A base da espectrometria de massas
The father of MS and the first mass
spectrometrist to win the Nobel Prize.
Pure species and mixtures
JJ Thomson's 'Plum Pudding Model' of the atom, a sphere
of positive charge containing electrons
Mass spectra and isotopes
The Nobel Prize in Chemistry 1922
"for his discovery, by means of his mass spectrograph, of isotopes, in a large
number of non-radioactive elements, and for his enunciation of the wholenumber rule"
Francis William Aston
At the end of 1909 he accepted the invitation of Sir J.J.Thomson to
work as his assistant at the Cavendish Laboratory, Cambridge, on
studies of positive rays. It was during this period that he obtained
definite evidence for the existence of two isotopes of the inert gas
neon.
EI : Ionização por elétrons
(Dempster e Nier)
Princípio Geral de EI
• Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorção
térmica), a uma pressão típica de 10-5 torr, são
bombardeadas por elétrons, com energia típica de 70
eV. Ocorre principalmente a retirada ou captura de um
eléctron formando íons M+. ou M-.. Íons positivos são
em geral predominantes (~100 vezes mais). M-. se
tornam importantes para moléculas com alta EA.
M + e- (70 eV) → M+. (~ 5 eV) + 2e- (65 eV)
e
F1
F2
F3
F4
+
M
M
Princípios Gerais
• Processo unimolecular. Os íons formados são rapidamente
extraídos da fonte de ionização pelo eletrodo de repulsão
("repeller“).
• Íons moleculares são formados com excesso de energia
interna e se fragmentam total ou parcialmente.
• EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular
(massa) como também fragmentos (estrutura); espectros
reprodutíveis; bibliotecas de espectros de EI a 70 eV;
estável; fácil de operar; alta sensibilidade.
• Aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo
peso molecular (~500u), voláteis e termo-estáveis:
moléculas orgânicas relativamente pequenas.
Princípios Gerais
• Quando o íon molecular não é observado (devido a dissociação
excessiva), é inútil diminuir a energia dos elétrons.
• Uma em cada 103-105 moléculas que entram na fonte de EI é
ionizada.
• EI ocorre em ~10-16 s. Ocorre sem mudanças nas distâncias
internucleares (Frank-Condon).
• Esquema Geral
• A diminuição da energia dos elétrons provoca uma queda brusca nas
intensidades absolutas de todos os íons, mas um aumento na intensidade
relativa do íon molecular.
Espectros Típicos de EI a 70 eV
2-Hydroxy-1,2-diphenyl-ethanone
56
100
OH
41
70
84
50
29
27
15 18
0
100
39
45
37
10
20
(mainlib) 1-Octanol
30
40
50
50
43
73 77
62
60
70
91
80
97 101
90
112
100
110
120
130
55
70
41
50
29
0
112
14
31
10
20
(mainlib) 1-Octene
100
30
45
40
59 62
50
72
60
77
70
91
80
97
90
100
110
120
55
41
29
50
83
39
27
39
27
70
112
83
0
15
10
20
(mainlib) 2-Octene
30
67
51
32
40
50
60
77
70
97
80
90
100
110
120
140
Alguns espectros de EI apresentam dissociação excessiva, outros pouca dissociação.
M+. = massa e isótopos
F+ = estrutura
Espectro de Massas: Ionização por Elétrons (EI)
Isômeros C3H6O
M-1
Perda de hidrogênio radicalar
M - .H
M-15
Perda de metil radicalar
M - .CH3
M-29
Perda de etil radicalar
M - .C2H5
M-31
Perda de metoxi radicalar
M - .OCH3
M-43
Perda de propil radicalar
M - .C3H7
M-45
Perda de etoxi radicalar
M - .OC2H5
M-57
Perda de butil radicalar
M - .C4H9
M-2
Perda de hidrogênio
M – H2
M-18
Perda de água
M – H2O
M-28
Perda de CO ou etileno
M-CO
C2H4
M-30
Perda de formaldeido
M- CH2O
M-32
Perda de metanol
M-CH3OH
M-44
Perda de CO2
M-CO2
M-60
Perda de ácido acético
M-CH3CO2H
ou
M-
56
100
OH
41
Íon Molecular
70
84
50
29
27
0
100
39
15 18
45
37
10
20
(mainlib) 1-Octanol
30
40
50
50
43
73 77
62
60
70
91
80
97 101
90
112
100
110
120
130
55
70
41
50
29
0
14
10
20
(mainlib) 1-Octene
83
39
27
112
45
31
30
40
59 62
50
60
72
70
77
91
80
90
97
100
110
120
140
“Chemical Ionization”
CI
Munson and Field - 1966
Princípios Gerais
• Ionização por reação química (ex: protonação : MH+). A
exotermicidade da reação controla a extensão dos processos
dissociativos.
