam ao seu volume
normal são denominados regulação por diminuição de volume (RVD, regulatory
volume decrease) e regulação por aumento de volume (RVI, regulatory volume
increase), respectivamente (Strange, 2004, Shennan et al, 2006).
13
Na maioria das células testadas, a ação coordenada dos canais para K+
e Cl- é o principal mecanismo para a RVD (Niemeyer et al, 2001). As células
inchadas aumentam a condutância para o íon Ca2+ (Nilius et al, 2003) e o
conseqüente aumento na taxa de Ca2+ intracelular é responsável pela ativação
de canais para K+ ativados por Ca2+ (Fernandez- Fernandez et al, 2002). Além
desses canais, as células com seu volume aumentado expressam diferentes
tipos de canais para K+ (Wehner, 1998; Niemeyer et al, 2001). Para manter a
neutralidade elétrica, o efluxo de K+ acontece em paralelo ao efluxo de Clmediado pelo canal para cloreto ativado pelo aumento do volume celular
(Jentsch et al, 2002; Sardini et al, 2003).
Íons inorgânicos constituem dois terços da liberação de osmólitos
durante a diminuição regulatória do volume celular, porém a operação mais
eficiente dos canais para cloreto ativados por volume no modelo hipotônico não
é suficiente para acompanhar uma eficiente regulação de volume, o que parece
requerer uma contribuição da via de osmólitos orgânicos (Cheema et al, 2007;
López- Domínguez et al, 2007).
Osmólitos
orgânicos
são
solutos
tipicamente
encontrados
em
concentrações de dezenas a centenas de milimolares no citosol de todos os
organismos, desde bactérias a humanos. Esses solutos desempenham um
papel importante na homeostase do volume celular e podem também ter
função citoprotetora. Em células animais, os osmólitos orgânicos são
agrupados em 3 classes: polióis (sorbitol e mioinositol), aminoácidos e seus
derivados
(taurina,
alanina
e
prolina)
e
metilaminas
(betaína
e
glicerofosforilcolina) (Strange, 2004).
Os VRACs fornecem, em muitos tipos celulares, uma via para o efluxo
de osmólitos orgânicos induzida pela hipotonicidade, como aminoácidos
(glicina, glutamato e aspartato).
Uma possível função para esses canais seria, portanto, servir como via
de liberação de moléculas orgânicas carregadas negativamente. Além dos
osmólitos orgânicos citados anteriormente, sabe-se que em resposta a
modificação hipotônica, ocorre a liberação ATP para o meio extracelular
(Roman & Fitz, 1999). Os mecanismos pelos quais estes nucleotídeos
atravessam a membrana para acessar o espaço extracelular não estão bem
estabelecidos (Bodas et al, 2000; Kimelberg et al, 2006; Okada et al, 2006).
Como os VRACs possuem um poro grande o suficiente para permitir a
passagem de molecular relativamente grandes quando comparada aos íons
inorgânicos, então é possível que sejam a via utilizada pelo ATP para sua
liberação. A estreita correlação entre os efeitos desses inibidores com a
distinção físico-química e propriedades estruturais dos VRACs e a liberação de
ATP sugere uma relação entre os dois processos (Hisadome et al, 2002;
Sakaguchi et al, 1997).
A diferença da cinética entre a liberação de ATP e efluxo aniônico,
ambos induzidos pela hipotônicidade, entretanto, argumentam contra a
condutividade do efluxo de ATP através dos canais para cloreto regulados por
volume. Outro argumento para essa hipótese é o fato da dependência da
liberação de ATP do cálcio intracelular e do citoesqueleto intacto, o que
sugerem o envolvimento de um processo exocitótico (Van Der Wijk et al, 1999).
Porém, para confirmar a hipótese de diferentes vias de liberação de ATP e
efluxo de íons ativadas pelo aumento do volume celular, podem-se utilizar
como ferramentas as características farmacológicas dessas duas vias.
Glibencamida, tamoxifeno, verapamil, fluoxetina e Gadolínio além de serem
bloqueadores de canais para cloreto ativados pelo aumento do volume celular,
também suprimem a liberação de ATP induzida pelo estresse hipotônico.
Uma vez em solução extracelular o ATP se liga a receptores específicos
de modo a regular a saída do íon cloreto através da modulação dos canais
VRACs. Em hepatócitos, uma de suas funções como molécula de sinalização
autócrina/parácrina é regular o seu volume celular. Porém, há componentes
nessa cascata de sinalização que ainda permanecem desconhecidos
(Feranchak et al, 2000; Van Der Wijk et al, 1999). Então, a modulação pelo
ATP das correntes de cloreto ativadas pelo aumento do volume celular e da
variação de volume celular aponta um importante papel deste na via dos canais
aniônicos ativados por volume através de sinalização intracelular e outros
mecanismos. Entretanto a relação entre ATP e a ativação desses canais
aniônicos é complexa (Kimelberg et al, 2006).
Além do mecanismo de modulação pelo ATP e de outros mecanismos
moduladores dos canais VRACs citados anteriormente, outro possível
mecanismo modulador desse canal seria através da mudança da concentração
iônica intracelular. O aumento de volume ocorre pelo fluxo de água para dentro
15
da célula, o que resulta também na modificação da concentração iônica
intracelular. Essa modificação pode, então, ter o papel de modular a atividade
desses canais, como já observado em alguns estudos (Cannon et al, 1998;
Ross et al, 1994; Doroshenko, 1999). Como os canais para cloreto apresentam
sítios de ocupação com carga positiva em seu interior, são, portanto, passíveis
de regulação por ligação aniônica. Como foi demonstrado em canais do tipo
CFTR, onde uma diminuição da concentração iônica de cloreto intracelular faz
com que o canal deixe de se comportar como retificador e, passe a se
apresentar como um resistor ôhmico, isto é, permite a passagem do íon em
ambos os sentidos (revisado por Nilius & Droogmans, 2003). Já em canais ClC2, a atividade intracelular de cloreto determina tanto modificações no processo
de ativação como na seqüência de seletividade aniônica (Niemeyer et al,
2003).
