UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA
PROF.º DELBY FERNANDES DE MEDEIROS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS
NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS
FILLIPE DE OLIVEIRA PEREIRA
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor SOBRE
DERMATÓFITOS DO GÊNERO Trichophyton
João Pessoa – PB
2009
FILLIPE DE OLIVEIRA PEREIRA
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor SOBRE
DERMATÓFITOS DO GÊNERO Trichophyton
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos, Centro de
Ciências da Saúde, Universidade Federal da
Paraíba, em cumprimento aos requisitos
necessários para a obtenção do grau de
Mestre em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos.
Área
de
concentração:
farmacologia.
Orientadora:
Prof.ª Dr.ª Edeltrudes de Oliveira Lima
João Pessoa – PB
2009
P436a Pereira, Fillipe de Oliveira.
Atividade antifúngica do óleo essencial de Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor
sobre dermatófitos do gênero Trichophyton / Fillipe de Oliveira Pereira. - - João
Pessoa: [s.n.], 2009.
117 f.: il.
Orientadora: Edeltrudes de Oliveira Lima
Dissertação (Mestrado) – UFPB/CCS/LTF.
1. Produtos naturais. 2. Óleos essenciais. 3. Trichophyton. 4.Cymbopogon.
UFPB/BC
CDU: 547.9(043)
FILLIPE DE OLIVEIRA PEREIRA
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor SOBRE
DERMATÓFITOS DO GÊNERO Trichophyton
Dissertação de mestrado aprovada em 30 de outubro de 2009.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Prof.ª Dr.ª Edeltrudes de Oliveira Lima
Presidente da banca examinadora
_____________________________________
Prof.º Dr. José Pinto de Siqueira Júnior
Examinador interno
À minha mãe...
chão firme,
meu caminho florido e alegre.
Dedico.
AGRADECIMENTOS
Há algum tempo imerso num mar de dúvidas, resolvi passar mais um período
na universidade e adiar por mais um tempo a minha esperada atuação profissional
como farmacêutico. Embora sendo um caminho difícil, hoje sinto que não errei e
agradeço a todos que depositaram confiança e credibilidade na minha escolha e na
minha capacidade de “andar” por ela. Com certeza sem vocês o caminho poderia ter
sido bem diferente. Muito Obrigado!
Agradeço especialmente a minha querida irmã, Charlene e a minha família
grande. Poucas palavras bastam.
À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Edeltrudes de Oliveira Lima pelo apoio, pela
confiança e amizade; um verdadeiro exemplo de eficiência e humildade. É uma
grande satisfação minha continuar com um trabalho que data de anos, desde minha
iniciação científica e está dando certo até hoje.
Ao Prof.º Dr. Paulo A. Wanderley pela parceria neste trabalho, a partir do
fornecimento do óleo essencial utilizado durante toda a pesquisa.
A Fernando Viana (LTF-UFPB) pela grande força na etapa final do trabalho, na
coleta e preparação das exsicatas da planta.
À Prof.ª Dr.ª Rita B. de Lima pela identificação botânica da planta, sempre
esteve disposta a ajudar.
Ao Prof.º Dr. Frederico B. de Souza na construção das imagens microscópicas
utilizadas no trabalho.
A Sócrates Golzio (LTF-UFPB) pela grande ajuda nos estudos com o UV,
sempre disposto a ajudar. Com certeza, sem a sua ajuda ficaria quase impossível
desenvolver essas análises.
À banca examinadora, nominalmente o Prof.º Dr. José Pinto de Siqueira Júnior
e o Prof.º Dr. Evandro Leite de Souza pelas incríveis contribuições no manuscrito e a
minha própria vida acadêmica. Foi uma honra e satisfação ter professores de tão
grande qualidade na avaliação desta dissertação.
À equipe do Laboratório de Micologia nominalmente Prof.ª Dr.ª Zélia B. V. S.
Pontes, Maria de Fátima F. P. Carvalho e Neuza M. C. Oliveira pela ajuda,
disposição de material formativo e orientações. Sem dúvida alguma, a possibilidade
de desenvolver o trabalho fica mais tranquila quando estamos em meio a essas
pessoas.
Aos meus companheiros de bancada no Laboratório de Micologia: Wylly A. de
Oliveira, Vinícius N. Trajano, Egberto S. Carmo, Ana Carolina P. Moreira e Giliara C.
D. G. de Luna. Agradeço pela ajuda, pelas conversas, pelo trabalho sempre em
conjunto durante todo esse tempo. Juntos somos melhores.
Á minha turma do mestrado incondicionalmente. Com ele(as) a intensa jornada
de estudos se tornou sustentavelmente leve e prazerosa. Obrigado por terem
engrandecido as aulas e contribuído com minha formação.
Aos professores do Programa de pós-graduação pelo dinamismo, pelo
conteúdo e pela força que me deram. Dentre todos ressalto com plena convicção os
que me fizeram sentir que o conhecimento pode não ter limites para aqueles que
buscam conhecer sempre mais. Aos professores Dr. Demétrius A. M. de Araújo, Dr.ª
Bagnólia A. da Silva, Dr. Josean F. Tavares, Dr.ª Sandra R. Mascarenhas, Dr.ª Liana
C. S. L. Morais, Dr. Luís F. M. dos Santos e Dr.ª Márcia R. de Oliveira, que fizeram
toda a diferença.
A Tânia Alves, secretária do Programa de pós-graduação, pela amizade e pela
pronta disponibilidade em me ajudar, quando precisei nunca me faltou apoio.
Aos meus queridos amigos que me acompanham até hoje, por terem me
apoiado nesta empreitada e ficaram sempre do meu lado, torcendo. Vocês não
sabem o quanto me ajudaram. Aos que lerem este texto entenderão de quem estou
falando.
Não poderia faltar Kelly Samara. Uma pessoa de uma força e coração sem
tamanhos que se fez uma grande companheira minha de longos tempos, com quem
pude contar sempre. Obrigado pelo incentivo, material de estudo, orientações, pelos
“ombros” e “ouvidos”.
Costumo dizer que minha formação acadêmica é construída com tudo que eu
venho colocando na minha bagagem durante a vida. Entre vários professores que
tive na graduação, uma importante parte do conteúdo desta bagagem vem de uma
professora que tive o prazer de conhecer, estudar, trabalhar e admirar durante a
graduação: a Prof.ª Dr.ª Leônia M. Batista. Obrigado pela força, pelo querer bem.
À Universidade Federal da Paraíba e ao Programa de Pós-graduação em
Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pela oportunidade de fazer o curso de
mestrado.
Ao CNPq e à FAPESQ-PB pelo apoio financeiro para elaboração deste
trabalho.
Desde os tempos medievos
Nossos sábios ancestrais
Quando surgia um problema
De doenças corporais
Seu médico e sua farmácia
Estavam na eficácia
Das plantas medicinais.
As plantas são seres vivos
Que tem no caule e nas flores,
Nas raízes e nos frutos
Poderes superiores
De essências e extratos
Com requisitos exatos
Para curar nossas dores...
...”Todos” os medicamentos
Que o homem fabrica agora
Com nomes complicadíssimos
Bela embalagem por fora
E preços proibitivos
Têm seus princípios ativos
Nos atributos da flora...
...Esta farmácia do mato
Não tem caixa, nem balcão,
Nem “empurroterapia”
Nem tem falsificação,
Disso, pode ter certeza
Porque a mãe natureza
É despida de ambição.
Manoel Monteiro
(Campina Grande – PB)
RESUMO
PEREIRA, F. O. Atividade antifúngica do óleo essencial de Cymbopogon
winterianus Jowitt ex Bor sobre dermatófitos do gênero Trichophyton. 117p.
Dissertação (mestrado). Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2009.
Trichophyton rubrum e Trichophyton mentagrophytes são os principais agentes
causadores de dermatofitoses, uma micose que afeta tecidos queratinizados de
homens e animais. Considerada uma das doenças infecciosas mais diagnosticadas
em todo o mundo, pesquisas que visam à busca de novos produtos com atividade
antifúngica tornam-se necessários para superar a dificuldade no tratamento dessas
micoses. Nesse contexto, destacam-se os produtos oriundos de plantas medicinais,
especialmente os óleos essenciais os quais possuem amplo reconhecimento do seu
poder antimicrobiano por inúmeros pesquisadores. Dessa maneira, este estudo visa
identificar os componentes do óleo essencial de Cymbopogon winterianus Jowitt ex
Bor e investigar sua atividade antifúngica contra 16 cepas de T. rubrum e 8 de T.
mentagrophytes. A análise da composição química do óleo foi realizada por
cromatografia a gás acoplada ao espectrômetro de massas (CG-EM). Os ensaios
antifúngicos foram constituídos do screening microbiológico, da determinação da
concentração inibitória mínima (CIM) e fungicida mínima (CFM), da análise dos
efeitos do óleo essencial no crescimento micelial, na germinação dos esporos
fúngicos, na viabilidade fúngica, na macro e micromorfologia, na parede celular
(ensaio com sorbitol) e na membrana celular (ensaio de lise celular) dos
dermatófitos. Os resultados da CG-EM mostraram 18 componentes, onde citronelal
(23,59 %), geraniol (18,81 %) e citronelol (11,74 %) foram os constituintes
majoritários. No screening, o óleo inibiu todas as cepas, com zonas de inibição de
crescimento de 24-28 mm de diâmetro. A CIM foi de 312 µg/mL e a CFM foi de 2500
µg/mL para 92 % das cepas testadas. O óleo essencial a 156, 312, 625 e 2500
µg/mL impediu fortemente o desenvolvimento micelial e apresentou forte poder
inibitório sobre a germinação dos conídios de ambas as espécies. No ensaio de
viabilidade fúngica, foi observado efeito fungicida do óleo essencial em todas as
concentrações. As principais alterações micromorfológicas dos dermatófitos
induzidas pelo óleo foram diminuição na conidiogênese e as alterações na forma e
na pigmentação das hifas. As colônias apresentaram algumas alterações no aspecto
e na pigmentação. Os resultados do ensaio com sorbitol sugerem que a ação
antifúngica do produto não envolve diretamente a parede celular. O óleo essencial
provocou lise celular nas concentrações testadas, sugerindo que a sua atuação
pode estar envolvida com a membrana celular fúngica. Diante disso, conclui-se que
o óleo essencial de C. winterianus mostrou uma forte atividade inibitória contra os
dermatófitos e, consequentemente, pode ser considerado como um potencial
produto com propriedades antifúngicas, especialmente para o tratamento das
dermatofitoses.
Palavras-chaves: Trichophyton, Cymbopogon, óleo essencial.
ABSTRACT
PEREIRA, F. O. Antifungal activity of the essential oil of Cymbopogon
winterianus Jowitt ex Bor on dermatophytes of the genus Trichophyton 117p.
Dissertation (Master Course). Federal University of Paraiba, João Pessoa, 2009.
T. rubrum and T. mentagrophytes are the main causative agents of dermatophytosis,
a fungal infection that affects keratinized tissues of humans and animals. Considered
one of the most diagnosed diseases in the world, research projects aiming the
searching for new products with antifungal activity are necessary to overcome the
difficulty in treating these fungal infections. In this context, the products from
medicinal plants are highlighted, especially essential oils which have broad
recognition of their antimicrobial power by many researchers. Thus, this study aims to
identify the components of the essential oil of Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor
and investigate its antifungal activity against 16 strains of T. rubrum and 8 ones of T.
mentagrophytes. The analysis of the oil chemical composition was performed by gas
chromatography-mass scpectrometry (GC-MS). The antifungal tests were consisted
of microbiological screening, determination of minimum inhibitory concentration (MIC)
and minimal fungicidal concentration (MFC), analysis of the essential oils effects on
mycelial growth, germination of fungal spores, in fungal viability within macro and
micromorphology of dermatophytes, in the cell wall (test with sorbitol) and the cell
membrane (cell lysis test). Results of GC-MS showed 18 compounds, citronellal
(23.6 %), geraniol (18.8 %) and citronellol (11.74 %) were the majority constituents
present in the essential oil. At the screening, the oil inhibited all strains, with zones of
growth inhibition of 24-28 mm in diameter. The MIC was 312 µg/mL and CFM was
2500 µg/mL for 92% of the strains tested. The essential oil at 156, 312, 625 and 2500
µg/mL strongly prevented mycelial growth. In these same concentrations, the oil
showed a strong inhibitory power on the conidia germination of both species. In the
test for fungal viability was observed fungicidal effect of the essential oil in all
concentrations. The main micromorphological changes in the dermatophytes induced
by the oil were decreased conidia genesis and changes in shape and pigmentation of
the hyphae. The colonies showed some changes in appearance and pigmentation.
The results of sorbitol test suggest the antifungal action of the product does not
directly involve the cell wall. The essential oil caused cell lysis, suggesting its
actuation could probably involve the fungal plasma membrane. Given this, it is
concluded that the essential oil of C. winterianus showed a strong inhibitory activity
against dermatophytes and thus can be considered as a potential product with
antifungal properties, especially for the treatment of dermatophytosis.
Key words: Trichophyton, Cymbopogon, essential oil.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Estruturas microscópicas T. rubrum ATCC 1683, com a presença de
microconídios em forma de gota dispostos ao logo do conidióforo (400x). ............... 29
FIGURA 2. Estruturas microscópicas de T. mentagrophytes LM02 (400x), com a
presença
de
microconídios
agrupados
em
torno
dos
conidióforos
(A)
e
macroconídios charutóides com poucos septos (B) .................................................. 31
FIGURA 3. Estrutura química do cetoconazol ........................................................... 35
FIGURA 4. Estrutura química do itraconazol............................................................. 35
FIGURA 5. Estrutura química da terbinafina ............................................................. 36
FIGURA 6. Estrutura química da griseofulvina .......................................................... 37
FIGURA 7. C. winterianus (Poaceae) no horto do Centro de Formação de
Tecnólogos, Campus III da UFPB ............................................................................. 43
FIGURA 8. Localização geográfica da cidade de Bananeiras-PB ............................. 46
FIGURA 9. Aspecto visual do óleo essencial de C. winterianus (A) e embalagem de
conservação (B) ........................................................................................................ 47
FIGURA 10. Screening da atividade antifúngica do óleo essencial de C. winterianus
sobre T. rubrum LM333 ............................................................................................. 65
FIGURA 11. Percentual de redução da massa micelial seca de T. rubrum ATCC
1683 na presença do óleo essencial de C. winterianus ............................................ 71
FIGURA 12. Percentual de redução da massa micelial seca de T. mentagrophytes
LM02 na presença do óleo essencial de C. winterianus ........................................... 72
FIGURA 13. Percentual de inibição da germinação dos conídios de T. rubrum ATCC
1683 e T. mentagrophytes LM02 após 24 h de interação com o óleo essencial de C.
winterianus ................................................................................................................ 74
FIGURA 14. Alterações morfológicas durante a germinação dos conídios de T.
rubrum ATCC 1683 em CSD com conídios normais, inchados (A) e germinados (B)
.................................................................................................................................. 76
FIGURA 15. Alterações morfológicas durante a germinação dos conídios de T.
mentagrophytes LM02 em CSD com conídios normais e germinados ...................... 76
FIGURA 16. Viabilidade das estruturas fúngicas de T. rubrum ATCC 1683 em
LogUFC/mL na presença do óleo essencial de C. winterianus ................................. 83
FIGURA 17. Viabilidade das estruturas fúngicas de T. mentagrophytes LM02 em
LogUFC/mL na presença do óleo essencial de C. winterianus ................................. 83
FIGURA 18. Micromorfologia de T. rubrum ATCC 1683 cultivado na ausência e
presença do óleo essencial de C. winterianus .......................................................... 86
FIGURA 19. Micromorfologia de T. mentagrophytes LM02 cultivado na ausência e
presença do óleo essencial de C. winterianus ......................................................... 88
FIGURA 20. Macromorfologia de T. rubrum ATCC 1683 cultivado em ASD, na
ausência e presença do óleo essencial de C. winterianus ....................................... 91
FIGURA 21. Macromorfologia de T. mentagrophytes LM02 cultivado em ASD, na
ausência e presença do óleo essencial de C. winterianus ....................................... 92
FIGURA 22. Percentual de lise das células de T. rubrum ATCC 1683 na presença do
óleo essencial de C. winterianus (78, 156 e 312 µg/mL) e anfotericina B (0,60 µg/mL)
.................................................................................................................................. 96
FIGURA 23. Percentual de lise das células de T. mentagrophytes LM02 na presença
do óleo essencial de C. winterianus (78, 156 e 312 µg/mL) e anfotericina B (0,60
µg/mL) ....................................................................................................................... 97
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Componentes do óleo essencial das folhas de C. winterianus .............. 60
TABELA 2. Screening microbiológico do óleo essencial de C. winterianus frente às
cepas de T. rubrum e T. mentagrophytes ................................................................ 63
TABELA 3. Valores de CIM e CFM do óleo essencial de C. winterianus e
cetoconazol sobre cepas de T. rubrum e T. mentagrophytes .................................. 68
TABELA 4. Distribuição do percentual de conídios de T. rubrum ATCC 1683 após 3
h de interação com diversas concentrações do óleo essencial de C. winterianus .... 78
TABELA 5. Distribuição do percentual de conídios de T. rubrum ATCC 1683 após 15
h de interação com diversas concentrações do óleo essencial de C. winterianus .... 78
TABELA 6. Distribuição do percentual de conídios de T. rubrum ATCC 1683 após 24
h de interação com diversas concentrações do óleo essencial de C. winterianus .... 78
TABELA 7. Valores de CIM do óleo essencial de C. winterianus e cetoconazol sobre
as cepas de T. rubrum e T. mentagrophytes, na presença de sorbitol (0,8 M) ......... 94
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 15
2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 18
2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 18
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 18
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................................ 20
3.1 DERMATOFITOSES ....................................................................................... 20
3.2 DERMATÓFITOS ............................................................................................ 24
3.2.1 Trichophyton rubrum (Castellani) Sabouraud, 1911 .............................. 28
3.2.2 Trychophyton mentagrophytes (Robin) Blanchard, 1896 ....................... 30
3.3 TRATAMENTO DAS DERMATOFITOSES ..................................................... 32
3.3.1 Azólicos ................................................................................................. 33
3.3.2 Alilaminas .............................................................................................. 35
3.3.3 Griseofulvina .......................................................................................... 36
3.4 RESISTÊNCIA A ANTIFÚNGICOS ................................................................. 38
3.5 PRODUTOS NATURAIS ................................................................................. 39
3.5.1 Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor ................................................. 41
4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 45
4.1 LOCAL DE TRABALHO .................................................................................. 45
4.2 MATERIAL BOTÂNICO................................................................................... 45
4.2.1 Óleo essencial ....................................................................................... 46
4.2.2 Análise dos componentes do óleo essencial ......................................... 47
4.3 FÁRMACOS ANTIFÚNGICOS ........................................................................ 48
4.4 MICRO-ORGANISMOS .................................................................................. 49
4.5 MEIOS DE CULTURA ..................................................................................... 49
4.6 INÓCULO ........................................................................................................ 50
4.7 METODOLOGIA ............................................................................................. 51
4.7.1 Screening microbiológico ....................................................................... 51
4.7.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ....................... 51
4.7.3 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM) .................... 52
4.7.4 Efeito do óleo essencial sobre o crescimento micelial ........................... 52
4.7.5 Efeito do óleo essencial sobre a germinação dos esporos fúngicos ...... 53
4.7.6 Efeito do óleo essencial sobre a viabilidade fúngica .............................. 54
4.7.7 Efeito do óleo essencial sobre a micromorfologia dos dermatófitos ...... 55
4.7.8 Efeito do óleo essencial sobre a macromorfologia dos dermatófitos ..... 56
4.7.9 Ensaio com sorbitol................................................................................ 56
4.7.10 Lise da membrana celular.................................................................... 57
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................. 58
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 60
5.1 ANÁLISE DOS COMPONENTES DO ÓLEO ESSENCIAL ............................. 60
5.2 SCREENING MICROBIOLÓGICO .................................................................. 62
5.3 DETERMINAÇÃO DA CIM E CFM .................................................................. 66
5.4 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE O CRESCIMENTO MICELIAL ....... 70
5.5 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE A GERMINAÇÃO DOS ESPOROS
FÚNGICOS ............................................................................................................... 73
5.6 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE VIABILIDADE FÚNGICA ............... 81
5.7 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE A MICROMORFLOGIA DOS
DERMATÓFITOS ...................................................................................................... 84
5.8 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE A MACROMORFOLOGIA DOS
DERMATÓFITOS ...................................................................................................... 89
5.9 ENSAIO COM SORBITOL .............................................................................. 93
5.10 LISE DA MEMBRANA CELULAR ................................................................. 95
6. CONCLUSÕES ................................................................................................... 101
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 103
Introdução
15
1. INTRODUÇÃO
A expressão dermatófitos é utilizada para designar um grupo de fungos que
colonizam tecidos queratinizados como a pele, unhas e pêlos, parasitando o
hospedeiro e produzindo micoses superficiais denominadas de dermatofitoses. Por
serem conhecidos como fungos queratinofílicos e queratinolíticos, os dermatófitos
representam um grupo biologicamente homogêneo. Embora tenham características
similares quanto à sua aparência, fisiologia, taxonomia, antigenicidade e limites de
infectividade e doença, apresentam diferenças no perfil enzimático e nas exigências
nutricionais para crescimento (LACAZ et al., 2002; SIDRIM; ROCHA, 2004).
Atualmente, esses fungos compreendem diversas espécies distribuídas entre os
gêneros Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton.
As dermatofitoses estão entre as doenças infecciosas mais diagnosticadas no
mundo e os dermatófitos estão entre os agentes etiológicos mais comuns de
infecção no homem, não existindo povos ou regiões geográficas sem terem sido
acometidas por eles. Essas infecções afetam aproximadamente 40% da população
mundial e representam 30% de todas as infecções cutâneas micóticas (EL FARI et
al., 1999; GUPTA et al., 1998; RIPPON, 1988).
