Laboratório de Pesquisas em Cromatografia Líquida
AGROTÓXICOS: TÉCNICA DE PREPARO DE
AMOSTRAS, DETERMINAÇÃO E ESTUDO
DE CASO DA ÁREA DE RECARGA DO
AQUÍFERO GUARANI
Profa. Dra. Isabel Cristina Sales Fontes Jardim
AGROTÓXICOS
BENEFÍCIOS
• Produção de alimentos de qualidade
• Atender à demanda crescente por alimentos
MALEFÍCIOS
• Contaminação do meio ambiente e
dos alimentos
• Efeitos adversos à saúde dos
consumidores e dos produtores rurais
Toxicidade dos Agrotóxicos
- Cancerígenos
- Mutagênicos
- Mimetizadores de hormônios
- Teratogênicos
Origem da Contaminação do Solo e do
Ambiente Aquático pelos Agrotóxicos
Aplicação direta ou mobilização a partir de seu uso na agricultura
Precipitação
Pulverização
Aplicação no solo ou
na plantação
Transporte de vapor e de poeira
Lavagem de materiais usados na
aplicação
Escoamento
fotólise
Efluentes
industriais
volatilização
Solo
biodegradação
decomposição
química ou física
agrotóxico
adsorvido
agrotóxico
dessorvido
Lixiviação
Água subterrânea
dissolvido
associado ao
sedimento
biodegradação
decomposição
química ou
física
Água
Superfi
cial
Esgotos
municipais
Etapas da determinação de multirresíduos
Amostragem
Preparo da amostra
Extração do analito da matriz
Eliminação de interferentes (clean-up)
Concentração dos analitos
Separação, identificação e determinação dos analitos
Técnicas cromatográficas
Validação do método
MATRIZ
estado físico
(sólido, líquido
ou gasoso)
tamanho da
amostra
conteúdo
de matéria
orgânica
conteúdo de
gordura,
pigmentos,
proteínas,
etc.
pH
ANALITO
propriedades
físicas
propriedades
químicas
massa molar
carga
polaridade
volatilidade
pKa
propriedades
que permitam a
detecção
absorção UV-vis
fluorescência
eletroatividade
concentração
CARACTERÍSTICAS DESEJADAS DO
MÉTODO DE PREPARO DE AMOSTRA
número
mínimo
de etapas
seletivo
alta
eficiência
alto fator
de
concentração
detecção de
concentrações
mais baixas
análise de
traços e
ultra traços
consumo
mínimo de
solventes e
reagentes
química
verde
reduz
erros
rápido
automação e
baixo custo da
instrumentação
EXTRAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM SOLO
• Extração por Soxhlet
Técnicas convencionais • Agitação Mecânica
• Banho Ultrassônico
• Extração por fluido
supercrítico
• Líquido pressurizado ou
acelerada por solvente
• Assistida por micromicro-ondas
• QuEChERS (Quick, Easy,
Cheap, Effective, Rugged and
Safe)
Técnicas alternativas
Extração por Agitação Mecânica
Extração por Banho Ultrassônico
• Promovem contato efetivo entre o
solvente e a matriz da amostra
durante a extração
• Podem ser feita à temperatura
ambiente, o que permite a análise de
compostos termolábeis
• Possibilidade de realizar mais de 20
extrações simultaneamente
• Fácil acesso e baixo custo dos
equipamentos
• Podem consumir muito tempo
• Uso de solventes orgânicos
Extração por Fluido Supercrítico
Fluidos supercrítico:
• elevado poder de solvatação
• elevada difusivilidade
CO2 solvente mais utilizado em SFE. É considerado “solvente verde”
por não trazer problemas ao meio ambiente.
VANTAGENS:
• baixa toxicidade
• facilidade de ser produzido e purificado
• condições relativamente brandas para atingir o estado crítico (Tc=
43 oC e P = 73 bar)
DESVANTAGEM:
• baixa polaridade, o que dificulta a extração de solutos de média
polaridade e polares.