O efeito da concentração iônica intracelular na regulação de volume por
vias de transporte de íons e osmólitos orgânicos pode ter uma importante
implicação fisiológica. Mudanças na força iônica podem coordenar a atividade
de várias vias de transporte de regulação de volume (Emma et al, 1997;
Strange et al, 1996). O uso de osmólitos orgânicos para a diminuição do
volume celular poderia causar a elevação da concentração intracelular de íons
inorgânicos a níveis perigosos para a sobrevivência celular, pois estes podem
ativar enzimas e desencadear cascatas de sinalização, levando a alterações
indesejadas do metabolismo celular (Halows & Knauf, 1994). O mecanismo que
leva as células a monitorar o gradiente iônico e controlar a perda relativa de
osmólitos orgânicos e íons inorgânicos durante o processo de diminuição do
volume celular pode levar a regulações simultâneas do volume e da
concentração iônica intracelular (Cannon et al, 1998).
Os canais VRACs já foram identificados em diversos tipos celulares.
Kubo & Okada, 1992; Kimelberg et al, 2006; Li et al,
2000; Chen et al, 2004;
Yamazaki et al, 1998; Guan et al, 2006). As células de cultura GH3 são células
tumorais, originalmente derivadas de tumor de pituitária anterior de ratos. A
etiologia do tumor pituitário é pobremente entendida. Geralmente são benignos
e crescem lentamente, podendo ser tumores secretores de hormônios ou
tumores não funcionais. São células excitáveis e, quando em cultura
apresentam-se em monocamada, em formato arredondado, adequadas para os
16
experimentos eletrofisiológicos de patch clamp. Expressam canais para
potássio, cálcio (subtipo L e T) e canais para sódio (Lewis et al, 2002).
Estudo abordando modificações de volume em células GH3 submetidsa
a estresse hipotônico, sugere a participação dos canais para cálcio do tipo L
como sensores de estiramento, diante o bloqueio do aumento de cálcio
intracelular através da utilização de nifedipina e gadolínio (Chen et al, 1996).
Em experimentos prévios realizados em nosso laboratório (dados não
publicados) para verificarmos os possíveis tipos de canais para cloreto
encontrados nas células GH3, observamos que essas células expressam
canais para cloreto ativados por cálcio, porém não há estudos caracterizando
os canais VRACs nesse tipo celular, o que o torna um alvo interessante para o
estudo desses canais.
17
1.1- Justificativa
Como regra geral, a água está em equilíbrio termodinâmico através da
membrana plasmática, isto é, a tonicidade intra e extracelular são iguais.
Qualquer perturbação na tonicidade do meio induzirá o fluxo de água através
da membrana, restaurando rapidamente seu equilíbrio (Nilius et al, 1996;
Sardini et al,
2003). A maioria das células responde às modificações do
volume celular através da ativação de transportadores específicos e/ou
processos metabólicos capazes de fazer com que as células retornem ao seu
volume normal (Inoue et al, 2005; Gónczi et al, 2007). Estes processos são
essenciais para a função e sobrevivência celular e os canais ativados pelo
aumento do volume celular desempenham um papel importante nesse
processo (Nilius & Droogmans, 2003, Sardini et al, 2003). A descoberta de
mecanismos sensíveis ao volume e vias de sinalização representam o desafio
mais urgente e significante e é essencial para se entender totalmente como a
célula controla seu volume e os processos intracelulares relacionados (Strange,
2004).
Em trabalho realizado anteriormente em nosso laboratório (Scalzo,
2004), observamos a existência de canais para cloreto ativados por Ca2+, cujas
correntes surgiam quando a célula era estimulada com forscolina por 24 horas.
Nesta condição, a célula se diferenciava, com grande aumento de volume
celular, e a correlação corrente-voltagem, medida com 140 mM de cloreto na
solução de pipeta, assemelhava-se à corrente ativada por volume. O
conhecimento de que o aumento de volume celular pode causar liberação de
ATP celular, com implicações sobre a ativação de canais para cloreto, e que a
própria concentração intracelular de cloreto pode modular os canais VRACs
levou-nos, neste trabalho, a caracterizar os canais para cloreto ativados pelo
aumento do volume celular em células GH3, verificar o efeito da liberação de
ATP sobre a ativação das correntes dependentes de volume, e analisar o papel
da concentração intracelular de cloreto na regulação dessas correntes.
18
2- Objetivo Geral:
Caracterizar os canais sensíveis à variação do volume celular em células
GH3.
2.1- Objetivos específicos:
•
Estudar a modulação desses canais pela modificação da
concentração intracelular de cloreto.
•
Identificar eletrofisiologicamente os canais sensíveis à variação
do volume celular, pela determinação de sua seqüência de
permeabilidade e pelo estudo farmacológico desses canais.
•
Medir a quantidade de ATP liberada pelas células durante o
choque hipotônico e correlacionar essa liberação com a atividade
dos canais ativados pelo aumento do volume celular.
3- Materiais e métodos
3.1- Cultura celular
As células GH3 (ATCC - The American Type Culture Collection),
cultivadas em garrafas de 25cm2 estéreis (TTP, Europe/ Switzerland) foram
mantidas à temperatura de 37oC, em atmosfera com 5% de gás carbônico, em
meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – Sigma) suplementado
com 10% v/v de soro fetal bovino (inativado, estéril, isento de mycoplasma –
Cultilab, Campinas, SP) e 1% v/v de antibiótico (Solução de Penicilina 10,000
I.U./ml e Estreptomicina 10,000 µg/ml – Sigma, EUA). O meio de cultura foi
trocado 2 a 3 vezes, semanalmente.
Quando a cultura celular atingia uma confluência estimada de 80%, as
células eram desprendidas pela substituição de 2ml do meio por 1 ml de
solução 1 mM de EDTA, 1 mM de HEPES e 0,9% p/v de NaCl (Sigma) pH 7,4
(NaOH). Cerca de 20% das células eram transferidas para garrafas novas com
o intuito de permitir a continuidade da multiplicação celular. Com o seqüestro
de cálcio causado pela substituição do meio de cultura pela solução contendo
19
EDTA, HEPES e NaCl, as células se desprendiam da parede da garrafa e com
o auxílio de uma pipeta de transferência eram dissociadas mecanicamente
umas das outras. Após 3 minutos, eram adicionados 2 ml de meio, e 200 μL da
suspensão de células eram colocados sobre lamínulas de vidro para
microscopia (22 x 22 mm) contidas em placas de Petri (10 x 40 mm),
esperando-se 3 a 5 minutos para a fixação das células, completando-se, então,
o volume de meio para 2 ml. O manejo da cultura celular foi feito sempre em
capela de fluxo laminar, em ambiente estéril e utilizando materiais previamente
esterilizados.