Embora a diversidade encontrada na freqüência de espécies de dermatófitos no
Brasil seja evidenciada em trabalhos de inúmeros pesquisadores, registros
epidemiológicos apontam o predomínio das espécies T. rubrum e T. mentagrophytes
como um dos principais agentes causadores de dermatofitoses em humanos, nas
mais diversas manifestações clínicas (MEZZARI, 1998; COSTA et a., 2002;
REZENDE et al., 2008).
Alguns profissionais de saúde consideram as dermatofitoses como um problema
puramente cosmético, de pouca importância. No entanto, o impacto real que essas
infecções têm sobre a qualidade de vida dos pacientes pode ser significativa, pois
causam coceira, desconforto e dores nas áreas infectadas (SHAW et al., 2002). Isto
é especialmente importante em pacientes com dermatofitoses crônicas, tais como
tinea unguium ou tinea pedis, em que a terapia disponível é pouco eficaz, em muitos
casos. No caso de tinea unguium, o potencial do fracasso terapêutico chega a ser de
25% (TORRES, 2005). Nos casos de tinea pedis causadas por T. rubrum, a infecção
pode persistir durante anos e as recidivas são comuns em cerca de 70% dos
pacientes. Possíveis causas dessas recidivas podem ser reinfecção ou o fato de que
16
a infecção original não foi erradicada em sua totalidade (DRAKE et al., 1998).
Algumas dermatofitoses tendem a cronicidade, que leva ao aumento no consumo de
antifúngicos – a maioria deles de preços elevados e com tempo de uso prolongado –
gerando um aumentado custo para os indivíduos tratados (TORRES, 2005).
O tratamento das infecções micóticas, incluindo as dermatofitoses, tem sido
motivo de muita preocupação em todo o mundo. Este fato é justificado pelo aumento
da prevalência dessas doenças no cenário mundial, pela ampliação de uso de
antifúngicos e pelo consequente aparecimento de cepas resistentes aos principais
antifúngicos empregados na terapêutica clínica.
Para tentar superar este panorama, várias pesquisas vêm sendo desenvolvidas
em busca de novos produtos antifúngicos nos últimos anos. A partir desse contexto
que pesquisadores de todo o mundo têm se dedicado ao estudo de plantas
medicinais, considerando os aspectos da botânica, da etnofarmacologia, química e
atividade biológica, visto elas serem consideradas uma promissora fonte de novos
compostos com propriedades farmacológicas, incluindo a atividade antifúngica.
Por isso, estudos de atividade antifúngica com óleos essenciais obtidos de
plantas medicinais merecem destaque, principalmente quando se refere ao óleo
essencial de Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor, pois estudos frente a
dermatófitos ainda são de certa forma inéditos. Os óleos essenciais são produtos
oriundos do metabolismo secundário das plantas com algumas propriedades
farmacológicas já evidenciadas, como a antimicrobiana. E acredita-se que essas
propriedades são normalmente um reflexo do seu próprio papel nos vegetais, no
controle biológico de micro-organismos fitopatogênicos.
Considerando a importância clínica e epidemiológica das dermatofitoses,
especialmente àquelas cujos agentes etiológicos são as espécies T. rubrum e T.
mentagrophytes, torna-se relevante a realização de estudos que enfoquem a busca
de novos produtos antifúngicos, com especial ênfase para o tratamento dessas
doenças.
Objetivos
18
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a atividade antifúngica in vitro do óleo essencial de C. winterianus
contra cepas de T. rubrum e T. mentagrophytes.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Identificar os componentes presentes no óleo essencial de C. winterianus;
 Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Fungicida
Mínima (CFM) do óleo essencial de C. winterianus;
 Avaliar o efeito do óleo essencial de C. winterianus sobre o crescimento micelial,
a germinação dos esporos e a viabilidade das espécies fúngicas em estudo;
 Avaliar a interferência do óleo essencial de sobre os ascpectos morfológicos dos
dermatófitos em estudo;
 Estudar os possíveis modos de ação do óleo essencial de C. winterianus com
ênfase nos seus efeitos sobre a parede celular e a membrana plasmática fúngica.
Fundamentação teórica
20
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 DERMATOFITOSES
Dermatofitoses são infecções produzidas por fungos dermatófitos em tecidos
queratinizados como unhas, cabelos e estrato córneo (do latim stratum = camada e
corneum = córneo) da pele de homens e animais. A pele é formada por três
camadas, a epiderme, a derme e a hipoderme que também pode ser chamado de
tecido subcutâneo ou tecido celular intermediário, sendo a primeira a camada
superior da pele. Entre outras células, a epiderme é formada por queratinócitos que
contêm queratina constituinte de sua estrutura interna. Os queratinócitos são a parte
proliferativa da epiderme; e na medida em que essas células se diferenciam e
amadurecem, vão se tornando maiores e perdendo seus núcleos, finalizando na
formação do estrato córneo (BANKS, 1992; WYATT et al., 2005).
Os dermatófitos são fungos queratinofílicos, ou seja, tem a capacidade de digerir
e utilizar a queratina encontrada em determinados tecidos animais como substrato.
A queratina é um substrato necessário para os dermatófitos obterem nutrientes
importantes para o seu desenvolvimento. Os dermatófitos conseguem metabolizar e
digerir diversas estruturas devido à produção de lipase, endopeptidase, glicosidases,
nuclease, queratinase, colagenase e elastase. Estas enzimas reforçam a penetração
e o desenvolvimento micelial em tecidos queratinizados, resultando em respostas
inflamatórias no hospedeiro. Dessa forma, a infecção é geralmente superficial e
restrita à camada córnea da pele em decorrência desses fungos serem, muitas
vezes, incapazes de penetrar nas camadas mais profundas da pele de indivíduos
imunocompetentes (LACAZ et al., 2002; WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995;
TORRES, 2005).
As dermatofitoses incluem diferentes formas clínicas resultantes da colonização
dos dermatófitos e da conseqüente manifestação inflamatória do hospedeiro. Os
aspectos clínicos variam de acordo com o sítio anatômico acometido e o agente
etiológico envolvido. A severidade da doença, portanto, provavelmente está
intimamente relacionada com o status imunológico em que o hospedeiro se
encontra, assim como a espécie do micro-organismo causador da infecção
(RIPPON, 1988; WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995). A transmissão da doença pode
ocorrer por contato direto com seres humanos, animais ou solo contaminado através
de espécies antropofílicas, zoofílicas ou geofílicas, respectivamente de forma direta
21
ou indiretamente por exposição a fômites contaminadas. Acredita-se que esta
transmissão seja feita através de estruturas denominadas artroconídios que são
visualizados em cabelos e escamas epidérmicas infectadas (LÓPEZ-MARTÍNEZ et
al., 1994; MATSUMOTO; AJELO 1987).
A patogênese das dermatofitoses é iniciada pela inoculação de fragmentos de
hifas – estruturas que podem permanecer viáveis por anos no meio ambiente –
sobre a pele, favorecida por uma lesão cutânea ou escoriação preexistente,
associada à habilidade do fungo em degradar a queratina. No caso de pêlos
acometidos, eles são sempre infectados secundariamente à evolução da lesão na
pele, uma vez que essa se desenvolve de maneira circular e centrífuga até atingir
uma região de folículo piloso, sendo esta uma nova fonte de queratina para o seu
crescimento (MATSUMOTO; AJELO 1987; SIDRIM; ROCHA, 2004).
Muitas espécies de dermatófitos formam síndromes clínicas bem definidas e a
mesma espécie pode estar envolvida em diferentes formas clínicas da doença,
dependendo
do
sítio
anatômico
envolvido.
As dermatofitoses podem
ser
classificadas clinicamente de acordo com as localizações anatômicas das lesões,
utilizando a denominação tinea (do latim tinea = verme ou traça) para todas as
dermatofitoses, seguida do sítio anatômico onde se localiza a infecção, também em
latim. O termo “tinea” era usado pelos romanos para descrever as infecções
dermatofíticas, pois tinha o aspecto semelhante ao efeito das traças nas roupas de
lã. Dessa maneira, as formas clínicas mais relevantes são: tinea capitis, tinea
corporis, tinea cruris, tinea unguium, tinea barbae, tinea manuum e tinea pedis
(KURSTAK, 1989; RIPPON, 1988; WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995).
Tinea capitis acomete o couro cabeludo, sobrancelhas e cílios, afetando
principalmente crianças em idade escolar e sendo mais difícil de encontrá-la em
adultos. É caracterizada pela produção de lesões que variam de forma branda e
descamativa a uma forma eritematosa, acompanhadas de alopécia, e que podem
tornar-se severamente inflamada formando lesões ulceradas profundas. São
causadas principalmente por fungos dos gêneros Trichophyton e Microsporum. As
tineas do couro cabeludo podem se apresentar sob a forma de crostas compostas
de restos celulares epiteliais e massas densas de hifas, denominando-se de tinea
capitis favosa, uma infecção severa e crônica. As crostas determinam inicialmente
foliculite com conseqüente lesão do folículo piloso, que freqüentemente se torna
atrofiado, com aparecimento de alopécia permanente. Há a forma tonsurante, mais
22
comum, de evolução crônica, caracterizada pela presença de uma ou mais lesões
circulares, com placas de alopécia. Na tinea capitis tonsurante, encontramos a forma
microscópica, onde a lesão é geralmente grande, única e redonda; e a forma
tricofítica, com lesões múltiplas muito descamativas (LACAZ et al., 2002; RIPPON,
1988).
Tinea corporis acomete a pele glabra, principalmente o tronco, ombros, braços e
ocasionalmente a face. As lesões se manifestam geralmente com aspecto anelar,
sob a forma de pequenos eritemas de contornos delimitados. Em certos casos, com
bordas elevadas, vesiculosas ou até mesmo pustulosas, sob formas mais severas,
com formação de granulomas. A forma anelar é a mais freqüente, caracterizada por
placas arredondadas com crescimento centrífugo. As bordas são pápuloeritematosas e há tendência à cura central. Os principais fungos agentes de tais
micoses pertencem às várias espécies de Trichophyton e Microsporum, porém todas
as espécies de dermatófitos são capazes de causar a tinea corporis. O dermatófito
mais comumente isolado em todo o mundo nesses casos é o T. rubrum seguido do
T. mentagrophytes. Há uma forma de tinea corporis denominada de tinea imbricata;
esta micose é causada pelo fungo T. concentricum e ocorre endemicamente entre
os indígenas de certas ilhas do oceano pacífico, das Américas do Sul e Central, e
sudeste da Ásia. Clinicamente é caracterizada por policiclos, de modo imbricado,
descamativas, acometendo todo o corpo e sem sinais de reação inflamatória
(LACAZ et al., 2002; RIPPON, 1988).
Tinea cruris envolve as regiões inguinais, perineais e perianais, de forma aguda
ou crônica. As lesões se manifestam sob a forma de placas avermelhadas,
descamativas, marginadas, bilaterais ou unilaterais com sensação de queimação e
prurido intenso nas áreas afetadas. As margens das lesões circinadas, elevadas,
ligeiramente papulosas, algumas vezes acompanhadas de vesículas. As principais
espécies causadoras de tinea cruris são T. mentagrophytes, T. rubrum e E.
floccosum. A doença é encontrada em todas as partes do mundo, mas é mais
prevalente nas regiões tropicais, onde a umidade favorece a colonização do
dermatófito. Acomete mais comumente os homens, e dificilmente envolve as
mulheres exceto quando ocorre transmissão por um contato íntimo ou fômite
contaminado (LACAZ et al., 2002; RIPPON, 1988).
Tinea unguium é uma invasão da lâmina ungueal por dermatófitos. O
comprometimento da unha pode ocorrer na forma subungueal distal, subungueal
23
proximal e superficial branca. A forma subungueal distal se inicia no bordo livre da
unha, desloca a lâmina ungueal, podendo evidenciar hiperceratose na maioria dos
casos. Na forma subungueal proximal, a lâmina se desloca a partir da borda
proximal, com acúmulo de detritos córneos. A forma superficial branca é
caracterizada por pontos de cor branca em qualquer parte da lâmina ungueal,
podendo acometer toda a unha, e geralmente está associada ao T. mentagrophytes.
Todas essas formas podem evoluir para distrofia parcial ou total da unha. T. rubrum
e T. mentagrophytes são os dermatófitos mais comuns em casos de tinea unguium
(ELEWSKI, 1998; RIPPON, 1988).
Tinea barbae afeta regiões pilosas da face e do pescoço e, portanto restrito a
adultos homens. Apresenta dois quadros clínicos distintos: o tipo leve e superficial
onde as bordas das lesões são vesiculopustulares, a reação do hospedeiro é menos
forte, embora a alopécia pode se desenvolver na região central da lesão; e o tipo
mais profundo e pustular, com formação de pústulas foliculares e crostas, que
podem resultar em formação de nódulos, semelhante clinicamente à foliculite
bacteriana. As lesões podem ter intensa reação inflamatória dos folículos pilosos
presentes nesta região. É causada principalmente por T. verrucosum, T. rubrum e T.
mentagrophytes (LACAZ et al., 2002; RIPPON, 1988).
Tinea manuum refere-se àquelas infecções por dermatófitos nas superfícies
planares das mãos e regiões interdigitais. Clinicamente, há comprometimento da
superfície palmar e das áreas interdigitais, geralmente apresentando-se como uma
hiperceratose unilateral difusa, ou lesões esfoliativas, lesões papulosas discretas ou
eritematosas difusas. As espécies mais frequentemente causadoras de tinea
manunm são T. rubrum e T. mentagrophytes. As lesões descamativas pequenas e
fracamente papulosas estão mais associadas com T. rubrum, enquanto as lesões
vesiculares ou na forma inflamatória mais aguda quase sempre são provocadas por
T. mentagrophytes (RIPPON, 1988).
Tinea pedis é uma infecção dermatofítica que envolve particularmente as solas
dos pés e dedos. É uma das doenças provocadas por fungos que mais acometem o
homem e está entre as micoses com maior frequência em todo o mundo. Estima-se
que cerca de 30 a 70% da população mundial apresente tinea pedis, muitas vezes
com evolução clínica oculta ou subclínica. As lesões aparecem nas bordas e plantas
dos pés sob quatro formas mais comuns. A forma clínica intertriginosa crônica é a
mais comum, na qual aprecem maceração, descamação e fissuras na pele. A forma
24
vesicular aguda, caracterizada por lesões vesico-pustulares e às vezes bolhosas;
existe ainda a forma escamosa com hiperceratose e lesões descamativas; e a forma
de placas ulcerativas agudas, que podem ser complicadas por uma infecção
secundária bacteriana. Nesse caso, o fluido da vesícula é purulento e ocorre
ulceração da epiderme. Três dermatófitos são responsáveis pela a maioria dos
casos desta forma clínica, são eles: T. rubrum, T. mentagrophytes e E. floccosum
(LACAZ et al., 2002; RIPPON, 1988).
Além das lesões superficiais relativas às agressões dos fungos em tecidos
queratinizados, os dermatófitos principalmente do gênero Trichophyton podem
invadir o estrato córneo e provocar processos infecciosos mais profundos.
Situações, como doenças de base, contribuem para o aparecimento desses casos, a
exemplo de indivíduos com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS –
Acquired Immune Deficiency Syndrome), síndrome de Down, uso prolongado de
corticosteróides e outras drogas imunossupressoras em transplantados (ARAÚJO et
al., 2003; ARENAS; RUIZ-ESMENJAUD, 2004).
Atualmente, com o crescente número de indivíduos imunossuprimidos – que
fazem uso de corticoterapia prolongada – ou até mesmo com alguma deficiência no
seu sistema imunológico, muitas dessas dermatofitoses entre outras infecções
fúngicas, assumem características diferentes do esperado atingindo a derme,a
hipoderme e até mesmo órgãos viscerais provocadas por diferentes espécies de do
gênero Trichophyton, principalmente T. rubrum, T. violaceum e T. verrucosum. Podese incluir nesses casos especialmente o granuloma de Majocchi ou granuloma
tricofítico que se trata de uma foliculite e perifoliculite granulomatosa com nódulos
subcutâneos quase sempre provocados pelo T. rubrum; o micetoma dermatofítico
caracterizado por nódulos subcutâneos não aderidos às camadas mais profundas da
pele, com uma fístula que drena uma secreção que contém grãos formados de
emaranhados de estruturas fúngicas dermatofíticas, principalmente, de T. rubrum, M.
canis e M. ferrugineum; e a moléstia dermatofítica na qual são comuns as lesões
cerebrais, geralmente sob a forma de abscessos, onde os dermatófitos mais
frequentemente envolvidos nesses casos são T. rubrum, T. schoenleinii e o T.
violaceum (LACAZ et al., 2002; SIDRIM; ROCHA, 2004).
3.2 DERMATÓFITOS
25
Em torno de 1880, Raimond Sabouraud deu início aos estudos sistemáticos dos
dermatófitos resultando na publicação de sua obra clássica Les Teignes em 1910.
Nesta obra, ele classifica os dermatófitos em quatro gêneros: Achorion,
Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton levando em consideração aspectos
clínicos das doenças, associados com observações macroscópicas e microscópicas
das culturas dos fungos (WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995).
Chester Emmons, em 1934, estabeleceu os critérios para a classificação dos
dermatófitos a qual é utilizada atualmente, com base na morfologia dos esporos e
estruturas de ornamentação. Este autor modernizou os esquemas de classificação
taxonômica proposto por Sabouraud e outros pesquisadores e eliminou o gênero
Achorion, reconhecendo somente três gêneros aceitos até os dias de hoje:
Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton. Estudos nutricionais e fisiológicos
posteriores simplificaram a classificação dos dermatófitos conduzindo a uma
redução do número de espécies e variedades (WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995).
A descoberta do estado sexual (telomórfico) de um fungo queratinofílico do solo
por Dawson e Gentles em 1959, permitiu rápidas descobertas de estados
teleomórficos de inúmeros dermatófitos, o que permitiu um grande avanço na
taxonomia dos dermatófitos. A descoberta da reprodução sexuada dos dermatófitos
abriu portas para clássicos estudos genéticos com esses fungos, contribuindo em
um maior entendimento de alguns de seus aspectos biológicos e taxonômicos
(AJELLO; CHENG, 1967; WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995).
Os dermatófitos no seu estado sexuado foram classificados no gênero
Arthroderma (CURREY, 1854) ou Nannizzia (STOCKDALE, 1961). Weitzman et al.
(1986) concluíram que Arthroderma e Nannizzia correspondiam ao mesmo gênero,
sendo adotada atualmente na taxonomia, a denominação Arthroderma.
A forma sexuada dos fungos é denominada de teleomórfica e a denominação
anamórfica é usada para a forma reprodutiva assexuada dos fungos. Até o presente
momento, somente espécies dos gêneros Trichophyton e Microsporum são capazes
de apresentar a forma sexuada. Dentre estas espécies do gênero Trichophyton, T.
mentagrophytes tem sua forma teleomórfica descrita, e enquanto T. rubrum ainda
não; sendo ambos foco de estudo no presente trabalho (LACAZ et al., 2002;
WEITZMAN et al., 1986).
26
Sendo assim, os fungos dermatófitos constituem um grupo de organismos
altamente especializados que têm a capacidade de invadir o estrato córneo da pele
e anexos de seres humanos e outros animais, produzindo micoses superficiais
conhecidas como dermatofitoses. Suas habilidades em invadir e parasitar tecidos
está intimamente relacionada à utilização de queratina, uma proteína sulfurada e
insolúvel que raramente é utilizada como substrato na natureza. A estrutura
molecular da queratina difere de espécie para espécie e, consequentemente,
diferentes enzimas queratinazes são envolvidas na digestão específica de variadas
queratinas, nos diferentes hospedeiros homens e animais (OYEKA, 2000). Estes
fungos compreendem inúmeras espécies e variedades, agrupadas em três gêneros:
Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton, segundo critérios microscópicos,
macroscópicos e fisiológicos (LACAZ et al., 2002; RIPPON, 1988; SIMPANYA,
2000).
As diferentes espécies de dermatófitos podem ser classificadas também
ecologicamente, conforme seus habitats primários e afinidade por hospedeiros
específicos. Dessa maneira, eles podem ser divididos em três grandes grupos
ecológicos: antropofílicos, geofílicos e zoofílicos (WEITZMAN; SUMMERBELL,
1995).
Os dermatófitos pertencentes ao grupo dos fungos geofílicos apresentam como
saprófitas nos solos e tem a habilidade de colonizar tecidos queratinizados como
penas, pêlos, escamas, cabelos, cascos, chifres, que estejam em processo de
decomposição, após terem sidos dissociados dos seres vivos. Esses fungos podem
causar infecção em homens e animais, porém poucos geofílicos têm esta
capacidade. O principal dermatófito geofílico e virulento é M. gypseum, relatado
como agente causador de dermatofitoses em humanos e animais (RIPPON, 1988;
SIMPANYA, 2000; WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995).
Os fungos zoofílicos têm como hospedeiro preferencial espécies animais como
felinos, suínos, aves, caninos, bovinos, etc. e ocasionalmente infectam o homem.
Raramente crescem no solo como saprófitas, mas sobrevivem em um estado de
latência em materiais contaminados de origem animal. T. verrucosum, T.
mentagrophytes e M. canis são exemplos de fungos enquadrados neste grupo,
sendo o M. canis a espécie melhor documentada como agente etiológico em
humanos. Isto é devido principalmente por ele infectar animais de estimação como
cães e gatos, causando perdas de partículas infectadas no meio domiciliar de modo
27
que o contato com estas estruturas podem resultar em infecções familiares
(RIPPON, 1988; SIMPANYA, 2000; WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995).