• Gases ionizantes típicos: metano, isobutano, amônia.
• Como em EI, aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade
e baixo peso molecular (~500u), voláteis e termo-estáveis:
"moléculas orgânicas". Uma aplicação típica de CI ocorre para
substâncias que não apresentam o íon molecular por EI.
• Adutos formados entre M e o íon reagente podem ser observados
(Ex. M-NH4+). Estes adutos podem diferenciar isômeros.
• CI é uma técnica branda de ionização, por provocar pouca ou
nenhuma fragmentação da molécula ionizada.
CI – IONIZAÇÃO QUÍMICA
Ionização Química (CI).
Controle da Exotermicidade da Reação:
Extensão de Fragmentação
CH4
+ e-
+
CH2 + H2
+ CH4
CH3+ + CH4
+
50 eV
+
CH4
+
+ e-
CH3+ + H
+
CH4
CH4
70 eV
CH4
Reação
Íon/molécula
+
CH2 + CH4
C2H3+ + CH4
CH5+ + CH3
C2H5+ + H2
C2H3+ + H2 + H
C3H5+ + H2
+ e-
térmica
Ionização Química (CI).
• Ionização Química Positiva:
Metano:
CH4 + e -----> CH4+. + 2e ------> CH3+ + H.
CH4+. + CH4 -----> CH5+ + CH3.
CH4+. + CH4 -----> C2H5+ + H2 + H.
Isobutano:
i-C4H10 + e -----> i-C4H10+. + 2e
i-C4H10+. + i-C4H10 ------> i-C4H9+ + C4H9 +H2
Amônia:
NH3 + e -----> NH3+. + 2e
NH3+. + NH3 ------> NH4+ + NH2.
NH4+ + NH3 --------->N2H7+
Reserpina EI 70 eV
Reserpina CH4 CI
MS ?
APCI – “Atmospheric Pressure Chemical Ionization”
APPI – “Atmospheric Pressure Photo-Ionization”
SIMS – IONIZAÇÃO POR ÍONS SECUNDÁRIOS
1970 Benninghoven
ion guns (LMIG) Ga+ and In+
Csþ ions give higher yield
SF5+, Bi+n, Au+n
FAB – IONIZAÇÃO POR BOMBARDEAMENTO
DE ÁTOMOS ACELERADOS (liquid SIMS)
Formação de átomos acelerados
Xe
+ e-
IONIZAÇÃO
ÁTOMO LENTO
+
ÍON LENTO
+
Xe
+
Xe
ÍON LENTO
ACELERAÇÃO
Xe
+
Xe
ÍON RÁPIDO ÁTOMO LENTO
+
Xe
ÍON RÁPIDO
TROCA DE
ENERGIA
+
Xe
ÍON LENTO
+
Xe
ÁTOMO RÁPIDO
Índice de popularidade - FAB
Matrizes
Efeito da Matriz
Sistema CF-FAB
(continuous-flow FAB)
The Nobel
Prize in
Chemistry
2002
"for the development of methods for identification
and structure analyses of biological
macromolecules"
Yamashita, M.; Fenn, J.B., J. Phys. Chem. 88 (1984) 4451.
Whitehouse, C.M.; Dreyer, R.N.; Yamashita, M.; Fenn, J.B., Anal. Chem. 57 (1985) 675.
Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F.; Whitehouse, C.M., Science 246 (1989) 64.
"Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules,“
Popularidade do Electrospray
Príncipio Geral
• Uma solução acidificada ou basificada da amostra (ou
“neutra” de um sal) é submetida a um spray eletrolítico
sob pressão atmosférica. Um fino “spray” (aerosol) se
forma (cone de taylor) na presença de um alto campo
elétrico (+4000V ou – 4000V). O contra-íon é oxidado ou
reduzido e formam-se gôtas com excesso de carga (positiva
ou negativa). O solvente das gôtas evapora com redução de
volume, e as gôtas se subdividem. Eventualmente, devido a
alta repulsão entre os íons de mesma carga, ou se formam
gôtas contendo apenas um íon (modelo CRM) ou íons são
expelidos das gôtas para a fase gasosa (modelo IEM de
evaporação de íons).