3.2- Eletrofisiologia
Para a medida das correntes de cloreto ativadas por aumento de
volume, submetemos estas células a estresse hipotônico. As correntes
aniônicas foram medidas através da técnica de patch-clamp, na configuração
whole-cell (Hamil, et al,1981). em temperatura ambiente (20–25 oC). Utilizamos
uma mesa antivibratória projetada pelo Laboratório de Eletrofisiologia Celular e
construída pela serralheria do Instituto de Ciência Biológicas, com visualização
em microscópio invertido Olympus CK-2 (10 x 40), e movimentação da
micropipeta através de dois sistemas de micromanipulação independentes: um
mecânico (Axon Instruments, EUA) e outro piezoelétrico, Newport M-42 (Irvine,
CA, EUA) com controle remoto triaxial PCS-201 (Burleigh Instruments Inc.,
Fishers, NY, EUA). As correntes foram registradas através de um amplificador
Axopatch
200B
(Axon
Instruments,
EUA),
ligado
a
um
conversor
analógico/digital Digidata 1200 (Axon Instruments, EUA), gerenciado pelo
aplicativo pClamp7 (Axon Instruments, CA, USA). A freqüência de amostragem
dos dados foi de 10 KHz, aplicando-se filtro de 1KHz. O circuito elétrico foi
fechado por hemi-células de Ag/AgCl.
Pipetas (com resistência entre 2,5 e 3,5 MΩ) foram fabricadas a partir de
capilares de vidro (tubo microhematócrito de vidro, PERFECTA) usando um
estirador vertical de pipetas de dois estágios (PP 830 Narishige, Tokyo, Japan).
Para a medida das correntes, um selo de alta resistência, com valores acima
de 1GΩ, chamado de giga-selo, era formado entre a membrana celular e a
parede da pipeta, aplicando-se uma pequena pressão negativa (Hamil et al,
20
1981). Posteriormente, uma sucção adicional permitia a ruptura da membrana
celular, ocorrendo a difusão da solução da pipeta para dentro da célula e a
obtenção da configuração whole- cell.
A solução de banho Isotônica era composta por (mM): 100 NMDG, 3
CsCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 100 Manitol, 10 HEPES; osmolaridade de 310 mOsm.
As soluções hipotônicas eram preparadas sem a adição de manitol, com
osmolaridade de 210 mOsm. O pH 7,4 é ajustado com solução estoque de HCl
(10M). Antes de começar o experimento de patch clamp (descrito acima), era
adicionada às soluções de banho 1g/L de glicose. Inicialmente, as células
foram expostas à solução isotônica. Após o selo e o rompimento da membrana
celular, as células foram submetidas às alterações no potencial de membrana,
realizando a substituição da solução isotônica pela solução hipotônica. As
correntes foram registradas com a solução isotônica e após o choque
hipotônico.
3.3- Modificação da concentração intracelular de cloreto:
Para verificar a modulação dos canais VRACs pela modificação da
concentração interna de cloreto, soluções de pipeta com concentrações
diferentes de cloreto foram adotadas. As seguintes soluções de pipeta foram
utilizadas:
•
Alto cloreto intracelular (CsCl, 140 mM; ATP, 2 mM; HEPES, 10
mM; MgCl2, 1 mM; EGTA, 1 mM); pH 7,2 (CsOH) e 296 mOsm.
•
Baixo cloreto intracelular (CsOH, 100 mM; Aspartato, 100 mM;
CsCl, 40 mM; ATP, 2 mM; HEPES, 10 mM; MgCl2, 1 mM; EGTA,
1 mM); pH 7,2 (CsOH) e 296 mOsm.
3.4- Bloqueio Farmacológico
Infelizmente ainda não existem bloqueadores seletivos para canais
aniônicos, sendo que as doses utilizadas na literatura podem variar até 3
ordens de grandeza para um mesmo canal. Após a observação da ativação da
corrente ativada pelo aumento do volume celular, a solução de banho
hipotônica era trocada por uma solução de banho hipotônica contendo o agente
21
farmacológico estudado. Para o bloqueio farmacológico, foram utilizados os
seguintes agentes: Tamoxifeno, 100µM; Gadolínio, 10 µM; NPPB, 100 µM;
Glibenclamida, 100 µM e Ácido Niflúmico, 500 µM e 1 mM. Essas
concentrações foram baseadas nos valores médios dos dados apresentados
por Jentsch et al. (2002), com exceção do Gadolínio que foi baseado no
trabalho de Brodeault & Grygorczyk, (2002) .
3.5- Seqüência de Seletividade
A seletividade foi determinada através da medida de potenciais biiônicos, partindo-se de uma condição simétrica, tomando-se o ânion cloreto
como referencial, com o potencial de reversão igual a zero, para outra em que
esse ânion era substituído, na solução de banho, por quantidades equimolares
do Ânion X-. A permeabilidade relativa (Px/PCl) foi obtida de acordo com a
equação de Goldman-Hodgkin-Katz:
(2)
Onde : [Cl1-] é a concentração de cloreto no banho na condição simétrica; [Cl2-]
é a concentração de cloreto no banho na condição assimétrica; [X2-] é a
concentração do ânion X, que substitui em quantidade equimolar o cloreto; R é
a constante ideal dos gases (0,082 atm.l.mol-1.K-1); T é a temperatura absoluta;
F é a constante de Faraday; ∆E é a modificação medida no potencial de
reversão da corrente; e z é a valência do íon.
3.6- Medida da liberação de ATP
O ATP na solução de banho foi determinado por luminescência,
empregando o método da reação com o sistema luciferina/luciferase, descrita
por Santos et al. (2003), de acordo com o seguinte procedimento:
1- As medidas foram feitas com células expostas a solução de banho
Isotônica, Hipotônica, Hipotônica + Gadolínio (Gd3+) e Hipotônica +
Tamoxifeno. As concentrações dos bloqueadores foram as mesmas utilizadas
22
nos experimentos eletrofisiológicos. Cada grupo foi composto de 5 garrafas de
25 cm2 de área, contendo células em cultura com 80% de confluência.