Dermatófitos antropofílicos são primariamente associados a seres humanos e
raramente acometem outros animais, além de não conseguirem sobreviver e
proliferar no solo. São comumente transmitidos por propágulos oriundos de lesões
ativas de outro indivíduo de forma direta ou indireta. Como exemplos de fungos
antropofílicos temos T. rubrum, T. mentagrophytes var. interdigitale, T. tonsurrans e
E. floccosum. Os dermatófitos antropofílicos são os mais freqüentes causadores de
dermatofitoses em humanos (RIPPON, 1988; SIMPANYA, 2000; WEITZMAN;
SUMMERBELL, 1995).
Evolutivamente, acredita-se que os dermatófitos tiveram uma origem comum a
partir do solo, onde viviam com sapróbios. A partir de determinado momento da
escala evolutiva, os mesmos adquiriram a capacidade de degradar a queratina do
solo, presente na forma de cabelos, pêlos e descamações cutâneas de animais que
conviviam no mesmo ambiente. Esses fungos passaram então a parasitar esses
animais, adaptando-se à sua pele e pêlos, dando origem aos fungos zoofílicos. O
parasitismo dessas espécies possibilitou uma nova adaptação ao parasitismo
humano, dando origem às espécies antropofílicas (RIPPON, 1988; WEITZMAN;
SUMMERBELL, 1995).
Os dermatófitos zoofílicos e geofílicos tendem a formar lesões mais inflamatórias
que àquelas formadas pelos dermatófitos antropofílicos, porém podem ser mais
espontaneamente curadas. Geralmente quanto mais adaptado ao homem for o
dermatófito, menos capaz será de provocar resposta inflamatória do hospedeiro
(RIPPON, 1988; WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995).
O entendimento dessa distribuição dos dermatófitos determina não apenas os
principais reservatórios das espécies como também ajuda a compreender as
diferentes características clínicas das dermatofitoses, como por exemplo, o sítio
cutâneo geralmente infectado, grau de infecção produzido e cronicidade da infecção
(KURSTAK, 1989).
Quanto à distribuição geográfica mundial, os dermatófitos são cosmopolitas,
observando-se, porém, distribuições regionais mais freqüentes, sob influência de
faixa etária, fatores genéticos, condições climáticas, contato com animais e
exposição a locais públicos e áreas fechadas que favorecem a penetração do
dermatófito no estrato córneo desencadeando a infecção. Em certos casos,
28
correntes migratórias fazem com que determinados agentes etiológicos sejam
introduzidos, na maioria das vezes de forma temporária, nas regiões receptoras de
migrantes (AQUINO et al., 2007; REIS et al., 1992; RUIZ; ZAITZ, 2001).
Epidemiologicamente, as espécies T. rubrum e T. mentagrophytes se destacam
como os principais agentes etiológicos de dermatofitoses em humanos. Em um
trabalho desenvolvido por Lima et al. (1999) em João Pessoa com 1708 pessoas
com suspeita clínica de micoses superficiais, verificaram que cerca de 23,3% dos
casos foram confirmados como sendo dermatofitoses. Em 50,8% T. rubrum foi a
espécie mais encontrada em diferentes formas clínicas da doença, predominando
nos casos de tinea corporis (47%) e tinea capitis (31%). Em sequência, foi
encontrado o fungo T. mentagrophytes com incidência de 22,1% e, da mesma
maneira, predominando nos casos de tinea corporis (18%) e tinea capitis (14%).
Na identificação dos dermatófitos, é preciso analisar sua macrocolônia, com
produção ou não de pigmento, o aspecto do verso e anverso da colônia, as
necessidades nutritivas da amostra isolada e suas características micromorfológicas.
A análise micromorfológica é composta da observação da forma e disposição dos
macroconídios, superfície da parede, microconídios, presença de hifas em raquete,
em espiral ou pectinadas, eventuais clamidoconídios e órgãos nodulares. Em alguns
casos, algumas provas são requeridas para melhor elucidação da espécie, tais
como: teste da uréase, teste de perfuração do pêlo, pigmentação em meio Agar
batata e testes nutricionais (RIPPON, 1988).
3.2.1 Trichophyton rubrum (Castellani) Sabouraud, 1911
É um dermatófito antropofílico e recentemente se tornou o mais comum e
largamente distribuído dermatófito que acomete o homem, sendo um dos principais
causadores de dermatofitoses a exemplo de tinea unguium, tinea pedis, tinea
manuum, tinea corporis e, ocasionalmente, tinea capitis. É responsável por cerca de
70% dos casos de dermatofitoses em humanos do mundo (SANTOS; HAMDAN,
2005). Em trabalhos desenvolvidos por pesquisadores da América do Sul e do
Norte, além da Europa colocam este micro-organismo como sendo um dos mais
comumente isolado em casos de dermatofitoses nessas regiões e com reconhecida
resistência à terapêutica local (REIS et al., 1992; MEZZARI, 1998; RUBIO et al.,
1999; RUIZ; ZAITZ, 2001; COSTA et al., 2002; PADILLA et al., 2002; VALDIGEN et
29
al., 2006). No Brasil, ele também continua sendo o dermatófito mais frequentemente
isolado (AQUINO et al., 2003; COSTA et al., 2002; LIMA et al., 1999; RUIZ; ZAITZ,
2001; ZAITZ et al., 1998).
FIGURA 1. Estruturas microscópicas T. rubrum ATCC 1683,
com a presença de microconídios em forma de gota
dispostos ao logo do conidióforo (400x). Barra = 50 µm
T. rubrum tem uma taxa de crescimento lenta, tornando-se completamente
maduro em torno de 14 dias. As colônias em seu crescimento primário são
geralmente cotonosas e brancas, tornando-se aveludadas posteriormente. O reverso
da colônia apresenta pigmentação de coloração avermelhada ou vermelho-púrpura,
que se difunde no meio de cultivo; melhor evidenciado em ágar batata. Em certas
ocasiões, a coloração é inicialmente amarelada, escurecendo gradativamente até se
tornar vermelha. As colônias possuem pregas radiais, formando uma pequena
saliência no centro. Suas hifas são hialinas, septadas com microconídios em forma
de lágrima ou gota, com aproximadamente 2-3 por 3-5 µm, dispostos ao longo das
hifas ou em cachos. Os macroconídios são raros, produzidos geralmente por
amostras mais granulosas, esporulantes, formados no final das hifas, sozinhos ou
30
em grupos. Eles são longos, estreitos, com bordas laterais bem paralelas, paredes
finas, com 2-8 septos e dimensões de 6-8 por 60-80µm (LACAZ et al., 2002;
LARONE, 1995).
Além dos critérios morfológicos, alguns testes são importantes na diferenciação
do T. rubrum de outras espécies. A produção de pigmento em meio ágar batata e a
ausência na perfuração de pêlos in vitro podem auxiliar na diferenciação entre o T.
rubrum e o T. mentagrophytes. Além disso, o T. rubrum é incapaz de hidrolisar a
uréia, no teste de urease em meio de Christensen, diferentemente do T.
mentagrophytes (LACAZ et al., 2002).
3.2.2 Trychophyton mentagrophytes (Robin) Blanchard, 1896
T. mentagrophytes assim como outros dermatófitos, tem a capacidade de
digerir áreas queratinizadas no homem, em outros mamíferos e aves, e atualmente,
é um dos dermatófitos mais comumente encontrado no homem, nos animais e no
solo. (OYEKA, 2000).
Esta espécie possui pelo menos cinco diferentes variantes. Basicamente o que
diferencia estas variantes são suas características relacionadas à ecologia dos
dermatófitos. T. mentagrophytes var interdigitale é um antropofílico causador de
tinea pedis, tinea corporis e, algumas vezes, invade a lâmina ungueal apresentando
pontos brancos; T. mentagrophytes var nodulare é um forma rara antropofílica que
ocasionalmente é isolado em casos de tinea pedis, não invade o cabelo in vivo, mas
perfura o pêlo in vitro; T. mentagrophytes var mentagrophytes é zoofílico, infectando
grande número de animais como macacos, cobaias, gatos, cavalos, carneiros,
coelhos e cangurus, podendo produzir lesões mais inflamatórias na pele e couro
cabeludo de humanos; T. mentagrophytes var quinckeanum é zoofílico e causa
lesões
crostosas
em
camundongos
e,
ocasionalmente
no
homem;
T.
mentagrophytes var. erinacei é também zoofílico, isolado em ouriços e raramente em
humanos, encontrado atualmente em regiões da Europa e Nova Zelândia. Todas
estas variantes compõem o complexo T. mentagrophytes, e sua diferenciação se
torna impossível em um único meio, portanto será tratado nesse trabalho em sua
totalidade, como o complexo (AJELLO; CHENG, 1967; HOUCK et al., 1996; OYEKA,
2000).
31
T.
mentagrophytes
é
universalmente
distribuído
onde
suas
formas
antropofílicas e zoofílicas são encontradas, acometendo o homem principalmente
nas regiões do couro cabeludo, pés e mãos, unhas e regiões interdigitais.
Clinicamente, essa espécie é responsável pela segunda ou terceira causa de
dermatofitose em humanos; quando essas lesões são provocadas por variações
zoofílicas, apresentam maior intensidade inflamatória (OYEKA, 2000; RIPPON,
1988).
A
B
FIGURA 2. Estruturas microscópicas de T. mentagrophytes LM02 (400x), com a presença
de microconídios agrupados em torno dos conidióforos (A) e macroconídios charutoides com
poucos septos (B). Barra = 50 µm.
É um dermatófito de crescimento moderado, conseguindo em de 7 a 10 dias
um estado maduro da colônia, em semeadura primária. Numerosas variações na
morfologia da colônia são vistas entre as variantes que compõem o complexo T.
mentagrophytes. Em ágar sabouraud dextrose, a forma antropofílica cresce com
colônias planas, de coloração branca a creme e superfície aveludada, pulverulenta
ou até mesmo ou cotonosa; com reverso pigmentado de amarelo a marrom,
escurecendo com a idade. Em ágar batata, o micélio aéreo é esparso com
numerosos esporos. Em isolados zoofílicos, no ágar sabouraud dextrose, as
colônias são geralmente planas, de coloração branca a creme e superfície
32
pulverulenta a granular; o reverso apresenta pigmento amarronzado ou marromamarelado (LACAZ et al., 2002; OYEKA, 2000).
Microscopicamente, o fungo possui hifas hialinas septadas com macroconídios
dificilmente presentes. Esses são charutoides e de parede fina, com estreita
aproximação às hifas, geralmente com 3 a 5 septos, sendo comumente encontrados
nas colônias mais jovens. Estes esporos possuem dimensões em torno de 20-50 por
4-8μm. A principal característica de T. mentagrophytes, no entanto, é a presença de
microconídios globosos e agrupados nas ramificações dos conidóforos, (hifas
especiais que dão origem aos conídios) cujo arranjo lembra um cacho de uvas.
Esses são mais abundantes em cepas zoofílicas, cujas colônias apresentam-se mais
granulosas. Podem também ser vistas hifas na forma de espiral assim como corpos
nodulares e clamidoconídios, em algumas cepas (LACAZ et al., 2002; LARONE,
1995; OYEKA, 2000).
Aspectos fisiológicos são bastante marcantes em cepas de T. mentagrophytes.
Dessa maneira, pode-se observar intensa atividade da enzima urease facilmente
detectável em meio de Christensen, positivando o teste em poucos dias; perfuração
do pêlo in vitro em até 40 dias e ausência de pigmentação em meio ágar batata
(BADILLET, 1991; LACAZ et al., 2002; OYEKA, 2000).
3.3 TRATAMENTO DAS DERMATOFITOSES
A escolha do tratamento adequado das dermatofitoses é determinada pelo sítio,
pela extensão da infecção e pela espécie envolvida, tão bem quanto pela eficácia,
segurança e biodisponibilidade dos fármacos, podendo ser tratadas topicamente,
sistemicamente ou associando-se ambas as formas de tratamento. Os antifúngicos
tópicos aplicados localmente nas lesões podem ser apresentados sob a forma de
gel, cremes, esmalte de unhas ou pomadas (TORRES, 2005).
Atualmente, são numerosos agentes antifúngicos comumente empregados na
prática clínica. Esses fármacos podem ser fungicidas – aqueles agentes que
conseguem destruir as células fúngicas – ou fungistáticos – aqueles agentes que
apenas inibem o crescimento do fungo. Para pequenas lesões localizadas na pele a
terapia tópica é genericamente utilizada. Para tinea unguium, lesões do couro
cabeludo, lesões extensas ou na pele com foliculite, o tratamento com antifúngicos
33
sistêmicos também é necessário (ALOU et al., 2001; DEBRUYNE; COQUEREL,
2001; GUPTA; TU, 2006; MILLKAN, 2001; NIEWERTH; KORTING, 2000).
Alguns agentes se destacam na utilização clínica para o tratamento das
dermatofitoses. Em infecções mais brandas, o tratamento com antifúngico tópico tem
como base o uso de derivados imidazólicos dos quais clotrimazol, cetoconazol,
miconazol e isoconazol são comumente utilizados. Outro antifúngico de uso tópico
frequentemente utilizado é a terbinafina. Para o tratamento das lesões crônicas ou
mais severas, terbinafina, griseofulvina e triazólicos como itraconazol e fluconazol
são mais utilizados (FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002; FERNÁNDEZ-TORRES et
al., 2003).
3.3.1 Azólicos
Os antifúngicos azólicos foram descobertos na década de 1970, são totalmente
sintéticos e se apresentam como o grupo de agentes antifúngicos que estão se
expandindo muito rapidamente, assumindo a maior classe de agentes em uso
clínico, devido à sua baixa toxicidade e elevada eficácia para micoses superficiais e
profundas (BENNETT, 2005; GERGOPAPADAKOU, 1998; ODDS et al., 2003).
Eles são classificados como imidazólicos ou triazólicos, diferindo-se nas suas
estruturas químicas, com base se eles possuem dois ou três átomos de nitrogênio,
respectivamente, no anel azólico composto de cinco membros (Figuras 3, 4). Os
parâmetros essenciais para a atividade antifúngica são a presença e, pelo menos,
um anel imidazólico e a união desse anel ao restante da molécula por uma ligação C
– N (LACAZ et al., 2002).
Ambos compartilham o mesmo espectro antifúngico e mecanismo de ação. Os
triazólicos são metabolizados mais lentamente, exercem menos efeitos colaterais e,
portanto, os novos fármacos azólicos em desenvolvimento são derivados triazólicos.
Alguns exemplos de produtos do grupo dos imidazólicos mais estudados e melhor
conhecidos são o cetoconazol, miconazol, tioconazol, econazol e clotrimazol, entre
outros; já nos triazólicos enquadram-se o itraconazol e fluconazol, além do
terconazol. Os novos triazólicos em uso clínico são: voriconazol e ravuconazol que
são estruturalmente relacionados ao fluconazol; e o posaconazol, com estreita
relação com o itraconazol (BENNETT, 2005; LACAZ et al., 2002; ODDS et al., 2003).
34
Os azólicos atuam na biossíntese do ergosterol, o principal esterol presente na
membrana celular de todas as células fúngicas. Esta interferência se processa por
meio da inibição da 14-α-desmetilase, enzima que catalisa a remoção oxidativa do
grupo 14-α-metil do lanosterol por uma típica atividade P450 monoxigenase; é
primeira
transformação
depois
da
ciclização
do
epóxido
do
esqualeno
(GERGOPAPADAKOU, 1998; ODDS et al., 2003). Esta proteína contém um ferro
protoporfirínico localizado no seu sítio ativo que serve como alvo para antifúngicos
azólicos via interação com o átomo de nitrogênio presente nos anéis imidazólico ou
triazólico. A natureza da interação entre a proteína e o azólico e a exata
conformação do sítio ativo vai depender da estrutura do fármaco e das espécies
onde essas enzimas estão presentes. Estes fatores determinam a extensão do efeito
fungistático dos azóis, bem como de seus efeitos colaterais (BOSSCHE et al., 1995;
ODDS et al., 2003).
Com a depleção do ergosterol e sua substituição com esteróis incomuns como
o lanosterol (14-α-metilesterol), ocorre desagregação no arranjo dos lipídios de
membrana, alterando a fluidez da membrana, com consequências secundárias nas
funções de determinadas enzimas ligadas à membrana – envolvidas na síntese da
parede celular e H+/ATPase – inibindo, assim, o crescimento fúngico (BENNETT,
2005, ODDS et al., 2003).
Os derivados azólicos inibem a biossíntese de esteróis do hospedeiro
(colesterol) do mesmo modo dos fungos, atuando sobre os sistemas enzimáticos
dependentes do citocromo P450 em diversos tipos celulares do homem. Dessa
forma, podem ser observadas diversas anormalidades de origem endocrinológica,
variando de acordo com a dose, duração do tratamento e de fatores relacionados
aos usuários desses produtos, a exemplo da idade, sexo e “status” fisiológico
(BENNETT, 2005).
35
FIGURA 3. Estrutura química do cetoconazol. Fonte: BENNETT (2005).
FIGURA 4. Estrutura química do itraconazol. Fonte: BENNETT (2005).
3.3.2 Alilaminas
Esta classe de compostos foi descoberta em meados de 1970. Seus
componentes são totalmente sintéticos e a única alilamina antifúngica em uso clínico
é a terbinafina que mostra eficácia no uso oral e tópico (Figura 5). É um reversível
inibidor não competitivo da esqualenoepoxidase, uma enzima envolvida nas etapas
iniciais da síntese de esteróis (GERGOPAPADAKOU, 1998; ODDS et al., 2003). A
36
2,3-esqualenociclase juntamente com a esqualenoepoxidase, são responsáveis pela
ciclização do esqualeno a lanosterol (GERGOPAPADAKOU, 1998).
Em consequência à ação da terbinafina, ocorre a depleção de ergosterol e
acúmulo de esqualeno afetando a estrutura e função da membrana, com
consequências fungicidas em espécies susceptíveis (GERGOPAPADAKOU, 1998;
GEORGOPAPADAKOU; BERTASSO, 1992; ODDS et al., 2003).
Esse fármaco possui elevada lipossolubilidade, o que justifica sua relativa
afinidade pelo estrato córneo da pele e unhas. Desse modo, os fármacos desse
grupo são bastante eficazes e indicados no tratamento das dermatofitoses e
candidíase cutânea (BENNETT, 2005; SIDRIM; ROCHA 2004; LACAZ et al., 2002).
FIGURA 5. Estrutura química da terbinafina. Fonte: BENNETT (2005).
3.3.3 Griseofulvina
A griseofulvina – descoberta em 1939 por Oxford et al, a partir do fungo
Penicillium griseofulvum – foi o primeiro agente específico para espécies fúngicas
(ODDS et al., 2003). É um derivado benzofurano (Figura 6), com estrutura química
37
semelhante à colchicina e com eficácia comprovada principalmente para o
tratamento das dermatofitoses (LACAZ e al., 2002).
Esse fármaco se distribui largamente pelos tecidos queratinizados tais como a
pele, pêlos e unhas. De acordo com estas circunstâncias, a griseofulvina é um dos
principais agentes de escolha no tratamento das dermatofitoses (SIDRIM; ROCHA,
2004). Sua indicação é direcionada na terapêutica de tinea capitis, tinea corporis e
tinea unguium além das demais formas clínicas resistentes às aplicações tópicas de
diferentes antifúngicos (LACAZ et al., 2002).
FIGURA 6. Estrutura química da griseofulvina. Fonte: BENNETT (2005).
O preciso mecanismo de ação deste fármaco é ainda obscuro. Uma das
manifestações morfológicas proeminentes da ação da griseofulvina consiste na
formação de células multinucleadas, de parede celular espessa e hifas encurvadas.
Isto é atribuído ao fato da griseofulvina inibir a formação do fuso mitótico por meio de
sua
interação
com
os
microtúbulos
polimerizados,
inibindo
a
mitose
e,
consequentemente, a multiplicação do micro-organismo. A griseofulvina tem efeitos
semelhantes à colchicina, havendo evidências de que antifúngico liga-se a uma
38
proteína associada aos microtúbulos, além de sua ligação direta à tubulina
(DEVELOUX, 2001; BENNETT, 2005).
Casos de resistência à griseofulvina não têm sido descritos na literatura, porém
o emprego indiscriminado, bem como o tratamento insuficiente ou incompleto deve
ser evitado para impedir o aparecimento de cepas resistentes e recidivas da doença
(LACAZ et al., 2002).
3.4 RESISTÊNCIA A ANTIFÚNGICOS
A prevalência de infecções por fungos filamentosos e leveduriformes aumentou
drasticamente durante as duas últimas décadas, principalmente devido à síndrome
da
imunodeficiência
imunossupressores
adquirida
e
(AIDS)
procedimentos
e
ao
médicos
aumento
(FRIDKIN;
da
utilização
JARVIS,
de
1996;
VANDENBERGH et al., 1999, KAPLAN et al., 2000). O aumento do diagnóstico de
infecção fúngica foi seguido por uma utilização mais alargada de agentes
antifúngicos, com distintos modos de ação, com propósitos profiláticos quanto
terapeuticamente. Em suma, esses fatores favoreceram o emergente aparecimento
de espécies fúngicas que desenvolveram resistência aos variados antifúngicos
(CIHLAR et., 2002).
O uso ou dose inadequada das drogas contribuem para o fracasso em eliminar o
agente causador da doença completamente, estimulando o crescimento dos mais
resistentes, o que pode levar ao difícil tratamento das infecções fúngicas. A
resistência in vitro de um isolado pode ser classificada como intrínseca ou adquirida.
A resistência intrínseca permite a todos os membros normais de uma espécie a
tolerar uma determinada droga. Neste caso, uma característica específica
responsável pela resistência é inerente às espécies e surgiu através do processo de
evolução. Já a resistência adquirida é um termo utilizado quando uma cepa
resistente emerge a partir de uma população que foi anteriormente sensível a uma
droga específica (GHANNOUM et al., 2004; MARTINEZ-ROSSI et al., 2008).
Diversos mecanismos bioquímicos contribuem para o fenótipo de resistência a
drogas nos fungos. O mais freqüente deles envolve uma modificação na membrana
plasmática reduzindo a permeabilidade ou captação da droga, alterações estruturais
no sítio alvo e um aumento no efluxo das drogas ou alteração nos níveis
intracelulares dos alvos (DEISING et al., 2008).