HCl
O
C
OH
+
H3N
Cl-
O
+ 4.000 V
C
O
+
H3N
C
OH
ESI Positivo
OH
NH2
O
NaOH
H 2N
C
O-
Na
+
- 4.000 V
O
H 2N
C
O-
ESI Negativo
“Enganando” as moléculas neutras com curvas
Z-spray (Micromass)
Fonte Z-spray
ESI+, Full Scan
Extracted at m/z 256
Total Run Time > 25 Hr
More than 500 mg salt
n=1
n = 509
0.00
0.40
0.80
Time
1.20
1.60
Fonte de ESI:
Ionização sob pressão atmosférica !
MS
Proteínas
Positive ESI-MS m/z spectrum of the protein hen egg white lysozyme
Ionização a Pressão Atmosférica (API).
Eletrospray (ESI)/Pequenas moléculas
Possibilidade de formação de íons com múltiplas cargas
Espectros de ESI-MS típicos : “Pequenas Moléculas”
Espectros de ESI-MS típicos : “Pequenas Moléculas”
n=(M1- 1)/(M2 –M1)
n=(1131.2 – 1)/(1211.9-1131.2) = 14,1
M = n(M1 – 1) ⇒ 14 (1131.2 – 1)= 15822,8
MALDI vs ESI
Popularidade do Electrospray
MS ?
MALDI – “Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization”
The Nobel
Prize in
Chemistry
2002
"for the development of methods for identification
and structure analyses of biological
macromolecules"
(Karas & Hillenkamp - 1987)
Popularidade do MALDI
MALDI “…fazendo um elefante voar !”
MALDI “…fazendo um elefante voar !”
MALDI- IONIZAÇÃO/DISSORÇÃO A LASER ASSISTIDA POR MATRIZ
MALDI- IONIZAÇÃO/DISSORÇÃO A LASER ASSISTIDA POR MATRIZ
Matrizes
(1) α-cyano-4-hydroxycinnamic acid : CCA
(2) 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapinic acid) : SA
(3) 2,5-dihydroxybenzoic acid.
• Razão matriz-amostra: 100:1 a 5000:1
• Prepara-se solução da amostra e matriz (pequenas moléculas orgânicas). O
solvente é evaporado resultando em uma solução sólido-sólido que é depositada
sobre a superfície da sonda. Esta solução é então irradiada com laser. Ocorre
aquecimento localizado e seletivo. A matriz absorve fortemente a radiação do
laser. Ocorre a evaporação rápida da matriz e a molécula ionizada (ex: MH+) é
então liberada para a fase gasosa, e acelerada em direção ao analisador de
massas pelo alto potencial (20.000 V) aplicado à sonda.
Espectros e Aplicações
MALDI de polímeros
Conceitos Importantes
Notação dos Espectro de Massas
Ion Abundance (%)
100
80
60
40
20
0
0
50
100
150
200
250
m/z
Eixo y: Abundância %
Eixo x: Relação massa/carga (m/z)
• Informações Estruturais
• Informação da Massa do Compostos
Algumas definições importantes
Isóbaros
São moléculas com diferentes elementos e mesma de massa molecular.
Ex.: [C5H6O4]+; [C6H10O3]+, [C9H22]+ = 130 Da
Isótopos
São núcleos associados ao mesmo elemento da tabela periódica (mesmo número
atômico) mas com diferentes números de nêutrons.