2- O meio de cultura foi retirado e as garrafas lavadas com 5 ml da solução
a qual serão expostas. Após a lavagem, foram adicionados 2ml de solução de
banho e, imediatamente (30 segundos após a lavagem) colhida três amostras
de 50 μl de cada garrafa para a medida do ATP.
3- Às alíquotas de 50 μl das amostras do banho adiciona-se a 50 μl da
mistura de medida do ATP (Sigma, contendo luciferase 0,0033 mg; luciferina
0,0083 mg; MgSO4 0,06 mg; EDTA 0,02 mg; ditiotreitol 0,0008 mg; albumina
bovina sérica 0,05 mg; Tricina 0,45 mg; diluídos em água milli-q)
4- Essas enzimas reagem com o ATP do banho emitindo luz. A luz é
captada por um aparelho denominado luminômetro (BioOrbit 1250) por 15
segundos. A intensidade de luz é proporcional a quantidade de ATP do banho.
Os valores obtidos, em mV, são convertidos para nmol por interpolação em
uma curva de calibração, preparada com concentrações de ATP entre 10-9 e
10-12 M).
5- Outras amostras foram colhidas nos tempos um e cinco, dez, quinze e
trinta minutos.
Após a medida do ATP, determinamos o número e a viabilidade celular,
pelo método de exclusão do corante Azul de Trypan em câmara de Neubauer,
de acordo com o seguinte protocolo:
1- Suspender as células em 200 µl de solução
2- Observar ao microscópio, em placa fechada, a presença de células.
3- Procedimento de Viabilidade (Azul de Trypan)
- Preparar a suspensão de células (1ml de meio +1ml EDTA)
-Diluir uma pequena amostra da suspensão de células 1:1 em 0,4% p/v
de Azul de Trypan
4- Preencher a câmara de Neubauer com a diluição.
5- Usar aumento de 100x no microscópio, contar 5 quadrantes.
6- Determinar o número de células por ml e o total do número de células
usando a fórmula:
Células/ml= número de células contadas x 104 x fator de diluição
número de quadrantes contados
(1)
23
Para compararmos a quantidade de ATP liberada em cada garrafa, o
valor total de ATP liberado foi corrigido para 10.000 células.
3.7- Análise estatística
Os resultados foram analisados empregando-se o programa Clampfit
(Axon Intruments, CA, USA). A corrente bruta obtida na vigência da solução
hipotônica era então subtraída da corrente obtida em solução isotônica
(corrente basal). A análise das correntes brutas foi feita nos 30 ms finais
quando não apresentavam inativação e no pico quando inativaram com o
tempo. O teste estatístico utilizado foi ANOVA do programa Prism. (Graphpad,
USA), com nível de significância P < 0,05.
4- Resultados
4.1- Registros Eletrofisiológicos
Os registros em células GH3 foram realizados através da técnica de
fixação de voltagem (patch clamp), na configuração whole-cell. As células
escolhidas para os registros apresentavam-se isoladas e com morfologia
arredondada. O protocolo consiste em uma seqüência de despolarizações
partindo do Potencial de Holding (potencial mantido pelo equipamento) de –60
mV, sendo o primeiro pulso despolarizante de –20mV, aumentando de 20 em
20 mV até que o último pulso seja de +120mV. De modo que se possa
observar o potencial de ativação e a inativação dessas correntes. Cada pulso
tem a duração de 200ms.
O primeiro registro foi realizado na presença de solução isotônica no
banho e, logo após, a solução de banho era trocada por outra, hipotônica.
Nesta condição, o segundo registro era realizado no tempo entre o primeiro e
segundo minutos seguintes. Os demais registros eram feitos a cada minuto, até
observarmos a ativação da corrente pelo aumento do volume celular. O tempo
decorrido para a ativação da corrente variou de célula para célula, porém o
tempo mínimo observado para a ativação dessas correntes foi acima de 2
24
minutos (dados não mostrados) como já visto em outros tipos celulares (Duan
et al,1997; Gong et al, 2004; Li et al, 2000).
No intuito de testarmos se a modificação da concentração de cloreto
intracelular altera a correlação corrente-voltagem destes canais, também
realizamos medidas em baixas concentrações deste ânion na solução de
pipeta. De fato, a diminuição do cloreto intracelular modificou a correlação
corrente-voltagem, mas para valores mais positivos. Além disso, nesta
condição, não observamos a inativação por tempo que se instala na condição
de alto cloreto (figuras 1 e 2).
Na análise do processo de ativação por voltagem, a condutância
normalizada foi ajustada pela equação de Boltzmann, obtendo-se valores
significativamente diferentes para V50 de 30,7 ± 1,86 mV (n = 12) e 54,8 ± 1,49
mV (n = 7), mas não para a inclinação, 11,8 ± 1,78 (n = 12) e 14,2 ± 1,31 (n =
7), nas condições de alta e baixa concentração de cloreto na pipeta,
respectivamente (figura 3). Estes resultados demonstram que a diminuição na
concentração do cloreto modifica a dependência de voltagem do processo de
ativação do canal, para valores mais positivos.
25
A
500 pA
50 ms
B
Figura 1- Corrente bruta de células com Alto (142 mM) Cloreto IntracelularRegistro representativo das correntes brutas obtidas em solução Isotônica (A) e
em solução Hipotônica (B). Solução de pipeta de alto cloreto (142 mM de Cl-).
No topo, figura representativa do protocolo utilizado.
26
A
500 pA
B
50 ms
Figura 2- Corrente bruta de células com Baixo (42 mM) Cloreto Intracelular
Registro representativo das correntes brutas obtidas em solução Isotônica (A) e
em solução Hipotônica (B). Solução de pipeta de baixo cloreto (42 mM de Cl-).