Extração por Fluido Supercrítico
• A extração com fluido supercrítico é amplamente empregada nas áreas de
alimentos, combustíveis, saúde e meio ambiente.
• VANTAGEM → facilidade com a qual pode ser acoplada em linha com as
técnicas cromatográficas (GC, HPLC, CE).
• DESVANTAGEM → elevado custo dos equipamentos disponíveis
comercialmente.
Extração por Líquido Pressurizado ou
Acelerada por Solvente
• Cartuchos similares aos utilizados em extração em fase sólida.
• Solvente ou mistura de solventes em estado líquido sob pressão
e temperatura relativamente altas.
• Acetona, metanol ou mistura de água e metanol como solventes
extratores (volumes baixos)
• Sistema automatizado (possibilidade de realizar mais de 20
extrações simultaneamente)
Extração Assistida Por MicroMicro-ondas
Aquecimento de amostras, que contenham analitos dipolares, pela
incidência de radiação micro-ondas, que aquece a amostra de dentro
para fora, de forma rápida e uniforme.
Recomendada pela Agência de Proteção ao Meio Ambiente dos Estados
Unidos (USEPA) para análise de amostras sólidas.
• Vantagens
– Aumento da velocidade de extração
– Extração de múltiplas amostras, inclusive analitos
termicamente instáveis
– Redução no consumo de solventes
– Uso de micro-ondas caseiro
• Desvantagens
– Dificuldade de automação
– Cuidado quanto à segurança ao usar o micro-ondas caseiro.
QuEChERS
(“quick, easy, cheap, effective, rugged and safe”)
•
Minimiza as etapas de preparo das amostras: 2 etapas
– partição com acetonitrila, utilizando uma mistura de sais (MgSO4, NaCl e tampão citrato)
– limpeza do extrato por EFS dispersiva, utilizando um sorvente composto por aminas primárias e
secundárias (PSA)
• MgSO4 – remove o excesso de água
• PSA – remove açúcares, ácidos graxos, ácidos orgânicos e pigmentos
• NaCl – ajuste da força iônica
• tampão citrato – ajuste do pH ~ 5
MODIFICADO
*acetato de etila ou acetona
*C18 – remove interferentes não polares
*Carbono – remove pigmentos esteróides e interferentes apolares
•
Capaz de extrair agrotóxicos:
– altamente polares
– de elevada acidez ou basicidade
•
Utiliza pequenas quantidades de solvente
•
Relativamente mais rápido e robusto
TÉCNICAS DE DETERMINAÇÃO DE
AGROTÓXICOS
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) e
Cromatografia
Líquida
de
Ultra
Eficiência
(UPLC):
determinação de compostos não voláteis, termicamente
instáveis e de alta polaridade.
• Detectores:
- Arranjo de diodos (DAD)
- Espectrômetro de massas (MS):
- LC-MS/MS: técnica recomendada por agências reguladoras
ESTUDO DE CASO
Desenvolvimento e Validação de Métodos para a
Determinação de Agrotóxicos em Solo das Áreas
de Recarga do Aquífero Guarani, na Região das
Nascentes do Rio Araguaia, GO/MT
• Desenvolvimento e validação de métodos para determinação dos
agrotóxicos imazetapir, nicossulfurom, imazaquim, carbofuram,
atrazina, linurom, clorimurom-etil e diflubenzurom em solo utilizando
HPLC-DAD e a LC-ESI-MS/MS.
• Determinação dos agrotóxicos em amostras de solo das áreas de
recarga do Aquífero Guarani, situadas na divisa entre MT e GO.
Mapa Esquemático do
Aquífero Guarani
Águas Subterrâneas no Brasil
MT
Abastecem: • 61% da população
• 80% SP, MA e PI
Sistema Aquífero Guarani
Local estudado
(Áreas de recarga do
Aquífero Guarani,
nascentes do Rio
Araguaia)
GO
MG
MS
SP
• 45 % do volume total.
