CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES
CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS DE Eugenia arenosa
MATTOS (MYRTACEAE) FRENTE A Escherichia coli
CAMILA ERTHAL
Lajeado, julho de 2012
BDU – Biblioteca Digital da UNIVATES (http://www.univates.br/bdu)
Camila Erthal
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS DE Eugenia arenosa
MATTOS (MYRTACEAE) FRENTE A Escherichia coli
Trabalho de Conclusão do Curso de Farmácia
apresentado na disciplina de Estágio
Supervisionado III, como exigência parcial
para a obtenção do título de Bacharel em
Farmácia.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Miranda Ethur
Lajeado, julho de 2012
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RESUMO
O Brasil possui uma rica biodiversidade, permitindo assim vários estudos
científicos através do conhecimento popular. O intuito desse trabalho foi obter dados
sobre uma espécie pouco conhecida Eugenia arenosa pertencente a família da
Myrtaceae. Neste trabalho, foi realizada a atividade antimicrobiana, do extrato
aquoso e etanólico, e o screening fitoquimico das folhas, da espécie nativa do RS,
Eugenia arenosa. Através do screening fitoquímico foram detectadas a presença de
flavonoides e taninos. Tanto o extrato aquoso como etanólico inibiram o crescimento
da Escherichia coli em uma CIM de 1250 µg/mL, apresentando desta foram
atividade bacteriostática.
Palavras-chave: Eugenia arenosa. Extratos vegetais. Atividade antimicrobiana.
Escherichia coli.
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Foto da espécie vegetal Eugenia arenosa coletada em Manoel Viana. 11
FIGURA 2 – Foto de uma colônia de E. coli. ............................................................. 12
FIGURA 3 - Foto dos extratos aquoso e etanólico de Eugenia arenosa, na diluição
de trabalho. ............................................................................................................... 20
FIGURA 4 - Placa de 96 poços utilizada para o ensaio de Concentração Inibitória
Mínima. ..................................................................................................................... 22
FIGURA 5 - Resultado da Concentração Bactericida Mínima para Escherichia coli. 27
FIGURA 6 – Resultado do teste para taninos do extrato aquoso de E. arenosa. A
esquerda, o resultado do tubo A; resultado do tubo B ,resultado tubo C indicando a
presença dos metabólitos.......................................................................................... 28
FIGURA 7 – Resultado do teste para flavonoides do extrato aquoso de E. arenosa. A
esquerda, o branco; e a direita a solução alaranjada indicando a presença dos
metabólitos. ............................................................................................................... 29
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Principais agentes causadores de diarreia infecciosa (MARQUES,
2008). ........................................................................................................................ 14
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SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 6
2
OBJETIVO ........................................................................................................... 8
3
4
2.1
Objetivo geral ................................................................................................. 8
2.2
Objetivo específico ......................................................................................... 8
REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................... 9
3.1
Eugenia arenosa .......................................................................................... 10
3.2
Escherichia coli ............................................................................................ 11
3.3
Screening fitoquímico ................................................................................... 16
MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 18
4.1
Materiais vegetais ........................................................................................ 18
4.2
Preparo dos extratos .................................................................................... 18
4.2.1
Extrato aquoso....................................................................................... 18
4.2.2
Extrato etanólico .................................................................................... 19
4.3
Micro-organismo .......................................................................................... 19
4.4
Diluição dos extratos .................................................................................... 19
4.5
Fármaco utilizado como referência antimicrobiana ...................................... 20
4.6
Controle diluente .......................................................................................... 21
4.7
Atividade antimicrobiana .............................................................................. 21
4.7.1
Determinação da concentração mínima inibitória pelo método de
microdiluição. ..................................................................................................... 21
4.7.2
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4.8
5
Screening fitoquímico ................................................................................... 24
4.8.1
Taninos .................................................................................................. 24
4.8.2
Flavonóides ........................................................................................... 24
4.8.3
Alcalóides .............................................................................................. 25
RESULTADO E DISCUSSÃO ............................................................................ 26
5.1
6
Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) ................. 23
Screening fitoquímico ................................................................................... 27
5.1.1
Taninos .................................................................................................. 28
5.1.2
Flavonoides ........................................................................................... 29
CONCLUSÃO .................................................................................................... 30
PERSPECTIVAS PARA NOVOS TRABALHOS ........................................................ 31
BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................... 32
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1 INTRODUÇÃO
O Brasil apresenta uma ampla diversidade ecológica, com uma das floras
mais
ricas do
mundo
permitindo,
assim,
diversos
estudos
científicos
e,
consequentemente, aumentando o desenvolvimento nesta área. Com o passar do
tempo, o homem veio descobrindo, através de pesquisas, que as frutas possuem
não só um valor nutricional, mas, além disso, um grande efeito medicinal e
cosmético (GUERRA; NODARI 2004).