27
Baixo Cl
Alto Cl
1.0
G/Gmax
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-50
0
50
100
Vm
Figura 3- Curva de ativação estacionária dos canais para cloreto ativados
pelo aumento do volume celular. A condutância normalizada foi ajustada
pela equação de Boltzmann, obtendo-se valores significativamente diferentes
para V50 de 30,7 ± 1,86 mV (n = 12) e 54,8 ± 1,49 mV (n = 7), mas não para a
inclinação, 11,8 ± 1,78 (n = 12) e 14,2 ± 1,31 (n = 7), nas condições de alta e
baixa concentração de cloreto na pipeta, respectivamente.
28
Para adicionar outro elemento à caracterização biofísica deste canal,
determinamos a sua seqüência de seletividade iônica, através da medida da
permeabilidade relativa de diferentes ânions, empregando o método da medida
do potencial biiônico. Os ânions brometo e aspartato foram utilizados como
substitutos do cloreto na solução de banho. Após a ativação da corrente
dependente de volume, em condições simétricas para o íon cloreto, a solução
de banho era substituída por outra contendo aspartato ou brometo. O protocolo
foi adaptado para a análise da corrente após o pré-pulso positivo : No topo da
figura 5 mostramos o protocolo utilizado: potencial de Holding em -60mV,
primeiro pulso em +80mV por 100ms de modo que os canais fossem ativados;
segundo pulso começando em -30mV aumentando de 15 em 15mV até +30mV
para que pudéssemos verificar a mudança no potencial de reversão; sendo a
análise das correntes feita após 4ms do término do primeiro pulso (Kenyon,
2000). Os valores calculados para os potenciais de reversão foram: 11,0 mV
(95% IC de 0,067 a 16,1) para o íon cloreto, 24,7 mV (95% IC de 19,53 a
31,27) para o aspartato, e 38,3 mV (95% IC de 25.31 a 65.29) para o íon
brometo. Os potenciais de reversão foram corrigidos pelo potencial de junção
calculado para cada íon através do programa Clampfit. Estes valores serviram
para o cálculo da permeabilidade relativa, empregando-se a equação 2,
resultando na seguinte seqüência de seletividade: PCl- > PAsp- = PBr- (figura 5).
A
caracterização
farmacológica
é
uma
ferramenta
auxiliar
na
identificação dos canais aniônicos. Como os bloqueadores destes canais
apresentam pouca especificidade, utilizamos algumas substâncias descritas na
literatura como bloqueadoras de canais ativados por volume ou estiramento.
Após a ativação dessas correntes, a solução era trocada novamente por outra
solução hipotônica contendo o suposto bloqueador.
Apesar da baixa concentração de cloreto ser a mais próxima da
concentração fisiológica intracelular, optamos por fazer esses experimentos
com solução de pipeta de alto cloreto. Desse modo, necessitamos de menores
despolarizações para a ativação dos canais VRACs e diminui o risco de perder
o selo durante o registro (figura 1). A análise das correntes foi feita sem a
correção pelo potencial de junção, já que não influencia nos resultados. Os
bloqueadores Gadolínio 10 µM (n = 3), Glibencamida 100 µM (n = 8) e Ácido
29
Niflúmico 500 µM (n = 3) e 1 mM (n = 2) não tiveram efeito no bloqueio dessas
correntes (figuras 6, 7 e 8, respectivamente).
Com o NPPB observamos que havia uma redução da corrente. Nos
registros brutos são observadas tanto a corrente ativada por volume quanto a
basal, com correlação I-V semelhantes. Portanto, a fim de nos certificarmos em
qual das correntes o bloqueador estava agindo, o bloqueador foi utilizado na
condição isotônica. O resultado observado indica que o NPPB inibe a corrente
basal de maneira dependente da sua concentração (figuras 9 e 10). A partir
destes resultados, utilizamos concentrações crescentes acima daquela efetiva
sobre a corrente basal (10 µM), até a concentração máxima de 100 µM,
sugerida por Jentsch et al. (2002) e não observamos qualquer efeito sobre as
correntes ativada por volume (figura 11).
30
A
1000
800
600
IN 0
(mV)
400
200
0
-200
-400
B
0
100
Time (ms)
200
Sweep:1 Visible:5 of 5
1000
IN 0
(mV)
500
0
-500
0
100
Time (ms)
200
Sweep:1 Visible:5 of 5
Figura 4- Registro representativo das correntes brutas após o pré-pulso
positivo. A- solução Isotônica; B- solução Hipotônica. Solução de pipeta de
alto cloreto (142 mM de Cl- ). No topo figura representativa do protocolo
utilizado.
31
pA
-50
-25
4
3
2
1
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
Cloreto
Cloreto
Aspartato
Aspartato
brometo
Brometo
25
mV
50
Figura 5- Seqüência de Permeabilidade. Relações I-V obtidas pela medida de
potenciais biiônicos. Os valores calculados para os potenciais de reversão
foram: 11,0 mV (95% IC de 0,067 a 16,1) para o íon cloreto, 24,7 mV (95% IC
de 19,53 a 31,27) para o aspartato, e 38,3 mV (95% IC de 25,31 a 65,29) para
o íon brometo.
32
12.5
CONTROLE
GADOLINIO
10.0
pA/pF
7.5
5.0
2.5
-50
50
-2.5
100
150
200
mV
Figura 6 – Efeito do Gadolínio nas correntes VRACs -I x V da corrente
ativada por volume na ausência (controle) e na presença de gadolínio (10 µM).
Solução de pipeta com alto cloreto (142 mM de Cl-). Não houve diferença
significativa entre as correntes.
33
12
CONTROLE
GLIBENCLAMIDA
10
pA/pF
8
6
4
2
-50
-2
50
100
150
200
mV
Figura 7- Efeito da Glibenclamida nas correntes VRACs- I x V da corrente
ativada por volume na ausência (controle) e na presença de glibenclamida
(100 µM). Solução de pipeta com alto cloreto (142 mM de Cl-). Não houve
diferença significativa entre as correntes.
34
15
CONTROLE
AC NIFLÚMICO 500 µM
pA/pF
10
5
-50
50
100
150
200
mV
-5
15
CONTROLE
AC NIFLÚMICO 1mM
pA/pF
10
5
-50
50
-5
100
150
200
mV
Figura 8- Efeito do Ácido Niflúmico nas correntes VRACs- I x V da corrente
ativada por volume na ausência (controle) e na presença de Ácido Niflúmico na
concentração de 500 µM (acima) e 1 mM (abaixo). Não houve diferença
significativa entre as correntes na análise estatística em 500 µM e 1 mM.
