INSTITUTO BIOLÓGICO
PÓS-GRADUAÇÃO
ANÁLISE DA DIVERSIDADE MORFOLÓGICA E GENÉTICA DE ISOLADOS DE
Metarhizium anisopliae (METSCH.) SOROK. E AVALIAÇÃO DA VIRULÊNCIA EM
Diatraea saccharalis (FABRICIUS, 1794) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE).
DAYSI DA SILVA ANDRADE PENNA
Dissertação apresentada ao Instituto Biológico,
da
Agência
Paulista
de
Tecnologia
dos
Agronegócios, para obtenção do título de Mestre
em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental
no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade
Segurança Alimentar e o Ambiente.
Vegetal,
Orientador: Prof. Dr. Antonio Batista Filho
Co-orientadora: Prof.
Lanza Destéfano
São Paulo
2012
Dra.
Suzete
Aparecida
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Núcleo de Informação e Documentação - Biblioteca
Instituto Biológico
Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo
Penna, Daysi da Silva Andrade
Análise da diversidade molecular e genética de isolados de Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorok e avaliação da
virulência em Diatraea saccharalis (Fabricius,1794) (Lepdoptera : Crambidae) / Daysi da Silva Andrade Penna. -São Paulo, 2012.
Dissertação (Mestrado). Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação.
Área de concentração: Segurança Alimentar e Sanidade no Agroecossistema
Linha de pesquisa: Biodiversdidade : caracterização, interações, interações ecológicas em agroecossistemas
Orientador: Antonio Batista Filho
Versão do título para o inglês: Analysis of morphological and genetic diversity Metarhizium anisopliae isolates
(Metsch) Sorok and evaluation of virulence in Diatraea saccharalis (Fabricius,1794) (Lepdoptera : Crambidae)
1. Metarhizium anisopliae. 2. Diatraea saccharalis 3. Controle biológico 4. Controle microbiano 5. Cana-deaçúcar 6. Rep-PCR I. Batista Filho, Antonio II. Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação III.
Título
IB/Bibl./2012/003
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO BIOLÓGICO
Pós-Graduação
Av. Cons. Rodrigues Alves 1252
CEP 04014-002 - São Paulo – SP
[email protected]
FOLHA DE APROVAÇÃO
DAYSI DA SILVA ANDRADE PENNA
ANÁLISE DA DIVERSIDADE MORFOLÓGICA E GENÉTICA DE ISOLADOS DE
Metarhizium anisopliae (METSCH.) SOROK. E AVALIAÇÃO DA VIRULÊNCIA EM
Diatraea saccharalis (FABRICIUS, 1794) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE).
Orientador: Prof. Dr. Antonio Batista Filho
Co-orientador: Prof. Dra. Suzete Aparecida Lanza Destéfano
Dissertação apresentada ao Instituto
Biológico
da
Agência
Paulista
de
Tecnologia
dos
Agronegócios
para
obtenção do título de Mestre em
Sanidade,
Segurança
Alimentar
e
Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade Vegetal,
Segurança, Alimentar e Ambiental no
Agronegócio.
Aprovada em:
Banca Examinadora
Assinatura:
Prof. Dr.: Antonio Batista Filho
Instituição: Instituto Biológico de São Paulo
Assinatura:
Prof. Dr.: José Eduardo Marcondes de Almeida
Instituição: Instituto Biológico de São Paulo
Assinatura:
Prof. Dr.: Nelson Sidnei Massola Júnior
Instituição: ESALQ/USP
“Determinação, coragem e autoconfiança são fatores decisivos para o sucesso.
Se estivermos possuídos por uma inabalável determinação conseguiremos superá-los.
Independentemente das circunstâncias, devemos ser sempre humildes, recatados e
despidos de orgulho”.
(Dalai Lama)
Ao meu pai Valmir que mesmo lá de cima, tenho a certeza de que sempre esteve
ao meu lado.
Dedico.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a Deus, pela saúde e capacidade para atingir os meus
objetivos.
Ao Prof. Dr. Antonio Batista Filho pela orientação, amizade, respeito, total
confiança para a realização desse trabalho e principalmente por toda tranquilidade nos
meus momentos de estresse e pelo exemplo profissional. E é claro, por todos os fortes
abraços!
A Prof. Dra. Suzete Aparecida Lanza Destéfano que além de uma co-orientadora,
esteve o tempo todo ao meu lado e como uma mãe confiou e me ensinou desde os
primeiros passos da biologia molecular até a realização total desse trabalho. Agradeço de
coração pelo carinho, amizade, simplicidade, dedicação, serenidade, segurança e
exemplo de pessoa a quem me espelho.
Ao Dr. José Eduardo Marcondes de Almeida pela amizade e confiança, mesmo
com toda a minha insegurança ou quando tudo parecia não sair do papel.
Ao Dr. Ricardo Henri Rodrigues Destéfano por ter nos concedido o DNA E-9.
Ao Dr. Luis Garrigos Leite, Dr. Valmir Antonio Costa e Dra. Zuleide Alves Ramiro
pelo convívio.
Ao Dr. José Eduardo Marcondes de Almeida, Dr. Luis Garrigos Leite e Dr. Nelson
Sidnei Massola Junior pelas indispensáveis correções e contribuições no trabalho.
Ao Dr. Valmir Antonio Costa pelas lindas fotos.
A FUNDAG e FUNDEPAG pelo apoio financeiro nas despesas do trabalho.