As afecções de origem alimentar ocorrem devido à ingestão de alimentos
contaminados com micro-organismo ou toxinas indesejáveis. Esses microorganismos aderem à mucosa do intestino proliferando e penetrando nos tecidos ou,
ainda, produzem toxinas que alteram o funcionamento das células do trato
gastrintestinal. Entre as bactérias invasivas destacam-se a Salmonella, Shigella,
Escherichia coli invasora, Yersinia enterocolitica. E as bactérias toxigênicas,
incluem-se Vibrio cholerae, Escherichia coli enterotoxigênica, Campylobacter jejuni
(FORSYTHE, 2002; FRANCO; LANDGRAFF 2008).
No inicio de 2012, foram incluídas no projeto de pesquisa "Estudo Químico e
Atividade Biológica de Plantas Nativas e Adaptadas do RS", como objeto de estudo
quatro Myrtaceaes – Eugenia anomala, Eugenia pluricepala, Eugenia pitanga e
Eugenia arenosa – todas coletadas no interior do município de Manoel Viana, RS, e,
para todas, verificou-se uma carência de estudos, tanto sobre o ponto de vista
agronômico, químico como biológico.
7
Desta forma temos como proposta de Trabalho de Conclusão de Curso, aqui
apresentado, o início dos estudos em relação a essas quatro Myrtaceaes, tanto
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químico como de suas atividades biológicas.
Assim, foi selecionada a espécie vegetal nativa Eugenia arenosa, e o microorganismo Escherichia coli. Esta bactéria Gram-negativa está presente em um
grande incidência deste em casos de intoxicação alimentar, causando desde casos
de diarreia e até mesmo a morte, no caso de cepas mais patogênicas.
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2 OBJETIVO
2.1 Objetivo geral
O presente trabalho tem como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana de
uma espécie vegetal Eugenia arenosa frente ao micro-organismo Escherichia coli.
2.2 Objetivo específico
 Obter extrato aquoso, etanólico das folha Eugenia arenosa;
 Realizar o screening fitoquímico do extrato aquoso das folha Eugenia
arenosa;
 Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) frente ao micro-organismo
Escherichia coli.
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3 REFERENCIAL TEÓRICO
A familia Myrtaceae é considerada uma das mais importantes encontradas no
Brasil. Esta família envolve cerca 129 gêneros e 4620 espécies e configura-se como
a maior família da ordem Myrtales, com dois grandes centros de dispersão nas
Américas e na Austrália embora possam ser encontradas em todo mundo (COLE et
al., 2007; JOLY,1993).
Pode ser dividida em duas subfamílias Myrtoideae e Leptospermoideae que
são diferenciadas pela morfologia das folhas e frutos. Na subfamília família
Myrtoideae as folhas são opostas e frutos carnosos já na família Leptospermoideae
as folhas são alternas e frutos secos (SOBRAL, 2003).
As plantas que pertencem a essa família são lenhosas, arbustivas ou
arbóreas, as folhas simples, opostas, de bordos inteiros. As Myrtaceae brasileiras
são caracterizadas por possuir tronco de casca lisa e florescem no início da
primavera (JOLY, 1993; SOBRAL, 2003).
Na flora brasileira essa família aparece entre as mais comuns na maioria das
formações vegetais, destacando a Floresta Atlântica e a floresta de Restinga, onde
espécies de Eugenia, Marlierea, Gomidesia são muito comuns (SOUZA; LORENZI
2005).
Trabalhos realizados por Cruz e Kaplan (2004) e Alves (2008) revelaram que
a família Myrtaceae apresenta um indicie bastante significativo em relação ao
número de espécies empregadas para fins medicinais.
10
Vários estudos apontam que inúmeras espécies que pertencem a essa família
apresentam alguma atividade terapêutica. lha confirmou que o extrato etanólico dos
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frutos Psidium guajava L (goiaba) apresentam atividade antimicrobiana frente a
bactérias Gram-positiva como Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis
(IHA et al., 2008).
Luzia verificou que o extrato etanólico da semente de Eugenia Uniflora L
apresenta atividade antioxidante e um elevado grau de instauração que favorece seu
uso para fins comestíveis como matéria prima para indústrias farmacêuticas (LUZIA
et al., 2010).
