From the Chromosomal Loops
and the Scaffold to the Classic
Bands of Metaphase
Chromosomes
Y. Saitoh & U. K. Laemmli
Cold Spring Harbor Symposia on Quantititive Biology
Vol 83, 1993
Loops da Cromatina

O estudo da estrutura dos cromossomos:




Microscopia ótica: muito grosseira
Microscopia eletrônica: muito detalhada
Métodos bioquímicos: interferências destrutivas
Em seu estado original, os cromossomos
aparentam ser apenas estruturas cilíndricas,
preenchidos homogeneamente com fibras
nucleoprotéicas.
Microscopia Ótica
Microscopia Eletrônica
Loops da Cromatina

A noção de que ocorrem loops na
cromatina a cada 100 Kb em média, é
bastante sólida.

Esta organização foi descoberta em
cromossomos metafásicos sem proteínas e
histonas, que foram removidas com
poliânions de sulfato de dextran e
heparina; com intuito de desenovela-los.
Loops da Cromatina

Os princípios da organização em loops foram
comprovados com técnicas de:



Seções cromossômicas finas
Espalhamento dos cromossomos
Imunoflorescência com anticorpos contra
Topoisomerase II
Loops da Cromatina

Em cromossomos distendidos por exposição a
baixas concentrações de sal ou pela retirada
parcial de H1, os loops são observados como
halos periféricos, devido a:


Distensão das fibras da cromatina
Desespiralização longitudinal das
compõe o loop
bases
que
Proteínas formam
uma armação ou
scaffold

Alças de DNA são
ligadas pela base

SAR = scaffold
attachment region

DNA rico em AT com
sítios para Topo II

Loops da Cromatina

A base dos loops de cromossomos nativos é
uma região longitudinal e hetrocromática
denominada de scaffold.

Com base no modelo Loop / Scaffold poderiam
ser identificadas proteínas específicas do
scaffold e de regiões associadas a ele, como as
SARs.
Topoisomerase II e SARs

A SC1 (Scaffold 1) é a principal proteína do
scaffold e foi identificada como uma
topoisomerase II.

Essa proteína se liga seletivamente as SARs e
está envolvida com o final da condensação
cromossômica.
Topoisomerase II e SARs

As SRAs são os possíveis constituintes da base
dos loops da cromatina e são regiões ricas em
AT (cerca de 65 %).

Proteínas que se ligam seletivamente as SRAs:
Histona H1
 HMG I Y - High Mobility Protein
 ARBD

Bandas Cromossômicas

São variações na estrutura longitudinal das cromátides que são
reveladas por diferentes técnicas de coloração.

Classicamente os cromossomos parecem ser construídos por
discos empilhados, e cada disco difere de seu vizinho por:





Densidade gênica
Tempo de replicação
Composição de bases
Conteúdo de sequências repetitivas
Conformação da cromatina
Bandas Cromossômicas

Os principais padrões
cromossômico são:

de
bandamento
Banda C - Heterocromatina centromérica, contendo DNA
satélite e praticamente nenhum gene.

Banda G - Composta por bandas de hetrocromatina
facultativa, de replicação tardia e ricas em AT.

Banda Q - Feita com quinacrina, cora também regiões
ricas em AT, revelando um padrão semelhante as bandas C.
Esquerda:
Padrão
de
bandamento G de alta
resolução em prometáfase
do cromossomo 1 do
Muntjac. As sub-bandas
estão coradas em preto.
Direita: Coloração com
Daunonicina do mesmo
cromossomo mostrando a
relação 1:1 das regiões ricas
em AT para as sub-bandas
em preto
Bandas Cromossômicas

Apenas 20% dos genes humanos mapeados
encontram-se em regiões de banda Q e G; e em
sua maioria são housekeeping.

A heterocromatina facultativa corada pela
banda Q é responsável pelo silenciamento de
genes tecido-específicos.
Bandas Cromossômicas

As bandas R possuem um padrão reverso ao
encontrado nas bandas Q e G, coram regiões ricas em
GC e se replicam na fase S.

A maioria dos genes selvagens expressos estão
localizados em bandas R.