• Apresenta diversos pontos de recarga ou
afloramento.
PR
• Exibe alta vulnerabilidade à
contaminação por agrotóxicos decorrente
de atividades agrícolas.
• Avaliação do nível de contaminação.
SC
RS
• Avaliação da sorção no solo.
• Foco principal deste trabalho.
Áreas de afloramento
Áreas de confinamento
O Cultivo de Soja e Milho na Região Centro-Oeste do
Brasil e Situação Atual do Sistema Aquífero Guarani na
Região das Nascentes do Rio Araguaia
• Aumento no cultivo de grãos (soja e milho) na região que compreende os
estados de Goiás, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul
• Cultivo de lavouras na região: 100 % de aumento entre 1995 a 2006
• Região Centro-Oeste: 2a maior produtora de grãos
• Mato-Grosso: maior produtor nacional de grãos (2009)
• Alto consumo e utilização indiscriminada de agrotóxicos
• Região abriga uma área considerável de recarga do Aquífero Guarani, situada
nas nascentes do Rio Araguaia.
• Solo: Neossolo quartzarênico (arenosos, com baixos teores de matéria
orgânica e de minerais) → favorecem a lixiviação dos agrotóxicos para as
águas subterrâneas.
Procedimentos de Extração e Determinação dos
Agrotóxicos em Solo
• Extração por agitação mecânica (MEC), extração por banho
ultrassônico (BUS) e extração assistida por micro-ondas caseiro (MIC).
• Variáveis otimizadas: solventes, pH da solução aquosa, tempo de extração
e potência do micro-ondas.
Condições Otimizadas
Variáveis
MEC/HPLCDAD
BUS/HPLCDAD
MIC/HPLCDAD
MIC/LC-ESIMS/MS
Acetato de
etila (mL)
10
5
10
10
Água, pH 2,5
(mL)
1
2
1
1
Acetona (mL)
---
5
---
---
Tempo (min)
120
60
2
2
Potência (W)
---
---
200
200
Validação dos Métodos de Determinação
dos Agrotóxicos em Solo
Seletividade análise de pureza dos picos e comparação entre
Seletividade:
cromatogramas de brancos da matriz e de brancos da matriz
fortificados.
Limites de Detecção e de Quantificação do Instrumento (LDI e
LQI)): concentração dos analitos que resultou em um sinal igual a 3 e 10
LQI
vezes o ruído da linha de base, respectivamente.
Limite de Quantificação do Método (LQM)
(LQM): a menor concentração
dos analitos na amostra que produziu um sinal igual ao LQI após os
procedimentos de extração.
Curva Analítica:
Analítica seis pontos com valores de concentrações em função
do LQM.
Validação dos Métodos de Determinação
dos Agrotóxicos em Solo
Linearidade determinada através da regressão linear das curvas e
Linearidade:
avaliada através dos gráficos de resíduos.
Exatidão determinada através da porcentagem de agrotóxicos
Exatidão:
recuperada (R) em três níveis de fortificação: 1x, 2x e 10x, o LQM.
Precisão::
Precisão
a) Repetitividade:
Repetitividade determinada em um mesmo dia, com três séries de
três replicatas dos níveis de concentração (1x, 2x e 10x, o LQM).
b) Precisão Intermediária
Intermediária: determinada em três dias diferentes, com
três replicatas dos níveis de concentração (1x, 2x e 10x, o LQM).
