T3
MÉTODO:
ELISA
FINALIDADE:
Teste de ELISA para a determinação quantitativa de Triiodotironina Total (T3) em
soro ou plasma humano. Para uso profissional. Somente para uso diagnóstico IN
VITRO.
PRINCÍPIO:
O teste T3 ELISA se baseia no princípio da ligação competitiva entre T3 de uma
amostra teste e o conjugado-peroxidase-T3 para um número limitado de sítios de
ligação em uma cavidade recoberta com anti-T3 (carneiro). Assim a quantidade de
conjugado-peroxidase-T3 ligada na cavidade é inversamente proporcional a
concentração de T3 na amostra.
Após a incubação da amostra e do conjugado-peroxidase-T3, o conjugado
enzimático não ligado é removido no estado de equilíbrio pela lavagem. A solução
substrato é adicionada, e uma cor azul é desenvolvida. A intensidade desta cor, que
muda para amarela após a adição da solução STOP, é inversamente proporcional a
quantidade de T3 na amostra.
A absorbância de calibradores, controles e amostras é determinada pelo uso de uma
leitora de Elisa de tiras ou placas de microtitulação ou sistemas automatizados
(como a linha HUMAREADER ou ELISYS da Human). A concentração da amostra é
extrapolada a partir de uma curva dose resposta gerada pela utilização de soros
calibradores de concentrações de antígenos conhecidas.
SIGNIFICADO CLÍNICO:
Triiodotironina (T3) é um hormônio sintetizado e armazenado na glândula tireóide.
Mais que 99% de T3 no sangue está reversivelmente ligado a proteínas plasmáticas.
A concentração de T3 é muito mais baixa que a de T4, mas o seu potencial
metabólico é muito maior. A determinação de T3 é uma importante ferramenta no
diagnósticos de doenças da tireóide. Sua determinação revelou uma variante de
hipertireoidismo onde pacientes tireotóxicos apresentam valores elevados de T3 com
valores normais de T4 (hipertireoidismo-T3). Um aumento em T3 sem um aumento
em T4 é freqüentemente um precursor de tireotoxicose recorrente em pacientes
tratados previamente. O significado clínico de T3 é também evidente em pacientes
nos quais o eutireoidismo é atribuído somente para T3 normal, embora seus valores
de T4 estejam subnormais. A determinação de T3 é também útil na monitoração de
pacientes sob tratamento para hipertireoidismo e de pacientes que descontinuaram
a terapia de droga antitireoide. Ele é especialmente valioso na distinção de pacientes
eutireoideos e hipertireoideos. Em adição ao hipertiroidismo, níveis de T3 aumentam
durante a gravidez, contraceptivos orais ou tratamento com estrógeno,
paralelamente TBG (Globulina ligadora de tiroxina) aumenta de maneira análoga
para T4. Da mesma maneira, um decréscimo na concentração de TBG diminui a
concentração de T3. Estas variações no nível de T3, entretanto, não são reflexos
verdadeiros do status da tireóide. Uma melhor informação diagnóstica sobre a
tireostasia em tais situações pode ser obtida pelo teste de TRH.
IDENTIFICAÇÃO E ARMAZENAMENTO:
Conservar entre 2-8°C.
MIC- 12
Tiras de Microtitulação (em suporte para tiras)
Tiras descartáveis com 8 cavidades cobertas com anti T3 (carneiro).
CAL- 6 x 2,0 mL Calibradores de A a F - Pronto para uso.
Calibradores (humanos) para T3 nas concentrações de 0 (A); 0,50 (B);
1,00 (C); 2,50 (D); 5,00 (E) e 7,50 ng/mL (F) de T3.
Ver precauções.
CON- 1,5 mL Enzima-Antígeno Conjugado
pH 7,45 ± 0,1
Pronto para uso
T3-HRP-conjugado, em matriz protéica estabilizada a 1%.
C-DIL- 13 mL Tampão Conjugado
pH 7,42 ± 0,1
Pronto para uso
Tampão fosfato 0,05 M.
WS- 20 mL Solução de lavagem
pH 8,8 ± 0,4
Concentrada para 1000 mL, Tris Tampão salina 250 mmol/L.
SUB- 14 mL Reagente Substrato A
3,3', 5, 5'- tetrametilbenzidina (TMB) 0,55 g/L; Uréia peróxido de
hidrogênio 0,03%; Tampão acetato de sódio 0,05 mol/L.
STOP- 7,5 mL Solução Stop
Ácido sulfúrico 0,5 mol/L
Tiras Adesivas
Conservantes: Concentração total < 0,04%.
ESTABILIDADE:
Os reagentes são estáveis até a data de validade impressa no rótulo, quando
armazenados entre 2 e 8ºC. Depois de abertos os reagentes devem ser
armazenados entre 2 e 8ºC e usados dentro de 60 dias (ver nota).