Algumas espécies são utilizadas na culinária (Syzigium aromaticum), outras
como plantas ornamentais (Melaleuca leucadendra, Eugenia sprengelii, E. ficifolia) e
ainda como frutos comestíveis (Eugenia uniflora, Psidium guajava, Psidium
cattleyanum) (SOUZA; LORENZI, 2005).
3.1 Eugenia arenosa
A espécie vegetal Eugenia arenosa (FIGURA 1) é um subarbusto que atinge
até 0,5 m; possui ramos jovens, folhas lanceoladas ou oblongas, frutos não vistos.
Essa planta se distribui em campos arenosos da região da Campanha no Rio
Grande do Sul e ocorre também no Paraná e no Paraguai. Existem tão poucos
estudos sobre a planta, que não foi encontrada nenhum nome popular para a
mesma (SOBRAL, 2003).
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FIGURA 1 – Foto da espécie vegetal Eugenia arenosa coletada em Manoel Viana.
Fonte: Dos autores.
3.2 Escherichia coli
A bactéria Escherichia coli (E. coli, FIGURA 2) pertence a família
Enterobacteriaceae. São bacilos Gram-negativo, não esporulados, aeróbicos e
anaeróbicos facultativos, capazes de fermentar glicose com produção de ácido e
gás, sendo um dos habitantes mais comum da microbiota intestinal dos animais e
dos homens (GERMANO; GERMANO, 2001; FRANCO; LANDGRAFF 2008;
TORTORA; FUNKE; CASE 2005).
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FIGURA 2 – Foto de uma colônia de E. coli.
Fonte: Eric Erbe, colorida digitalmente por Christopher Pooley, USDA, ARS, EMU.
http://en.wikipedia.org/wiki/File:E_coli_at_10000x,_original.jpg
A E. coli geralmente não é considerada patogênica, contudo, pode estar
envolvida nas infecções urinárias. Existem certas cepas que podem ser patogênicas,
apresentando fímbrias especializadas que se ligam a certas células do epitélio
intestinal
produzindo
uma
toxina,
provocando
distúrbios
gastrointestinais
(GERMANO; GERMANO 2001).
Com
base
nos
fatores
de
virulência,
manifestações
clínicas
e
epidemiológicas, as linhagens dessas bactérias consideradas patogênicas são
divididas em: E. coli enteropatogênica clássica, enteroinvasora, enterotoxigênica,
entero-hemorrágica enteroagregativa (FORSYTHE, 2002).
A E. coli enterotoxigênica (ETEC) é conhecida como a causadora da diarreia
dos viajantes, ou seja, ocorre entre pessoas recém-chegadas em determinado lugar
devido às mudanças alimentares. A ETEC causa uma diarreia liquida, e produz
febres baixas.
O
micro-organismo
(FORSYTHE, 2002; JAY, 2005).
coloniza
próximo
ao intestino
delgado
13
As condições favoráveis para o desenvolvimento desse bacilo são:
temperatura de 37 °C, existindo casos de cepas que podem se proliferar a 4 °C, pH
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7,5 e sobrevivem por longos períodos em alimentos fermentados ou ácidos
(GERMANO;GERMANO, 2001).
A transmissão pode ocorrer através do consumo de alimentos contaminados
de origem animal ou vegetal, principalmente crus ou levemente cozidos, leite cru,
além de água de abastecimento não tratada, facilitando a contaminação cruzada na
preparação de alimento (FORSYTHE, 2002; GERMANO; GERMANO, 2001).
A ocorrência de infecções é maior nas regiões tropicais, onde há predomínio
de uma grande concentração de pessoas, onde as condições sanitárias são
precárias e a contaminação de água é seguida (GERMANO; GERMANO, 2001).
Nos dias atuais a E. coli é umas das principais bactérias envolvidas em
surtos. No ano de 1996, 9000 pessoas no Japão ficaram doentes e 7 morreram
(TORTORA; FUNKE; CASE 2005). Em 2011, foi relatado, na Alemanha, um surto
envolvendo a E. Coli 0104:H4. A origem foi atribuída a contaminação de brotos de
feijão e sementes germinadas, onde causou 276 casos de síndrome hemolíticaurêmica e 3 mortes. Já na França também ocorreram surtos envolvendo E. Coli
0104:H4. O surto acometeu 4137 pacientes, levando 50 a óbito, sendo a origem por
contaminação de alimentos (MARTINO; MENEZES, 2011).
Em vários países no mundo a E. coli, juntamente com outros microorganismos, é responsável também por diversos casos de diarreia.
Segundo a OMS, a diarreia é a segunda causa de morte infantil no mundo,
sendo responsável por cerca de 16% das mortes em crianças de até 5 anos, o que
representa algo em torno de 1,5 milhões de mortes (WHO, 2009 ).
