Protocolo de Extração de RNA a partir de Sangue Total
As colunas QIAamp representam uma tecnologia de preparação de RNA total que
combina propriedades de ligação seletiva de membrana baseada em sílica com a velocidade e
conveniência da tecnologia do microspin. O sistema de tampões baseados em altas
concentrações de sal captura RNAs com tamanhos superiores a 200 bases e propicia a ligação
dos mesmos à membrana QIAamp.
O máximo de amostra que pode ser processada por membrana QIAamp é o de 1,5 mL
de sangue total de adultos saudáveis (tipicamente com 4000 – 7000 leucócitos por microlitro –
ou 6,0x106 – 1,05x107 leucócitos em 1,5 mL de sangue). Se mais leucócitos forem
processados por coluna, eles podem vir a não ser completamente lisados e os contaminantes
celulares podem não ser completamente removidos, se o volume do tampão RLT não for
aumentado.
Antes de começar a extração, é preciso checar alguns detalhes:
 O tampão RPE vem concentrado. Antes do primeiro uso, deve-se adicionar 04
volumes de etanol (96-100%) para se obter a solução de trabalho.
 O tampão RLT pode precipitar durante a estocagem. Se necessário, aqueça para
redissolver.
 -Mercaptoetanol (-ME) deve ser adicionado ao tampão RLT antes do uso. Adicione
10 µL de -ME por 1mL de tampão RLT. O tampão RLT é estável por um mês a
temperatura ambiente (15-25ºC) após a adição de -ME.
PROTOCOLO
1) Centrifugue o tubo de coleta contendo 4 mL de sangue a 1000 rpms por 08 minutos,
com a finalidade de separar as fases do sangue. Retirar todo o soro/plasma e recolher
500 L de “buffy coat”. Transferir 250 L para dois tubos eppendorf de 02 mL.
2) Adicione 05 volumes do tampão EL para cada volume de sangue (para 250 L de
sangue: 1,250 mL de tampão EL). Para aperfeiçoar os resultados, o volume de mistura
(sangue + tampão EL), não deve ultrapassar ¾ do volume do tubo para uma mistura
eficiente.
3) Incubar o tubo eppendorf de 20-30 minutos no gelo. Durante a incubação, agitar
(utilizando vórtex) pelo menos 02 vezes. A solução deixa de ficar turva durante a
incubação, indicando a lise dos eritrócitos.
4) Centrifugue a 400 rpms por 10 minutos a 4ºC e remova o sobrenadante
completamente. Os leucócitos irão formar um pellet após a centrifugação. Assegure-se
de que o sobrenadante foi completamente removido, Pequenas quantidades de
eritrócitos podem deixar o pellet com aparência avermelhada, o que deve ser eliminado
no passo seguinte: lavagem.
5) Adicione tampão EL ao pellet celular (use 02 volumes de tampão EL por volume de
sangue usado no passo 01 – usar 500 L para cada 250 L de sangue utilizado).
Ressuspenda as células por agitação momentânea (utilizando o vórtex) e junte o
conteúdo dos dois tubos.
6) Centrifugue a 400 rpms por 10 minutos a 4ºC. Remova completamente o
sobrenadante. Uma retirada incompleta do sobrenadante pode interferir com a lise e
com a subseqüente ligação do RNA a coluna QIAamp, resultando em um baixo
rendimento.
7) Adicione o tampão RLT ao pellet de leucócitos, de acordo com a tabela abaixo. Agite
(utilizando vórtex) o pellet. Quando não se é usado sangue de pacientes saudáveis, é
necessário determinar o número de leucócitos para determinar o volume de tampão
RLT. O tampão RLT rompe as células. A solução não deve ficar turva após a
homogeneização. A homogeneização deve ser feita com o auxílio de uma pipeta,
desfazendo todo e qualquer grumo ou turbidez.
8) Pipete o lisado celular diretamente em uma coluna QIAshredder, previamente acoplada
a um tubo de 02 mL (provido pelo kit) e centrifugue na velocidade máxima da
centrífuga, por 02 minutos, à temperatura ambiente, para homogeneizar o sistema.
Descarte a coluna QIAshredder e guarde o lisado homogeneizado (coletado no tubo de
02 mL). Para evitar a formação de aerossóis, ajuste a micropipeta para um volume
maior ou igual a 750 µL para assegurar que o lisado será adicionado na coluna
QIAshredder em um único passo. Se uma quantidade demasiada de células for
utilizada, o lisado ficará muito viscoso para pipetar.
9) Adicione um volume (600 µL) de etanol 70% para homogeneizar o lisado, misturando
com auxílio da pipeta. Não centrifugue. Um precipitado pode ser formado após a
adição do etanol. Isto não irá afetar o procedimento em questão.
10) Pipete a amostra cuidadosamente, incluindo qualquer precipitado que possa vir a ser
formado, em uma coluna QIAamp, previamente acoplada a um tubo de 02 mL
(provido pelo kit), sem o umedecimento da borda. Centrifugue o conjunto por 15
segundos em uma velocidade igual ou superior a 10.000 rpms. O volume máximo
desta coluna é de 700 µL. Caso este volume seja ultrapassado, o volume residual deve
ser adicionado na coluna logo após a primeira centrifugação. Descarte o líquido que
passar pela coluna juntamente com o tubo de 02 mL.
11) Transfira a coluna QIAamp para um novo tubo de 02 mL (provido pelo kit). Aplique
700 µL do tampão RW1 na coluna QIAamp e centrifugue por 15 segundos em uma
velocidade igual ou superior a 10.000 rpms para lavar. Descarte o líquido que passar
pela coluna juntamente com o tubo de 02 mL.
12) Transfira a coluna QIAamp para um novo tubo de 02 mL (provido pelo kit). Pipete
500 µL do tampão RPE para a coluna QIAamp e centrifugue por 15 segundos a uma
velocidade igual ou superior a 10.000 rpms. Descarte o líquido que passar pela coluna
juntamente com o tubo de 02 mL. Assegure-se que o etanol tenha sido adicionado ao
tampão RPE.
13) Abra cuidadosamente a coluna QIAamp e adicione 500 µL do tampão RPE. Feche a
tampa e centrifugue na velocidade máxima da centrífuga por 03 minutos.
14) Transfira a coluna QIAamp para um novo tubo de 02 mL (provido pelo kit) e descarte
o antigo. Centrifugue na máxima velocidade por 01 minuto. Este passo ajuda a
eliminar a chance de uma possível contaminação com tampão RPE.
15) Transfira a coluna QIAamp para um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga (provido pelo
kit) e pipete 30-50 µL de água RNAse Free (provida pelo kit) diretamente na coluna
QIAamp. Centrifugue a 10.000 rpms por 1 minuto para eluir o RNA da coluna. Repita
o processo se a quantidade de sangue inicial for maior que 0,5 mL.