NOTA:
Os reagentes são estáveis até a data de validade impressa no rótulo, quando
armazenados entre 2 e 8ºC, mesmo depois de abertos. Entretanto a contaminação
está diretamente relacionada com o número de vezes que os reagentes são abertos
e utilizados. O limite de 60 dias depois do primeiro uso é por razões de segurança. O
manuseio cuidadoso dentro das Boas Práticas de Laboratório oferece a oportunidade
de utilização dos reagentes após os 60 dias (Isto inclui: frascos bem tampados após
o uso, tirar da geladeira somente o reagente que vai ser usado, soluções estoque
devem ser colocadas de volta na geladeira quando não estiverem sendo usadas). Os
critérios de validação deverão sempre ser encontrados.
TRANSPORTE:
O transporte do kit deve ser feito pela rota mais direta evitando-se as chegadas nos
finais de semana e feriados no local de destino. O kit não é afetado pelo transporte
desde que seja entregue ao destinatário no período máximo de 7 dias e em uma
temperatura de até 37ºC.
TERMOS E CONDIÇOES DE GARANTIA:
O fabricante garante a qualidade do produto, se este for armazenado como descrito
acima e em sua embalagem original.
PREPARO DOS REAGENTES:
Todos os reagentes devem estar a temperatura ambiente (15 a 25ºC) antes do uso.
Reagentes não utilizados devem ser sempre armazenados entre 2 e 8ºC.
Solução Conjugada de Uso WCON
Diluir CON 1 + 10 com C-DIL. Exemplo: diluir 160 µL de CON com 1,6 mL de C-DIL
para 16 cavidades.
Estabilidade: 24 horas ente 2 e 8ºC.
Solução de Lavagem de Uso WASH
Uma turbidez ligeira, que pode aparecer na solução WS concentrada,
desaparecerá completamente na diluição. Enxaguar o frasco várias vezes.
Diluir a Solução de lavagem concentrada WS para 1000 mL com água recém
destilada ou deionizada em um recipiente adequado.
Estabilidade: 60 dias entre 15 e 25ºC.
Tiras de Microtitulação MIC
As tiras são lacradas em uma bolsa de alumínio com dessecante. Antes de serem
abertas, as tiras devem ficar a temperatura ambiente. As tiras não utilizadas devem
retornar para a bolsa plástica com o dessecante. As tiras armazenadas desta
maneira entre 2 e 8ºC podem ser usadas até o vencimento da data de validade
impressa no rótulo de caixa. Não tocar na borda superior ou no fundo das cavidades
com os dedos. Ver Nota.
AMOSTRA:
• SORO ou plasma (EDTA, Heparina).
• Estabilidade: 5 dias entre 2 e 8ºC ou até 30 dias a -20ºC.
• Congelar e descongelar somente uma vez. Amostras descongeladas devem
ser homogeneizadas. Eliminar material em suspensão por centrifugação ou filtração.
• Não utilizar amostras altamente lipêmicas ou hemolisadas.
PRECAUÇÕES:
Não ingerir ou aspirar os reagentes. Evitar contato com a pele e as mucosas.
• A Solução Stop STOP contém ácido sulfúrico, manuseá-la com cuidado porque
pode irritar os olhos e a pele. Em contato com os olhos enxaguar abundantemente e
contatar um médico.
O produto contém derivados de fluido humano e foi testado para a presença de
HBsAg e anticorpos HCV e HIV apresentando resultados negativos. Apesar de terem
sido utilizados testes validados com alto grau de confiabilidade, nenhum deles pode
assegurar que produtos que contenham derivados de fluidos humanos sejam
incapazes de provocar doenças. Portanto, os cuidados habituais de biossegurança
devem ser aplicados na manipulação desse produto.
Todo o material contendo amostras de pacientes ou controles deve ser inativado
por procedimentos validados (autoclavação ou tratamento químico).
Para o descarte seguro dos reagentes e materiais biológicos, sugerimos utilizar as
regulamentações normativas locais, estaduais ou federais para a preservação
ambiental.
• A limpeza dos tubos utilizados para o preparo dos reagentes deve ser feito com
detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo sendo o último enxágüe com água
destilada ou deionizada.
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO:
Cronômetro
Pipetas e ponteiras
Leitora de ELISA
Lavadora de ELISA
PROCEDIMENTOS:
Seguir os procedimentos exatamente como descritos.
P1. Não misturar ou usar componentes com número de lote diferente. Não trocar a
tampa dos frascos (risco de contaminação). Não usar reagentes após o vencimento
da data de validade.
P2. Não usar reagentes que possam estar contaminados ou tenham a aparência ou
cheiro diferente do usual.