Ao agrônomo Diogo Miranda pela ajuda nos primeiros passos.
A bióloga Patrícia Lima pelos protocolos e dúvidas esclarecidas no início das
extrações de DNA.
A Dra. Mariana Ferreira Tonin e a doutoranda Daniele Corrêa pela paciência,
explicações e auxílio na realização de algumas técnicas laboratoriais.
A doutoranda Lucilene Lopes pela amizade, apoio e essencial ajuda nas análises
moleculares.
Ao doutorando Lucas Rivera pela ajuda com o programa NTSYS.
Aos funcionários e estagiários do Laboratório de Bacteriologia Vegetal Dr. Berian,
Dr. Júlio, Dra. Celeste Diniz, MSc. Irene Maria Gatti de Almeida, Alex Tomaseto, Karen
Maciel, Larissa Merighi, Renata Comparoni, Soninha e Victor Pierini pela receptividade e
convívio.
A bióloga Jaqueline Rebouças Cachatori pelo incentivo e convívio no primeiro ano
que passamos juntas em Campinas.
Aos biólogos e amigos do Laboratório de Controle Biológico Aline Almeida, Ana
Beatriz Monteiro, Ana Paula Pinto, Ana Paula Pereira, Fabio Shimit, Fenanda Polastre,
Lucas Simi, Mariana Silva, Mariana Garcia, Marília Marcassi, Maria Elízia Pacheco,
Patrícia Ballone, Renata Imperato, Renata Marraschi, Roselaine Bueno e Tatiane
Pietrobon pela convivência amiga, pelas conversas, piadinhas e gargalhadas que
tornavam o nosso ambiente de trabalho mais animado e agradável. Em especial a Paty,
por estabelecer a rotina de confraternizações diárias que resultaram nos “kg” a mais da
turma.
A amiga Marília Marcassi por ser sempre tão delicada e atenciosa no dia a dia,
além de não medir esforços para criar e ceder todas as lagartas de D. saccharalis para os
experimentos.
Novamente aos amigos Ana Paula Pereira, Mariana Garcia, Marília Marcassi,
Lucas Simi, Patrícia Ballone e Roselaine Bueno pela prontidão e imprescindível
colaboração nos experimentos de virulência – Muito obrigada, sem vocês tudo seria mais
difícil! E não poderia deixar de fora mais uma vez à amiga Ana Paula Pinto por todos os
bons momentos, mesmo quando se fazia presente apenas “on line”.
A Daniele Oliveira, Débora Rais, Mário Kokubo e Anderson Fujita pela amizade,
companhia no alojamento e/ou nas intermináveis viagens a SP.
Ao doutorando Matheus Cipriano pela confiança em me acompanhar, aprender e
até ajudar nos experimentos moleculares.
A pesquisadora Harumi Hojo pela amizade, incentivo e presteza em sempre
ajudar, seja no lado profissional ou pessoal, com uma palavra, um conselho ou apenas
em me ouvir.
Aos colegas e amigos do Programa de Pós Graduação pelo convívio e boas
risadas, as quais descontraiam os momentos de tensão, além das histórias, apelidos e
lembranças que ficarão gravadas para sempre em minha memória.
Aos pesquisadores, professores e funcionários do Instituto Biológico, pela
amizade, dedicação e princípios que ficaram registrados no convívio desses dois anos de
trabalho.
E por fim, agradeço aos Professores Dr. Douglas Máscara (orientador da
graduação) e Maria Cecília Piola Brandt pelo incentivo e pela carta de recomendação.
Em particular ao Dr. Douglas Máscara pela maneira como ministrava suas aulas de
Controle Biológico, as quais despertaram meu interesse pela área.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A minha mãe pelo amor, orgulho, confiança e principalmente pela educação,
valores e momentos de superação que sempre esteve ao meu lado.
A minha irmã pelo amor, carinho e saudades o qual aprendemos controlar com o
passar do tempo.
A Sandy minha paixão e fiel companheira, que me esperava por longos dias em
troca muito carinho, respeito e amor verdadeiro.
Aos meus avós: Nair, Lourdes e Miel o qual dispenso palavras, amor
incondicional.
A minha família em geral tios, primos e agregados os quais eu amo muito e hoje
tenho a certeza de que somos mais unidos do que nunca.
As eternas amigas Ana Claudia Oliveira, Amanda da Silva, Paloma Teixeira e
Silvia Espinoza pela certeza da verdadeira amizade, carinho, admiração e pensamentos
positivos cada vez que eu precisei uma palavra amiga. Amo de verdade!
As amigas Aline Santos, Roberta Duarte e Thais Feitosa que mesmo longe em
momento algum deixaram de estar presente na minha vida por meio de um telefonema,
um e-mail ou uma mensagem de celular, mostrando que simplesmente pensavam em
mim e estavam ali para qualquer coisa.
Ao irmão, amigo e sempre companheiro Willian Silva Arruda, sem dúvida um
exemplo de pessoa que através de coisas simples me mostrou com um olhar e um
sorriso o verdadeiro significado da VIDA e sem dúvida para mim ficou alguém especial
que me ensinou muito do que sou hoje e que ficará para sempre em meu coração.
Saudades eternas meu querido – DESCANSE EM PAZ!
Ao amigo Felipe Sousa por ser especial na minha vida.