39
Micro-organismos podem responder a concentrações subletais de produtos
químicos e agentes físicos por sintetizar uma variedade de proteínas específicas de
baixo peso molecular, compostos que são úteis para agir como protetores ou
efetores de sinalização para promover o desenvolvimento de reações de defesa ou
tolerância (FACHIN et al., 2001). Os fungos têm inúmeras vias de transdução de
sinais para sentir e assegurar adequados mecanismos fisiológicos para se adaptar
ao estresse ambiental, que é caracterizado pelas mudanças na expressão de genes
relacionados ao estresse. As drogas antifúngicas induzem respostas celulares
relacionadas ao estresse que são necessárias para superar os efeitos tóxicos destas
drogas permitindo a sobrevivência fúngica (MARTINEZ-ROSSI et al., 2008).
3.5 PRODUTOS NATURAIS
O uso terapêutico das plantas medicinais é um dos pontos mais característicos
da espécie humana, tão antigo quanto à própria humanidade e encontrado
praticamente em todas as civilizações e grupos culturais conhecidos (RODRIGUES,
2007).
O emprego das plantas medicinais pelas populações brasileiras atualmente é
influência de várias tradições culturais, resultando em sistemas etnofarmacológicos
bastante diferenciados. Entre eles pode-se incluir o sistema etnofarmacológico
africano, europeu, indígena, oriental, amazônico, nordestino, além do sistema
científico europeu, resultado de pesquisas científicas com plantas de países
europeus. O resultado disso são as práticas de uso medicinal de plantas por
comunidades brasileiras, que fazem delas um dos seus principais recursos no
tratamento de doenças ou manutenção da saúde (RODRIGUES, 2007).
Estas informações ganham mais destaque quando a Organização Mundial de
Saúde (OMS) se posiciona a respeito da necessidade de valorizar a utilização de
plantas medicinais, na declaração de Alma-Ata, em 1978. A OMS reconhece que a
grande parte da população dos países em desenvolvimento depende da medicina
tradicional para sua atenção primária, onde 80 % desta população fazem uso da
medicina tradicional e 85% destes utilizam plantas ou preparações destas para
suprir as suas necessidades básicas na atenção primária à saúde (WHO, 2002;
BRASIL, 2006). Na América do Sul, o uso dessas plantas contribui de forma
significativa no cuidado primário a saúde e muitas delas são utilizadas no Brasil sob
40
a forma de extratos brutos, infusões, pastas ou outras formas de preparados para o
tratamento de infecções (HOLETZ et al., 2002).
É inegável a importância dos produtos naturais no desenvolvimento de novas
ferramentas terapêuticas. Neste ponto, as plantas medicinais e os produtos
derivados delas, são reconhecidamente importantes para a pesquisa farmacológica
e o desenvolvimento de drogas. Isto tanto porque podem ser utilizados diretamente
como agentes terapêuticos, como também de fonte de matéria-prima para a síntese,
ou ainda podem servir de protótipos para novos modelos farmacologicamente ativos
(BRASIL, 2006). E nesse sentido, o estudo apropriado da química e farmacologia de
plantas medicinais se apresenta como um instrumento relevante de investigação de
suas propriedades, garantindo à comunidade informações seguras envolvendo
essas plantas e, dessa forma, contribuindo com a ampliação do conhecimento.
No tocante às aplicações das plantas medicinais com propósito antimicrobiano, a
ideia de que certas plantas tinham potencial dito cicatrizante ou curativo era bem
aceita muito antes da descoberta dos próprios micróbios pela humanidade.
Atualmente, sabe-se que essas plantas continham o que é caracterizado como
propriedades antimicrobianas. Desde a antiguidade que as plantas medicinais são
utilizadas para tratar doenças infecciosas que comumente acometem a população.
Dos produtos encontrados nessas plantas, são os óleos essenciais que tem o maior
uso popular no tratamento de infecções em muitas partes do corpo como sistema
respiratório, trato intestinal, trato urinário e sistemas biliares e na pele (RIOS;
RECIO, 2005).
Tendo em vista a crescente importância clínica e epidemiológica dispensada às
infecções micóticas e a necessidade de tratamentos mais eficazes e menos tóxicos
para os indivíduos acometidos, numerosas pesquisas vêm sendo desenvolvidas na
expectativa de se obter novos produtos antifúngicos. A busca por novas drogas a
partir de produtos naturais continua sendo um assunto de grande importância no
cenário mundial, pois a adequada vigilância na competição entre fungos e humanos,
nos remete à informação de que novos alvos susceptíveis e novos agentes
continuarão sendo requeridos para uma terapia mais efetiva (ODDS et al., 2003).
Contudo, mesmo com o avanço da tecnologia, o processo para descobrir e produzir
novas drogas que possam ser utilizadas na terapêutica torna-se o principal déficit,
que paradoxalmente, afeta a indústria farmacêutica (PATWARDHAN et al., 2004).
41
É nessa perspectiva que muitos estudos de atividade biológica, incluindo
atividade antimicótica, têm sido realizados com óleos essenciais obtidos de plantas
medicinais, a exemplo do óleo essencial de C. winterianus. Entre as plantas
empregadas com finalidades medicinais em todo o mundo, as plantas aromáticas
constituem um grupo de vegetais proeminentes principalmente pelos óleos
essenciais (NUNES et al., 2006).
Os óleos essenciais são complexos de compostos voláteis caracterizados pelo
odor forte e são formados por plantas aromáticas como metabólitos secundários,
encontrados em suas folhas, resinas, frutos, flores, troncos e outras partes. Eles são
estocados em células secretórias, cavidades, canais, células epidérmicas ou
tricomas
glandulares
(BURT,
2004).
Seus
componentes
variam
desde
hidrocarbonetos terpênicos, alcoóis simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis,
ésteres, éteres, óxidos, peróxidos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas e até
mesmo compostos com enxofre. Há vários métodos de obtenção dos óleos
essenciais, como por exemplo por meio de expressão, enfleurage ou extração, mas
o método de destilação por vapor de água é o mais comumente utilizado (VAN DE
BRAAK; LEIJTEN, 1999; SIMÕES; SPITZER, 2007).
Sabe-se que alguns óleos essenciais são amplamente usados especialmente
pelas indústrias farmacêuticas, sanitárias, cosmética, agricultura e de alimentos
devido às suas ações bactericida, fungicida, parasiticida, inseticida e virucida, além
de outras propriedades medicinais, (BAKKALI et al., 2008). Alguns aspectos devem
ser considerados quanto à importância desses produtos para os próprios vegetais,
nesse caso, atuam como inibidores da germinação, na proteção contra predadores,
e contra a perda de água, aumento da temperatura, além de estarem envolvidos na
atração de polinizadores e atuarem contra herbívoros, ao reduzirem o apetite desses
animais pelas plantas (CRAVEIRO; MACHADO et al., 1986; HARBONE, 1993).
3.5.1 Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor
A família Poaceae, também denominada Gramineae, inclui cerca de 668
gêneros e aproximadamente 9.500 espécies distribuídas universalmente e com
grande importância econômica. Essa família botânica inclui plantas herbáceas com
raízes fibrosas e rara ocorrência de arbustos ou árvores. As espécies de Poaceae
contêm uma grande variedade de constituintes químicos, e uma grande proporção
42
desses produtos é utilizada na indústria de gêneros alimentícios, amido, açúcar e
óleos essenciais. Os outros constituintes incluem alcalóides, saponinas, substâncias
cianogênicas, ácidos fenólicos, flavonoides e terpenoides (EVANS, 1996).
As espécies da família Poaceae são cultivadas em larga escala, principalmente
em países tropicais e subtropicais, podendo ser cultivadas em regiões montanhosas,
de planícies ou até mesmo em regiões áridas, sendo cultivada largamente em
regiões tropicais e subtropicais do planeta em função de suas propriedades
aromáticas (MARCO et al., 2007).
Cymbopogon é um importante gênero da família Poaceae e é representado por
cerca de 120 espécies e suas variedades, em torno de 100 espécies são
encontradas em países tropicais Esse gênero tem sua importância econômica na
produção de óleo essencial, como por exemplo, o C. winterianus (LORENZI;
MATOS, 2003).
C. winterianus (Figura 7), popularmente conhecida como citronela, é uma
planta perene a qual pode chegar até 1 metro de altura. Acredita-se que esta planta
foi originada do Sri Lanka. É uma planta aromática cultivada na Índia e no Brasil, que
serve como importante fonte de produção de seu óleo essencial para esses países.
C. winterianus tem elevada relevância econômica devido à extração de seu óleo
essencial a partir de suas folhas, os quais são empregados nas indústrias de
perfumaria, cosméticos, produtos farmacêuticos e aromatizantes (WIJESEKERA et
al., 1973; ROCHA et al., 2000). O cultivo de C. winterianus no Brasil tem um forte
espaço no mercado de produtos naturais justificado pela grande procura do seu óleo
essencial tanto no mercado interno como para exportação (ROCHA et al., 2000).
43
A
FIGURA 7. C. winterianus (Poaceae) no horto do Centro de
Formação de Tecnólogos, Campus III da UFPB.
É uma planta de grande utilidade na medicina popular nas regiões litorâneas e
também por populações ribeirinhas do Brasil no controle de fungos, de ácares e,
principalmente, como repelente contra uma variedade de insetos. Nesse caso, o seu
óleo essencial é largamente utilizado associado a óleos minerais e vegetais em
formulações para impedir picadas de insetos (GUENTHER, 1992; MATOS 2000;
ROCHA et al., 2000; PANDEY; RAI, 2003). Além dessas propriedades, infusões de
suas folhas frescas são utilizadas na medicina popular do nordeste do Brasil para o
tratamento de epilepsia e da ansiedade (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2008).
Material e Métodos
45
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 LOCAL DE TRABALHO
O trabalho foi realizado no Laboratório de Micologia do Departamento de
Ciências Farmacêuticas, do Centro de Ciências da Saúde (CCS), da Universidade
Federal da Paraíba (UFPB). E parcerias, para o apoio no desenvolvimento deste
trabalho, foram realizadas com as equipes dos seguintes locais:
 Laboratório de Tecnologia Farmacêutica – UFPB;
 Centro de Formação de Tecnólogos (CFT) – UFPB;
 Laboratório de Botânica – UFPB;
 Laboratório de Microscopia e Imagem Biológica – UFPB;
4.2 MATERIAL BOTÂNICO
O óleo essencial de C. winterianus foi fornecido pelo Dr. Paulo Alves Wanderley,
do CFT, Campus III da UFPB, Bananeiras-PB. As folhas da planta foram coletadas
em fevereiro de 2007, no setor de agricultura do CFT na cidade de Bananeiras, uma
região localizada na microrregião do Brejo incluída na mesorregião Agreste do
estado da Paraíba (Figura 8). Esta espécie foi identificada pela Dr.ª Rita Baltazar de
Lima, do Laboratório de Botânica do Departamento de Sistemática e Ecologia, do
Centro de Ciências Exatas e da Natureza da UFPB e registrada no Herbário Prof.º
Lauro Pires Xavier, onde uma exsicata foi depositada com o registro JPB 41387.
46
Bananeiras
Paraíba
FIGURA 8. Localização geográfica da cidade de Bananeiras-PB. Fonte: ABREU,
(2006), adaptado.
4.2.1 Óleo essencial
As folhas frescas de C. winterianus (100 g) foram cortadas em pequenas
unidades e submetidas a uma hidrodestilação utilizando um aparelho de Clevenger.
O óleo essencial apresentou-se isento de resíduos, densidade de 0,8790 g/mL, odor
característico e coloração verde clara (Figura 9). O óleo foi conservado em um
frasco âmbar e mantido sob refrigeração, a uma temperatura inferior a 4°C.
As emulsões do óleo essencial nas diferentes concentrações foram preparadas
no momento de execução dos ensaios. Em um tubo de ensaio esterilizado, foi
adicionado 60.000 µg do óleo essencial, 0,02 mL de Tween 80 como agente
emulsificante e quantidade suficiente para 3 mL de água destilada estéril. A mistura
foi agitada por 5 minutos utilizando o aparelho Vortex, obtendo uma emulsão de
concentração final de 20.000 µg/mL. A partir desta, obtiveram-se as concentrações
inferiores realizando diluições seriadas em razão de dois utilizando água destilada
ou o próprio meio de cultura líquido estéreis como diluentes (ALEGRINI et al., 1972).
47
A
B
FIGURA 9. Aspecto visual do óleo essencial de C. winterianus (A) e
embalagem de conservação (B).
4.2.2 Análise dos componentes do óleo essencial
A análise dos componentes do óleo essencial foi realizada no Laboratório de
Química Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM), utilizando o
instrumento QP-5050A equipado com um GC-17A (Shimadzu, Japão) (ADAMS,
2001; MCLAFFERTY; STAUFFER, 1989). O procedimento foi realizado nas
seguintes condições analíticas:
 Diluição da amostra: 1:1000 em hexano (v/v);
 Volume de injeção da amostra: 1 µL;
 Gás de arraste: Hélio (He);
 Vazão do gás de arraste: 0,9 mL/min/
 Pressão da cabeça da coluna: 48,9psi;
 Temperatura do detector: 280°C;
48
 Característica da coluna: coluna capilar apolar de sílica fundida de 30 m de
comprimento, 0,25 mm de diâmetro, 0,25 µm de diâmetro do filme da fase
estacionária líquida;
 Programa de temperatura: temperatura inicial de 60°C, com aumento
gradual até 240°C a uma taxa de 3°C/min. A temperatura permaneceu em 240°C por
10 minutos.
As condições de uso do espectrômetro para a detecção e identificação dos
componentes do óleo essencial foram as seguintes:
 Temperatura da linha de transferência: 170°C;
 Voltagem de ionização: 70 eV;
 Faixa de scanning (scan time): 0,5 s;
 Demora no início de atuação do espectrômetro (delay): 1,5 min.
A composição química do óleo essencial das folhas de C. winterianus foi
determinada por cromatografia a gás acoplada a um espectrômetro de massas (CGEM). Os componentes foram identificados por comparação de seus padrões de
fragmentação registrados nos espectros de massa com àqueles presentes na
biblioteca de espectrômetros de massas NIST 98 (Library, National Institute of
Standards and Technology, EUA) que está instalada no computador e com relatos
encontrados na literatura. A quantificação dos componentes foi realizada com base
na percentagem de área do pico de cada componente em relação à área total de
todos os picos normalizados no cromatograma.
4.3 FÁRMACOS ANTIFÚNGICOS
Nesta pesquisa, foi utilizado como controle positivo ou droga padrão o
cetoconazol e anfotericina B, ambos adquiridos na Sigma-Aldrich (São Paulo-SP), na
forma de pó. As soluções foram preparadas no momento de execução dos testes,
para o alcance da concentração desejada nos testes de sensibilidade.
49
4.4 MICRO-ORGANISMOS
Para os ensaios de atividade antifúngica, foram selecionadas 24 cepas das
quais foram 16 cepas da espécie T. rubrum e 8 cepas da espécie T.
mentagrophytes, obtidas da coleção do Laboratório de Micologia (LM), e uma cepa
padrão da “American Type Culture Collection” (ATCC). As cepas testadas foram: T.
rubrum ATCC 1683, LM 63, LM 98, LM 130, LM 222, LM 309, LM 333, LM 422, LM
600, LM 629, LM 640, LM 710, LM 713, LM 720, LM 722 e LM 730; T.
mentagrophytes LM 02, LM 07, LM 11, LM 28, LM 79, LM 202, LM 308 e LM 962.
As cepas estoque utilizadas nos ensaios foram mantidas em tubos de ensaio
contendo ágar batata inclinado, sob refrigeração (8°C).
4.5 MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura utilizados nos ensaios para avaliação da atividade
antifúngica foram o meio sólido ágar Sabouraud dextrose (ASD) e o meio líquido
caldo Sabouraud dextrose (CSD) e preparado de acordo com as instruções do
fabricante. Para conservação das cepas e preparação do inoculo foi utilizado o ágar
batata dextrose (ABD). Seguem-se as descrições das formulações de cada meio de
cultura utilizado:
 Ágar Sabouraud Dextrose
Peptona ................................................................... 5 g
Caseína ................................................................... 5 g
Dextrose ................................................................ 40 g
Ágar ....................................................................... 15 g
Água destilada q.s.p. ...................................... 1000 mL

Caldo Sabouraud Dextrose
Peptona ................................................................... 5 g
Caseína ................................................................... 5 g
Dextrose ................................................................ 20 g
50
Água destilada q.s.p. ...................................... 1000 mL

Agar Batata Dextrose
Féculas de batata .................................................... 4 g
Dextrose ................................................................ 20 g
Ágar ....................................................................... 15 g
Água destilada q.s.p. ...................................... 1000 mL
Os meios foram adquiridos da Difco Laboratories Ltda, solubilizados com água
destilada esterilizada, distribuídos em tubos de ensaio ou balões de fundo chato e
esterilizados em autoclave, a 121°C por 15 minutos.
4.6 INÓCULO
Na preparação do inoculo dos dermatófitos, primeiramente os isolados foram
cultivados em meio ABD a 28°C por 10 dias, para atingirem um satisfatório
crescimento. As recentes colônias fúngicas foram devidamente cobertas com 5 mL
de solução salina estéril (NaCl 0,85 % p/v), e as suspensões foram feitas por suaves
agitações e raspagens com auxílio de uma alça de platina em “L”. A mistura
resultante de conídios e fragmentos de hifas foi retirada e transferida para tubos de
ensaio esterilizados (FERNÁDEZ-TORRES et al., 2002; SANTOS; HAMDAN, 2005).
Em seguida, essas suspensões foram agitadas por 2 minutos com auxílio do
aparelho Vortex. Após agitação, cada suspensão teve sua turbidez visualmente
comparada e ajustada àquela apresentada pela suspensão de sulfato de bário do
tubo
0,5
da
escala
McFarland,
a
qual
corresponde
a
um
inóculo
de
aproximadamente 106 unidades formadoras de colônias/mL (UFC/mL) (CLEELAND;
SQUIRES, 1991; HADACEK; GREGER, 2000; SAHIN et al., 2004).
A quantificação do inoculo foi confirmada por meio do plaqueamento de 0,01 mL
das suspensões em ASD. As placas foram incubadas a 28°C e examinadas
diariamente para a contagem das colônias, determinando o número de UFC/mL
(CLEELAND; SQUIRES, 1991;HADACEK; GREGER, 2000).
51
4.7 METODOLOGIA
4.7.1 Screening microbiológico
O screening microbiológico foi realizado com base na técnica de difusão em
meio sólido com discos de papel de filtro (BAUER, et al., 1966; HADACEK;
GREGER, 2000; KONEMAN et al., 1993). Em placas de Petri (90 x 15 mm)
descartáveis e estéreis (ALAMAR Tecno Científica Ltda – Diadema/SP), foi colocado
1 mL da suspensão do micro-organismo. Em seguida, adicionou-se cerca de 20 mL
do meio ASD fundido à 50°C e todo o sistema foi homogeneizado. Após solidificação
do meio, um disco de papel de filtro (Sensiobiodisc do Centro de Controle e
Produtos para Diagnósticos Ltda – CECON/SP) embebido com 20 µL do óleo
essencial in natura foi depositado na superfície do meio de cultura ao centro da
placa de Petri. Todo o sistema foi incubado a 28°C por até 10 dias.
Os ensaios foram realizados em duplicata e o resultado foi expresso pela
média aritmética dos halos de inibição obtidos nos dois ensaios. A atividade
antifúngica do óleo essencial foi considerada positiva quando a média aritmética dos
halos de inibição foi superior ou igual a 10 mm de diâmetro, em pelo menos 50% do
total de cepas testadas (LIMA et al., 1993; LIMA, 1996; NUNES et al., 2006).
4.7.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
A determinação da CIM do óleo essencial foi realizada pelo método de
microdiluição, utilizando placas de microtitulação contendo 96 cavidades com fundo
em forma de “U” (ALAMAR®) (KONEMAN et al., 1993; HADACEK; GREGER, 2000;
SANTOS; HAMDAN, 2005; ALVES, 2006). Em cada orifício da placa, foi adicionado
100 µL do meio líquido CSD duplamente concentrado. Posteriormente, 100 µL da
emulsão do óleo essencial, também duplamente concentrado, foram dispensados
nas cavidades da primeira linha da placa. E por meio de uma diluição seriada a uma
razão de dois, foram obtidas concentrações de 20.000 µg/mL até 10 µg/mL, de modo
que na primeira linha da placa encontra-se a maior concentração e na última, a
menor concentração. Por fim, adicionou-se 10 µL do inóculo das espécies fúngicas
nas cavidades, onde cada coluna da placa refere-se a uma cepa fúngica,
especificamente. Paralelamente, foi realizado o mesmo experimento com o
antifúngico de escolha cetoconazol (Sigma-Adrich®), comumente utilizado na
52
terapêutica clínica para casos de dermatofitoses. O cetoconazol foi testado das
concentrações de 5.000 µg/mL 5 µg/mL.
Um controle de micro-organismo (controle negativo) foi realizado colocando-se
nas cavidades 100 µL do mesmo CSD duplamente concentrado, 100 µL de água
destilada estéril e 10 µL do inóculo de cada espécie. Para verificar a ausência de
interferência nos resultados pelo solvente utilizado na preparação da emulsão, no
caso o Tween 80, foi feito um controle no qual foi colocado nas cavidades 100 µL do
caldo duplamente concentrado, 100 µL do Tween 80 (10% em água destilada estéril)
e 10µL da suspensão. Um controle de esterilidade também foi realizado, onde foi
colocado 200 µL do CSD em um orifício sem a suspensão dos fungos. As placas
foram seladas e incubadas a 28°C por até 8 dias para ser realizada a leitura.