A diarreia pode ser definida pelo excessivo aumento da quantidade de água
eliminada nas fezes, sendo que até 200 g/dia do peso da água fecal, é um limite
aceitável para adultos saudáveis. A grande parte dos casos de diarreia resulta de
desordens de transporte da água e eletrólitos no intestino (MARQUES, 2008;
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GOODMAN; GILMAN 2010). Popularmente é tratada como uma enfermidade, mas
constitui um mecanismo fisiológico onde o próprio organismo busca eliminar
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rapidamente substâncias estranhas, podendo ser tóxicas ou irritantes (MARQUES,
2008).
A diarreia, por ser uma manifestação comum de doenças infecciosas, pode vir
acompanhada de alguns sintomas, tais como: flatulência, debilidade, mal-estar em
geral, dor abdominal, febre, incontinência, vômitos, sensação de urgência e dor
perianal. Alguns fatores como os socioeconômicos, ambientais, nutricionais,
demográficos e comportamentais, podem interferir diretamente para sua ocorrência
(MARQUES, 2008).
Segundo Marques, a diarreia infecciosa pode ser causada por inúmeros
agentes etiológicos, tais como vírus, bactérias e parasitas (MARQUES, 2008). A
Tabela 1, a seguir, mostra uma relação dos principais agentes causadores.
TABELA 1 – Principais agentes causadores de diarreia infecciosa (MARQUES,
2008).
Bactérias
Protozoários
Vírus
E. coli
E. histolytica
Rotavírus
Shigella
Giardia lamblia
Adenovírus
Salmonella
Cryptosporidea
Coronavírus
Vibrio cholera
Astrovírus
S. aureus
Calicivírus
Campylobacter
O tratamento farmacológico da diarreia será de acordo com a intensidade,
duração e a causa do quadro diarreico. Uma das medidas mais frequentes é o uso
de reidratantes orais a base de solução de cloreto de sódio, cloreto de potássio,
glicose e bicarbonato de sódio. O uso desses reidratantes é uma alternativa barata e
de fácil aquisição, existindo, ainda, uma fórmula caseira que possibilita, assim, o
tratamento de pessoas de baixa renda e, consequentemente, diminuindo o risco de
mortalidade (MARQUES, 2008; RANG et al., 2008).
15
Segundo Oliveira, a partir da década de 1990, houve um significativo declínio
nos casos registrados da doença, porém, a mesma ainda representa um grande
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problema de saúde pública, principalmente na população de menor renda e devido
ao fato dos serviços de saúde não assumirem um papel eficiente na assistência
precoce para a prevenção da doença, levando, inclusive, ao óbito em alguns casos
(OLIVEIRA; LATORRE 2010).
Desde os tempos antigos a humanidade vem acumulando inúmeras
informações sobre o ambiente em que a rodeia, resgatando e promovendo medidas
para melhorar as condições de sobrevivência. Os países em desenvolvimento
buscam alternativas terapêuticas nas plantas, pois, muitas vezes, são a única forma
de acesso aos cuidados básicos de saúde, devido à pobreza ou precariedade no
sistema de saúde (DI STASI, 1996).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 80% da
população desses países, encontra nas plantas alguma ação terapêutica, sendo,
inúmeras vezes, o único recurso encontrado para alívios de uma enfermidade.
(CALIXTO, 2001).
As informações sobre o uso de plantas medicinais e seus efeitos terapêuticos
foram sendo acumuladas durante séculos, ou seja, passando de pai para filho, de
uma geração para outra. Muitos desses conhecimentos empíricos, atualmente, já
possuem comprovação cientifica quanto a sua eficácia, podendo ser um atalho para
a descoberta de novos fármacos (DI STASI, 1996).
No entanto, essas informações sobre o uso popular e tradicional, não são
suficientes para comprovar quanto à eficácia e segurança, devendo ser previamente
validada, ou seja, sua ação comprovada e sua toxicidade potencial devem ser
avaliadas cientificamente na espécie humana. (LAPA et al.,2004)
Através de um levantamento etnofarmacológico sobre o uso de plantas
medicinais empregadas no tratamento de transtornos menores de saúde na cidade
de Tubarão/SC, conclui-se que a população estudada utiliza pelo menos um tipo de
planta na resolução de algum problema e ainda sofre influência de diferentes
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conhecimentos, uma vez que possui mais que uma etnia. O estudo ainda
demonstrou que o emprego em relação às plantas está de acordo com as
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propriedades farmacológicas associadas (NIEHUES et al., 2011).