As amigas Ana Paula Rosa, Daniela Moreira, Flávia Tatsuno (minha companheira
de graduação), Fernanda Ribeiro, Fernanda “Redher”, Gisele Antunes, Janaína Cavalari,
Marcelle Toutain e Marisa Cunha pelas conversas e palavras amiga, mesmo não
frequentes, mas aconteciam nos momentos em que eu mais precisava.
A amiga e companheira Danielle Vieira Rodrigues que sempre que possível
esteve ao meu lado, dividindo momentos de felicidades, dificuldades e superação.
A bióloga e amiga Dra. Denise Balani pela companhia durante o meu primeiro ano
em Campinas.
As biólogas e amigas Jéssica Harue e Renata Ésper pelos poucos, mas
inesquecíveis momentos de descontração.
Ao amigo Cleiton Fernando Feruglio por toda a atenção, carinho e belas palavras
a todo o momento.
Aos companheiros do Rotaract Club Campinas Universitário, em especial a minha
madrinha Letícia Biglia, pela oportunidade de fazer parte dessa família e aos
companheiros do Rotaract Club Poá, em particular aos amigos Fagner Barreto de
Carvalho e Paulo Victhor Bueno Costa pela compreensão, incentivo e apoio em tudo o
que eu escolhi para minha vida.
A todos, muito obrigada!
i
PENNA, D.A.S.; ANÁLISE DA DIVERSIDADE MOLECURAR E GENÉTICA DE
ISOLADOS DE Metarhizium anisopliae E AVALIAÇÃO DA VIRULÊNCIA EM Diatraea
saccharalis (FABRICIUS, 1794) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE). São Paulo. 2012.
Dissertação (Mestrado em Sanidade Vegetal, Segurança Alimentar e o Ambiente) –
Instituto Biológico.
RESUMO
A cultura da cana-de-açúcar é importante para o agronegócio brasileiro, constituindo uma das
fontes de energia mais consideráveis do país. No entanto, a produção dos canaviais poderia
ser maior se fossem minimizados os problemas de pragas e doenças, dentre elas o ataque
por Diatraea saccharalis, que tem levado a uma busca contínua por alternativas visando a
reduzir os efeitos adversos resultantes das aplicações de inseticidas químicos. Neste
contexto vem se destacando o controle biológico com uso de fungos entomopatogênicos, seja
pela sua ocorrência natural ou pela sua utilização como inseticidas biológicos. Assim o fungo
entomopatogênico Metarhizium anisopliae assume importante papel, pois é encontrado
facilmente nos solos e seu uso pode ser associado a parasitoides. O presente trabalho teve
como objetivo a análise da diversidade biológica de quarenta e sete isolados de M. anisopliae
armazenados e catalogados na Coleção de Fungos Entomopatogênicos “Oldemar Cardim
Abreu” do Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico bem como a avaliação da
virulência sobre D. saccharalis. Os resultados obtidos com a caracterização morfológica das
colônias e com a amplificação por primers específicos ITSMet e ITS4, permitiram confirmar a
identidade biológica de todos os isolados como M. anisopliae var. anisopliae e por meio da
técnica de rep-PCR pode-se afirmar que existe diversidade genética infraespecífica nos
isolados selecionados e dentre eles, o isolado IBCB 695 apresentou-se potencialmente mais
virulento para D. saccharalis que o isolado IBCB 425 comumente usado em áreas comercias
para o controle de Mahanarva fimbriolata.
Palavras-chave: Controle microbiano, controle biológico, cana-de-açúcar, Metarhizium
anisopliae, Diatraea saccharalis e rep-PCR.
ii
PENNA, D.A.S.; ANALISYS OF MORPHOLOGICAL AND GENETIC DIVERSITY OF
Metarhizium anisopliae ISOLATES AND EVALUATION OF VIRULENCE IN Diatraea
saccharalis (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE). São Paulo. 2012. Dissertation (Mestrado em
Sanidade Vegetal, Segurança Alimentar e o Ambiente) – Instituto Biológico.
ABSTRACT
The sugarcane crop is important for the Brazilian agribusiness, constituting one of the
most significant sources of income to the country. However, the production of sugar cane
could be increased if the problems due to pests and diseases we reduced, among them
Diatraea saccharalis, which has led to a continuous search for alternatives to reduce the
adverse effects from the application of chemical insecticides. In this context it has been
emphasized the use of biological control with entomopathogenic fungi, either by their
natural occurrence or by their use as biological insecticides. Thus the entomopathogenic
fungus Metarhizium anisopliae plays an important role, since it can be easily found in soils
and its use may be associated with parasitoids. This study aimed to analyze the biological
diversity of forty-seven isolates of M. anisopliae stored and cataloged in the Collection of
Entomopathogenic Fungi "Oldemar Cardim Abreu" Biological Control Laboratory of the
Biology Institute as well as evaluating the virulence of D. saccharalis. The results obtained
with the morphological characterization of the colonies and with the amplification with
specific primers ITSMet and ITS4, confirmed the identity of all isolates as M. anisopliae
var. anisopliae. Rep-PCR technique showed that there is infraspecific genetic diversity in
selected isolates and among them. The isolate IBCB 695 is potentially more virulent for D.
saccharalis than the isolate IBCB 425, which is normally used as agent for biological to
control of Mahanarva fimbriolata.