Validação dos Métodos de Determinação dos
Agrotóxicos em Solo Empregando HPLCHPLC-DAD
Seletividade
Brancos do solo
Brancos do solo fortificados
BUS/HPLC-DAD
(3)
(2)
(4) (5)
Resposta do detector
Resposta do detector
(3)
(6)
(7) (8)
(1)
0
5
10
15
t (min)
20
25
30
(2)
(6)
(4)
(5)
(7)
(1)
0
5
10
MIC/HPLC-DAD
15
t (min)
20
Resposta do detector
MEC/HPLC-DAD
(8)
25
30
(3)
(1)
0
5
(2)
10
(8)
(4)(5) (6)
(7)
15
20
25
30
t (min)
Agrotóxicos: (1) Imazetapir, (2) Nicossulfurom, (3) Imazaquim, (4) Carbofuram, (5) Atrazina, (6)
Linurom, (7) Clorimurom-etil, (8) Diflubenzurom. Condições cromatográficas: coluna analítica de
150 x 3,9 mm e coluna de guarda de 2,0 x 3,9 mm, C18, 4 µm, NovaPak, Waters. Vazão: 0,8 mL
min-1, eluição por gradiente com FM acetonitrila:H2O pH=3 (H3PO4) ; volume de injeção: 10 µL;
detecção: UV, 220 nm.
Limites de Detecção e de Quantificação do
Instrumento (LDI e LQI) e do Método (LDM e LQM)
Determinação dos agrotóxicos em solo empregando MEC, USB e
MIC/HPLC--DAD
MIC/HPLC
Agrotóxico
LDI
(ng mL-1)
LQI
(ng mL-1)
LDM
(ng g-1)
LQM
(ng g-1)
Conc. d.a.
(ng g-1)
Imazetapir
57
200
5,7
20
31
Nicossulfurom
35
100
3,5
10
16,1
Imazaquim
12
36
1,2
3,6
41
Carbofuram
35
150
3,5
15
438
Atrazina
6
30
0,6
3
659
Linurom
8
40
0,8
4
322
Clorimurom
38
100
3,8
10
15
Diflubenzurom
41
100
4,1
10
13,2
• Extrações: 5 g → 500 µL
(fator de concentração = 10)
• LQM < Concentração da dose de aplicação (d.a.)
Curvas Analíticas e Linearidade
Determinação dos agrotóxicos em solo empregando MEC, USB e
MIC/HPLC--DAD
MIC/HPLC
Curva Analítica
Intervalo de
Linearidade
Agrotóxico
a
b
r
(ng mL-1)
(intercepto) (inclinação)
Imazetapir
-569
24,7
0,9992
160 - 2400
243
18,9
0,9993
80 - 1200
Imazaquim
-732
83
0,9997
28 - 420
Carbofuram
-878
23,4
0,9996
120 - 1800
Atrazina
-504
101
0,9997
24 - 360
Linurom
-160
49,7
0,9993
32 - 480
Clorimurom
-719
32,1
0,9997
80 - 1200
Diflubenzurom
-172
28
0,9997
80 - 1200
Nicossulfurom
• r > 0,999 = < a dispersão do conjunto de pontos experimentais e
< a incerteza dos coeficientes de regressão estimados.
• ANVISA = r > 0,99.
• Gráficos de resíduos não apresentaram tendência ou padrão.
Exatidão (Recuperação) e Precisão
(repetitividade e intermediária)
• Recuperação na faixa aceitável de 70 a 120 % com as
três técnicas de extração. Recuperações obtidas em um
mesmo dia variaram na faixa de 76 a 112 % e as obtidas
em dias diferentes variaram de 77 a 111 %.
• Com apenas 2 min de extração assistida por micro-ondas
caseiro foram obtidas recuperações de 83 a 112 %.
• Precisão (repetitividade) para os três tipos de extração, os
valores de CV (0,2 - 10,2 %) ficaram abaixo do limite
recomendado de 15 %.
• Precisão (intermediária)os valores de CV variaram de 0,3
a 11,7 %, mostrando-se adequados.