Solução de pipeta com alto cloreto (142 mM de Cl-).
35
9
CONTROLE
NPPB 5 μM
7
5
pA
pA/pF
3
1
-50
-1
50
100
150
200
mV
9
CONTROLE
NPPB 10μM
7
pA
5
pA/pF
3
1
-50
-1
50
100
150
200
mV
9
CONTROLE
NPPB 30μM
7
pA
5
pA/pF
3
1
-50
-1
50
100
150
200
mV
Figura 9- Efeito do NPPB nas correntes basais- I x V da corrente ativada por
voltagem na ausência (controle) e na presença de NPPB na concentração de 5
µM (n = 4), 10 µM (n = 7) e 30 µM (n = 4) Solução de pipeta com alto cloreto
(142 mM de Cl- ).
36
1.25
I/Imáx
1.00
0.75
0.50
0.25
controle 5 μM
10 μM
30 μM
40 μM
Figura 10- Diminuição da corrente em resposta ao NPPB- Corrente de
cloreto basal na voltagem 100 mV. Solução de pipeta com alto cloreto (142 mM
de Cl- ).
37
20
HIPO-CONTROLE
HIPO+NPPB 10uM
pA/pF
15
10
5
-50
50
100
150
200
mV
-5
20
CONTROLE-HIPO
HIPO+NPPB 80uM
pA/pF
15
10
5
-50
50
100
150
200
mV
-5
30
HIPO CONTROLE
HIPO+NPPB 100uM
25
pA/pF
20
15
10
5
-50
-5
50
100
150
200
mV
Figura 11- Efeito do NPPB nas correntes ativadas por volume- I x V da
corrente ativada por volume na ausência (controle) e na presença de NPPB na
concentração de 10 µM (n = 4), 80 µM (n = 3) e 100 µM (n = 8). Solução de
pipeta com alto cloreto (142 mM de Cl- ).
38
De todas as substâncias testadas, a que mais nos surpreendeu foi o
tamoxifeno que, quando adicionado à solução hipotônica, causou aumento nas
correntes ativadas por volume (figura 12). Outro fato que nos chamou a
atenção foram os valores da corrente controle, um pouco menores que as
registradas em experimentos anteriores. Como dito anteriormente, estes
experimentos foram realizados na presença de alta concentração de cloreto na
solução de pipeta e, pode determinar alguma inativação por tempo nestes
canais. Portanto, resolvemos testá-lo também em células com baixo cloreto
intracelular e, neste grupo, o tamoxifeno, não demonstrou efeito sobre as
correntes (figura 13).
39
30
CONTROLE
TAMOXIFENO
TAMOX
IFEN
*
25
pA/pF
20
15
*
10
*
5
-50
-5
50
100
150
200
mV
Figura 12- Efeito do Tamoxifeno nas correntes ativadas por volume na
presença de Alto Cloreto intracelular- I x V da corrente ativada por volume
na ausência (controle) e na presença de Tamoxifeno (100 µM). Solução de
pipeta com Alto cloreto (n = 13).
40
25
CONTROLE
TAMOXIFEN
TAMOXIFENO
20
pA/pF
15
10
5
-50
50
-5
100
150
200
mV
Figura 13- Efeito do Tamoxifeno nas correntes ativadas por volume na
presença de Baixo Cloreto intracelular- I x V da corrente ativada por volume
na ausência (controle) e na presença de Tamoxifeno (100 µM). Solução de
pipeta com Baixo cloreto (n = 5).
41
4.2- Medida de liberação de ATP.
A via de liberação do ATP, ativada pelo aumento do volume celular
ainda não foi definida. Existem estudos que apontam para uma via secretória,
porém outros sugerem os VRACs como mecanismo de liberação de ATP. Para
testar essa última hipótese, nosso primeiro passo foi verificar a liberação de
ATP após o choque hipotônico. Utilizando método de medida da luminescência,
observamos que há um aumento na concentração de ATP no banho sendo que
o pico da liberação ocorre no primeiro minuto após a exposição das células à
solução hipotônica (figura 1). Após o pico, a quantidade de ATP diminui
gradualmente, e retorna aos níveis basais em 5 minutos, provavelmente devido
a presença de ecto-ATPases. O Tamoxifeno, um anti-estrogênico não
esteroidal, bloqueia canais para cloreto ativados por aumento de volume e por
estiramento
mecânico
das
membranas
celulares
de
cardiomiócitos
(Baumgarten & Clemo, 2003). Já o cátion gadolínio (Gd3+) é descrito como
bloqueador inespecífico de canais ativados por estiramento e por aumento de
volume (Kubo & Okada, 1992; Van Der Wijk et al, 1999). Outra característica
desta substância é bloquear a liberação de ATP de células submetidas ao
estresse hipotônico.
Nossos resultados demonstram que, nas células GH3, a
liberação de ATP é bloqueada pelo Gadolínio, mas não pelo Tamoxifeno. Estes
resultados sugerem que a liberação do ATP intracelular é um evento transiente,
e que ocorre logo nos primeiros instantes do choque hipotônico.
Com esses resultados, notamos que a liberação de ATP intracelular
antecipa-se à ativação dos canais para cloreto. Vale notar que já na primeira
medida, aos 30 segundos, o grupo exposto a solução hipotônica contendo
tamoxifeno apresenta diferença significativa em relação ao controle, mas não
em relação ao grupo hipotônico.
42
ATP (nmol/104 células)
Hipotônica + Tamoxifeno
**
0.6
§§
Hipotônica
Hipotônica + Gadolínio
0.5
Isotônica
0.4
**
0.3
***
##
#
0.2
0.1
0.0
0
1
2
3
4
5
6
Tempo (min)
Figura 14- Medida da liberação de ATP. Quantidade de ATP liberado em
função do tempo em células expostas à solução isotônica em preto, hipotônica
em vermelho, hipotônica + tamoxifeno 100 µM em azul e hipotônica + gadolínio
10 µM em verde. ** P<0,01 e *** P<0,001 em relação ao grupo controle.
P<0,05 e
##
P<0,01 em relação ao grupo hipotônico + Gd3+.
relação ao grupo hipotônico.