Um estudo realizado por Agra no Nordeste do Brasil, em 2007, registra o uso
de 483 plantas para fins medicinais. Muitas dessas espécies relatadas ainda não
foram comprovadas cientificamente, mas o estudo visa salientar a importância de
investigar mais plantas de conhecimento popular (AGRA et al., 2007).
As plantas estão sendo essenciais na descoberta de produtos naturais
biologicamente ativos, sendo que, muitas delas apresentam-se como base para a
síntese de novos fármacos (GUERRA; NODARI 2004).
3.3 Screening fitoquímico
Neste trabalho foi dada uma maior atenção aos dois principais grupos de
metabólitos encontrados em espécies da família Myrtaceae, os taninos e os
flavonoides.
Os taninos são substâncias fenólicas solúveis em água, apresentam
capacidade de formar complexos insolúveis em água com alcaloides, gelatina e
outras proteínas, estão distribuídas no reino vegetal (SANTOS; MELLO 2004).
Os taninos são classificados em hidrolisáveis e condensados. Os taninos
condensados podem ser encontrados em plantas lenhosas enquanto os taninos
hidrolisáveis ocorrem em dicotiledônia herbácea e lenhosa (SANTOS; MELLO
2004).
Na medicina tradicional o emprego de plantas ricas em taninos ocorre no
tratamento de diversas moléstias como hipertensão arterial, reumatismo, diarreia,
hemorragias, feridas, queimaduras, problemas estomacais, problemas renais e
processos inflamatórios (SANTOS; MELLO 2004).
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O emprego na indústria tem sido na utilização no curtimento do couro, a
contribuição também pode ser feita na fabricação de vinhos, chás, suco de frutas
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devido sua adstringência uma característica comum desse metabólito (SANTOS;
MELLO 2004).
Já os flavonoides, caracterizam por ser um dos grupos fenólicos mais
importantes e diversificados entre os produtos de origem natural sendo amplamente
encontrada no reino vegetal e com isso são utilizados como marcador taxonômico
(ZUANAZZI, 2004).
São atribuídas diversas funções para os flavonoides nas plantas, tais como:
proteção dos vegetais contra a incidência de raios ultravioleta, proteção contra
insetos, fungos, vírus, bactérias, atraentes de animais com finalidade de polinização,
antioxidante entre outas (ZUANAZZI, 2004).
O interesse econômico nesses compostos é devido a suas diferentes
propriedades, por exemplo: as cores que esses pigmentos possuem, sua
importância no processo de tanagem do couro, na fermentação do chá-da-índia, na
manufatura do cacau e suas contribuições em nutrição e sabor de alimentos
(ZUANAZZI, 2004).
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4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais vegetais
As folhas de Eugenia arenosa foram coletadas no município de Manoel Viana
no Rio Grande do Sul, em novembro de 2011. A identificação do material vegetal foi
realizada pela botânica Prof. Dra. Elisete Maria de Freitas.
4.2 Preparo dos extratos
A partir do material coletado foram preparados os extratos aquoso e etanólico
das folhas de Eugenia arenosa.
4.2.1 Extrato aquoso
O extrato aquoso foi obtido pelo processo de infusão. As folhas verdes foram
trituradas para aumentar a superfície de contato do vegetal com a solução extratora.
O solvente utilizado, nesse processo foi água destilada. Após, foi adicionado 100
gramas de folhas em 1000 mL de água destilada fervente durante 30 minutos. Em
seguida o material foi filtrado, acondicionado em frasco âmbar e guardado sob
refrigeração.
19
Após esse período retirou-se todo o solvente com o auxilio de um rotaevaporador em uma temperatura 40 °C, onde o extrato foi guardado sob refrigeração
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até a realização dos testes antimicrobianos e de screening fitoquímicos.
4.2.2 Extrato etanólico
O extrato etanólico foi obtido pelo processo de maceração a frio. Foram
utilizadas 70 g de folhas trituradas (o que aumenta a superfície de contato do vegetal
com a solução extratora) em 700 mL de álcool etílico 90 %. Estocou-se essa solução
à temperatura ambiente, protegida da luz por um período de sete dias procedendose em seguida a filtração a vácuo do material.
Após esse período retirou-se todo o solvente com o auxilio de um rotaevaporador em uma temperatura 40 °C, onde o extrato foi guardado sob refrigeração
até a realização dos testes antimicrobianos.
4.3 Micro-organismo
Para a avaliação da atividade antimicrobiana e da Concentração Inibitória
Mínima (CIM) foi empregada uma cepa padrão proveniente da American Type
Culture Collection (ATCC) Escherichia coli (ATCC 25922) cedida pelo Laboratório de
Microbiologia do UNIANÁLISES.
