ESTUDO DA ESTABILIDADE DO BIOSSURFACTANTE
PRODUZIDO EM BIORREATOR PARA BIORREMEDIAÇÃO
Brasileiro, P. P. F.(1); Souza Filho, G. L.(1); Silveira, G. N. M.(1); Rocha e Silva, N.
M. P.(1); Campos, J. M.(1); Luna, J. M.(1); Rufino, R. D.(1); Santos, W. A.(1) e
Sarubbo, L. A.(1) [email protected]
(1)
Universidade Católica de Pernambuco - UNICAP, Recife - PE, Brasil, UNICAP,
ANEEL, CAPES, CGTI, TERMOPE e FACEPE
RESUMO
Os surfactantes microbianos vieram para substituir os usuais dispersantes
químicos, devido às eficazes propriedades tensoativas, baixas toxicidades e
aos elevados rendimentos apresentados por essas biomoléculas. Nesse intuito,
o trabalho teve o objetivo de avaliar a estabilidade do biossurfactante
produzido pela levedura Candida guilliermondii produzida em biorreator (50
L), contendo 4,0% de melaço, 2,5% de milhocina e 2,5% de óleo de soja
residual, durante 144 horas, sob concentração de 104 células/mL e agitação de
90 rpm. O líquido metabólico, centrifugado e filtrado, foi aquecido por vapor
fluente e acrescido de aditivo químico para a manutenção de suas propriedades
surfactantes. Ademais, condições de aquecimento, potencial hidrogeniônico e
salinidade foram aplicadas para perceber os melhores resultados de aplicação
do biotensoativo. Os parâmetros para mensurar a qualidade do biossurfactante
foram as tensões superficiais e os índices de emulsificação e dispersão durante
120 dias. Ao final do processo, os resultados mais expressivos do
biossurfactante foram tensão superficial de 27,64 mN/m, capacidade
emulsificante de 100,0% em óleo motor e dispersante de 92,9%. Os resultados
demonstram a viabilidade de aplicação do biossurfactante em água marinha.
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Palavras-chave: Candida guilliermondii, Tensões Superficiais, Índices de
Emulsificação.
INTRODUÇÃO
O ser humano almeja o lucro proveniente do petróleo, contudo não
promove os procedimentoseficazes de segurança para o transporte desse
composto hidrofóbico. Por esse motivo, vários acidentes petrolíferos
ocorreram e alastraram um desequilíbrio na fauna e flora marinhas,
como no Golfo do México, em 2010, por 1,5 km de extensão com o
derramamento de 800 milhões de litros de petróleo. Os cientistas tentam
remediar esses desastres ambientais com os surfactantes químicos,
produtos petroderivados que também possuem uma elevada toxicidade
e tornam o ambiente ainda mais letal (ZHOU et al., 2013).
Em base ao problema citado, pesquisas estão sendo desenvolvidas para
substituir os substratos empregados na produção desse agente
tensoativo por resíduos e sub-produtos industriais, os quais precisam
degradados por micro-organismos com potencial biotecnológico. O
resultado dessa fermentação são biomoléculas com semelhantes ou
melhores propriedades, rendimentos elevados e baixas toxicidades. Esse
bioproduto é denominado de biossurfactante: o biorremediador do
petróleo.
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Esses produtos microbiológicos podem ser compostos por várias
estruturas orgânicas, dentre elas glicolipídeos, lipopeptídeos, complexos
proteínas-polissacarídeos, fosfolipídeos, ácidos graxos e lipídeos
neutros (GAUTAM; TYAGI, 2006) e apresentam dois segmentos
principais na molécula, um hidrofílico e outro hidrofóbico, sendo,
portanto, denominados de anfifílicos (MARCHANT; BANAT, 2012).
Os surfactantes microbianos possuem diversas propriedades como as
baixas tensões superficial e interfacial. Aquela permite avaliar o grau de
umectação de um líquido em uma superfície, enquanto que esta indica o
nível de penetrabilidade de um composto polar em um apolar. Essas
duas propriedades caracterizam um biotensoativo e influenciam as
demais propriedades como as capacidades emulsificante, dispersante,
entre outras (DALTIN, 2011).
A estabilidade é um fator essencial para viabilizar a produção em larga
escala, principalmente, de um produto biotecnológico que demora a ser
produzido perante a urgência da aplicação em um desastre petrolífero.
Todo o óleo precisa ser retirado do oceano em cerca de 24 horas após o
derramamento. Logo, a durabilidade precisa ser elevada com a
finalidade de utilização imediata(MARCHANT; BANAT, 2012).
Os biossurfactantes vieram para inovar e substituir os dispersantes
químicos pelas várias aplicações, pelo baixo custo e pelos imensuráveis
bens ambientais da biodegradabilidade e da baixa toxicidade.
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O presente trabalho teve como objetivo estudar o comportamento do
biossurfactante produzido por Candida guilliermondii em biorreator,
sob algumas das diversas propriedades apresentadas e sob condições
específicas, no decorrer do tempo e na manutenção do biossurfactante
por vapor fluente e adição de um sal químico como aditivo.