As bandas G / Q são cerca de 3.2 % mais ricas em AT
do que as bandas R. Esta pequena diferença não
poderia explicar os padrões de fluorescência com
Daunomicina. Assim, a única opção seria uma alta
organização cromossômica.
Tudo é uma questão de
como “ver”...
Durante a corrida não se vêem as equipes
Última volta Sprintador da equipe é conduzido
Então, não seria uma questão de
corar os cromossomos, mas sim
de ver????
?
Modelo de Loops/Scaffold de
Cromossomos Nativos

Este modelo dita que as fibras das cromátides contêm
uma região central, longitudinal denominada corda AT
e dois loops diferentes:



O Loop Q, que é menor e possui orientação longitudinal
O Loop R, que é maior e possui orientação radial
Na corda AT, um sinal ótico é emitido por corantes
com alta afinidade por AT, pois nesta região estão as
SARs.
A coloração com Daunonicina cora de amarelo as regiões ricas em
AT e a YOYO/MG cora de verde os Loops Q e R.
Modelo de Loops/Scaffold de
Cromossomos Nativos

A construção das bandas R pode ser
representada por este modelo como um scaffold
central circundado por loops periféricos.

O scaffold seria organizado assim: fortemente
espiralizado na região de heterocromatina das
bandas Q e longitudinalmente desespiralizado
nas regiões de banda R.
Bandas Q e R

As bandas Q se originam da estriação cruzada das
cordas AT e podem ser evidenciadas por corantes que
se ligam a regiões ricas em AT.

As bandas R ocupam uma posição mais central nas
cordas AT.

A complementaridade entre estas bandas é uma
conseqüência direta da estrutura diferenciada das
cordas AT.
Bandas Q e R

A estrutura dos cromossomos metafásicos
considerada neste modelo combina com a
Citogenética clássica e com os estudos bioquímicos.

As bandas Q são muito raras ou ausentes nos
invertebrados, nos vertebrados inferiores, como as
serpentes e nas plantas. Isto pode ser explicado pela
ausência de diferenciação no scaffold, culminando
numa coloração homogênea.
Detecção da Base dos Loops

Foi detectada utilizando tanto anticorpos contra
proteínas do scaffold, quanto fluorocromos altamente
específicos para AT, como a Daunonicina e o Giemsa.

A Dauno cora bandas Q e sabe-se que o DNA precisa
ser composto por mais de 65 % de AT para que ela
floresça.

Assim se as SARs estivessem realmente organizadas
no scaffold, um sinal forte seria observado com este
tipo de coloração.
Detecção do Corpo dos Loops

O corante YOYO é um fluorocromo que cora
todo o loop da cromatina.

Para se corar o corpo de loop, o YOYO é
associado a MG, que inibe a emissão das
SARs.
a) Esquema de protocolos de coloração seletiva para a base ou
corpo dos loops da cromatina
b) Simulação da coloração utilizando um líquido opaco no qual foi
emergida uma mola.
Complementaridade entre as Bandas

Um cromossomo exposto a YOYO se cora
homogeneamente, o que implicaria:



Baixa concentração de DNA nas bandas R
Cromatina mais aberta
Comparando as colorações feitas com
YOYO/MG e Dauno, observa-se um padrão
complementar nas bandas R
a) Comparação entre as colorações YOYO, YOYO/MG e Dauno
b) Confocal mostrando bandas Q e R de telômeros. Nas bandas R positivas para
YOYO/MG observam-se puffs nas regiões ricas em AT.
a) O cromossomo 1 do Muntjac é corado em vermelho pela Dauno
(cora cordas AT) e em azul pelo YOYO/MG (cora loops Q e R).
b) Em maior aumento são mostrados os braços longos dos mesmos
cromossomos. As regiões de overlap se coram de branco.
Complementaridade nas sub-bandas

A complementaridade perfeita entre as bandas
R e Q é conseqüência direta do folding
diferencial das cordas AT. Este mesmo padrão
pode ser observado nas sub-bandas

Tomando como exemplo um cromossomo
visto sob microscopia confocal, a banda Q4
possui 4 sub-bandas que podem ser observadas
em outras colorações.
Topo II e SARs

Topo II imunolocaliza o scaffold de
cromossomos nativos, pois se liga
especificamente a seqüências SARs através
de ligações cooperativas.

As SARs também possuem sítios para a
proteína HMG IY, que se liga
preferencialmente a repetições de A.
Identificação do scaffold nativo por imunofluorescência. Os cromossomos foram
imunocorados com Topo II e Topo II + Dauno. Topo II cora SARs e cordas AT,
resultando num padrão de bandas Q e revela um sinal mais central nas bandas R.
O Scaffold de Cromossomos
Desespiralizados é Giemsa Positivo