4.4 Diluição dos extratos
Para preparar soluções de cada extrato, aquoso e etanólico, pesou-se 0,2
gramas de cada um em copo de Becker de 25 mL. Em seguida, adicionou-se 8 mL
de água deionizada estéril, e 0,5 mL de DMSO. Após a solubilização do extrato,
transferiu-se para um balão volumétrico de 10 mL e com auxilio de uma pipeta de
Pasteur, foi completando o volume com água deionizada estéril.
20
Desta forma, foi obtida uma solução de 20.000 μg/mL com dimetilsulfóxido
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(DMSO) a 0,5% conforme a Figura 3.
FIGURA 3 - Foto dos extratos aquoso e etanólico de Eugenia arenosa, na diluição
de trabalho.
Fonte: dos autores.
4.5 Fármaco utilizado como referência antimicrobiana
Para o controle antimicrobiano foi utilizado como referência o antibiótico
cloranfenicol, adquirido comercialmente na forma de colírio oftalmológico onde se
preparou uma solução de 200 μg/mL, a partir de 500 L diluídos em 10 mL de água
destilada e desionizada.
21
4.6 Controle diluente
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Para o controle diluente foi preparado uma solução. Em um balão volumétrico
de 10 mL, adicionou-se 0,5 mL de DMSO e completou-se o volume com água
deionizada estéril.
4.7 Atividade antimicrobiana
A atividade antimicrobiana é avaliada através da determinação de uma
pequena quantidade de substância necessária para inibir o crescimento do microorganismo,conhecida como Concentração Inibitória Mínima (CIM). O método
empregado foi descrito por Clinical and Laboratory Standards Insitute (CLSI).
4.7.1 Determinação da concentração mínima inibitória pelo método de
microdiluição.
A determinação da concentração mínima inibitória foi realizada através do
método de microdiluição, utilizando placas de acrílico com 96 poços. Nas placas
foram aplicados os extratos aquoso e etanólico, o fármaco antimicrobiano
(cloranfenicol), o diluente (DMSO) todos em triplicata. Também foram feitos controle
positivo e negativo.
A técnica foi realizada em capela de fluxo laminar, onde primeiramente
desinfetou-se com álcool 70 °GL, o manipulador pavimentou-se de acordo e após foi
colocado todos os materiais necessários para a realização dos testes.
Inicialmente com auxilio de uma alça estéril, retirou-se algumas colônias e
inoculou-se em solução salina 0,8% em tubo de ensaio. Em seguida ajustou-se o
inoculo conforme à escala de 0,5 Mc Farland.
22
Após retirou-se 200 μL do inóculo padronizado e transferiu-se para tubos de
ensaio contendo 10 mL de caldo de caseína de soja. Deixando um tubo de ensaio
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sem micro-organismo para o controle do meio.
As placas apresentavam linhas de A – H e colunas de 1 a 12 conforme a
Figura 4.
FIGURA 4 - Placa de 96 poços utilizada para o ensaio de Concentração Inibitória
Mínima.
Fonte: Dos autores
Para cada um dos 12 poços da linha A até a linha F foram adicionados 100 μL
do meio de caseína de soja com o inoculo. Na linha G adicionou-se apenas em cada
poços 100 μL do meio de caseína de soja com o inoculo para o controle do
crescimento do micro-organismo. Na linha H apenas foi adicionado o meio (caldo de
caseína de soja sem o inóculo), em cada poços 100 μL.
As colunas 1, 2, 3 foram destinadas para os extratos aquosos, as colunas 4,
5, 6 para extrato etanólicos as colunas 7, 8 ,9 ao cloranfenicol e as colunas 10 , 11 e
23
12 ao DMSO. Adicionou-se 100 μL de cada extrato, cloranfenicol e DMSO aos seus
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respectivos poços da linha A totalizando 200 μL em cada poço.
Após, iniciou-se as diluições. Homogenizou-se cuidadosamente os primeiros
poços da linha A, transferindo 100 μL para os poços seguintes, usando as mesmas
ponteiras, e assim sucessivamente, até a linha F.
Terminada as diluições, as placas foram incubadas a 36 °C por 24 horas.
As concentrações finais, após as diluições para cada extrato, foram:
1°poço:10.000 µg/mL, 2º poço: 5.000 µg/mL, 3º poço:2.500µg/mL, 4º poço:1.250
µg/mL, 5º poço: 625 µg/mL 6º poço: 312,5 µg/mL
As concentrações finais para o cloranfenicol foram: 1°poço:0,1µg/mL, 2º poço:
0,05 µg/mL, 3º poço:0,025µg/mL, 4º poço:0,0125 µg/mL, 5º poço: 0,00625, 6º poço:
0,003125 µg/mL
Após o tempo de incubação, realizou-se a leitura das placas. A ausência de
crescimento bacteriano foi representada pelo poços límpido e o crescimento
bacteriano foi representado pelo poços turvo. O primeiro poço onde não se observou
crescimento (de maior diluição), (de menor valor) corresponde ao valor da
concentração inibitória mínima.