A CIM para o óleo essencial e cetoconazol foi definida como a menor
concentração capaz de inibir visualmente o crescimento fúngico verificado nos
orifícios quando comparado com o crescimento controle. Os ensaios foram
realizados em duplicata.
4.7.3 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
Após realização da microdiluição para determinação da CIM do óleo essencial
e cetoconazol, alíquotas de 20 µL do meio presente nas cavidades onde não
apresentaram crescimento fúngico foram semeadas em placas de microtitulação
com 100 µL de CSD, desprovidas de qualquer antifúngico. Todo o sistema foi
incubado a 28°C por até 8 dias. A CFM foi definida como a menor concentração do
óleo essencial ou cetoconazol onde a cepa teste não mostrou capacidade de
crescimento, quando inoculada no meio de cultura isento de antifúngicos (DENNING
et al., 1992; KONEMAN et al., 1993; RASOOLI; ABYANEH, 2004).
4.7.4 Efeito do óleo essencial sobre o crescimento micelial
A análise da interferência do óleo essencial sobre o crescimento micelial foi
realizada pela determinação da massa micelial seca dos fungos teste, utilizando-se
a técnica de diluição em caldo (RASOOLI; ABYANEH, 2004; RASOOLI et al. 2006;
SHARMA; TRIPATHI, 2008). Em um tubo de ensaio esterilizado adicionou-se 10 mL
53
do CSD adicionado da emulsão do óleo essencial com a concentração final de 156,
312,
625
e
2500
µg/mL,
em
seguida
adicionou-se
um
fragmento
de
aproximadamente 1 cm2 das colônias fúngicas. No tubo controle correspondente, o
fragmento será inoculado em 10 mL de CSD. Todo o sistema foi incubado a 28°C
por um tempo total de 15 dias. Em ambos os grupos (teste e controle), cada tubo
corresponde a um intervalo de tempo de interação.
Dessa forma, a cada 3 dias a partir do sexto dia de exposição foi determinada a
massa micelial seca. Para isto, as culturas foram autoclavadas a 121°C por 30
segundos com a finalidade de causar inativação das estruturas fúngicas, seguida
pela filtração da cultura através de papel de filtro e lavagem com água destilada
estéril. O micélio retido no papel de filtro foi submetido à secagem em estufa a 60°C
por 6 h e a 40°C “over night”. Ao término, o papel de filtro contendo o micélio seco foi
pesado e o percentual de redução da massa micelial seca foi calculado, comparando
os resultados obtidos no experimento teste com os resultados do experimento
controle. Todo o ensaio foi realizado em duplicata.
4.7.5 Efeito do óleo essencial sobre a germinação dos esporos fúngicos
Neste ensaio avaliou-se a influência do óleo essencial nas concentrações de
156, 312, 625 e 2500 µg/mL sobre a germinação dos esporos fúngicos de T. rubrum
ATCC 1683 e T. mentagrophytes LM 02. A partir de repiques recentes dos fungos
em ABD, preparou-se o inóculo dos mesmos com solução salina estéril, contendo
uma mistura resultante de conídios e fragmentos de hifas. Em seguida, essas
suspensões foram agitadas por 2 minutos com auxílio do aparelho Vortex, deixando
em repouso por 20 minutos, tempo para que os fragmentos de hifas se sedimentem
e o sobrenadante, contendo os conídios foi então recolhido. O número de conídios
foi determinado em uma câmara de Newbauer e ajustado a 10 6 esporos/mL
(FERNÁDEZ-TORRES et al., 2002).
Em tubos de ensaio estéreis, 500 µL do CSD duplamente concentrado
acrescido do óleo essencial nas concentrações finais de 156, 312, 625 e 2500
µg/mL, foram homogeneamente misturadas com 500 µL da suspensão dos conídios
fúngicos e imediatamente incubado a temperatura de 28°C. Amostras dessa mistura
foram tomadas nos tempos de 3, 15 e 24 h para análise, pois são nesses intervalos
de tempo que pode-se observar as principais alterações morfológicas nos conídios
54
que naturalmente ocorrem e culminam em sua germinação. Todo o experimento foi
feito em duplicata, onde o número de conídios foi determinado em uma câmara de
Newbauer e o percentual de inibição de germinação dos conídios em cada tempo foi
calculado, comparando os resultados obtidos no experimento teste com os
resultados do experimento controle, em todos os intervalos de tempo. Um controle
com tween 80 (10% em água destilada) e um controle apenas com água destilada
Somente os conídios de T. rubrum foram utilizados para análise das alterações
morfológicas ocorridas durante o processo germinativo. A análise foi conduzida em
um microscópio óptico comum (Zeiss® model Primo Star), em duplicata. (RANA et
al., 1997; SANTIAGO et al., 2000; LIU et al., 2007).
4.7.6 Efeito do óleo essencial sobre a viabilidade fúngica
O estudo de interferência do óleo essencial sobre a viabilidade das cepas de
dermatófitos foi realizado pelo método de contagem das estruturas fúngicas viáveis.
Neste experimento foi observado o efeito do óleo essencial nas concentrações de
156, 312, 625 e 2500 µg/mL sobre as suspensões dos fungos T. rubrum ATCC 1683
e T. mentagrophytes LM 02. Em um tubo de ensaio esterilizado foram adicionados 4
mL do CSD adicionado de 1 mL do inóculo, em seguida foram adicionadas as
emulsões do óleo essencial. Todo o sistema foi incubado a 28°C. A cada 3 dias de
exposição, uma alíquota de 0,5 mL dos tubos foi retirada e diluída seriadamente em
água destilada esterilizada. Com um loop calibrado, descartável e estéril
(ALAMAR®), foi inoculado uniformemente 10 µL dessa última diluição na superfície
de placas de Petri com ASD.
Os ensaios foram incubados a 28°C (temperatura ambiente) por um período de
no máximo 5 dias até o aparecimento das colônias na superfície do meio de cultura.
Após esse período de incubação, foi realizada a contagem do número de estruturas
viáveis a qual foi expressa em logUFC/mL. Os ensaios foram realizados em
duplicata e o resultado expresso pela média aritmética obtidas nos dois ensaios
(RASOOLI et al., 2006; VILJOEN et al., 2003).
55
4.7.7 Efeito do óleo essencial sobre a micromorfologia dos dermatófitos
A análise do efeito do óleo essencial na micromorfologia dos dermatófitos foi
realizada com base na técnica de preparação de microcultivos, utilizando as cepas
T. rubrum ATCC 1683 e T. mentagrophytes LM 02. Para o cultivo de fungos em
lâminas, placas de Petri (90 x 15 mm) de vidro foram forradas com papel de filtro e,
em seguida, foi introduzido um suporte (um bastão de vidro encurvado sob a forma
de U ou duas lâminas de vidro unidas), uma lâmina e uma lamínula. Posteriormente,
todo o sistema foi esterilizado por calor seco em estufa de secagem e esterilização
modelo 315-SE (FANEM – São Paulo/SP) a 170°C por 2 horas.
Após preparação das placas, foi preparado o meio de cultura sólido acrescido
do óleo essencial nas concentrações de 78, 156 e 312 µg/mL. Para isto, em placas
de Petri (90 x 15 mm) descartáveis e estéreis, foram vertidos cerca de 20 mL de
ASD fundido e ajustado na temperatura de 50°C em banho-maria. Em seguida,
adicionou-se um volume da emulsão do óleo essencial correspondendo às
concentrações desejadas na placa. Para o experimento controle, a emulsão do óleo
essencial não foi adicionada. Após solidificação do meio, cavidades foram feitas no
ASD utilizando cânulas de vidro estéreis. Com o auxílio de uma alça de platina,
transferiram-se as porções do meio de cultivo para a superfície central da lâmina de
microscopia, disposta sobre o suporte. Em seguida, dois fragmentos do micélio da
cepa em estudo foram dispostos nas extremidades do meio de cultivo, cobrindo-o
com a lamínula. O papel de filtro foi umedecido e as placas foram incubadas a
temperatura ambiente (28°C) por 5 dias. Após o período de incubação, a lamínula foi
retirada assim como a porção do meio de cultura com o auxílio da alça de platina.
Cerca de 1 gota do corante azul de lactofenol algodão foi adicionada no centro de
uma lâmina e cobriu-a com a lamínula, evitando-se a formação de bolhas de ar. Da
mesma forma foi feito com a lâmina onde estava a porção do meio, cobrindo-a com
uma lamínula limpa. As duas lâminas formadas foram vedadas com esmalte de
unhas e examinadas ao microscópio óptico comum. As alterações estruturais
observadas em microscopia óptica (Zeiss® modelo Primo Star) nos ensaios testes
foram registradas e comparadas com o crescimento normal encontrado nos
experimentos controle (GUNJI et al., 1983; FROST et al 1995; SHARMA;
TRIPARTHI, 2006).
56
4.7.8 Efeito do óleo essencial sobre a macromorfologia dos dermatófitos
A análise do efeito do óleo essencial provocados na macromorfologia dos
dermatófitos foi realizada com as cepas T. rubrum ATCC 1683 e T. mentagrophytes
LM 02. Placas de Petri foram inicialmente preparadas com 15 mL de meio ASD
fundido a 50°C acrescido do óleo essencial nas concentrações 156 e 312 µg/mL e
todo o sistema foi homogeneizado. Após solidificação do meio de cultura, foi tomado
um fragmento de aproximadamente 2 cm de colônias fúngicas das cepas citadas,
oriundas de culturas novas mantidas a 28°C por 10 dias, e depositado na superfície
do ASD, no centro da placa. O controle fúngico foi realizado por meio da observação
do crescimento das amostras em placas de Petri com ASD sem adição do óleo
essencial. Após a montagem das placas, todo o sistema foi incubado a 28°C por 10
dias. Posteriormente ao período de incubação, a análise foi executada com base na
observação visual das colônias tanto do experimento controle quanto do teste,
caracterizando-as quanto ao aspecto, a textura e a pigmentação, além dos aspectos
do reverso das colônias (ADAM et al., 1998; DAFARERA et al., 2003).
4.7.9 Ensaio com sorbitol
A determinação da CIM do óleo essencial de C. winterianus, na presença do
sorbitol (0,8 M), foi realizada pelo método de microdiluição, utilizando placas de
microtitulação contendo 96 cavidades, com fundo em forma de “U” (ALAMAR ®) e em
duplicata semelhante ao item 4.6.2. Em cada orifício da placa, foi adicionado 100 µL
do meio líquido CSD previamente adicionado de sorbitol
de peso molecular de
182,17 g. (VETEC Química Fina Ltda – Rio de Janeiro/RJ), ambos duplamente
concentrados. Posteriormente, 100 µL da emulsão do óleo essencial, também
duplamente concentrado, foram dispensados nas cavidades da primeira linha da
placa. E por meio de uma diluição seriada a uma razão de dois, foram obtidas
concentrações de 10.000 µg/mL até 10 µg/mL do óleo essencial e, no caso do
sorbitol, uma concentração final de 0,8 M em cada cavidade. Por fim, adicionou-se
10 µL do inóculo das espécies nas cavidades, onde cada coluna da placa refere-se a
uma cepa fúngica, especificamente (FROST et al., 1995; ZACCHINO, 2001)..
57
Um controle de micro-organismo foi realizado colocando-se nas cavidades 100
µL do mesmo CSD e sorbitol (0,8 M) também duplamente concentrados, 100 µL de
água destilada estéril e 10µL do inóculo de cada espécie. Para verificar a ausência
de interferência nos resultados pelo solvente utilizado na preparação da emulsão, no
caso o Tween 80, foi feito um controle no qual foi colocado nas cavidades 100 µL do
mesmo CSD e sorbitol (0,8 M) também duplamente concentrados, 100 µL do Tween
80 (10% em água destilada estéril) e 10 µL da suspensão. Um controle de
esterilidade também foi realizado, onde foi colocado 200 µL do CSD em um orifício
sem a suspensão dos fungos. As placas foram seladas e incubadas a 28°C por até 8
dias para ser realizada a leitura.
4.7.10 Lise da membrana celular
Para analisar a capacidade do óleo essencial em interferir na integridade da
membrana plasmática das células fúngicas, uma amostra de 10 mL do inóculo
fúngico (106 UFC/mL) foi adicionada em um tubo de ensaio estéril. Em seguida, foi
inoculado o óleo essencial obtendo concentrações finais referentes a 78, 156 e 312
µg/mL. A mistura foi incubada à temperatura de 28°C e amostras de 3 mL foram
retiradas em intervalos de tempo de 2, 4 e 24 horas e submetidas à centrifugação a
3.000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi retirado e analisado em um
espectrofotômetro a 260 nm, para análise de sua absorbância. Uma solução
etanólica de KOH (KOH 25 % em etanol a 70 %) a 80°C por 1 hora foi utilizada como
referência, a qual produziu 100 % de lise celular e será denominada “lisante”.
Controle sem a presença de qualquer produto antifúngico foi realizado. Da mesma
forma, foram realizados controles positivos com produtos que tenham capacidade de
lisar a célula fúngica a exemplo da anfotericina B, na sua respectiva CIM (0,60
µg/mL) frente às mesmas cepas. A CIM da anfotericina foi determinada conforme
descrito no item 4.7.2 frente às cepas teste. Os resultados foram expressos em
percentual de lise das células fúngicas, resultante da média dos valores de dois
experimentos, quando comparados com o lisante (LUNDE; KUBO, 2000; SVETAZ et
al., 2007; ESCALANTE et al., 2008).
58
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A avaliação estatística dos resultados referentes ao estudo dos efeitos do óleo
essencial sobre o crescimento micelial, a viabilidade fúngica, percentual de inibição
da germinação dos conídios e percentual de lise celular foi realizada para determinar
diferenças estatisticamente significantes, quando um valor de p<0,05, empregandose a análise de variância (ANOVA), utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido do
pós-teste de Dunn. No que se refere à análise das alterações morfológicas dos
conídios de T. rubrum durante a germinação, o teste Qui-quadrado foi utilizado.
Nessa situação, foi verificado se a presença do óleo essencial é um fator que
contribui com a quantidade de conídios não germinados, em outras palavras, se os
resultados encontrados são conseqüência da ação do óleo essencial. Em todos os
casos, a execução da análise estatística foi realizada utilizando o programa
GraphPad Prism versão 4.03 para Windows.
Resultados e Discussão
60
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ANÁLISE DOS COMPONENTES DO ÓLEO ESSENCIAL
Os fitoconstituintes e seus respectivos percentuais na composição do óleo
essencial, pesos moleculares e tempos de retenção estão expostos na Tabela 1. C.
winterianus é uma planta que possui entre 0,6-1,0 % de óleo essencial em suas
folhas. Este óleo essencial é citado como possuidor de mais de 80 substâncias, a
partir do qual citronelal, citronelol, geraniol, limoneno e ésteres têm particular
importância (MAIA et al., 1998; MARCO et al., 2007). Como mostra a tabela 2, a
análise
CG-EM
resultou
na
identificação
de
18
componentes.
Entre
os
fitoconstituintes, o citronelal se apresentau como o componente majoritário do óleo
essencial das folhas de C. winterianus com 23,6 % do total de constituintes
presentes, seguido pelo geraniol (18,8 %) e citronelol (11,7 %), em ordem
decrescente de percentual.
TABELA 1. Componentes do óleo essencial das folhas de C. winterianus.
Picos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Composto
2-metil-2-hepten-6-ona
β-mirceno
Limoneno
Linalol
Citronelal
Citronelol
Geraniol
Acetato de citronelil
β-elemeno
Eugenol
Germacreno
Δ-cadineno
Elemol
Endo-1-bourbonanol
Farnesol
γ-eudesmol
Torreyol
Trans-farnesol
Percentual (%)
0,13
0,07
3,39
1,34
23,59
11,74
18,81
5,29
6,40
10,34
2,63
2,27
6,73
1,01
0,60
1,00
1,65
3,01
Peso
molecular
126
136
136
136
154
156
139
138
189
164
204
204
204
222
204
222
204
222
Tempo de retenção
(min)
6,99
7,18
8,58
11,13
13,81
17,00
18,65
22,30
22,50
23,96
27,69
29,44
30,67
31,52
33,01
33,66
34,08
34,69
61
Estes resultados confirmam os achados de outros pesquisadores em relatos
anteriores, onde é registrado que citronelal e geraniol são os principais constituintes
do óleo essencial de C. winterianus e até mesmo de outras plantas (PANDEY;
MAHENDRA, 2003; SIMIC et al., 2008).
Apesar de todos os órgãos de uma planta possam acumular óleos essenciais,
sua composição química, caracteres físico-químicos e odores podem variar segunda
a localização na planta. Embora seja controlada geneticamente, a biossíntese dos
constituintes de uma planta é fortemente afetada pelo ambiente, colheita e póscolheita fatores. A precipitação pluviométrica, a temperatura, a luminosidade e a
umidade influenciam o conteúdo dos principais constituintes (SARMA, 2002). A
composição dos óleos voláteis de uma espécie em particular também pode variar
entre os tempos ou estação de coletas e entre as fontes geográficas na qual os
vegetais foram coletados (DELAQUIS et al., 2002).
C. winterianus é um vegetal que se propaga através de divisão de touceiras e
pode ser cultivado na maioria dos solos – adaptando-se melhor em solos arenoargilosos, porosos e férteis – dando-se bem em climas tropicais e subtropicais. Nas
regiões do Brejo e Curimataú paraibanos, região onde foi feita a colheita da planta, a
temperatura amena (23 a 30°C) e o solo com fertilidade entre média e alta
favorecem o desenvolvimento dessa cultura. A produtividade do seu óleo fica entre
80-100 L/ha (CASTRO, 2003).
Blank et al. (2007) estudaram Influência das estações do ano, horários de
colheita e secagem sobre o óleo volátil de C. winterianus na região nordeste do
Brasil, e relataram que a estação afetou efetivamente sua composição química, mas
o período da colheita teve apenas uma pequena influência sobre a composição do
óleo essencial. De acordo com esses resultados, o geraniol foi um dos componentes
majoritários no óleo essencial das folhas frescas de C. winterianus, bem como o
citronelal, ambos tiveram suas concentrações variando com a estação do ano.
Semelhantemente
aos
nossos
resultados,
geraniol
e
citronelal
foram
os
componentes majoritários no óleo essencial, no período seco da região de coleta
(verão). Do mesmo modo, Quintans-Júnior (2008) verificou que geraniol, citronelal e
citronelol foram os principais componentes do óleo essencial das folhas de C.
winterianus coletados no estado de Sergipe, na região nordeste do Brasil.
Os componentes citronelal, geraniol e citronelol pertencem a um grupo de
compostos constituintes de óleos essenciais definidos como terpenóides. Esse
62
termo designa os compostos que são derivados de unidades do isopreno (unidades
pentacarbonadas) que, por sua vez, origina-se biossinteticamente do ácido
mevalônico. Os esqueletos carbonados dos terpenoides são formados pela
condensação de unidades de isopreno e, dessa maneira, esses constituintes são
classificados como monoterpenos acíclicos, com base nas suas estruturas químicas
(SIMÕES; SPITZER, 2007).
O óleo essencial de C. winterianus é considerado uma grande fonte de matériaprima para produção de geraniol, citronelal e citronelol, constituintes esses muito
utilizados nas indústrias de sabões, detergentes, perfumaria, cosmética e
farmacêutica (ROCHA et al., 2000).
Além disso, é relatado na literatura que o citronelal e o geraniol apresentam
atividade antifúngica frente aos micro-organismos Aspergillus niger, Fusarium
oxysporum e Penicillium digitatum, com CIM de 100 μg/ml para esses microorganismos (MOLEYAR; NARASIMHAM, 2004).
Em um estudo desenvolvido por Shim e Lim (2004), citronelol e geraniol foram
avaliados quanto à sua atividade frente seis cepas fúngicas do gênero Tricophyton,
entre as quais apenas uma cepa de T. rubrum ATCC 6345 e uma de T.
mentagrophytes KCCM (Korean Culture Center of Microorganisms) 11950, onde
ambos os constituintes apresentaram atividade inibitória. O geraniol apresentou-se
como
mais
potente
que
o
citronelol,
porém
os
dois
compostos
foram
semelhantemente mais ativos contra a cepa de T. mentagrophytes.
5.2 SCREENING MICROBIOLÓGICO
O poder antifúngico do óleo essencial de C. winterianus foi estudado
inicialmente no screening microbiológico, realizado frente a 16 cepas da espécie T.
rubrum e 8 cepas da espécie T. mentagrophytes, pelo método de difusão em meio
sólido com discos. O resultado pode ser observado na tabela 1, onde encontram-se
os diâmetros das zonas de inibição produzidos pelo óleo essencial in natura.
O óleo essencial in natura exerceu intensa atividade sobre todas as cepas
ensaiadas, consideração evidenciada pelas amplas zonas de inibição do
crescimento fúngico compreendidas entre 24-28 mm de diâmetro. Observa-se, de
modo geral, que as cepas estudadas apresentaram zonas de inibição com valores
muito próximos, sendo encontrado um valor médio de 25,41 mm de diâmetro. As
63
cepas mais sensíveis foram T. mentagrophytes LM07 e T. rubrum LM63, tendo em
vista que o óleo essencial produziu as maiores zonas de inibição com 28 mm. As
menores zonas de inibição foram encontradas em T. mentagrophytes LM02, LM11,
LM79 e T. rubrum LM333, cujo valor foi de 24 mm de diâmetro.
TABELA 2. Screening microbiológico do óleo essencial de C.
winterianus frente às cepas de T. rubrum e T.
mentagrophytes.