P3. Marcar CAL, amostras e controles cuidadosamente na folha fornecida junto com
o kit.
P4. Selecionar o número necessário de MIC, e coloca-las firmemente no suporte.
P5. Realizar duplicatas dos CAL, amostras e controles. Pipetá-los no fundo da
cavidade.
P6. Adicionar sempre os reagentes na mesma ordem, cronometrando para
minimizar a diferença do tempo de reação entre as cavidades. Isto é
importante para a reprodutibilidade dos resultados. A pipetagem das amostras não
deve exceder a 10 minutos. Se o tempo for superior a 10 minutos, pipetar os
calibradores nas posições indicadas na metade do tempo da pipetagem das
amostras. Se mais de 1 placa for utilizada, realizar uma curva para cada placa.
P7. Evitar/remover bolhas de ar antes das incubações e leitura de absorbância.
P8. A adição da SUB inicia uma reação cinética, que é finalizada pela adição da
STOP. Evitar luz forte durante o desenvolvimento de cor.
PROCEDIMENTO DE LAVAGEM:
O Procedimento de lavagem é crítico. Como em qualquer teste de microtitulação
sensível, leituras inconsistentes podem ser obtidas devido a lavagem inadequada.
Entretanto, é importante aspirar completamente as cavidades antes de adicionar a
WASH ou reagentes líquidos.
Lavagem insuficiente resulta em pouca precisão ou absorbâncias falsamente
elevadas.
L1: Aspirar o conteúdo das cavidades, adicionar a Solução de Lavagem WS, aspirar
novamente o conteúdo das cavidades após 30 segundos de tempo de espera.
Repetir a lavagem duas vezes.
L2: No caso de lavadoras automáticas, realizar um prime com a solução de lavagem
(WS) e lavar as tiras 3 vezes. Verificar se a lavadora encheu todas as cavidades
completamente e aspirar após 30 segundos eficientemente (líquido remanescente
deve ser < 15 L).
L3: Após a lavagem, remover o líquido remanescente batendo a placa invertida em
um papel absorvente.
REV. 02/14
Esquema de pipetagem:
ETAPA1
CAVIDADE ( L)
A1...D2
E2
50
----50
100
100
CAL A-F , em duplicata
Amostras, Controles (em duplicata)
WCON
Homogeneizar gentilmente e cobrir as MIC com as tiras adesivas.
Incubar 60 minutos entre 20-25ºC
Lavar 3 vezes como descrito em Procedimento de Lavagem
300
WASH
ETAPA 2
100
SUB
Não agitar a placa depois da adição do SUB.
Incubar 15 minutos entre 20-25ºC (ver P8)
50
STOP
COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS:
O kit T3 foi comparado contra um ensaio de quimioluminescência. 90 amostras de
populações hipo-, hiper- e eutiroidianas foram testadas. Os dados individuais foram
avaliados por uma análise de regressão não-paramétrica, de acordo com Passing &
Bablok e pelo menos por uma regressão quadrada. Os dados demonstram a
excelente correlação entre o T3 Elisa e testes de concorrentes.
Número de amostras T3 Elisa (Y): 90
Número de amostras concorrente (X): 90
Média Y:
1,193
Mediana: 1,00
Média X:
1,363
Mediana: 1,16
300
100
50
Homogeneizar cuidadosamente
Medir a absorbância em 450 nm o mais rápido possível ou no máximo dentro
de 30 minutos após o término da reação. Utilizar como comprimento de
onda de referência 630-690 nm (se disponível).
VALIDAÇÃO DO TESTE:
Os resultados dos testes são válidos se os seguintes critérios forem encontrados:
A média da absorbância [OD] de CAL A ≥ 1,3.
As diferenças entre as duplicatas de CAL A não deve exceder 10%.
CÁLCULO:
Plotar as absorbâncias medidas contra as concentrações de CAL em um gráfico
linear. A interpolação apropriada dos pontos de medição plotados resulta em uma
curva de calibração, onde a concentração do analito de cada amostra pode ser
determinada. Para o cálculo das concentrações do analito, selecionar a opção de
curva apropriada e validada (recomendação: ponto a ponto).
As amostras com concentrações de T3 superiores a 7,5 ng/mL, podem ser diluídas
com CAL A e testadas novamente. Multiplique a concentração da amostra pelo fator
de diluição.
CONTROLE DE QUALIDADE
Boas práticas de laboratório exigem controles a serem testados com cada curva de
calibração. Um número significativo de controles deve ser executado para
estabelecer os valores médios e limites aceitáveis para garantir um desempenho
adequado. Amostras de controle de qualidade devem ser executadas de acordo com
as regulamentações locais. Os resultados devem estar dentro das faixas
estabelecidas.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:
A concentração sérica total de triiodotironina é dependente de uma multiplicidade de
fatores: função da glândula tireóide e sua regulação, concentração de TBG, e a
ligação de triiodotironina com a TBG (3,4).