A confirmação de crescimento microbiano nos poços, foi realizado por meio
da aplicação de 10 μL de uma solução de cloreto de trifeniltetrazólico 0,5 % (TTC), o
que revelou uma coloração avermelhada onde houve crescimento.
4.7.2
Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)
Inicialmente verteu-se o meio de cultura (ágar nutriente) sobre as placas de
Petry estéreis. Em seguida onde os poços estavam límpidos com o auxilio de uma
alça estéril foi semeado sobre o meio. Essas placas foram incubadas a 36 °C por 24
horas.
24
A leitura dos resultados é realizada da seguinte maneira:
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 Caso ocorra crescimento do micro-organismo no meio de cultura, significa
ação bacteriostática;
 A ausência de crescimento do micro-organismo no meio de cultura, significa
ação bactericida.
4.8 Screening fitoquímico
A pesquisa fitoquímica tem como principio conhecer os constituintes químicos
das espécies vegetais ou avaliar a sua presença. A caracterização dos grupos de
metabolitos foi realizada utilizando reações químicas específicas para cada caso,
que resultam no desenvolvimento de cor ou precipitado característico (SIMOES et al,
2002).
4.8.1 Taninos
Para o teste dos taninos, extraiu-se cerca 0,1 g dos extratos vegetais em 20
mL de água por 30 minutos em banho-maria fervente. Após o resfriamento, filtrou-se
e dividiu-se em 4 tubos de ensaio (A,B,C,D). No tubo A adicionou-se 1 mL de
solução de gelatina 1%. A formação de turvação ou precipitado indica uma reação
positiva (presença de taninos). No tubo B foram adicionadas 2 gotas de uma solução
de FeCl3 1%. O desenvolvimento de uma coloração azulada ou esverdeada indica a
presença taninos. No tubo C foi adicionado 1 mL de ácido clorídrico 10% e aqueceuse em banho-maria por 30 minutos. O desenvolvimento de flobafenos indica a
presença de taninos condensados. O tubo D foi usado como controle da coloração
inicial da amostra vegetal.
4.8.2 Flavonóides
Para o desenvolvimento deste teste, extraiu-se cerca de 0,2 g dos extratos
em 50 mL de água em banho-maria fervente. Após o resfriamento filtrou-se e
extraiu-se em funil de separação com 10 mL de n-butanol, repetindo mais uma vez
essa etapa. Evaporou-se a fração orgânica até à secura em cápsula de porcelana,
25
retomou-se o extrato em metanol e em seguida dividiu-se em dois tubos de ensaio,
A e B. No tubo A adicionou-se cuidadosamente 0,5 g ácido clorídrico concentrado e
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após 0,1 g de magnésio metálico.
O desenvolvimento de uma coloração violácea indica a presença flavanonas,
a coloração laranja indica a presença de flavonas e a coloração vermelha indica a
presença de flavonóis. O tubo B foi usado como controle da coloração inicial da
amostra vegetal.
4.8.3 Alcalóides
Para a identificação de alcaloides, extraiu-se cerca de 0,1 g dos extratos
vegetais com 20 mL de metanol. Essa solução foi dividida em 3 tubos de ensaio
onde adicionou-se em cada tubo 5 mL de ácido clorídrico 10%. Os tubos foram
aquecidos em banho-maria durante 30 minutos em uma temperatura 40°C. Após o
resfriamento, filtrou-se e transferiu-se uma parte deste para um vidro relógio e
adicionou-se gota a gota os reagentes Bouchardat, Mayer, Dragendorff e Bertrand a
formação de um precipitado indica a presença de alcalóides.
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5 RESULTADO E DISCUSSÃO
O rendimento dos extratos das folhas Eugenia arenosa foi calculado após o
término da remoção do solvente. O extrato aquoso de Eugenia arenosa teve um
rendimento 3,92%. Já o extrato etanólico Eugenia arenosa teve um rendimento
32,72%.
A atividade antimicrobiana do extrato aquoso e etanólico da Eugenia arenosa
foi determinada através da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração
Bactericida Mínima (CBM) pelo método de microdiluição em caldo.