MATERIAL E MÉTODOS
Micro-organismo e substratos
A levedura Candida guilliermondii (UCP 995), depositada no Banco de
Culturas do Núcleo de Pesquisas Ambientais da Universidade Católica
de Pernambuco foi utilizada como produtora do biossurfactante. A
repicagem desse organismo microbiano ocorreu a cada 30 dias, em
tubos de ensaio contendo o meio sólido de Yeast Mold Agar (YMA).
Como fontes de energia, para a produção do biossurfactante, foram
utilizados a milhocina, o melaço e o resíduo industrial da refinaria de
óleo de soja (SANTOS et al., 2013).
Meios de manutenção e de crescimento do inóculo e de produção do
biossurfactante
A levedura foi mantida através da mistura sólida de YMA, composta
por: extrato de malte (0,3%), extrato de levedura (0,3%), D-glicose
(1,0%), triptona (0,5%), ágar bacteriano (2,0%) e água destilada q.s.p.
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(100 mL). Os componentes foram esterilizados em autoclave a 121 °C
por 20 min. A exclusão do ágar propiciou à mistura o estado líquido e
foi denominada de Yeast Mold Broth (YMB), indicando o meio de
crescimento da levedura. O meio de produção foi composto pelo
acréscimo de 4,0% de milhocina e 2,5% de melaço do volume inicial, o
pH foi ajustado para 5,5, acrescentou-se 2,5% de resíduo de óleo de soja
e todo o meio foi autoclavado a 121 °C por 20 min.
Preparação do inóculo e produção do biossurfactante
O inóculo tornou-se padrão pela transferência da C. guilliermondii para
um tubo de ensaio, contendo o meio YMA, com a finalidade de se obter
uma cultura jovem, em temperatura ambiente (25 °C). Logo após, as
leveduras foram transferidas assepticamente até um frasco com YMB
estéril. Por fim, o Erlenmeyer do YMB foi posto à agitação na máquina
incubadora shaker durante 24 horas, a 200 rpm e a 28 °C.
Para a produção do biossurfactante em biorreator de 50 L de capacidade
volumétrica, após o crescimento do inóculo em meio YMB, foi
realizada uma diluição seriada para a contagem das células por mililitro
e calculado o volume para alcançar a concentração de 104 células/mL.
Esse volume determinado foi inserido em 20 L do meio de produção,
selecionado em shaker, estéril, sob agitação mecânica de 90 rpm,
durante 144 horas e à temperatura de 28 ºC.
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Estabilização do biotensoativo e determinação das propriedades
surfactantes
O líquido metabólicoobtido pelo biorreator foi centrifugado a 4500 rpm
durante 15 min e filtrado à vácuo, para a retirada das células. O
biossurfactante também passou por uma filtração simples devido à
baixa agitação oferecida pela máquina piloto industrial no momento da
produção do biossurfactante.
A estabilização do surfactante microbiano ocorreu pelo prévio
aquecimento a 80 °C em um banho-maria durante 30 min, sendo essa
técnica conhecida como vapor fluente. Após o tempo citado, 0,2% do
sal sorbato de potássio foi adicionado e o líquido dividido em vidros de
armazenamento, em triplicata, para a verificação das propriedades
surfactantes nos períodos de 0, 15, 30, 45, 90 e 120 dias. Em cada um
desses dias, foram alteradas as condições de potencial hidrogeniônico
para 6, 8 e 10; adicionadas percentagens de salinidade 1, 3 e 5% do
volume a ser estudado e aquecidas as amostras durante 30 min a 40 e 50
°C. Para avaliar as propriedades surfactantes, foram mensuradas as
tensões superficiais e os índices de emulsificação e dispersão.
s tensões foram medidas pelo método do anel DU NUOY no
tensiômetro KSV Sigma 70 (Finland). A superficial foi mensurada pela
força limite (mN/m) para suspender o anel de platina no líquido
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metabólico livre de células até a interface ar-líquido e a interfacial entre
o biossurfactante e o hidrocarboneto n-hexa-decano.
Para a determinação das emulsões, foram colocados em tubos de ensaio,
2 mL do biossurfactante acoplados isovolumetricamente a três
compostos apolares: óleos motor, de milho ede soja a 25 °C e 1 atm.
Esses recipientes foram agitados em vórtex durante 2 minutos e
deixados, durante 24 horas, em repouso. O índice de emulsificação foi
calculado pela razão entre a altura da emulsão e a altura total da
mistura,
sendo
o
valor
multiplicado
por
100
(COOPER;
GOLDENBERG, 1987).
A capacidade de dispersão e agregação do óleo motor foi simulada em
placa de Petri (14 cm de diâmetro), contendo 100 mL da água do mar,
coletada nas proximidades do sistema de captação do gerador de
energia da Termelétrica Pernambuco. Uma quantidade desse óleo foi
colocada no centro da placa, adicionando posteriormente diferente
proporçõesdo
surfactante
(biossurfactante/óleo
microbiano:
motor).Os
valores
1:1,
1:2
foram
e
1:8
(v/v)
medidos
pela
percentagem do diâmetro do halo, formado com a adição do
biossurfactante, pelo da placa, e o teste de agregação foi apenas visual
(MORIKAWA et al, 2000).