Keywords: microbial control, biological control, cane sugar, Metarhizium anisopliae,
Diatraea saccharalis and rep-PCR.
iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Isolados de Metarhizium anisopliae ............................................................ 15
Tabela 2: Sequência dos primers utilizados nas reações de ERIC-, BOX- e REP-PCR 22
Tabela 3: Mortalidade de lagartas de Diatraea saccharalis após a aplicação do fungo
entomopatogênico Metarhizium anisopliae ................................................................. 41
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Variação morfocultural de M. anisopliae cultivados em meio BDA .............. 24
Figura 2: Características do crescimento micelial vigoroso de algumas colônias ....... 25
Figura 3: Coloração das colônias e verso das placas. ............................................... 25
Figura 4: Quantificação de DNA de isolados de M.anisopliae .................................... 26
Figura 5: Produtos da amplificação do DNA de isolados de M. anisopliae utilizando-se
iniciadores ITSMet e ITS4 ........................................................................................... 27
Figura 6: Produtos da amplificação do DNA de isolados de Metarhizium anisopliae
utilizando-se os iniciadores REP1R-I e REP2R-I ........................................................ 28
Figura 7: Dendrograma gerado de acordo com amplificação de isolados de M. anisopliae
utilizando-se os iniciadores REP1R-I e REP2R-I ........................................................ 30
Figura 8: Produtos da amplificação do DNA de isolados de Metarhizium anisopliae
utilizando-se o iniciador BOX A1R. ............................................................................. 31
Figura 9: Dendrograma gerado de acordo com amplificação de isolados de M. anisopliae
utilizando-se os iniciadores BOX A1R ......................................................................... 32
Figura 10: Produtos da amplificação do DNA de isolados de Metarhizium anisopliae
utilizando-se os iniciadores ERIC1R e ERIC2. ............................................................ 33
Figura 11: Dendrograma gerado de acordo com amplificação de isolados de M.
anisopliae utilizando-se os iniciadores ERIC1R-I e ERIC2 .......................................... 35
Figura 12: Dendrograma gerado em conjunto das matrizes dos iniciadores de REP1R-I e
REP2, BOX AR1, ERIC1R e ERIC2 ............................................................................ 37
Figura 13: Testemunha de D. saccharalis não colonizada por M. anisopliae ............. 42
v
Figura 14: Lagartas de D. saccharalis morta por ataque de diferentes isolados de M.
anisopliae ................................................................................................................... 42
Figura 15: Lagarta de D. saccharalis morta com o isolado de M. anisopliae IBCB 69542
Figura 16: Mortalidade de lagartas de Diatraea saccharalis após a aplicação do fungo
entomopatogênico Metarhizium anisopliae IBCB 425 ................................................. 43
SUMÁRIO
RESUMO ....................................................................................................................... i
ABSTRACT ...................................................................................................................ii
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... iii
LISTA DE TABELAS ....................................................................................................iv
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................... 3
2.1. Características e importância econômica da cana-de-açúcar ................................ 3
2.2. Biologia e danos de Diatraea saccharalis............................................................... 3
2.3. Monitoramento e controle ...................................................................................... 4
2.4. Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin e o controle microbiano ........................ 7
2.4.1 Mecanismo de ação sobre o inseto ...................................................................... 8
2.4.2 Aplicação do isolado IBCB 425 no controle pragas .............................................. 8
2.5. Caracterização molecular e marcadores moleculares ............................................ 9
2.6. Diversidade genética em fungos .......................................................................... 10
3. OBJETIVO.............................................................................................................. 13
4. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 14
4.1. Isolados de Metarhizium anisopliae ..................................................................... 14
4.2. Meios de cultivo e soluções ................................................................................. 17
4.2.1. Meio de cultivo BDA. ......................................................................................... 17
4.2.2 Soluções e tampões........................................................................................... 17
4.3. Obtenção dos conídios para a inoculação em meio sólido e cultura monospórica 18
4.4. Caracterização Morfológica.................................................................................. 19
4.5. Caracterização Molecular .................................................................................... 19
4.5.1 Obtenção de micélio utilizado para a extração do DNA ...................................... 19
4.5.2. Extração de DNA em pequena escala............................................................... 20
4.5.3 Confirmação da identidade biológica por primers específicos ............................ 20
4.5.4. Caracterização dos isolados por rep-PCR ........................................................ 21
4.5.4.1. Análise dos padrões de fingerprinting ............................................................ 22
4.6. Ensaio de virulência ............................................................................................. 23
4.7. Análise Estatística................................................................................................ 23
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................ 24
5.1 Caracterização Morfológica ....................................................................................... 24
5.2 Caracterização Molecular.......................................................................................... 26
5.2.1 Extração de DNA ............................................................................................... 26
5.2.2 Confirmação da identidade dos isolados de M. anisopliae por primers específicos26
5.2.3 Caracterização dos isolados por rep-PCR e análise dos padrões de fingerprinting 27
5.2.3.1 REP-PCR............................................................................................................ 28
5.2.3.2 BOX-PCR ........................................................................................................... 31
5.2.3.3 ERIC-PCR........................................................................................................... 33
5.2.3.4 Análise por rep-PCR ........................................................................................... 36
5.3 Ensaio de virulência .................................................................................................. 40
6. CONCLUSÃO ............................................................................................................. 44
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 45
Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
________________________________________________________________________________________________
1. INTRODUÇÃO
O agronegócio é uma das fontes de renda mais importante para a economia do país,
representando cerca de um terço do Produto Interno Bruto (PIB) brasileiro e responsável
pela geração de empregos em diversos setores. Atualmente, o Brasil exporta seus produtos
agroindustriais para cerca de 180 países, podendo ser expandido, respeitando os cuidados
com relação à segurança e sanidade ambiental e alimentar (PORTAL, 2011).