Validação do Método de Determinação dos
Agrotóxicos em Solo Empregando MIC/LC
MIC/LC--ESI
ESI--MS/MS
1) NICO
411,3>182,2 ES+
5) ATRAZ
216,2>174,2 ES+
2) IMZA
312,4>199,2 ES+
6) CLOR
415,2>186,2 ES+
3) IMZE
289,3>177,2 ES+
7) LINU
249,1>160,2 ES+
4) CARBO
222,3>122,8 ES+
8) DIFLU
309,3>156,1 ES-
Cromatogramas obtidos para o branco do solo fortificado com os agrotóxicos após a extração por MIC,
empregando LC-ESI-MS/MS. Condições cromatográficas: coluna analítica de 150 x 3,9 mm e coluna de
guarda de 2,0 x 3,9 mm, C18, 4 µm, Waters. Vazão: 0,7 mL min-1, eluição por gradiente com FM
acetonitrila:H2O, 1 % de ácido acético; volume de injeção: 10 µL.
Limites de Detecção e de Quantificação do
Instrumento (LDI e LQI) e do Método (LDM e LQM)
Determinação dos agrotóxicos em solo empregando MIC/LCMIC/LC-ESI
ESI--MS/MS
LDI (ng mL-1)
LQI (ng mL-1)
LDM (ng mL-1)
LQM (ng mL-1)
3
10
0,3
1
Extrações: 5 g → 500 µL
(fator de concentração = 10)
Curvas Analíticas e Linearidade
Curva Analítica
a (intercepto)
b (inclinação)
r
Intervalo de
Linearidade
(ng mL-1)
Nicossulfurom
10,78
11,8
0,9995
5 - 120
Imazaquim
6,76
10,3
0,9998
5 - 120
Imazetapir
-0,28
2,05
0,9996
5 - 120
Carbofuram
-5,44
7,94
0,9998
5 - 120
Atrazina
-13,5
31,95
0,9995
5 - 120
Clorimurom
-3,39
9,6
0,9998
5 - 120
Linurom
-4,78
5,85
0,9998
5 - 120
Diflubenzurom
-1,18
5,98
0,9997
5 - 120
Agrotóxico
Exatidão, Precisão em termos de Repetitividade e
Precisão Intermediária
a
b
MEC/
HPLC-DAD
USB/
HPLC-DAD
MIC/
HPLC-DAD
MIC/
LC-ESIMS/MS
Recuperação a (%)
76 - 112
82 - 111
83 - 112
81 - 110
Recuperação b (%)
77 - 107
82 - 111
86 - 111
83 - 108
Repetitividade CV
(%)
0,3 - 9,9
1,5 - 10,2
0,2 - 5
1 - 10,7
Precisão
intermediária CV
(%)
1,2 - 11,7
0,4 - 8,1
0,3 - 4,9
1,2 - 12,1
Intervalos das recuperações obtidas em um mesmo dia
Intervalos das recuperações obtidas em três dias diferentes
SANCO: 70 < R < 120 %
AOAC International: CV < 15 %
Aplicação do Método Validado
• Locais das coletas de solo.
Fazenda
Município
Chitolina
Mineiros/GO
Levi
Goiânia/GO
Tipo
Latitude Longitude
de
Cultura
17.89.083 53.11.917
Soja e
Milho
16.67.888 49.25.388
Resultado: nenhum dos agrotóxicos estudado foi detectado
Métodos de Determinação dos Agrotóxicos em
Solo Empregando MEC, BUS e MIC/HPLCMIC/HPLC-DAD e
MIC/LC--ESIMIC/LC
ESI-MS/MS
• A validação dos métodos empregando as três técnicas de
extração resultou em valores aceitáveis na literatura.
• MIC/LC-ESI-MS/MS: resultou em LQM menores.
• Extração assistida por micro-ondas: rápida (2 min), simples e
o equipamento empregado é de baixo custo e de fácil acesso.
• Alternativa às outras técnicas de extração, as quais
consumiram no mínimo uma hora de extração.
AGRADECIMENTOS
À comissão organizadora do 4o Seminário sobre
contaminantes em alimentos
Ao grupo de pesquisa, em particular a doutoranda
Laís Sayuri Ribeiro de Morais que desenvolveu o
presente trabalho
À DEUS
À todos pela atenção