§§
#
P<0,01 em
43
5- Discussão
A caracterização biofísica e farmacológica dos canais para cloreto
ativados pelo aumento do volume celular foi realizada empregando-se a técnica
de patch clamp. As correntes de cloreto carreadas por esses canais
apresentaram retificação para fora e inativação dependente de tempo em
potenciais altamente positivos, quando utilizamos alta concentração de cloreto
na solução de pipeta. Devemos considerar que estes canais estejam
localizados em organelas citoplasmáticas que possuem potenciais de
membranas positivos, tais como mitocôndrias, retículo endoplasmático e
lipossomas (Alberts et al, 1994). Os canais aniônicos permitem que o cloreto
atue como íon acompanhante sempre que há geração ou dissipação de
gradientes catiônicos através de membranas, sejam de organelas intracelulares
ou não. São os ânions permeantes, por exemplo, que garantem a eficiência da
H+-ATPase e, portanto, contribuem no estabelecimento de gradientes de pH,
essenciais no processo de acidificação de vesículas (Jentsch et al, 2002). Os
VRACs são também permeáveis ao lactato e bicarbonato e, portanto,
participam da regulação do equilíbrio ácido-base (Nilius & Droogmans, 2003).
O canal ClC-3, que apresenta-se como um forte candidato pela formação do
canal VRAC, é encontrado nas membranas de organelas intracelulares e as
suas funções biológicas precisas dos canais para cloreto na fisiologia de
diferentes organelas ainda são pouco entendidas. Então, esse canal pode ter
um papel importante na regulação do volume dessas organelas e, quando
inseridos na membrana plasmática, em condições fisiológicas, ficariam inativos
(Greenwood, 2004; Puljak & Kilie, 2006).
Os canais VRACs apresentam múltiplas vias de modulação. Como o
aumento do volume celular ocorre devido ao fluxo de água para meio
intracelular, a modificação do gradiente iônico intracelular é uma provável via
de modulação desses canais. Em experimentos com diferentes concentrações
de cloreto na pipeta, observamos que a atividade do canal é modulada pela
concentração de cloreto intracelular. Em altas concentrações (142 mM), há
uma diminuição do V50 em relação às baixas concentrações (42 mM) de cloreto
intracelular (figura 3). Isto é, para células com alto cloreto, potenciais com
valores menos positivos são necessários para que a célula atinja 50% da
44
condutância máxima. Esses dados também foram observados em outros
estudos (Cannon et al, 1998; Ross et al, 1994; Doroshenko, 1999) mostrando
que a concentração iônica é responsável por mudanças na taxa de ativação
dos VRACs. Um possível mecanismo pelo qual ocorre essa modulação é pela
interação do ânion com as paredes internas do canal, nas quais se encontram
aminoácidos com carga positiva.
Além do seu papel na regulação da ativação, foi observado em nosso
estudo que a mudança da concentração de cloreto intracelular parece
influenciar o processo de inativação dos canais VRACs (figura 2). O canal não
demonstra inativação com o tempo em potenciais muito positivos quando há
uma baixa concentração de cloreto intracelular, enquanto a maioria dos canais
com alto cloreto intracelular apresenta uma corrente que inativa com o tempo.
Porém a modificação do gradiente iônico não parece ser o único responsável
por este efeito já que em células da mesma linhagem, sob as mesmas
condições (na presença de alta concentração de cloreto intracelular), pode
ocorrer inativação com o tempo ou não. O fato é que ainda não conhecemos a
maneira pela qual as células regulam o seu ponto de ajuste para a inativação
destas correntes. Prova disto, é que Browe e Baumgarten (2006), em estudos
com cardiomiócitos, observaram nestas correntes uma forte inativação com o
tempo, mesmo utilizando a concentração de cloreto no meio intracelular de
20,2 mM. Conforme observamos, o processo de instalação da corrente
acontece antes do de inativação. Assim, não descartamos a hipótese da
existência de dois tipos de canais, nem a possibilidade de associação entre
isoformas determinando o surgimento de novas propriedades funcionais.
Poucos trabalhos discutem a modificação ocorrida na inativação em relação ao
tempo apresentado por essas correntes. Nestes trabalhos, os autores sugerem
uma modulação da inativação dos canais VRACs pela modificação do pH ou
pela presença de cátions na solução (Ackerman et al, 1994; Anderson et al,
1995;
Nilius et al, 1996). Porém, em nosso estudo, essa diferença na
inativação foi observada em células sob as mesmas condições experimentais.
Outra diferença que gostaríamos de salientar é em relação a corrente de
saída. Em nosso estudo, a corrente apresenta uma forte retificação e não são
observadas correntes em potenciais de 0 e -20 mV (figura 1). Característica
semelhante foi observada apenas em estudos com cardiomiócitos (Browe &
45
Baumgarten, 2006; Gong et al, 2004). Nos outros, há correntes de entrada
ativadas pelo aumento de volume celular mesmo em potenciais negativos.
Essas correntes podem ser muito grandes como as vistas em neurônios
corticais (Kubo & Okada, 1992), astrócitos (Kimelberg et al, 2006), células CHO
(Li et al, 2000) e colangiócitos (Chen et al, 2004), ou pequenas como as vistas
em células de músculo liso (Yamazaki et al, 1998; Guan et al, 2006).
Para a caracterização dos canais das células GH3 foram realizados
experimentos
para
determinar
a
sua
seqüência
de
permeabilidade.