A cultura da cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma das mais importantes para o
agronegócio brasileiro e está presente nos setores econômico, social ou ambiental. O Brasil
é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, e também lidera o setor de tecnologia de
produção do etanol. Além da matéria prima para a produção de açúcar e álcool, os
subprodutos e resíduos dessa cultura são utilizados para a co-geração de energia elétrica,
produção de ração animal e fertilizantes para as lavouras (EMBRAPA, 2010).
A área de cana-de-açúcar colhida destinada à atividade sucroalcooleira na safra de
2011 foi estimada em 8.091,5 mil hectares, distribuída em todos estados produtores. O
Estado de São Paulo continua sendo o maior produtor com 54,35%, seguido por Minas
Gerais com 8%, Paraná com 7,5%, Goiás com 7,4%, Alagoas com 5,74%, Mato Grosso do
Sul com 4,2% e Pernambuco com 4,1%. Nos demais estados produtores as áreas são
menores, mas com bons índices de produtividade (CONAB, 2011).
Porém, a produção brasileira poderia ser maior se fossem minimizados os problemas
de pragas e doenças. Entre esses destaca-se o ataque por Diatraea saccharalis (Fabricius,
1794) (Lepidoptera: Crambridae), conhecida popularmente como broca-da-cana e
considerada a praga mais importante da cultura (BOTELHO, 1992; YAMAUCHI et al., 1997;
GALLO et al., 2002).
O controle da broca-da-cana tem levado à busca contínua de alternativas visando
diminuir os efeitos adversos ao homem e ao ambiente decorrentes do emprego de
inseticidas químicos. Neste contexto, os entomopatógenos assumem papel importante, seja
pela sua ocorrência natural, como pela sua utilização como inseticidas biológicos ou no
emprego de programas de controle biológico e manejo integrado de pragas (MIP)
(ALVES, 1998).
Com relação ao controle biológico no Brasil, a cultura da cana-de-açúcar possui dois
dos maiores programas mundial sendo a liberação de Cotesia flavipes para o controle de D.
saccharalis e a aplicação do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae para o
controle de Mahanarva posticata e Mahanarva fimbriolata (Hemiptera: Cercopidae) (PINTO;
GARCIA; BOTELHO, 2006).
___________________________________________________________________________
Instituto Biológico - 2012
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Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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A presente dissertação teve como objetivo a análise da diversidade biológica de
quarenta e sete isolados de M. anisopliae pertencentes à Coleção de Fungos
Entomopatogênicos “Oldemar Cardim Abreu” do Laboratório de Controle Biológico do
Instituto Biológico de São Paulo, bem como avaliação da virulência dos isolados sobre
D. saccharallis.
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Instituto Biológico - 2012
2
Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Características e importância econômica da cana-de-açúcar
A cana-de-açúcar é uma espécie pertencente à família Poaceae, subfamília
Panicoideae, tribo Andropogoneae, subtribo Saccharinae, e ao gênero Saccharum
(TZVELEV; 1989). Tem origem no Sudeste da Ásia e tem sido utilizada como fonte de
energia desde a antiguidade, e há cerca de 12 mil anos já era domesticada na Nova Guiné
(Oceania). Foi introduzida no Brasil pelos primeiros colonizadores e logo se disseminou
pelos estados brasileiros devido a sua preferência por regiões tropicais. Desenvolve-se em
forma de touceira, sua parte aérea é formada por colmos, folhas, inflorescências e frutos; e
a parte subterrânea é formada por raízes e rizomas. Suas características varietais definem o
número de colmos por plantas, altura e diâmetro do colmo, comprimento e largura das
folhas e arquitetura da parte aérea, sendo a expressão desses caracteres influenciados pelo
clima, manejo e pelas práticas culturais realizadas (MAULE; MAZZA; MARTHA, 2001;
AZEVEDO et al., 2003; ASSIS et al., 2004).
De acordo com Lopes (2011), a cultura da cana-de-açúcar possui importância
histórica e econômica para o Brasil. O agronegócio sucroalcooleiro vem sofrendo grande
expansão na última década, não só no país como também em todo o mundo em função,
principalmente, da demanda por fontes de energia menos agressivas ao ambiente. Assim,
para atender à maior demanda por seus subprodutos, principalmente de etanol, as áreas
cultivadas com cana-de-açúcar vêm aumentando a cada ano no Brasil, ocupando áreas
novas de cultivo nas regiões centrais do país.
Em 2011 as vendas gerais do agronegócio ao exterior chegaram a US$ 85,7 bilhões
no período acumulado dos últimos 12 meses, superando expectativas do Ministério da
Agricultura. Em um ano, os produtos do complexo sucroalcooleiro foram um dos mais
exportados, superados apenas pelo complexo soja seguido das carnes (ProCana, 2011).
Para incrementar a produção de cana-de-açúcar por meio da instituição de novas
usinas e pelo aumento da capacidade produtiva da renovação dos canaviais, a Petrobras
Biocombustível deve investir US$ 2,5 bilhões na ampliação da produção de etanol e
biodiesel até o ano de 2015. Desse volume, US$ 1,9 bilhão, ou 76% do total, será
direcionado para produção de etanol (PROCANA, 2011).