Micro-organsimos
T. rubrum ATCC 1683
T. rubrum LM63
T. rubrum LM98
T. rubrum LM130
T. rubrum LM222
T. rubrum LM309
T. rubrum LM333
T. rubrum LM422
T. rubrum LM600
T. rubrum LM629
T. rubrum LM640
T. rubrum LM710
T. rubrum LM713
T. rubrum LM720
T. rubrum LM722
T. rubrum LM730
T. mentagrophytes LM02
T. mentagrophytes LM07
T. mentagrophytes LM11
T. mentagrophytes LM28
T. mentagrophytes LM79
T. mentagrophytes LM202
T. mentagrophytes LM308
T. mentagrophytes LM962
Zonas de inibição (mm)
26
28
26
25
26
26
24
25
25
25
25
26
25
25
25
25
24
28
24
25
24
26
26
26
A análise da susceptibilidade antifúngica tem sido utilizada em vários estudos
que visam obter novos produtos com atividade antifúngica, no controle da
terapêutica antifúngica, na caracterização de amostras fúngicas e também se tornou
64
muito importante para aplicabilidade clínica visto que pode ajudar na escolha correta
do fármaco a ser utilizado no tratamento antiinfeccioso (BOSSCHE et al., 1998;
HOFFMAN; PFALLER, 2001; SILVA et al., 1998).
O desenvolvimento de métodos para determinar a sensibilidade in vitro dos
fungos patogênicos aos antifúngicos não é tão antiga e tem sido associada com
aumento de infecções fúngicas oportunistas nos últimos anos. Durante um longo
período de tempo, estas técnicas não foram consideradas de interesse, então, na
década de 80, ainda não havia métodos padrão para fungos, apesar de que já
existia há muito tempo para as bactérias (TORRES, 2005). Atualmente, é descrito na
literatura vários métodos para avaliar a atividade antifúngica de produtos oriundos de
material vegetal. Entre os mais discutidos e utilizados, inclui-se o método de difusão
em meio sólido, utilizando discos de papel de filtro.
A análise antimicrobiana conduzida por difusão em meio sólido é aceita pelo
FDA (Food and Drug Administration) e estabelecida como padrão pelo NCCLS
(National Committe for Clinical Laboratory Standards). É um método físico, no qual o
micro-organismo é colocado em interação contra um produto biologicamente ativo
em meio sólido e relaciona o tamanho da zona de inibição de crescimento do microorganismo “desafiado” com a concentração da substância ensaiada, nesse caso o
óleo essencial in natura (PINTO et al., 2003).
A figura 10 ilustra o método de difusão em meio sólido. Assim que o disco
impregnado com o óleo essencial é posto na superfície do ASD sólido, o produto se
difunde para o meio circundante. Na medida em que se aumenta a distância em
relação ao disco, ocorre uma redução logarítmica da concentração do produto até
alcançar o um ponto onde o crescimento do micro-organismo na superfície do ágar
já não é mais inibido. O resultado é uma zona de inibição que é medida em
milímetros e registrada, para a adequada avaliação (KONEMAN et al., 1993).
A informação obtida no método de difusão em meio sólido é apenas qualitativa e
apresenta-se útil para estabelecer a sensibilidade dos dermatófitos ao óleo essencial
ou o seu poder antifúngico. Nesse caso, o screening microbiológico de produtos
naturais é geralmente utilizado como teste preliminar para avaliar o seu potencial
antimicrobiano, e de acordo com os resultados obtidos pode-se elaborar uma
seqüência de estudos mais detalhados na perspectiva de obtenção de maiores
informações sobre sua atividade antifúngica (HSIEH et al., 2001; LIMA, 2002).
65
Alguns estudos que se seguem revelaram o poder antimicrobiano do óleo
essencial de C. winterianus contra vários micro-organismos, com destaque para
protozoários, bactérias e fungos patogênicos para o homem e principalmente
àqueles que acometem os vegetais, visando o controle de doenças micóticas em
grandes plantações, além da sua atividade como repelente e inseticida.
Dikshit e Husain (1984) estudaram o óleo essencial extraído das folhas de C.
winterianus e confirmaram sua eficácia em inibir o crescimento de fungos
patogênicos causadores de doenças em humanos e animais, a uma concentração
de 400 ppm. Este mesmo óleo, na concentração de 0,25 µg/mL também apresentou
atividade amebicida sobre Entamoeba histolitica, conforme De-Blasi et al. (1990).
FIGURA 10. Screening da atividade antifúngica do
óleo essencial de C. winterianus sobre T. rubrum
LM333.
Pattnaik et al. (1996) trabalharam com o óleo essencial de C. winterianus contra
66
22 espécies de bactérias e 12 espécies de fungos e verificaram que o óleo mostrouse eficiente contra quinze do total das espécies bacterianas e contra todos os fungos
testados. Um estudo desenvolvido com o óleo essencial de C. winterianus e a
lagarta do cartucho do milho Spodoptera frugiperda J. E. Smith mostrou importantes
propriedades do óleo essencial, como inseticida e repelente (LABINAS; CROCOMO,
2002).
Costa et al. (2008) realizaram estudos com a finalidade de analisar o efeito da
atividade antibacteriana do óleo essencial de C. winterianus no controle da bactéria
Erwinia carotovora, agente causador de diversas doenças em vegetais do Nordeste
brasileiro. Os autores verificaram que o óleo utilizado puro mostrou-se eficiente
contra todos os isolados testados, com halos de inibição entre 25 e 35 mm de
diâmetro.
Embora existam relatos da atividade antimicrobiana do óleo essencial de C.
winterianus contra clássicos patógenos humanos, incluindo espécies causadoras de
dermatofitoses como T. rubrum e T. mentagrophytes pouco existem. Isto respalda a
importância do presente estudo, pela possibilidade de se adicionar ao painel de
propriedades inerentes a este óleo essencial, a de exercer ação antifúngica contra
os principais agentes causadores de dermatofitoses.
5.3 DETERMINAÇÃO DA CIM E CFM
A determinação dos valores de CIM do óleo essencial de C. winterianus foi
realizada pelo método de microdiluição. Os seus respectivos valores, bem como os
referentes aos controles realizados encontram-se sumarizados na tabela 3. Como
pode ser visto, a CIM do óleo essencial foi de 312 µg/mL para quase todas as cepas
ensaiadas, onde cerca de 92 % das cepas tiveram seu crescimento inibido até esta
concentração. Observa-se que o óleo essencial mostrou o maior poder de inibição
sobre as cepas T. mentagrophytes LM07 e T. rubrum LM63, tendo vista que
apresentaram os menores valores de CIM (156 µg/mL). Isto confirma os resultados
encontrados na análise inicial do poder antifúngico do óleo essencial, pois essas
mesmas cepas foram as mais sensíveis no screening microbiológico.
Quanto ao cetoconazol, a maioria dos valores de CIM se apresentaram menores
que as do óleo essencial, com um valor mínimo de 78 µg/mL. Da mesma maneira se
aplica aos valores de CFM, onde foi obtido um valor máximo de 5000 µg/mL. Todas
67
as cepas fúngicas foram capazes de crescer em CSD sem adição do óleo essencial,
o que caracteriza sua viabilidade (controle de micro-organismo). Da mesma forma,
as cepas conseguiram tolerar alta concentração de Tween 80 (10 % em água
destilada estéril), confirmando que o impedimento do seu crescimento era
conseqüência da presença do óleo essencial no CSD, não existindo interferência no
crescimento das cepas pelo agente emulsificante utilizado diluição do óleo essencial.
Um controle de esterilidade foi realizado para certificar que o CSD utilizado nos
ensaios não estava contaminado com micro-organismos, o que inviabilizaria a
execução dos testes caso houvesse crescimento microbiano de qualquer natureza.
Os menores valores de CIM e CFM foram observados nas cepas T.
mentagrophytes LM07 e T. rubrum. Em termos gerais, todo o experimento mostrou
que os valores de CFM foram sempre oito vezes acima dos respectivos valores de
CIM para todas as cepas ensaiadas. Estes resultados também podem ser
visualizados na Tabela 3.
Sabe-se que as plantas medicinais têm sido fonte de muitas drogas aplicadas
nos procedimentos clínicos. Na natureza, os óleos essenciais estão envolvidos em
muitas ações importantes mostrando um papel relevante na proteção das plantas
contra agentes antimicrobianos e inseticidas (BAKKALI et al., 2008). Há muito tempo
tem sido reconhecido que alguns óleos essenciais têm propriedades antimicrobianas
e estas características estão possivelmente relacionados à função desses
compostos nas próprias plantas (BURT, 2004). Sem dúvida, os óleos essenciais
encontram sua maior aplicação biológica como agentes antimicrobianos. Esta
capacidade representa uma extensão do próprio papel que exercem nas plantas,
defendendo-as de bactérias e fungos fitopatogênicos (JANSSEN et al, 1987).
Atividade antifúngica do óleo essencial de C. winterianus foi relatada em um
estudo desenvolvido por Duarte et al (2005). Neste o óleo essencial foi testado
frente à Candida albicans, onde apresentou uma CIM de 600 µg/mL, uma
concentração cerca de duas vezes a encontrada frente aos dermatófitos estudados
neste trabalho.
68
TABELA 3. Valores de CIM e CFM do óleo essencial de C. winterianus e cetoconazol sobre
cepas de T. rubrum e T. mentagrophytes.
Cetoconazol
(µg/mL)
CIM
CFM
CIM
CFM
Controle de
micro-organismo
Controle de
esterilidade
312
156
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
156
312
312
312
312
312
312
2500
1250
2500
2500
2500
2500
2500
2500
2500
2500
2500
2500
2500
2500
2500
2500
2500
1250
2500
2500
2500
2500
2500
2500
156
156
156
156
312
156
312
156
78
156
156
156
156
156
78
312
156
78
156
78
156
156
156
312
2500
2500
2500
2500
5000
2500
5000
2500
1250
2500
2500
2500
2500
2500
1250
5000
2500
1250
2500
1250
2500
2500
2500
5000
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Micro-organismos
T. rubrum ATCC 1683
T. rubrum LM63
T. rubrum LM98
T. rubrum LM130
T. rubrum LM222
T. rubrum LM309
T. rubrum LM333
T. rubrum LM422
T. rubrum LM600
T. rubrum LM629
T. rubrum LM640
T. rubrum LM710
T. rubrum LM713
T. rubrum LM720
T. rubrum LM722
T. rubrum LM730
T. mentagrophytes LM02
T. mentagrophytes LM07
T. mentagrophytes LM11
T. mentagrophytes LM28
T. mentagrophytes LM79
T. mentagrophytes LM202
T. mentagrophytes LM308
T. mentagrophytes LM962
Controles
Tween 80
Óleo essencial
(µg/mL)
+: presença de crescimento do micro-organismo;
-: ausência de crescimento de micro-organismos;
69
Simic et al (2008) também analisaram a atividade antimicrobiana do óleo
essencial de C. winterianus pelo método de microdiluição, para determinar a CIM e a
CFM do produto. O produto foi ativo contra os micro-organismos testados, entre os
quais se encontravam 19 espécies fúngicas e 7 bacterianas distribuídos como
patógenos de animais, patógenos de plantas, contaminantes de alimentos e fungos
esporulantes.
O método de microdiluição escolhido para a determinação da CIM e CFM se
apresenta como uma forma simples e econômica de avaliar a atividade
antimicrobiana de produtos naturais. Possui grande reprodutibilidade, sendo trinta
vezes mais sensível que outros métodos usados na literatura, requerem pequena
quantidade de amostra e meio de cultura, além de poder ser usado para grande
número de amostras (OSTROSKY, et al., 2008). Este método tem a vantagem de
poder ser utilizado tanto para produtos solúveis em água, como àqueles
lipossolúveis e ainda pode ser estendido para fornecer informações sobre a CFM
(ZACCHINO, 2001).
Em termos de aplicabilidade clínica, a efetiva terapia antimicrobiana requer que
os agentes primeiro alcancem o sítio de infecção e então cesse ou iniba a
progressão da invasão microbiana e facilite a ação das defesas do hospedeiro para
controlar a infecção (CLEELAND; SQUIRES, 1991). Em indivíduos com infecções
não complicadas cuja resposta imune está competente, os níveis de CIM são
geralmente suficientes como guias para estabelecer uma terapia antifúngica. Porém,
nos casos de indivíduos com doenças infecciosas cujo sistema imune encontra-se
deficiente ou suprimido, o valor de CFM se mostra mais útil. Na prática clínica, o
valor da CIM de um antimicrobiano significa simplesmente que esta concentração
deve ser obtida no sítio de infecção para que o crescimento microbiano seja
potencialmente inibido (KONEMAN e al., 1993).
Complexas variáveis podem afetar o curso de uma infecção e a terapia
medicamentosa exemplo dos mecanismos de defesa do hospedeiro, a virulência e a
susceptibilidade do patógeno, a dose empregada e propriedades farmacológicas
inerentes ao antimicrobiano utilizado no tratamento da infecção, entre outros fatores.
Mesmo as análises in vitro não envolvendo essas variáveis, os estudos que
determinam inicialmente a CIM e CFM, fornecem importantes informações sobre a
potência dos produtos analisados e podem guiar outros estudos que visam à
empregabilidade clinica dos produtos. Pois, é essencial que produto natural, como
70
um novo candidato a ser empregado clinicamente como antifúngico, obtenha
relevantes resultados nesses estudos in vitro para justificar a continuidade dos
estudos (CLEELAND; SQUIRES, 1991).
5.4 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE O CRESCIMENTO MICELIAL
Neste trabalho, o efeito de diferentes concentrações do óleo essencial de C.
winterianus sobre o crescimento micelial foram determinados pela quantificação da
massa micelial seca das cepas T. rubrum ATCC 1683 e T. mentagrophytes LM02.
Estas cepas foram escolhidas como representantes de todos os dermatófitos porque
apresentaram os mesmos valores de CIM e CFM da maioria das cepas. Os
resultados estão expressos em percentual de redução da massa micelial seca e
apresentados nas figuras 10 e 11.
Com relação aos efeitos sobre T. rubrum ATCC 1683, pode ser observado que
todas as concentrações testadas do óleo essencial conseguiram inibir o
desenvolvimento micelial normal da cepa (Figura 11). A concentração de 156 µg/mL
apresentou um crescente percentual da massa micelial seca ao longo do tempo. Isto
confirma que na concentração subinibitória, o impedimento do crescimento micelial
de T. rubrum ATCC 1683 se agrava com o aumento do tempo de interação entre a
droga e as células fúngicas. O mesmo não pode ser dito com as demais
concentrações do óleo essencial, visto que o fungo não conseguiu desenvolver
micélio até os 15 dias de interação, ou seja, houve 100 % de inibição em todos os
tempos analisados. Comparando-se os resultados das concentrações testadas,
constatou-se que houve diferença significante entre 156 e 312, 625, 2500 µg/mL em
cada tempo isoladamente.
O efeito do óleo essencial sobre T. mentagrophytes LM02 pode ser observado
na figura 12. Semelhantemente aos resultados com T. rubrum, todas as
concentrações testadas do óleo essencial conseguiram inibir o desenvolvimento
micelial normal da cepa. Os efeitos do óleo apenas na concentração de 156 µg/mL
se agravaram no decorrer do tempo de interação. Por fim, verificou-se que houve
diferenças estatisticamente significantes entre 156 e 312, 625, 2500 µg/mL em cada
tempo isoladamente.
71
Percentual de redução (%)
100
a a a
a a a
a a a
a a a
OE 156 g/mL
OE 312 g/mL
OE 625 g/mL
OE 2500 g/mL
75
50
25
0
6
9
12
15
Tempo (dias)
FIGURA 11. Percentual de redução da massa micelial seca de T. rubrum ATCC
1683 na presença do óleo essencial (OE) de C. winterianus.
a: p<0,05 quando comparado com os respectivos valores de 156 µg/mL, em cada
tempo isoladamente.
O método de quantificação da massa micelial seca tem se destacado na análise
dos efeitos dos óleos essenciais sobre o crescimento fúngico analisado
temporalmente.
Pesando
o
resíduo
seco
da
cultura
em meios
líquidos,
periodicamente, é possível traçar um gráfico expondo o percentual de inibição do
crescimento. É válido ressaltar que esse gráfico não reflete o total de células vivas,
mas a produção de material celular fúngico (MINAMI, 2003).
Os fungos de interesse médico, incluindo os agentes das dermatofitoses,
possuem um aparelho de reprodução, cujos órgãos se diferenciam para servir à
reprodução e um aparelho de vida vegetativa denominado micélio. Esse micélio é
geralmente formado por um aglomerado de células, o qual pode ser filamentoso
septado ou não-septado. A hifa – filamento fúngico ou um segmento do micélio
filamentoso – constitui, em seu conjunto, o micélio dos fungos (LACAZ et al., 1998).
Assim como outros fungos filamentosos, fungos do gênero Trichophyton apresentam
um simples ciclo celular não sexual, no qual forma-se uma colônia micelial via
crescimento da hifa, que resulta do alongamento linear do seu ápice. Ainda, em um
72
processo infeccioso, o crescimento longitudinal da hifa facilita a penetração nas
camadas mais internas da pele, enquanto o crescimento lateral pode agravar os
danos, que particularmente nos casos de dermatofitoses é um evento clinicamente
Percentual de redução (%)
importante (ZURITA; HAY, 1987; GUPTA et al., 2003).
100
a a a
a a a
a a a
a a a
OE 156 g/mL
OE 312 g/mL
OE 625 g/mL
OE 2500 g/mL
75
50
25
0
6
9
12
15
Tempo (dias)
FIGURA 12. Percentual de redução da massa micelial seca de T.
mentagrophytes LM02 na presença do óleo essencial (OE) de C. winterianus.
a: p<0,05 quando comparado com os respectivos valores de 156 µg/mL, em
cada tempo isoladamente.
Por isso, alguns pesquisadores vêm investigando o potencial de óleos
essenciais em inibir crescimento micelial de fungos patogênicos, por meio da medida
do massa micelial seca dos fungos, dada a sua importância no desenvolvimento das
micoses (RASOOLI; ABYANEH, 2004; RASOOLI et al. 2006; SHARMA; TRIPATHI,
2008). Isto se deve ao fato de que macromoléculas cuja funcionalidade esteja
relacionada ao crescimento, sobrevivência, virulência ou morfogênese celular são
apontadas como promissores alvos para novos agentes antifúngicos (ODDS et al.,
2003). Os resultados encontrados até o momento podem ser considerados de
73
grande valia para o estudo, pois foi constatado que o óleo essencial de C.
winterianus afeta fortemente o crescimento dos fungos analisados neste trabalho.
5.5 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE A GERMINAÇÃO DOS ESPOROS FÚNGICOS
Os resultados do efeito de diferentes concentrações do óleo essencial de C.
winterianus sobre a germinação dos conídios de T. rubrum ATCC 1683 e T.
mentagrophytes LM02 estão registrados na figura 13.
De modo geral, todas as concentrações do óleo essencial exerceram forte poder
inibitório sobre o processo germinativo dos conídios de ambas as espécies testadas.
Na concentração de 156 µg/mL, houve, respectivamente, 73 % e 72 % de inibição
dos conídios de T. rubrum ATCC 1683 e T. mentagrophytes LM02. Na medida em
que se aumentou a concentração do óleo essencial de 156 até 625 µg/mL,
aumentaram-se também o percentual de inibição, chegando a valores muito
próximos a 100 % de inibição. Ainda que esses resultados sejam relevantes
numericamente, apenas na CFM (2500 µg/mL) do óleo essencial é que não foi
observada a presença de conídios germinados na cultura de ambas as espécies,
indicando a totalidade da inibição do processo germinativo.
Ao comparar os resultados para cada cepa isoladamente, percebe-se que os
percentuais de inibição da germinação entre 156 e 625, 2500 µg/mL foram
diferentes, suportando a idéia de que o aumento da concentração de certa forma
acentua o efeito inibitório sobre a germinação. Apenas, não há diferença no poder
de interferência do óleo na CIM e a 156 µg/mL sobre o processo de germinação dos
conídios de ambos. Por fim, verificou-se que o tween 80 não interferiu na
germinação dos conídios de ambas as espécies.
As hifas que formam os férteis conidióforos – hifas que dão origem aos conídios
– diferenciam-se da hifa vegetativa, podendo apresentar diferentes graus de
semelhança com a hifa vegetativa. A conidiogênese ou como os processos e
sequências de eventos que resultam em um novo conídio podem ocorrer de duas
formas essencialmente: quando o conídio diferencia-se a partir da célula-mãe e
somente uma porção dela é que dá origem ao conídio (desenvolvimento blástico); ou
quando o conídio origina-se de toda a célula-mãe, assim sendo, toda a célula se
torna o conídio propriamente dito, evento denominado de desenvolvimento tálico
74
(LACAZ et al., 1998). Ainda, é importante ressaltar que os conídios não são
meramente células quiescentes, pois um nível basal de síntese de RNA e proteínas
é requerido para a sobrevivência dos esporos (LIU et al., 2007).
Percentual de inibição (%)
100
75
a
a
OE 156 g/mL
OE 312 g/mL
OE 625 g/mL
OE 2500 g/mL
50
25
0
T. rubrum
T. mentagrophytes
FIGURA 13. Percentual de inibição da germinação dos conídios de T. rubrum
ATCC 1683 e T. mentagrophytes LM02 após 24h de interação com o óleo
essencial (OE) de C. winterianus.
a: p<0,05 entre 156 e 625, 2500 µg/mL, em cada cepa isoladamente
Estudos na área de micologia, especialmente em micologia clínica, afirmam que
T. rubrum e T. mentagrophytes produzem numerosos esporos resultantes de
reprodução assexuada, os quais são considerados a causa primária das
dermatofitoses nos hospedeiros. A infecção é provocada pela aderência desses
esporos na superfície de contato com o estrato córneo da pele. Os esporos então
germinam e formam o micélio (ZURITA; HAY, 1987; GUPTA et al., 2003).
Entendendo o processo de germinação dos conídios de T. rubrum e T.
mentagrophytes como um evento decisivo na patogênese das dermatofitoses, este
pode apresentar-se como um alvo estratégico conferido de grande importância
terapêutica, respaldando a necessidade de estudos que visam obter novos produtos
capazes de bloquear este processo.