A Concentração Inibitória Mínima é determinada pela menor concentração
capaz de impedir o crescimento de um micro organismo, no presente estudo foi
certificada pela presença de poços límpidos (NCCLS - Document M7-A6, 2003).
O extrato etanólico e aquoso de Eugenia arenosa mostrou possibilidade de
inibir o crescimento da cepa Escherichia coli em uma CIM de 1250 µg/mL.
Para a determinação da concentração que origina a morte do micro
organismo
(CBM),
foi
indispensável
semear
alíquotas
das
diluições
que
desenvolveram poços límpidos que não houve crescimento para placas de Petry.
Após 24 horas, o período necessário para a incubação, foi confirmado a presença de
crescimento bacteriano nas placas de Escherichia coli, como mostra a Figura 5.
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FIGURA 5 - Resultado da Concentração Bactericida Mínima para Escherichia coli.
Fonte: Dos autores.
O método microbiológico que avalia a capacidade de um antimicrobiano
eliminar bactérias é conhecido como atividade bactericida. Outro método
microbiológico onde tem a capacidade de inibir sua multiplicação é conhecido como
atividade bacteriostático (FUCHS; WANNMACHER 2010).
Diante desse resultado, o extrato pode ser considerado bacteriostático, pois
apenas inibiu o crescimento bacteriano e não teve capacidade de ocasionar a morte
do micro-organismo.
5.1 Screening fitoquímico
A partir dos resultados encontrados nos testes fitoquímicos, verificou-se a
presença de alguns compostos nas folhas de Eugenia arenosa tais como
flavonoides e taninos. Não foi verificada a presença de alcaloides na espécies.
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5.1.1 Taninos
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O teste para caracterização de taninos dos extratos de Eugenia arenosa
resultou no desenvolvimento de um precipitado no tubo A (gelatina 1%), pois os
taninos por serem substâncias fenólicas precipitam proteínas. A complexação de
hidroxilas com Fe²+ leva o surgimento de substâncias de coloração azul ou verde, o
tubo B (cloreto de ferro 1%), caracterizou uma coloração esverdeada, indicando a
presença de tanino condensado (FIGURA 6).
O tubo C também indica a presença de taninos, pois em contato com ácidos
diluídos e aquecidos precipitam sob a forma de grumos grosseiros.
FIGURA 6 – Resultado do teste para taninos do extrato aquoso de E. arenosa. A
esquerda, o resultado do tubo A; resultado do tubo B ,resultado tubo C indicando a
presença dos metabólitos.
Da direita para esquerda: resultado do precipitado, resultado coloração esverdeada, presença de
grumos.
Fonte. Dos autores.
Segundo o estudo Loguercio em 2005 aponta que as folhas jambolão
Syzygium cumini (L) rica em tanino apresentam atividade antibacteriana frente a
bactérias gram-positiva e gram-negativas, onde as bactérias gram-positiva obtiveram
maior atividade pois sua estrutura celular é mais rígida, parede celular menos
complexa e menor teor lipídico do que comparada as bactérias gram-negativa
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5.1.2 Flavonoides
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Na reação para detecção de flavonoides no extrato Eugenia arenosa obtevese uma coloração alaranjada indicando a presença de flavonoides. Conforme mostra
a Figura 7.
FIGURA 7 – Resultado do teste para flavonoides do extrato aquoso de E. arenosa. A
esquerda, o branco; e a direita a solução alaranjada indicando a presença dos
metabólitos.
A esquerda, o branco; e a direita a solução alaranjada indicando a presença dos metabólitos.
Fonte. Dos autores.
Um estudo, feito por Iha (2008), demonstrou que os taninos são os possíveis
responsáveis pela atividade antimicrobiana; Utilizando extrato etanólico dos frutos
Psidium guajava (goiaba) frente a S. epidermidis, S. aureus. Neste mesmo estudo
ficou evidenciado que os flavonoides são os possíveis responsáveis pela atividade
antioxidante.
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6 CONCLUSÃO
Com a avaliação antimicrobiana do extrato aquoso e etanólico de Eugenia
arenosa, verificou-se que os extratos apresentaram atividade bacteriostática nas
concentrações de 1250 µg/mL, para ambos os extratos, frente a Escherichia Coli.
O screening fitoquímico empregado indicou a presença de taninos e
flavonoides, onde a presença de taninos pode ser responsável pela atividade
antimicrobiana encontrada.
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PERSPECTIVAS PARA NOVOS TRABALHOS
Serão necessários maiores estudos relacionando a composição química com
a atividade biológica; pois assim seria possível correlacionar o tipo de metabólito
com sua aplicação terapêutica. É uma tarefa imprescindível para um mercado cada
vez mais exigente em todo o mundo.
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