2.2. Biologia e danos de Diatraea saccharalis
___________________________________________________________________________
Instituto Biológico - 2012
3
Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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A broca-da-cana, Diatraea saccharalis Fabr. (Lepidoptera: Crambidae), um inseto
pertencente
a
Ordem
Lepidoptera,
Família
Crambidae,
possui
desenvolvimento
holometabólico e é muito conhecida no Brasil pelos prejuízos causados à cultura de canade-açúcar (CRUZ; 2007). Os adultos frequentemente depositam seus ovos na face dorsal
das folhas, em um agrupamento característico semelhante a uma escama de peixe,
contendo em média de 5 a 50 ovos podendo chegar a colocar de 300 à 600 ovos durante
toda a sua vida com período de incubação de ovos variando de 4 a 12 dias
(GALLO et al., 2002).
Ainda de acordo com Gallo e colaboradores (2002), as lagartas apresentam
coloração branco amarelada com cabeça marrom, podendo atingir até 2,5 cm de
comprimento. Após a eclosão, as lagartas de 1° ínstar alimentam-se do parênquima das
folhas e entre o 2° e 3° ínstar passam a caminhar em direção ao colmo e penetram na
região dos entre nós, abrindo galerias longitudinais e transversais até a fase de pupa. A fase
larval tem duração de 20 a 79 dias, sofrendo variações de acordo com as condições
climáticas. A fase pupal ocorre no interior das galerias abertas até a emergência do adulto.
Os adultos emergem sob a forma de mariposas com coloração amarela-palha
medindo 2,5 cm de envergadura, sendo as fêmeas maiores com abdômen dilatado,
diferenciando-se dos machos que apresentam o último par de pernas cobertos por cerdas.
Sua longevidade varia de 2 a 9 dias (GALLO et al., 2002; PINTO; GARCIA; BOTELHO
2006).
Os danos causados por essa praga podem ser diretos ou indiretos. Os danos diretos
são caracterizados pela abertura das galerias no colmo, perda de peso, morte das gemas,
redução do fluxo da seiva, além de torná-la mais suscetível ao tombamento pela ação do
vento e das chuvas. Em canas mais jovens a broca produz o secamento dos ponteiros
(conhecido
como
coração
morto).
Os
danos
indiretos
ocorrem
pela
ação
de
microorganismos fitopatogênicos, entre eles os fungos Colletotrichum falcatum (Went, 1993)
e Fusarium moniliforme Sheldon (Nirenberg, 1976) que penetram através dos orifícios e
galerias, ocasionando a podridão vermelha do colmo. Muitas vezes esses fungos chegam a
degradar a sacarose diminuindo a pureza do caldo, competindo com as leveduras no
processo fermentativo e interferindo negativamente na produção de açúcar e álcool,
resultando algumas vezes em perdas maiores do que àquelas causadas pelos danos diretos
(GALLO et al., 2002; BOTELHO; MACEDO, 2002).
2.3. Monitoramento e controle
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Com a expansão das áreas cultivadas pela cana-de-açúcar em locais de diferentes
condições edafoclimaticas, faz-se necessário o monitoramento de pragas, principalmente da
broca da cana-de-açúcar pois ela encontra-se bem disseminada em todas as áreas de
cultivo. Por isso, existe a preocupação dessa praga ser monitorada todos os anos, para que
a sua população não ultrapasse o nível de controle, causando prejuízos consideráveis à
produção. Quando a broca-da-cana ocorrer em altas infestações, a diminuição dos seus
danos até níveis toleráveis será lenta, levando, geralmente, de dois a três anos
(PINTO, 2008).
O controle químico pode ser empregado na situação quando houver 3% de cana com
lagartas recém-eclodidas. Nessa situação, são realizadas pulverizações com inseticidas
reguladores de crescimento visando a região do palmito da planta. A recomendação desse
tipo de controle consiste na pulverização de inseticidas nas proximidades do conjunto de
folhas centrais, fazendo-se uso de algum dos produtos recomendados, tendo como
ingredientes ativos o triflumuron, lufenuron ou fipronil. (GALLO et al., 2002; MAPA, 2011).
De acordo com Bortoli e colaboradores (2004), para o sucesso do controle da broca é
imprescindível que o mesmo seja realizado antes de sua penetração no colmo da cana, uma
vez que no interior do colmo seu o controle torna-se muito difícil.
Esse método apresenta uma série de efeitos adversos prejudiciais ao homem e
outros animais como a seleção de populações resistentes do inseto, desequilíbrio ecológico;
além do seu alto custo, fazendo-se, portanto, necessária a busca de alternativas que
minimizem os efeitos negativos dos inseticidas sintéticos sobre o meio ambiente (KOGAN;
1998; DALVI et al., 2011). E neste contexto, os entomopatógenos, alguns parasitoides e
predadores assumem um importante papel seja pela sua ocorrência natural como pela sua
utilização como inseticidas biológicos (ALVES, 1998).