75
Como em outros fungos filamentosos, o processo de germinação dos conídios
pode ser dividido em três etapas:
 uma etapa de ativação provocada por fatores ambientais;
 uma fase de crescimento isotrópico representando o primeiro evento
morfologicamente observado;
 uma fase de crescimento polarizado.
Quando a germinação é induzida, o conídio inicia o crescimento isotrópico.
Investigações morfológicas mostraram que na fase de crescimento isotrópico o
conídio torna-se brilhante e o diâmetro mais largo do que na fase latente. A etapa de
crescimento isotrópico finalmente induz o crescimento polarizado e resulta na
formação de uma célula germinada tanto em leveduras quanto em fungos
filamentosos (WENDLAND; PHILIPPSEN, 2001).
O requerimento primário para o início da germinação e conclusão das etapas
subseqüentes é a sensibilidade a sinais externos. Em espécies fúngicas como
Sacharomyces cerevisae e Aspergillus nidulans, a glicose ou outra fonte de carbono
fermentável são necessários como sinal externo e suficientes para provocar a
germinação de esporos (LIU et al., 2007). No laboratório, algumas condições
experimentais são necessárias para que ocorra o completo processo de germinação:
suprimento nutritivo, oxigenação, temperatura, pH, umidade e viabilidade celular
(MINAMI, 2003).
Em T. rubrum, a germinação conidial é acompanhada por duas transições
morfológicas:
o
intumescimento
e
emergência
do
tubo
germinativo.
O
intumescimento geralmente acontece em 3-4 h e continua até 9-10 h depois da
indução da germinação (LIU et al, 2007).
As alterações observadas durante o processo de germinação dos conídios de T.
rubrum foram melhor evidenciadas do que as de T. mentagrophytes, em virtude da
dificuldade na diferenciação morfológica dos conídios quando estavam no estado
normal ou intumescido. Como os conídios de T rubrum se apresentam ligeiramente
pontiagudos, em forma semelhante a uma lágrima ou gota, o que facilita a
visualização da passagem do estado normal para o intumescido e os posteriores
(figuras 14 e 15). Somando-se a isto, a espécie T. rubrum possui maior importância
clínica e epidemiológica em detrimento de T. mentagrophytes no estado da Paraíba,
conforme Lima et al. (1999).
76
A
B
FIGURA 14. Alterações morfológicas durante a germinação dos conídios de T. rubrum
ATCC 1683 em CSD com conídios normais, intumescidos (A) e germinados (B). Barra = 50
µm (400x).
FIGURA 15. Alterações morfológicas durante
a germinação dos conídios de
T.
mentagrophytes LM02 em CSD com conídios
normais e germinados. Barra = 50 µm (400x).
77
Por isso foi avaliado a interferência do óleo essencial de C. winterianus nas
concentrações 156, 312, 625 e 2500 µg/mL na morfologia dos conídios de T.
rubrum, durante o processo germinativo dos conídios. As alterações morfológicas
ocorridas nos experimentos controle e teste foram analisadas em microscópio óptico
comum (Zeiss® model Primo Star) e os resultados exibidos nas tabelas 4, 5 e 6
como percentual das formas conidiais observadas, nos tempos 3, 15 e 24 h. Esses
intervalos de tempo foram cuidadosamente escolhidos, pois são esses em que as
principais alterações morfológicas são observadas, durante o processo normal de
germinação.
Em linhas gerais, 100 % dos conídios no experimento controle (ausência de óleo
essencial) conseguiram germinar em apenas 15 h de incubação, indicando
apropriadas condições de cultivo para o desenvolvimento dos conídios.
No primeiro momento de observação (3 h), verificou-se que o óleo essencial
conseguiu impedir o inicio da germinação, onde apenas 11, 6 e 4 % de conídios
intumescidos foram observados, respectivamente,em 156, 312 e 625 µg/mL. E na
CFM (2500 µg/mL) houve total impedimento do desenvolvimento dos conídios, efeito
este que se manteve até 24h de cultivo. Enquanto isso, no experimento controle,
todos os conídios apresentaram-se normalmente intumescidos, resultando em
diferenças estatisticamente significantes quando comparado com os resultados
obtidos com o óleo essencial (tabela 4).
Após 15 h de cultivo, enquanto o ensaio controle apresentou 100 % de células
germinadas, os ensaios experimentais não apresentaram nenhuma célula
germinada (tabela 5). Porém, foi detectado um aumento no percentual de conídios
intumescidos, indicando uma progressão dos eventos de germinação mesmo que
retardada, quando comparados ao experimento controle.
Na presença do óleo essencial, o progresso no desenvolvimento dos conídios
resultou em germinação de um pequeno percentual deles. Apenas na concentração
subinibitória (156 µg/mL) é que esse percentual foi mais elevado, embora
apresentando diferença estatística em relação ao controle, como todas as outras
concentrações. De um modo geral, analisando o número de conídios e a sua relativa
morfologia encontrada nos ensaios controle e nos ensaios pode-se confirmar que o
óleo interfere na germinação dos conídios.
78
TABELA 4. Distribuição do percentual de conídios de T. rubrum ATCC 1683 após 3 h de
interação com diversas concentrações do óleo essencial de C. winterianus.
Percentual de
conídios
Normais
Intumescidos
Germinados
156*
84
11
0
Óleo essencial (µg/mL)
312*
625*
2500*
94
96
100
6
4
0
0
0
0
Controle
0
100
0
* p<0,05 entre o controle (intumescidos) e 156, 312, 625, 2500 µg/mL.
TABELA 5. Distribuição do percentual de conídios de T. rubrum ATCC 1683 após 15 h de
interação com diversas concentrações do óleo essencial de C. winterianus.
Percentual de
conídios
Normais
Intumescidos
Germinados
156*
69
31
0
Óleo essencial (µg/mL)
312*
625*
2500*
90
98
100
10
2
0
0
0
0
Controle
0
0
100
* p<0,05 entre o controle (germinados) e 156, 312, 625, 2500 µg/mL.
TABELA 6. Distribuição do percentual de conídios de T. rubrum ATCC 1683 após 24 h de
interação com diversas concentrações do óleo essencial de C. winterianus.
Percentual de
conídios
Normais
Intumescidos
Germinados
156*
69
4
27
Óleo essencial (µg/mL)
312*
625*
2500*
90
6
4
98
1
1
* p<0,05 entre o controle (germinados) e 156, 312, 625, 2500 µg/mL.
100
0
0
Controle
0
0
100
79
Alguns genes homólogos aos de S. cerevisae e as vias de sinalização celular
relacionadas mostram importantes papéis nos processos celulares que envolvem a
germinação dos conídios de T. rubrum. Estes genes e vias de transdução celular
estão envolvidos em distintas etapas deste processo, como a ativação da
germinação conidial, manutenção do crescimento isotrópico, estabelecimento da
polaridade celular e transições morfológicas (LIU et al., 2007)
A indução da germinação pela glicose é mediada pela ativação da proteína
cinase dependente de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), denominada PKA.
A via de sinalização que envolve PKA controla os eventos iniciais da germinação
conidial em resposta à sensibilidade a fontes de carbono como a glicose, e mostra
um crítico papel, mas não essencial, no processo de germinação. De fato, a inibição
da ciclase de adenilil, enzima responsável pela formação do AMPc a partir do
trisfosfato de adenosina (ATP), resulta em atraso mas não em uma completa
interrupção na emergência do tubo germinativo (KRAAKMAN et al., 1999;
D’ENFERT, 1997).
As proteínas cinases são a maior família de proteínas em eucariotos e são a
chave central da comunicação no controle intracelular, regulação e transdução de
sinais (SILVA et al., 2009). A PKA fosforila resíduos de serina e treonina de outras
proteínas e é ativada por concentrações de AMPc. Esta enzima é formada por duas
subunidades: uma reguladora (R), com alta afinidade pelo AMPc, e uma catalítica
(C). Na ausência de AMPc, a subunidade C torna-se inativa pela formação de um
complexo tetramérico R2C2. A ligação do AMPc à subunidade R induz mudanças
conformacionais que resultam na dissociação da haloenzima inibida. Dessa forma, a
PKA regula a atividade de muitas proteínas celulares, desencadeando diferentes
respostas geralmente em resposta a estímulos externos (YU et al., 2004).
O crescimento isotrópico resulta em um drástico aumento no volume celular e
alguns estudos indicam que a manutenção da biossíntese bem como da integridade
da parede celular são muito importantes para o crescimento isotrópico de T. rubrum.
Esses eventos são conhecidamente importantes para evitar a lise celular, e algumas
vias de transdução celular foram caracterizadas estando envolvidas na regulação da
biossíntese da parede celular em S. cerevisae e outros fungos filamentosos. Estudos
desenvolvidos por Liu et al. (2007) indicam que estas vias incluem a via da Ras/RhoGTPase e da MAPK, as quais podem mostrar um papel modulador da biossíntese
da parede celular e estarem envolvidas na regulação do crescimento isotrópico.
80
A super família das GTPase inclui duas classes de proteínas: as proteínas
triméricas G, as quais são ativadas por certos receptores e ligam-se diretamente a
eles, e as monoméricas, também conhecidas como pequenas proteínas G (small G).
Essas small G regulam diversas funções celulares incluindo proliferação e
diferenciação celular, organização do citoesqueleto e o tráfego de moléculas no
meio intracelular, via ciclo químico da ligação e hidrólise do trisfosfato de guanosina
(GTP). Atualmente há cinco subfamílias, sendo estas a Ras, Rho, Rab, Arf e Ran, e
em todas, há duas formas de apresentação: uma inativa ligada ao bisfosfato de
guanosina (GDP) e outra ativa ligada ao GTP (LODISH et al, 2004; LI; ZHANG,
2004).
Em células eucarióticas, uma família de cinases de resíduos de serina e treonina
conhecidas como MAPK (mitogen-activated protein kinases) estão envolvidas na
transdução de uma variedade de sinais extracelulares e na regulação de diferentes
processos celulares (ZHAO et al., 2007). Embora havendo várias diferenças entre as
células dos mamíferos e dos fungos, quanto à complexidade e funcionalidade dos
elementos envolvidos, porém a estrutura central da cascata da MAPK é altamente
conservada (ROMÁN et al., 2007). Após um sinal estimulatório, com a participação
freqüente de small G (Ras/Rho) e proteínas cinases, inicia-se o desencadeamento
da cascata que formada por três proteínas cinases (Raf, MEK E ERK). A sequencial
ativação da cascata da MAPK eventualmente resulta e ativação de fatores de
transcrição e expressão de específicos genes. A expressão desses genes é
essencial nas respostas adaptativas da célula fúngica em contrapartida a um
determinado estímulo (ROMÁN et al., 2007; ZHAO et al., 2007). Em fungos, a via da
MAPK é importante no controle adaptativo aos estresses ambientais, na integridade
celular, na sustentação do crescimento vegetativo, na germinação dos esporos, na
virulência, na morfogênese e no estabelecimento das micoses (LEE, ELION; 1999;
DE NOBEL et al., 2000; SCHWARTZ; MADHANI, 2004).
O crescimento polarizado é também essencial para a germinação e
desenvolvimento da hifa. Informações fornecidas por Liu et al. (2007), colocam que a
via de sinalização que envolve a Rho-GTPase regula a maquinaria e septação e a
via da MAPK pode ser responsável por parte da regulação do desenvolvimento da
polaridade celular e mostra um papel na germinação conidial de T. rubrum.
Foi descrito que as vias de transdução do tipo two-component podem estar
envolvidas na germinação dos conídios de T. rubrum. As vias de transdução two-
81
component são largamente utilizadas para mediar a sinalização de eventos celulares
em seres procarióticos. Em anos recentes, estes sistemas de sinalização foram
encontrados em eucarióticos como plantas, leveduras e fungos filamentosos
(STOCK et al., 2000; WOLANIN et al., 2002). Muitos dos sistemas two-component
estão envolvidos na resposta à sensibilização por alterações no meio extracelular
tais como temperatura, pH, osmolaridade, substâncias químicas, íons etc.,
permitindo os organismos efetuarem adequadas respostas a essas variações
ambientais (ATTWOOD et al., 2007). Em Candida albicans, por exemplo, este
sistema de sinalização regula a biossíntese da parede celular, adaptação osmótica e
oxidante, morfogênese e virulência do organismo (MICHAEL, 2006).
Este esquema de fosfotransferência é constituído por dois componentes: uma
região cinase de histidina (CH) presente na membrana celular contendo o núcleo
cinase conservado e uma proteína reguladora de resposta (PRR), contendo um
domínio regulatório conservado. Estímulos extracelulares são detectados por CH e
servem para modular as suas atividades. A CH se autofosforila em um resíduo
histidina – a partir de um grupo fosfato do ATP – criando um resíduo de fosfato de
alta energia, que é posteriormente transferido para um resíduo de aspartato da PRR,
em uma reação catalisada pela PRR. A fosforilação induz uma mudança
conformacional que resulta em ativação de um domínio regulatório associado que,
por fim, efetua a resposta celular. Esta resposta é baseada na alteração da
transcrição de genes específicos que codificam proteínas que ajudarão a célula a
responder às variações ambientais. O esquema básico é altamente adaptável, e
inúmeras variações forneceram a otimização com específicos sistemas de
sinalização. Os domínios das proteínas que compõem o sistema two-component são
moduláveis e podem estar integradas em proteínas e vias sob uma variedade de
formas, mas o núcleo das estruturas e atividades é mantido (STOCK et al., 2000).
5.6 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE VIABILIDADE FÚNGICA
Nas figuras 16 e 17 são apresentados os resultados referentes ao efeito das
diversas concentrações do óleo essencial de C. winterianus sobre a viabilidade das
estruturas fúngicas de T. rubrum ATCC 1683 e T. mentagrophytes LM02,
respectivamente. Os resultados estão expressos em LogUFC/mL de cada cepa nos
tempos de 3, 6, 9 e 12 dias de exposição ao óleo essencial.
82
Após análise cada tempo isoladamente, observou-se que os valores obtidos pelo
óleo essencial diferiram de forma significativa em relação aos obtidos pelo controle.
Isto remete à informação de que todas as concentrações testadas interferiram
relevantemente de forma negativa na viabilidade celular de ambos os microorganismos desde o primeiro momento de análise, no terceiro dia de interação.
A CIM do óleo essencial conseguiu reduzir a viabilidade fúngica ao longo
período de experimento para ambos os fungos, chegando-se a 100 % de inibição da
viabilidade a partir de nove dias de interação. Na concentração subinibitória este
efeito também foi evidenciado, embora sendo preciso um tempo maior de interação
do óleo com os fungos. Neste caso, a partir de 12 dias de exposição, as células
fúngicas foram incapazes de voltar a crescer em meio isento de antifúngicos. Porém,
é notável que as concentrações mais elevadas, onde se incluem a CFM (2500
µg/mL) e a equivalente a duas vezes a CIM (625 µg/mL) exerceram maior efeito
inibitório sobre a viabilidade dos micro-organismos, pois a partir do terceiro dia de
interação os mesmos não conseguiram se desenvolver, tornando-os completamente
inviáveis para o crescimento.
As curvas de letalidade em função do tempo, semelhante às figuras expostas
acima, proporcionam informações importantes sobre a dinâmica da ação microbicida
de um antimicrobiano e sobre a relação entre a concentração deste produto e sua
atividade microbicida. Estas informações tornam-se uma ferramenta muito importante
na análise antimicrobiana de produtos com potencial antifúngico e, por isso, vem
sendo utilizadas para o estudo de novos antimicrobiano e também para determinar o
sinergismo e/ou antagonismo de associações de compostos utilizadas conjuntamente
(WHITE et al., 1996; CANTÓN; PEMÁN, 1999).
83
4
Controle
LogUFC/mL
a
OE 156 g/mL
a
OE 312 g/mL
a
OE 625 g/mL
a
OE 2500 g/mL
3
2
1
0
3
6
9
12
Tempo (dias)
FIGURA 16. Viabilidade das estruturas fúngicas de T. rubrum ATCC 1683 em
LogUFC/mL na presença do óleo essencial (OE) de C. winterianus.
a: p<0,05 quando comparado com o controle, em cada tempo isoladamente.
4
Controle
LogUFC/mL
a
OE 156 g/mL
a
OE 312 g/mL
OE 625 g/mLa
a
OE 2500 g/mL
3
2
1
0
3
6
9
12
Tempo (dias)
FIGURA 17. Viabilidade das estruturas fúngicas de T. mentagrophytes LM02 em
LogUFC/mL na presença do óleo essencial (OE) de C. winterianus.
a: p<0,05 quando comparado com o controle, em cada tempo isoladamente.
84
Assim, é uma metodologia suficientemente sensível para testes que visam
mensurar de forma dinâmica a capacidade de um composto de agir sobre a
viabilidade de um micro-organismo. Ainda, pode-se inferir qual é a estimativa de
mortalidade de uma população microbiana quando se enfrenta uma dada
concentração de um composto antimicrobiano, evidenciando a rapidez de um efeito
fungicida ou a duração de um efeito fungistático determinado pelo número de células
viáveis em placa (BURT, 2003). Suas vantagens resultam de fatores como
velocidade, economia e reconhecimento rápido de contaminantes nas culturas
utilizadas nos ensaio, podendo-se obter resultados altamente reprodutíveis (MINAMI,
2003). Estas curvas podem ser construídas a partir da contagem de células viáveis do
fungo em placas de ASD ou com percentual de células sobreviventes em uma cultura
fúngica em meio líquido, em relação aos diferentes intervalos de tempo analisados.
A análise final das curvas de viabilidade das estruturas fúngicas parte do
entendimento de que o comportamento fungicida de um produto é caracterizado pela
sua capacidade de impedir o crescimento de um fungo em caldo, de tal modo que
ele se torna incapaz de ser cultivado quando uma amostra do caldo de incubação é
transferida para um meio de cultura adequado ao seu crescimento (SMITH-PALMER
et al., 1998). Desse modo, ao considerar os resultados obtidos, pode-se confirmar
um efeito fungicida de todas as concentrações do óleo essencial de C. winterianus
sobre ambas as cepas teste, diferindo apenas no tempo necessário para evidenciar
esse efeito. As concentrações de 156 e 132 µg/mL se comportaram como
fungistáticas, cujo efeito inibitório durou em torno de 12 e 9 dias, respectivamente,
visto que a ausência de colônias nas placas de ASD foi apenas observada a partir
desses tempos.
5.7 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE A MICROMORFLOGIA DOS
DERMATÓFITOS
As cepas T. rubrum ATCC 1683 e T mentagrophytes LM02 foram cultivadas em
ASD na presença e ausência do óleo essencial de C. winterianus nas concentrações
78, 156 e 312 µg/mL, com base na técnica de microcultivo em lâmina. Esta técnica
de cultivo em lâminas permite demonstrar no microscópio óptico comum a
morfologia dos fungos e suas alterações provocadas pelo produto nas referidas
85
concentrações. Essas alterações morfológicas foram analisadas por microscopia
óptica, em um aumento de 400x, como pode ser visto nas figuras 18 e 19 referentes
às cepas T. rubrum e T mentagrophytes, respectivamente.
O exame microscópico do experimento controle demonstrou estruturas
características de cada espécie, com estrutura celular uniforme, citoplasma
homogêneo, ausência de clamidoconídios e grande esporulação por parte de ambas
as cepas. A espécie T. rubrum mostrou longas hifas hialinas, estreitas e septadas,
com seus conídios tipicamente em forma de gota ou lágrima, lateralmente dispostos
nos conidióforos e não foi observada a presença de macroconídios, como ilustra a
figura 18 (A). A ausência de macroconídios não descaracteriza a espécie, pois as
cepas podem ou não apresentá-los.
T. rubrum cultivado em meio de cultura acrescido do óleo essencial apresentou
diversas alterações morfológicas. Essas alterações foram semelhantes em todas as
concentrações, porém, apresentando um comportamento crescente no tocante à
incidência dessas alterações na medida em que a concentração do óleo essencial
foi aumentada (figura 18 B, C).Embora a forma dos conídios de T. rubrum não tenha
sido alterada, a sua produção foi seriamente prejudicada em todas as concentrações
do óleo essencial, tornando-se raramente encontrados na concentração de 312
µg/mL do óleo no meio de cultura. A grande maioria das hifas apresentou-se muitas
vezes curtas, mais largas do que o normal, um pouco descoradas e com vacúolos
no seu interior. Não foram observados macroconídios.
A partir da concentração de 156 µg/mL, foi detectada a presença de
clamidoconídios que teve a sua produção aumentada na proporção que se
aumentava a concentração do óleo essencial. Os clamidoconídios, também
chamados de hipnosporos, formam-se à custa dos filamentos micelianos, podendo
ser
terminais
ou
intercalares,
isolados
ou
contínuos.
São
conídios
de
desenvolvimento tálico e de origem holoblástica, uma vez que todas as paredes
celulares estão envolvidas ativamente na formação do conídio (LACAZ et al., 1998).
Os clamidoconídios são geralmente arredondados, de volume aumentado e com
paredes espessas. São formados em condições ambientais adversas, não
favoráveis ao desenvolvimento fúngico (GOMPERTZ, et al., 2000). Talvez seja seja
esta razão que foram produzidos na medida em que se aumentava a concentração
do óleo essencial, na tentativa de suportar seu crescimento na presença desse
componente adverso..
86
A
B
C
FIGURA 18. Micromorfologia de T. rubrum ATCC 1683 cultivado na ausência e presença do
óleo essencial de C. winterianus. Experimento controle apresentando formas típicas da
espécie (A); crescimento na presença do óleo essencial (156 µg/mL) apresentando hifas
curtas, tortuosas (B); e clamidoconídios (C). Barra = 50 µm (400x).
87
Com relação ao T. mentagrophytes, foram também observadas hifas longas,
hialinas, estreitas e septadas. Os microconídios arredondados e agrupados em
forma de cachos agregados aos conidióforos. Alguns macroconídios foram
visualizados, embora que eles também podem estar ausentes; esses são
morfologicamente semelhantes a charutos e de parede fina, conforme a figura 19 (A,
B).