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Conservação das propriedades do biossurfactante produzido em
biorreator pelo método de vapor fluente com sorbato
A redução das tensões superficial e interfacial é considerada como
principal parâmetro para detecção de um composto tensoativo em um
determinado meio (RAY, 2007). Em adição à tensão superficial ou
interfacial, a estabilidade de emulsões óleo/água também é muito
utilizada como um indicador de atividade superficial, embora a
habilidade de uma molécula em formar uma emulsão estável nem
sempre esteja associada à redução da tensão superficial (MUKHERJEE,
2006).
Nesse trabalho, foram verificadas as tensões superficiais nos períodos
de 0, 15, 30, 45, 90 e 120 dias e nas condições de pH, salinidade e
aquecimento. Após esse período e de acordo com a figura 1,
evidenciaram-se a redução das tensões superficiais, a partir dos 45 dias,
de 34,00 mN/m para faixas de 30,00 mN/m, o que significa uma maior
umectação e uma conservação eficaz do biossurfactante produzido em
biorreator.
As melhores condições foram obtidas em pH 6, salinidade de 5% e
aquecimento a 50 °C, com as respectivas tensões superficiais em todos
os períodos de 30,44; 32,13 e 31,54 mN/m. Com esses dados, o método
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de conservação superou o prazo estimado para delimitar uma validade
ao biossurfactante, reduzindo as tensões superficiais em vez de apenas
mantê-las.
Figura 1. Tensões superficiais do biossurfactante do
biorreator sob vapor fluente com sorbato de potássio a
0,2%, durante 120 dias, sob variação de pH, NaCl,
aquecimento e com o controle das condições.
Nos índices de emulsificação em óleo motor, figura 2-A, foram
percebidas severas reduções nas percentagens do pH diante do controle
do biossurfactante. Esse acontecimento foi de encontro ao ocorrido nas
figuras 2-B, com óleo de soja, e 2-C, com óleo de milho. Os melhores
resultados foram nas emulsificações do óleo motor com três índices
máximos (100%) e determinação das condições mais viáveis com pH
10, salinidade 5% e aquecimento a 50 °C. Essas condições também se
destacaram como mais estáveis em óleo de soja. No óleo de milho, as
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emulsões foram melhores em pH 10, salinidade 1% e aquecimento a 50
°C.
Figura 2. Índices de emulsificação do biossurfactante do biorreator sob vapor
fluente com sorbato a 0,2%, durante 120 dias, sob variação de pH, NaCl,
aquecimento e com controle das condições, nos óleos: (A) motor, (B) de soja e (C)
de milho.
Nos índices das dispersões, os percentuais foram elevados apenas frente
às alterações de pH, com um valor máximo de 92,9%, aos 120 dias com
pH 8 e na proporção 1:1 (v/v) de biossurfactante para óleo motor. As
melhores condições foram observadas nas dispersões 1:1 e 1:8 (v/v), pH
8, a salinidade 1% e aquecimento a 40°C. A dispersão 1:2 (v/v) diferiu
apenas na salinidade de 3%.
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Figura 3. Índices de dispersões do biossurfactante do biorreator sob vapor fluente
com sorbato a 0,2%, durante 120 dias, sob variação de pH, NaCl, aquecimento e com
o controle, nas proporções de biossurfactante/óleo (v/v): (A) 1:1, (B) 1:2 e (C) 1:8.
CONCLUSÃO
As tensões superficiais foram reduzidas em cerca de 4mN/m, tornando
o processo de conservação muito eficiente.
As emulsificações obtiveram os melhores resultados no óleo motor,
principalmente com a alteração da salinidade e com o aquecimento.
Os índices de dispersão foram elevados apenas com alteração dos
potenciais hidrogeniônicos nas três proporções estudadas;
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As melhores condições foram os potenciais 8 ou 10, preferindo-se um
pH 8 por estar próximo ao do mar; a salinidade de 1 ou 5%; ou o
aquecimento a 50 °C.
Mais pesquisas na área de biossurfactantes precisam ser desenvolvidas
para o aprimoramento da aplicação desse bioproduto.
REFERÊNCIAS
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Species. Applied and Enviromental Microbiology, v. 53, p. 224-229, 1987.
DALTIN, D. Tensoativos: química, propriedades e aplicações. São Paulo: Blucher,
2011.
GAUTAM, K. K.; TYAGI, V. K. Microbial Surfactants: a review. Journal of Oleo
Science, v. 55, p. 155-166, 2006.
MARCHANT, R.; BANAT, I. M.; Microbial biossurfactants: challenges and
opportunities for the future exploitation. Trends in Biotechnology, v. 30, p. 558-565,
2012.
MORIKAWA, M et al. A study on the structure-function relationship of lipopeptide
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MUKHERJEE, S.; DAS, P.; SEN, R. Towards commercial production of microbial
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SANTOS, D. K. F. et al. Synthesis and evaluation of biosurfactant produced by
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ZHOU, Z. et al. Characterization of oil components from Deepwater Horizon oil spill
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Chemistry, v. 148, p. 10-21, 2013.
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