No Brasil, o controle biológico é feito principalmente por meio criações e liberações
inundativas de parasitoides como C. flavipes (Cameron; 1891) (Hymenoptera: Braconidae),
e tem sido empregado desde 1974. Para Botelho e Macedo (2002), o sucesso da liberação
dessas vespinhas foi devido à facilidade da produção massal em laboratório de criação e a
sua capacidade de localização da praga. Esse é o controle biológico mais eficaz (FUCHS;
HARDING; SMITH, 1979; WIEDENMANN; SMITH; DARNELL, 1995), mesmo esta praga
não sendo seu hospedeiro natural (GIFFORD; MANN, 1967). C. flavipes é reconhecido
também por parasitar outras lagartas da família Crambidae, sendo considerado um
endoparasitoide larval, cenobionte e gregário (WIEDENMANN; SMITH, 1995; BOTELHO;
MACEDO, 2002).
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O
microhimenóptero
Trichogramma
galloi
Zucchi,
1988
(Hymenoptera:
Tricchogrammatidae) é outro inimigo natural eficiente ao controle de pragas, pois parasita
ovos de lepidópteros (BOTELHO et al., 1995).
Esse tipo de controle é recomendável quando no monitoramento for encontrado
médias superiores a 10 lagartas/hora/homem, ou com população estimada em 2.500
lagartas/ha (BOTELHO; MACEDO, 2002). Porém, a eficiência da liberação de parasitoides
pode ser comprometida pela falta de sincronismo observada no campo entre ovos da praga
e fêmeas de T. galloi, havendo a necessidade, nesse caso, de se utilizar outros métodos
para combater a praga (BOTELHO; MACEDO, 2002). Essa falta de sincronismo pode levar
ao aparecimento de lagartas, que não é o estágio suscetível ao parasitoide de ovos. Nesse
caso,a utilização de um agente microbiano seria recomendado levando em consideração o
comportamento do primeiro ínstar larval de se encontrar na parte externa da planta. As
diversas fases de desenvolvimento de D. saccharalis sofrem a ação de diferentes inimigos
naturais, tais como parasitoides, predadores e entomopatógenos como fungos, bactérias,
vírus (NAVA; PINTO; SILVA, 2009), uma vez que os microrganismos são compatíveis com
outros métodos usuais não interferindo na ação de parasitoides e predadores que já
participam naturalmente no controle de pragas (ALMEIDA et al., 1986).
Segundo Alves, (1986) e Lecuona e Alves (1998), os patógenos mais importantes
que infectam naturalmente a broca da cana-de-açúcar são Metarhizium anisopliae (Metsch.)
Sorok., Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin, (1912) e vírus da granulose.
Os fungos, devido à sua ampla distribuição geográfica, são os mais estudados para o
controle de pragas, e apresentam também a vantagem da variedade de hospedeiros e sua
ocorrência enzoótica ou epizoótica em algumas espécies de insetos pragas (ALVES; 1998).
Os fungos B. bassiana e M. anisopliae podem ser utilizados no controle de ovos e
lagartas recém eclodidas de Diatraea spp., uma vez que, quando em condições climáticas
favoráveis de umidade e temperatura favorecem a atuação do patógeno, possibilitando o
desenvolvimento de epizootias. A sua utilização em diferentes concentrações sobre lagartas
demonstrou que além de serem patogênicos às lagartas dessa praga, estes fungos também
interferiram negativamente na sua biologia (OLIVEIRA et al. 2008). Na região Nordeste, em
condições favoráveis, esses patógenos causam naturalmente a infecção de até 10% de
lagartas existentes nos canaviais (ALVES; LOPES 2008).
M. anisopliae é um agente de controle biológico capaz de infectar todas as fases de
desenvolvimento de D. saccharalis. De acordo com Almeida e colaboradores (1984) em
condições de laboratório, a eficiência do fungo sobre ovos do inseto chega a atingir 90% de
controle. Já Almeida; Alves (1982) obtiveram um controle de 100% de lagartas, propondo o
uso de M. anisopliae para o controle biológico deste inseto.
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Segundo Folegatti (1985), a aplicação conjunta de M. anisopliae e C. flavipes
Cameron 1891 (Hymenoptera: Braconidae) é mais eficiente que a aplicação do fungo
isoladamente e sua inoculação não é prejudicial a nenhum estágio de desenvolvimento da
vespinha. Logo, M. anisopliae é compatível com o uso de parasitoides e pode ser inserido
no manejo integrado de pragas nessa cultura.
Com relação ao entomopatógeno B. bassiana, Alves et al., (1985) avaliaram a
eficiência no controle de D. sacchharalis em condições de campo e observaram mortalidade
de 47,5% até 56%, de acordo com as diferentes concentrações das suspensões, causando
a redução do dano causado pela praga. E em 2009, Zappelini observou que B. bassiana é
mais virulento que M. anisopliae, porém, concluiu que ambos são promissores para a
aplicação no controle microbiano.
Fernandes e colaboradores (2006), concluíram que estudos desenvolvidos com os
entomopatógenos demonstraram que a variabilidade genética dos isolados, principalmente
quanto aos parâmetros moleculares e de patogenicidade, determinaram diferenças no grau
de virulência do patógeno, interferindo, dessa maneira, nos percentuais de eficiência do
controle de insetos e ácaros.
2.4. Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. e o controle microbiano
O fungo Metarhizium anisopliae, é um patógeno de inseto da classe Hiphomycetes,
foi descrito pela primeira vez pelo zoologista e patologista russo Metschnikoff em 1879, que
publicou também o primeiro trabalho de controle microbiano, utilizando esse patógeno para
o controle de larvas de um curculionídeo praga de importância econômica na cultura da
beterraba (ALVES, 1998).