Assim, a concentração isolada de triiodotironina total não é suficiente para avaliar o
estado clínico. Os valores séricos de triiodotironina total podem estar elevados em
condições tais como gravidez ou administração de contraceptivos orais. Um
decréscimo nos valores de T3 é encontrado em doenças com baixa de proteínas,
certas doenças do fígado e administração de hormônios e drogas.
VALORES ESPERADOS:
Resultados a partir de estudos com pacientes eutiróideos:
Média (x)
1,36 ng/mL
Desvio Padrão (DP)
0,33 ng/mL
Faixa esperada (± 2 DP)
0,69 - 2,02 ng/mL
Equação: Y = - 0,09722 + X 0,7811 (ng/mL)
r = - 0,7811
APRESENTAÇÃO:
Referência
54010
N°. testes
96
DEPARTAMENTO DE SERVIÇOS ASSOCIADOS:
Para esclarecimentos de dúvidas do consumidor quanto ao produto:
Telefax (31) 3067-6400 E-mail: [email protected]
N.º DO LOTE, DATA DE FABRICAÇÃO, DATA DE VALIDADE VIDE RÓTULO DO
PRODUTO.
BIBLIOGRAFIA:
1. Barker, S.B., Determination of Protein Bound Iodine, Jounal Biological Chemistry
173, 175 (1948)
2. Chopra, I.J. et al., A Radioimmunoassay of Triiodothyronine, J. Clinical Endocrinol.
33, 865 (1971)
3. Young, D.S. et al, Effects of Drugs in Clinical Laboratory Tests, Clinical Chemistry
21, 3660 (1975)
4. Sterling, L., Diagnosis and Treatment of Thyroid Disease, Clevland CRC Press, p.
19 – 51 (1975)
Produzido por Human GmbH Max-Planck-Ring 21, D 65205, Wiesbaden, Alemanha
e Distribuído por In Vitro Diagnóstica Ltda
Rua Cromita, 278, Distrito Industrial – Itabira/MG. CEP: 35903-053
Telefone: 31-3067-6400 – Fax: 31-3067-6401
e-mail: [email protected]
Resp. Téc.: Patrícia C. C. Vilela – CRF 4463
Reg. M.S. 10303460128
SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS UTILIZADOS NOS RÓTULOS DO PRODUTO
O conteúdo é suficiente para <n> testes
Data limite de utilização
Limite de temperatura (conservar a)
Número do Catálogo
Consultar Instrução de Uso
Número do lote
Produto Diagnóstico In Vitro
Data de Fabricação
Cada laboratório deve estabelecer seu próprio valor esperado utilizando
equipamentos, métodos de coleta de sangue e técnicas de teste comumente usadas
num laboratório, devido aos níveis de T3 serem muito influenciados por fatores
geográficos e alimentares.
REPETIBILIDADE E REPRODUTIBILIDADE:
A repetibilidade e reprodutibilidade foram avaliadas pelo emprego de pool de soros
com concentração baixa, média e alta de T3. Os resultados estão resumidos abaixo.
Repetibilidade
Reprodutibilidade
Média,
DP,
Média,
DP,
N
CV, %
N
CV, %
ng/mL ng/mL
ng/mL ng/mL
Nível 1
22
1,152
0,052
4,5
10
0,55
0,05
9,1
Nível 2
22
2,647
0,061
2,3
10
1,85
0,14
7,7
Nível 3
22
3,385
0,036
1,1
10
3,95
0,19
4,8
SENSIBILIDADE:
A sensibilidade analítica determinada para o T3 foi de 0,05 ng/mL.
ESPECIFICIDADE:
Substâncias potencialmente capazes de causar reações cruzadas foram adicionadas
a soros com concentrações pré-determinadas de T3. Nenhuma reação cruzada pode
ser observada com as substâncias abaixo, até as concentrações indicadas:
Substância
Concentração adicionada
I-Tiroxina
10 µg/dL
d-Tiroxina
10 µg/dL
d-triiodotironina
100 µg/dL
Monoiodotirosina
100 µg/mL
Diiodotirosina
100 µg/mL
Ácido triiodotiroacético
100 µg/mL
Ácido tetraiodotiroacético
100 µg/mL
Hemoglobina
30 µL/mL
Lipemia
50 µg/dL
Bilirrubina
200 µg/mL
Albumina
40 mg/mL
Salicilato
2,5 mg/mL
Globulina ligada a tiroxina (TBG)
40 µg/mL
Fenitoína
40 µg/mL
Fenilbutazona
10 µg/mL
REV. 02/14