Seminário – DNA e Cromossomos - 02/07/2004
Apresentação: Gilka e Gustavo
Distrofia Muscular Tipo I (DM1):
• Doença autossômica dominante ligada a
expansão de repetições CTG na região 3’
não traduzida do gene DMPK (DM protein
kinase)
• Indivíduos normais: 5 a 37 repetições
• Indivíduos afetados: 50 a 5000 repetições
• Varias hipóteses são propostas para
explicar o surgimento da doença
Expansão de regiões repetitivas:
Nova Replicação:
Replicação desigual do
microssatélite:
Célula
Normal
Célula
Com
Expansão
Formação do
grampo
Por que a expansão
de CTG leva à
distrofia miotônica?
Perguntas sobre o possível efeito
da expansão:
Local da expansão
x
Transcrito funcional
Cinase DM
•Só a cinase que sofre e ela teria efeito
pleiotrópico?
•A expansão do gene tornaria a cromatina
instável?
Hipótese dos autores:
RNA do gene mutante
(expandido) se liga aos fatores
básicos de transcrição (TFs),
sequestrando-os dos locais de
onde eles deveriam atuar.
Se mRNA mutante seqüestra
alguns TFs seletivamente, deve
haver um acúmulo dos TFs
ligados ao mRNA mutante e
não a outros mRNAs.
Experimento 1
• Para testar a premissa anterior foi realizada
uma imunoprecipitação de extratos nucleares
com anticorpos contra:
–
–
–
–
–
NUP153 (proteína do complexo de poro)
CUG-BP1 (controle – alta afinidade pelo mutante)
PDGRF-â (proteína da membrana)
Sp1 (fator de transcrição)
Soro
• Seguida de RT-PCR do precipitado para
verificar em qual destas proteínas o RNA
mutante estava ligado e se outros RNAs
estavam ligados a elas
Fatores de transcrição (TFs) ligam-se seletivamente
ao RNA mutante em células DM1:
Para Sp1
Alelo selvagem
Alelo mutante
Para RARã
A depleção leva a uma
redistribuição dos TFs
dentro da célula afetada?
CROMATINA
mRNA mutante
seqüestra os TFs
RPN
Experimento 2:
Miócito
• Extração do núcleo e
separação dos
componentes:
Extrai o núcleo
– DNase I : isola fração da
cromatina
– RNase : isola fração do
RNP
• Analise de western blot
dos TFs (RARã, Sp1 e
Sp3, STAT1 e STAT3) por
4,5 semanas para RARã
e 3 semanas para os
demais.
DNaseI
Cromatina
RNase
RNP
W
E
S
T
E
R
N
B
L
O
T
Dinâmica da distribuição dos fatores de transcrição nos
compartimentos nucleares em células normais e em
células DM1
Western blot de RARã:
Células normais
Células DM1
Redistribuição dos TFs (RARã, Sp e STAT) em
células afetadas (DM1):
Redistribuição dos TFs das famílias Sp e
STAT após 3 semanas (por Western blot):
Crom.
RNP
Crom.
Razão de RARã na cromatina/RNP
em quatro linhagens após 4,5
semanas em cel. Normais e DM1:
RNP
Para RARγ:
Resultado não
convincente
Repetir o procedimento com
número fixo de células
Distribuição de RARã na cromatina durante o cultivo para
um número fixo de células:
A retirada dos TFs dos seus
locais específicos de atuação
diminuiria a expressão dos
genes dependentes desses
fatores?
Experimento 3:
• Para medir os níveis de mRNAs dos genes
escolhidos, realizou-se uma RT-PCR
quatitativa, chamada análise de TaqMan: (“Com
quantos ciclos a reação chega a tantos mols de
replicons?...”).
• Além disso foi feita um Northern Blot de
células antes da indução e depois da indução
da expressão de DMPK
Northern Blot de mRNAs de genes específicos antes
e depois da indução do gene DMPK:
Níveis relativos de mRNAs em células normais e
DM1:
A expressão dos genes que
codificam os TFs também é
diminuída, levando a uma maior
diminuição da expressão dos
genes dependentes desses
fatores.
Levando a:
x
mRNA
TF
Baixa na transcrição de
TFs
Baixa na transcrição dos
genes dependentes dos
TFs
E a doença?
O gene CLCN1 codifica CIC-1,que é um canal
de cloro dos músculos esquéleticos,no qual sua
alteração implica em uma Distrofia miotônica
do tipo 1.
Em células afetadas os níveis de mRNA deste
gene é diminuído, devido provavelmente à
diminuição de Sp1.
Será que é?
Quando se restabelece o nível de Sp1
na célula afetada (via transdução), o
nível de expressão de CLCN1
também é restabelecido?
Experimento 4:
• Foi feita uma transdução através de um
plasmídio com alta expressão de Sp1 e
Sp3 a fim de “reabastecer” a célula de
Sp1para verificar se os níveis de
expressão de CLCN1 aumentariam
também.
Níveis de mRNA dos genes CLCN1 e FCGRT após
expressão de TFs da família Sp:
Conclusões:
• Os resultados dos experimentos
corroboram com a hipótese dos autores
de explicação da relação entre a
expansão de DMPK e o surgimento da
distrofia miotônica do tipo I