Observamos neste estudo, que ela difere da descrita para esta família de
canais para cloreto ativados pelo aumento do volume celular (Nilius et al,1996;
Roman et al, 1999; Yamazaki et al, 1998; Guan et al, 2006; Feranchak et al,
2000), mas assemelha-se à seqüência encontrada para a família de canais
ativados por voltagem. Vários estudos sugerem os canais ClC-3 da família de
canais ativados por voltagem como possível identidade molecular dos canais
VRACs, baseados na expressão funcional da proteína clonada (Baumgarten &
Clemo, 2003; Duan et al, 1997; Gong et al, 2004; Greenwood, 2004; Zhou et
al, 2005). A expressão heteróloga causou a ativação de correntes com
características biofísicas semelhantes as correntes ativadas por volume,
incluindo a retificação para fora, a seletividade aniônica I- > Cl- > aspartato,
inativação
em
potenciais
positivos,
inibição
pela
hipertonicidade,
por
nucleotídeos extracelulares e por tamoxifeno, além de também apresentarem
regulação pela PKC e pelas fostatases serina/treonina (Zhou et al, 2005, Duan
et al, 1997). Porém, Li et al (2000), verificaram que as correntes dos canais
ClC-3 apresentam tanto a seqüência de permeabilidade como a farmacologia,
distintas das correntes dos canais VRACs. Além disso, Jentsch et al (2002),
argumentam, que o ClC-3 é normalmente localizado em membranas
intracelulares e que a expressão do ClC-3 não necessariamente leva a
observação das correntes ativadas pelo aumento do volume na célula. Por
isso, a base molecular dos canais VRACs continua desconhecida (Baumgarten
& Clemo, 2003). Entretanto, os autores de alguns estudos não excluem a
possibilidade desse canal ser um heterodímero composto pelo ClC-3 e mais
uma outra subunidade (Sardini et al, 2003 Duan et al, 1997). Os dados
encontrados no nosso trabalho, portanto, aproximam-se desta hipótese.
46
Outra característica das correntes ativadas pelo aumento do volume
celular observadas foi o efeito dos inibidores clássicos dos canais VRACs.
Neste estudo, a Glibenclamida, o Gadolínio, o Ácido Niflúmico e o NPPB, não
foram capazes de bloquear o canal para cloreto ativado pelo aumento do
volume celular. É possível que o fato de não termos observado o bloqueio
destas correntes em nosso experimento seja pela concentração do bloqueador
utilizada, pois os efeitos dos bloqueadores de canais para cloreto nas correntes
VRACs são heterogêneas, e as concentrações, dependendo do tipo celular,
variam desde 1μM a 1mM (Nilius et al, 1997). Além disto, como estamos
comparando com outros tipos celulares, a resposta pode ser diferente pela
diferença na expressão do canal na membrana celular e das vias de
modulação presentes em cada tipo de célula (Feranchak et al, 2000; Roman et
al, 1999; Inoue et al, 2005; Nilius et al,1995; kubo & Okada, 1992; Sakaguchi
et al, 1997; Sabirov et al, 2001). Essas respostas heterogêneas sugerem uma
família
de
canais
VRACs
com
diferentes
propriedades
biofísicas
e
farmacológicas (Hisadome et al, 2002).
O Tamoxifeno bloqueia os canais para cloreto de muitos, mas não todos,
tipos celulares (Okada, 1997; Voets et al, 1997). Enquanto em astrócitos as
correntes são bloqueadas por concentrações de 10 μM, em células BC3H1 e
C2Cl1, o tamoxifeno não foi capaz de inibir as mesmas correntes em
concentrações acima de 100 μM (Kimelberg et al, 2006; Voets et al, 1997). Em
nossos estudos, porém, na presença do Tamoxifeno a corrente VRAC
aumentou na vigência de alto cloreto intracelular (figura 12). Como esse
aumento não foi observado em células com baixa concentração de cloreto
intracelular (figura 13), pode haver uma interação entre essas duas vias
moduladoras desse canal.
Além disso, a presença do Tamoxifeno na solução de banho hipotônica,
aumentou a liberação de ATP pela células GH3 em relação às células expostas
a solução sem o bloqueador, no tempo de 30 segundos (figura 14). Esta foi a
única correlação entre as correntes ativadas por volume e a liberação de ATP
ao longo de nosso estudo, no entanto, os dados permanecem inconclusivos.
Ainda persiste a dúvida se o ATP é liberado através de vesículas
secretórias ou através de canais iônicos. Vários autores propõem os canais
ativados por volume ou o CFTR como via condutiva de ATP. No entanto, as
47
evidências mais fortes associam esta propriedade aos canais dependentes de
volume, pois esta liberação é bloqueada por gadolínio (Roman et al, 1999), um
bloqueador inespecífico de canais, tanto catiônicos como aniônicos, ativados
pelo estiramento da membrana celular.
Nossos resultados demonstram que as células GH3 liberam ATP quando
submetidas ao estresse hipotônico, de modo transiente, já no primeiro minuto
de exposição. Utilizamos dois bloqueadores que atuam em canais ativados por
estiramento ou aumento de volume celular: o Gadolínio e o Tamoxifeno.
Corroborando trabalhos anteriores, o gadolínio bloqueou totalmente a liberação
de ATP para o banho (figura 14), sendo, portanto, uma evidência da mediação
dos canais ativados por aumento do volume celular neste processo. Apesar da
inespecificidade deste elemento, e seus efeitos sobre a liberação de ATP,
serem diferentes em cada tecido (Nilius et al, 1997), em célula GH3, esse
bloqueador foi uma ferramenta importante já que inibiu a liberação de ATP,
mas não a corrente ativada pelo aumento do volume celular. No entanto, o
Tamoxifeno mostrou-se desprovido de efeito bloqueador, com níveis
aumentados de ATP em relação ao grupo controle, já na amostra colhida aos
30 segundos após o estresse hipotônico.
O grupo hipotônico só se mostrou maior que o controle nas amostras
obtidas em 1minuto. Em nosso experimento verificamos que a ativação das
correntes ocorreu após 2 minutos de exposição à solução hipotônica, o que já
foi verificado em outros tipos celulares (Duan et al, 1997; Gong et al, 2004; Li et
al, 2000) demonstramos aqui que e estes eventos acontecem por vias distintas.
48
6- Conclusões
Neste trabalho, demonstramos que as células GH3 expressam
funcionalmente canais para cloreto ativados pelo aumento do volume celular e,
além disto, liberam ATP para o banho em resposta ao choque hipotônico. De
acordo com as características biofísicas e farmacológicas estudadas podemos
concluir que:
1. Na vigência do choque hipotônico, os ânions ATP e cloreto permeiam
a membrana celular por vias distintas.
2. Nesta mesma condição, o tamoxifeno aumenta a liberação de ATP
em células intactas.
3. As características eletrofisiológicas dos canais ativados por aumento
de volume assemelham-se às do ClC-3.
4. Esses canais mostraram-se insensíveis aos bloqueadores utilizados.
49
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