Ex: Hidrogênio, Deutério e Trítio
Espectro de Massas: ISÓTOPOS
Elemento
Carbono
Hidrogênio
Nitrogêio
Oxigênio
Enxoger
Cloro
Bromo
Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. Relativa
12
C
1
H
14
N
16
O
32
S
35
Cl
79
Br
100
100
100
100
100
100
100
13
C
2
H
15
N
17
O
33
S
1.1
0.016
0.38
0.04
0.78
18
O
34
S
37
Cl
81
Br
0.2
4.4
32.5
98
Espectro de Massas: abundância isotópica
Pico monoisotópico
Pico do Carbono 13
Espectro de Massas
Espectro de dissociação/fragmentação
Precursor
100
Ion Abundance (%)
Íon molecular
80
Fragmentos
60
40
20
0
0
50
100
150
m/z
200
250
120
120
C7H6O3
138.12
138.031694
C 60.87% H 4.38% O 34.75%
100
100
OH
OH
92
92
O
O
O
O
50
50
152
152
65
65
39
39
53
53
15
15
00
18
18
28
28
45
45
50
50
76
76 81
81
55
55
10
20
30
40
50
60
10
20
30
40
50
60
(mainlib)
(mainlib) Benzoic
Benzoic acid,
acid, 2-hydroxy-,
2-hydroxy-, methyl
methyl ester
ester
70
70
80
80
137
137
104
109
104 109
90
90
100
100
110
110
120
120
130
130
140
140
150
150
160
160
Espectro de Massas: abundância isotópica
25%
Para se estimar o número de
carbonos em uma molécula:
dividir a intensidade de A+1
por 1.1 (abundância do
Carbono 13 na natureza).
25 / 1.1 = 23,7
~ 23 átomos de
carbono na molécula
Espectro de Massas: abundância isotópica
Br - CH3
15 uma
79Br-CH =
3
81Br-CH =
3
Informações:
• Relação m/z
• Presença dos isótopos
• Diferença de massa entre os sinais
94
96
Espectro de Massas: abundância isotópica
Cloro
Peso atômico = 35,453
Mistura de Cloro 35 (75,77%) e Cloro 37 (24,23%)
100
50.0
7.49e12
CH3Cl
%
52.0
0
40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61
mass
Padrão isotópico: Cloro 35 (75,77%) e Cloro 37 (24,23%)
50.0
100
84.0
100
CH3Cl
CH2Cl2
86.0
%
%
52.0
87.9
0
40
mass
42
44
46
48
50
117.9
100
52
54
56
58
60
0
74
119.9
mass
76
78
80
82
84
86
88
90
92
94
96
153.9
100
151.9
CCl4
CHCl3
%
155.9
%
121.9
157.9
123.9
0
108
mass
110
112
114
116
118
120
122
124
126
128
130
132
0
mass
145
150
155
160
165
Padrões isotópicos complexos
178.9436
100
3.06e12
Composto contendo 1 átomo de Rutênio
%
172.9467
0
165
170
175
180
185
279.8496
100
mass
1.52e12
Composto contendo 2 átomo de Rutênio
%
0
190
265
270
275
280
285
290
mass
Evidência do número de elementos presentes na molécula
Medida de Massa Molecular
„
„
Ex: M = 249
ƒ
C20H9+
ƒ
C19H7N+
ƒ
C13H19N3O2+
Sistemas de
Baixa resolução
Ex: M = 249
ƒ
C20H9+
249.0700
ƒ
C19H7N+
249.0580
ƒ
C13H19N3O2+
249.1479
Sistemas de
Alta resolução
Massa
Massa nominal
Massa de um íon de uma determinada fórmula empírica calculada através do isótopo
mais abundante.
Ex : M=249
C20H9+ or C19H7N+ or C13H19N3O2+
Massa exata
Massa de um íon da uma determinada fórmula empírica calculada através da massa exata
do isótopo mais abaundante da cada elemento.
Ex : M=249
C20H9+
C19H7N+
C13H19N3O2+
249.070
249.0580
249.1479
Faixa de massas
- Limite superior e inferior de m/z observáveis por um dado analisador de massas.
Resolução
Medida da habilidade de um analisador de massas de separar íons adjacentes.
C20H9+
C19H7N+
C13H19N3O2+
3 compostos diferentes
Mesma massa nominal
Baixa Resolução
C20H9+
C19H7N+
C13H19N3O2+
3 compostos diferentes
3 massas exatas diferentes
alta resolução
249
249.0700 249.0580 249.1479
Massa Exata
[C18H15P]+ m/z 262.0911
Massa exata (ppm)=106 (Mcal. – Mobs)/Mobs
Caminhos de Fragmentação
Possibilidades de EI
Regra do Nitrogênio
• Contém Números ímpares de nitrogênio:
Íon molecular [M]+. terá massa ímpar!!
• Contém Números pares de átomos de Nitrogênio ou não contém
átomos de nitrogênio:
Íon molecular [M]+. terá massa par!!
Regras do elétron impar
Regras do elétron par
Fragmentação direcionada pelo elétron
Fragmentação direcionada pela carga
Rearranjos