T. mentagrophytes cultivado em meio de cultura acrescido do óleo essencial
também apresentou diversas alterações morfológicas. E da mesma forma de T.
rubrum, as alterações foram semelhantes em todas as concentrações e se
agravaram na medida em que se aumentava a concentração do óleo essencial,
prejudicando a morfogênese normal da espécie (figura 18 C, D).
A forma dos conídios de T. mentagrophytes não foi alterada, mas o seu
agrupamento típico da espécie foi fortemente prejudicado, tornando-se bastante
dispersos em todas as concentrações do óleo essencial. As hifas apresentaram-se
muito mais largas do que o normal, com grande perda de pigmentação e com
vacúolos abundantemente distribuídos no seu interior. Não foram observados
macroconídios
e
raros
clamidoconídios
foram
encontrados
nas
primeiras
concentrações do óleo essencial, aumentando sua produção na concentração de
312 µg/mL.
Em suma, essas alterações morfológicas observadas no microcultivo de ambas
as cepas prejudicaram até mesmo a caracterização normal da espécie em estudo,
segundo os critérios micromorfológicos.
A morfologia fúngica é um fator de grande importância durante a invasão e
durante a evasão das células do hospedeiro. A forma celular (conídios) parece
iniciar a infecção, mas as hifas apresentam alguma vantagem em específicos
estágios do processo infeccioso. As hifas formadas são mais difíceis de serem
fagocitadas e podem eventualmente provocar morte de macrófagos, penetrar mais
facilmente através do epitélio, invadindo tecidos (ROMÁN et al, 2007). Por isso, as
alterações na morfologia de fungos filamentosos por compostos antifúngicos são de
grande importância para o impedimento do seu crescimento normal, a viabilidade e a
virulência dos fungos.
88
A
B
C
D
FIGURA 19. Micromorfologia de T. mentagrophytes LM02 cultivado na ausência e presença
do óleo essencial de C. winterianus. Experimento controle apresentando formas típicas da
espécie com macroconídios charutóides com poucos septos (A) e microconídios esféricos e
agrupados ao longo dos conidióforos (B); crescimento na presença do óleo essencial (156
µg/mL) apresentando conídios em pouca quantidade e desagrupados, e hifas largas com
vacúolos no interior. Barra = 50 µm (400x).
89
Alguns autores afirmam que células tratadas com drogas que interferem com a
parede celular frequentemente apresentam distintas características morfológicas
(GUNJI et al., 1983; FUKUSHIMA et al., 1993). Ainda, é relatado que as
modificações anormais na estrutura morfológica da célula fúngica causadas por
óleos essenciais podem estar relacionadas com a interferência dos seus
constituintes sobre enzimas responsáveis pela biossíntese ou manutenção da
parede celular, afetando o crescimento e morfogênese fúngica (ZAMBONELLI et al.,
1996; DEBILLBECK et al. 2001).
5.8 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE A MACROMORFOLOGIA DOS
DERMATÓFITOS
Após a análise das alterações microscópicas da morfologia dos dermatófitos,
julgou-se interessante verificar se algumas alterações também seriam evidenciadas
macroscopicamente. A avaliação morfológica das culturas de T. rubrum ATCC 1683
e T. mentagrophytes LM02 foi realizada em meio ASD, adicionado do óleo essencial
nas concentrações 156 e 312 µg/mL. A escolha dessas concentrações foi baseada
segundo alguns critérios, na perspectiva de viabilizar a metodologia, como por
exemplo, não utilizar concentrações acima da CIM (312 µg/mL) tendo em vista que
não houve um bom desenvolvimento da cultura para a análise, além dos efeitos
sobre a micromorfologia das cepas terem sido mais claramente evidenciados a partir
da concentração de 156 µg/mL. De modo geral, foram observados o aspecto, a
textura e a pigmentação das colônias, além dos aspectos do reverso das colônias.
Pois essas características são fundamentais para somarem-se ao conjunto de
informações que caracterizarão cada uma das espécies em estudo.
Em T. rubrum, o experimento controle mostrou colônias com características
clássicas da espécie, com colônias lisas, aveludadas e brancas. O reverso da
colônia apresentou-se sem pigmentação (figura 20 A, B). Em 156 µg/mL do óleo
essencial, as colônias apresentaram pregas e uma pequena saliência no centro,
coloração creme um pouco mais escuro que a do controle, sem coloração no
reverso e com as pregas evidentes (figura 20 C, D). Com o crescimento na presença
de 312 µg/mL do óleo essencial, houve menor desenvolvimento das colônias, pois
90
se trata da CIM, e apresentou as mesmas características presentes na concentração
anterior (figura 20 E, F).
Em T. mentagrophytes, as alterações foram menos evidentes. O experimento
controle mostrou colônias lisas, algodonosas e brancas, com reverso pigmentado
com cor amarelada de tons mais escuros próximos ao centro (figura 21 A, B). Em
156 (figura 21 C, D) e 312 µg/mL (figura 21 E, F) do óleo essencial, as colônias
apresentaram-se lisas, com aspecto mais cotonoso e com o reverso de tonalidade
gradualmente mais fraca em relação ao controle.
Esses resultados mostram que houve alterações macromorfologicamente
detectáveis, refletindo os resultados encontrados na análise microscópica. Essas
alterações presentes nas colônias dos dermatófitos não chegam a descaracterizar
as espécies em estudo, em virtude das grandes variações morfológicas encontradas
nessas espécies.
Entretanto essas informações dão indícios de que o óleo essencial de C.
winterianus está de alguma interferindo com o desenvolvimento normal das espécies
de T. rubrum e T. mentagrophytes. Estes resultados são mais valorizados quando
associados às informações previamente confirmadas em que o produto impediu o
crescimento micelial e que após exposição ao óleo essencial, ele tornou as cepas
incapazes de retornarem o crescimento. Isto reflete diretamente na patogênese das
dermatofitoses, visto que, é um processo que depende, dentre outros fatores, da
capacidade da morfogênese normal dos fungos, da viabilidade e do seu crescimento
no local da infecção.
91
A
B
C
D
E
F
FIGURA 20. Macromorfologia de T. rubrum ATCC 1683 cultivado em
ASD, na ausência e presença do óleo essencial de C. winterianus.
Experimento controle apresentando colônia lisa, aveludada e branca
(A), com reverso sem pigmentação (B); crescimento na presença do
óleo essencial (156 µg/mL) com colônia pregueada, cotonosa e
coloração creme (C), com reverso de mesma coloração e pregas
evidentes (D); crescimento na presença do óleo essencial (312
µg/mL) com colônia menos desenvolvida e com as mesmas
características da concentração 156 µg/Ml (E, F).
92
A
B
EC
D
F
E
F
FIGURA 21. Macromorfologia de T. mentagrophytes LM02 cultivado
em ASD, na ausência e presença do óleo essencial de C. winterianus.
Experimento controle apresentando colônia lisa, algodonosa e branca
(A), e reverso com pigmentação amarelada (B); crescimento na
presença do óleo essencial a 156 µg/mL (C, D) e 312 µg/mL (E, F),
com colônias lisas, mais cotonosas e com reverso de tonalidade mais
fraca.
93
5.9 ENSAIO COM SORBITOL
O ensaio com sorbitol se baseia na medida dos danos que produtos com
atividade antifúngica produzem aos componentes da parede celular fúngica. Caso o
produto atue de alguma forma sob a parede celular do fungo, ele provocará lise de
suas células quando na ausência de um estabilizador osmótico, mas permitirá seu
crescimento na presença desse suporte osmótico. Dessa maneira, este ensaio
compara os valores de CIM dos produtos antifúngicos na ausência e presença de
sorbitol a 0,8 M, um protetor osmótico usado para estabilizar os protoplastos dos
fungos. A aplicação desta metodologia foi idealizada porque muitos agentes
antifúngicos que interferem com a parede celular fúngica, muitas vezes mostram
malformações que se podem ser vistas microscopicamente (GUNJI et al., 1983).
Na tabela 7, estão expostos os valores de CIM do óleo essencial de C.
winterianus e do cetoconazol na presença de 0,8 M do protetor osmótico sorbitol.
Como pode ser observado, o sorbitol não protegeu as células dos efeitos inibitórios
do óleo essencial e do cetoconazol, pois não houve alterações nos valores de CIM
dos produtos analisados frente a todas as cepas testadas na ausência e na
presença dos produtos. Os valores de CIM na ausência do sorbitol estão expostas
na tabela 3. O controle com sorbitol garantiu a confiabilidade dos resultados da
metodologia visto que as cepas foram capazes de crescer na presença do sorbitol e
ausência dos produtos. Da mesma forma, no controle de esterilidade, onde não foi
detectado crescimento microbiano no CSD livre de qualquer produto ou inóculo.
Esses resultados demonstram que a atividade antifúngica do óleo essencial de C.
winterianus possivelmente não envolve sua interação direta com a parede celular
dos dermatófitos em estudo.
A parede celular é composta quimicamente por um complexo de proteínas e
policarboidratos como mananos, glicanos e quitina, sendo esses últimos únicos nos
fungos. A quitina é um polímero linear constituído de resíduos de Nacetilglicosamina unidos por ligações β-1,4, produzida na face interna da membrana
plasmática e transferidas para a superfície celular como microfibrilas. As enzimas
quitina sintases estão ligadas à membrana e existem em três isoformas: Chs1, Chs2
e Chs3. Já os glicanos são os maiores componentes da parede celular. São
formados por longas cadeias de resíduos de glicose unidas por ligações β-1,3 e β-
94
1,6, cuja síntese é executada pela glicano sintase. Esta enzima é formada por duas
subunidades, a subunidade catalítica localizada na membrana plasmática e a
segunda, ligada a GTP e ativadora da subunidade catalítica (DEBONO; GORDEE,
1994; GEORGOPAPADAKOU; TKACZ, 1995).
TABELA 7. Valores de CIM do óleo essencial de C. winterianus e cetoconazol sobre as
cepas de T. rubrum e T. mentagrophytes, na presença de sorbitol (0,8M).
Controles
Micro-organismos
Óleo essencial
(µg/mL)
Cetoconazol
(µg/mL)
Sorbitol
Esterilidade
T. rubrum ATCC 1683
T. rubrum LM63
T. rubrum LM98
T. rubrum LM130
T. rubrum LM222
T. rubrum LM309
T. rubrum LM333
T. rubrum LM422
T. rubrum LM600
T. rubrum LM629
T. rubrum LM640
T. rubrum LM710
T. rubrum LM713
T. rubrum LM720
T. rubrum LM722
T. rubrum LM730
T. mentagrophytes LM02
T. mentagrophytes LM07
T. mentagrophytes LM11
T. mentagrophytes LM28
T. mentagrophytes LM79
T. mentagrophytes LM202
T. mentagrophytes LM308
T. mentagrophytes LM962
312
156
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
312
156
312
312
312
312
312
312
156
156
156
156
312
156
312
156
78
156
156
156
156
156
78
312
156
78
156
78
156
156
156
312
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+: presença de crescimento do micro-organismo;
-: ausência de crescimento dos micro-organismos;
95
A parede está envolvida com funções não compartilhadas com as células dos
mamíferos, pois são essenciais para os fungos e não estão presentes em
hospedeiros mamíferos. Dessa forma, ela se mostra como um alvo atrativo para
novos antifúngicos (DIDOMENICO, 1999). Ela é uma organela dinâmica importante
para a viabilidade do organismo, cuja complexa estrutura serve para muitas funções
celulares
incluindo
a
proteção
osmótica,
transportes
de
macromoléculas,
crescimento, conjugação e formação de esporos. Sua estrutura é composta por um
complexo de biopolímeros, onde cada um mostra um importante papel na sua
funcionalidade (DEBONO; GORDEE, 1994). Alterações em sua organização ou
interrupção funcional provocadas por agentes antifúngicos podem acarretar
letalidade
para
os micro-organismos,
provavelmente
com
mínimos
efeitos
indesejáveis ao hospedeiro.
A proteção com sorbitol é um ensaio que possui um amplo espectro de
possibilidades, pois pode detectar não somente agentes que afetam a síntese dos
polímeros da parede celular e a sua adjacência, como também os mecanismos
regulatórios envolvidos nesse processo que se complementam com a observação
microscópica das malformações detectadas nas cepas fúngicas analisadas
previamente (ZACCHINO, 2001). E de acordo com esses resultados, entende-se
que o óleo essencial pode estar atuando por outros mecanismos que indiretamente
podem estar envolvidos com a biossíntese ou manutenção da parede celular
fúngica, como por exemplo, a membrana celular fúngica.
5.10 LISE DA MEMBRANA CELULAR
Considerando o caráter lipofílico do óleo essencial de C. winterianus, há a
possibilidade de atuar sobre a membrana plasmática fúngica interagindo diretamente
com elementos constituintes ou interferindo de alguma forma na sua biossíntese,
ocasionando lise celular. Os efeitos de um óleo essencial sobre a membrana celular
pode ser avaliada pela detecção de componentes intracelulares liberados para o
meio externo, em conseqüência do rompimento da membrana. Os componentes
celulares que absorvem energia a 260 nm representam uma classe de compostos,
primariamente nucleotídeos, os quais contêm resíduos de uracila que exibem forte
absorbância nesse comprimento de onda (LUNDE; KUBO, 2000).
96
Nas figuras 22 e 23, estão registrados os resultados referentes aos efeitos do
óleo essencial de C. winterianus (78, 156 e 312 µg/mL) sobre a integridade das
células fúngicas, respectivamente, de T. rubrum ATCC 1683 e T. mentagrophytes
LM02. Os resultados estão expressos em percentual de lise, tomando-se como base
os resultados do lisante, o qual provocou 100 % de lise celular.
Os resultados referentes à cepa T. rubrum ATCC 1683 mostram que a CIM do
óleo essencial provocou 100 % de lise celular a partir de 4 h de interação, valores
que a anfotericina B apenas apresentou após 24 h. E em até 24 h, o óleo apresentou
valores maiores e diferentes significativamente que os da anfotericina B. As
concentrações inferiores à CIM (78 e 156 µg/mL) registraram um comportamento
crescente no percentual de lise no decorrer do tempo, porém não foram capazes de
provocar 100 % de lise até as 24 h analisadas nos ensaios. Após análise estatística,
verificou-se que em todos os tempos, houve diferença entre a concentração de 78
µg/mL e as demais concentrações do óleo essencial. Ainda, até o intervalo de 2 h os
resultados de 312 e 156 µg/mL foram semelhantes, diferindo após 24 h de interação.
Esses dados revelam que é necessário uma CIM desse óleo e um tempo de 4 h de
interação para se obter danos na membrana comparáveis ao controle positivo.
Percentual de lise (%)
100
OE 78 g/mL
OE 156 g/mL
OE 312 g/mL
OE Anfotericina B
75
50
25
0
2
4
24
Tempo (horas)
FIGURA 22. Percentual de lise das células de T. rubrum ATCC 1683 na presença
do óleo essencial (OE) de C. winterianus (78, 156 e 312 µg/mL) e anfotericina B
(0,60 µg/mL).
97
Com relação aos danos na membrana celular de T. mentagrophytes LM02, todas
as concentrações do óleo essencial foram capazes de provocar 100 % de lise celular
a partir de 4 h de interação das células com os produtos. Em 2 h de interação, os
resultados de 78 (35,00 %) e 156 µg/mL (55,00 %) foram semelhantes, diferindo
apenas dos de 312 (68,33 %). Ainda, desde o início da análise, os resultados da
anfotericina B (60 %) e do óleo a 312 µg/mL foram semelhantes estatisticamente.
Este comportamento pode ser observado com todas as concentrações a partir de 4
h de interação, onde todos os produtos apresentaram 100 % de lise celular, tal como
o controle positivo.
Percentual de lise (%)
100
OE 78 µg/mL
OE 156 µg/mL
OE 312 µg/mL
OE Anfotericina B
75
50
25
0
2
4
24
Tempo (horas)
FIGURA 23. Percentual de lise das células de T. mentagrophytes LM02 na
presença do óleo essencial de C. winterianus (78, 156 e 312 µg/mL) e
anfotericina B (0,60 µg/mL).
Embora as propriedades antifúngicas dos óleos essenciais e de alguns de seus
fitoconstituintes terem sido relatadas por inúmeros pesquisadores, o mecanismo de
ação ainda não foi estudada com grandes detalhes (LAMBERT, 2001). Sabendo-se
do grande número de diferentes constituintes químicos encontrados em óleos
essenciais, possivelmente, sua atividade antimicrobiana não está relacionada com
um mecanismo específico, de outra forma, acredita-se que ocorra uma ação
98
concomitante de vários compostos sobre diferentes alvos na célula microbiana
(CARSON et al., 2002).
Contudo, pesquisas têm sugerido que os componentes minoritários de óleos
essenciais também podem exercer importante papel no desencadeamento dos
fenômenos envolvidos na eficiência da atividade antimicrobiana (MILLOS et al.,
2000). E dessa maneira, a atividade de um óleo essencial pode ser esperada a partir
da relação da configuração de seus constituintes, a proporção em que eles estão
presentes e as interações entre os mesmos. Por isso, acredita-se que nem todos
estes mecanismos ocorram de forma separada, de modo que alguns deles,
possivelmente, possam ser ativados como conseqüência de outros mecanismos
previamente desencadeados (SIKKEMA et al., 1995; DORMAN et al., 2005;
MARINO et al., 2001).
Os óleos essenciais são tipicamente lipofílicos e, dessa forma, acredita-se que
esses produtos possam atravessar a parede celular e se particionarem nos lipídios
da membrana plasmática, alterando a estrutura das diferentes camadas de
polissacarídeos e ácidos graxos, deixando-as mais permeáveis (KNOBLOCK et al,
1989; SIKKEMA, et al., 1994).
Em bactérias, a permeabilização da membrana está associada com a redução
do potencial de membrana e perda de íons, colapso da bomba de prótons e
depleção do pool de ATP. Danos na parede celular ou membrana citoplasmática
pode induzir a liberação de macromoléculas e ocasionar lise celular (KNOBLOCK et
al, 1989; SIKKEMA, et al., 1994; DIPASQUA et al., 1998; ULTEE et al., 2002).
Os componentes majoritários do óleo essencial de C. witerianus como o
citronelal, geraniol e citronelol pertencem a um dos grupos de constituintes
comumente presentes em óleos essenciais (terpenos) que, de acordo com a
literatura, agem principalmente contra a membrana citoplasmática dos microorganismos (KNOBLOCH et al., 1989; SIKKEMA et al, 1995; DI PASQUA et al.,
2007). Isto é justificado pelo caráter lipofílico destes compostos, sugerindo sua
interação com membranas dos micro-organismos. E de fato, a hidrofobicidade
dessas moléculas as possibilita se particionarem nas membranas celulares dos
fungos, alterando suas funções e as deixando mais permeáveis (BURT, 2004).
Sendo assim, efeitos como perturbação da membrana citoplasmática, ruptura do
fluxo de elétrons, alteração no transporte de moléculas através da membrana,
inibição de atividade de certas enzimas e coagulação do conteúdo citoplasmático
99
são alguns mecanismos envolvidos na promoção do poder antimicrobiano dos óleos
essenciais descritos na literatura (SIKKEMA et al., 1995; COX, 2000).
A estrutura e função da membrana plasmática na célula fúngica é essencial para
a sobrevivência do fungo, visto que a ocorrência de alterações na síntese ou
manutenção da membrana celular resulta geralmente em letalidade (GOMPERTZ et
al., 2000; CIHLAR et al., 2002). A possível interação do óleo essencial de C
winterianus com a membrana celular e sua conseqüente lise, remete à necessidade
de melhor investigar como este evento ocorre. Alguns autores colocam que pode ser
conseqüência da interferência na biossíntese de ergosterol ou uma interação direta
com o ergosterol, na alteração do perfil dos ácidos graxos da membrana plasmática,
na função da H+/ATPase presentes na membrana plasmática, no efluxo de K + pela
membrana, entre outros fatores (HAWORTH et al., 1993; ARTHINGTON-SKAGGS,
et al., 1999; COX et al., 1998; LUNDE; KUBO, 2000; BORELI et al., 2008).
Essas informações colocam estes alvos como promissores na busca racional de
novos produtos com atividade antifúngica, os quais interfiram de alguma maneira
com a função da membrana celular destes micro-organismos. E dessa forma, é
sugestivo que as pesquisas com o óleo essencial de C. winterianus sejam
aprofundadas com o objetivo de tentar esclarecer seu modo de ação antifúngica em
dermatófitos.
Conclusões
101
6. CONCLUSÕES
Baseando-se nos resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que:
 Em linhas gerais, os resultados confirmam o potencial antifúngico do óleo
essencial de C. winterianus especialmente contra T. rubrum e T. mentagrophytes.

Os componentes majoritários do óleo essencial de C. winterianus são
monoterpenos acíclicos;
 O óleo essencial de C. winterianus inibe o desenvolvimento micelial, o processo
de germinação dos esporos e a viabilidade de T. rubrum e T. mentagrophytes;
 O óleo essencial de C. winterianus induz evidentes alterações micro e
macromorfológicas em T. rubrum e T. mentagrophytes;
 A atividade antifúngica do óleo essencial de C. winterianus parece estar envolvida
com a interferência na função da membrana plasmática fúngica;
 Agora, o referido óleo apresenta-se como um relevante e promissor produto
antifúngico e contribui para o arsenal de produtos com conhecida atividade
antifúngica, com especial ênfase para o tratamento de uma das doenças
micóticas que mais acometem o homem, as dermatofitoses. As investigações
proporcionam grandes expectativas para futuros estudos farmacológicos mais
aprofundados tanto com o óleo essencial de C. winterianus quanto com os
fitoconstituintes majoritários, na perspectiva de um melhor entendimento de suas
formas de ação em nível de membrana celular e de uma possível aplicação
terapêutica desses produtos no tratamento das dermatofitoses.
Referências
103
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