Segundo Zimmermann (1993), Alves (1998), o fungo M. anisopliae destaca-se como
um importante agente microbiano e suas variedades vêm sendo estudadas em muitas
espécies de insetos e acredita-se que esse patógeno ocorra naturalmente sobre mais de
300 espécies de insetos das diferentes ordens, além de vários grupos de insetos
importantes, como Diatraea saccharalis, que vêm sendo controlados por esse fungo.
A utilização de fungos entomopatogênicos no controle de pragas tem crescido por
ser considerado um método de controle que preserva o meio ambiente. A espécie M.
anisopliae é amplamente distribuída na natureza, podendo ser encontrada facilmente nos
solos, onde sobrevive por longos períodos e é utilizado no controle de pragas que causam
sérios prejuízos a culturas de importância econômica, em quase todos os países do mundo,
principalmente nos tropicais (AZEVEDO 2001, MILNER 2000).
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Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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Atualmente, o fungo M. anisopliae é usado em grande escala no Brasil,
principalmente para controlar um complexo de pragas na cultura da cana-de-açúcar,
alcançando 1 milhão de hectares tratados (PINTO; BOTELHO; OLIVEIRA, 2009).
2.4.1 Mecanismo de ação sobre o inseto
A broca-da-cana é muito sensível ao fungo M. anisopliae, nos diferentes estágios de
desenvolvimento causando mortalidade tanto dos ovos quanto lagartas pequenas (NAVA, et
al. 2009). Assim como a maioria dos fungos, atua principalmente por contato. Alguns
isolados podem ser diferenciados de acordo com sua variabilidade genética, permitindo
estudos de seleção para avaliação dos mais virulentos no controle de pragas. A escolha vai
depender de vários fatores como a espécie e isolado do patógeno, dificuldade da sua
produção, do ambiente onde será aplicado e do método de aplicação, podendo ser afetado
por fatores como temperatura, luz, umidade, radiação solar, condições nutricionais e
suscetibilidade do hospedeiro (ALVES; 1998).
Segundo o autor, o mecanismo de ação consiste em adesão, seguido de
germinação, penetração, colonização e reprodução. Os insetos atacados tornam-se
mumificados e cobertos por uma camada pulverulenta de cor verde, formada pela
aglomeração de conídios (ALVES; 1998).
2.4.2 Aplicação do isolado IBCB 425 no controle de pragas
O isolado IBCB 425 de Metarhizium anisopliae é atualmente o mais utilizado na
produção comercial por algumas biofábricas brasileiras e empregado como padrão, em
muitos trabalhos. Em 2005, Loureiro e colaboradores selecionaram isolados do fungo M.
anisopliae, com potencial de uso no controle de ninfas de Mahanarva fimbriolata e o IBCB
425 foi um dos mais virulentos, apresentando mortalidade confirmada acima de 70% no
sexto dia de aplicação, o que já havia sido relatado por Loureiro (2004); onde o isolado além
de produzir maior quantidade de conídios, foi um dos mais virulentos em ninfas e adultos do
mesmo inseto, permanecendo ativo por até 60 dias após a aplicação sem interferir na
atividade agrícola.
Em 2010, Gassen também relatou que ao avaliar 19 isolados, o IBCB 425 ficou entre
os dois mais promissores para o controle de M. fimbriolata.
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Barbosa e colaboradores (2011) avaliou o isolado no controle da lagarta do cartucho
do milho, Spodoptera frugiperda J. E. Smith 1797, em milho cultivado em condições de
campo e obteve resultados com 35% de eficiência.
Com relação à ocorrência natural do fungo M. anisopliae, assim como em áreas onde
ocorre a aplicação do isolado IBCB 425, foi constatado que o fungo encontra-se
amplamente distribuído nessas regiões de canaviais brasileiros (Miranda, 2011).
2.5. Caracterização molecular e marcadores moleculares
Com objetivo de revelar a variabilidade genética em nível de DNA, as técnicas de
diagnóstico molecular foram utilizadas, a princípio, para a taxonomia de microrganismos e
desde então, têm sido empregadas em programas de melhoramento genético (MARQUES
et al., 2002); assim como em programas de controle de qualidade de produtos biológicos, de
monitoramento ambiental e de avaliação de persistência de produtos microbianos
(HEGEDUS; KHACHATOUIANS, 1996).
A tecnologia da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi descrita por Kary Mullis
nos anos 80, e a partir de então, devido à sua rapidez, versatilidade e facilidade de
realização, a PCR causou uma verdadeira revolução nos conceitos da biologia, por ser uma
técnica eficaz para estudos genéticos moleculares (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).
Para fins de PCR é possível utilizar métodos rápidos e simplificados de extração de
DNA, uma vez que essa técnica requer quantidades mínimas de DNA e este não precisa
apresentar alto grau de pureza, podendo ser extraídos a partir de amostras de ambientes
complexos,
tais
como
solos,
rios
e
açudes,
alimentos
e
amostras
clínicas
(FUNGARO; 2000).
Desde a criação desta técnica, muitos trabalhos científicos têm sido publicados,
utilizando-se diretamente a PCR ou de técnicas derivadas. Estes trabalhos têm permitido
avanços significativos tanto em áreas básicas quanto em áreas que buscam o entendimento
de processos biológicos fundamentais e áreas aplicadas, dentre elas a identificação de
genótipos, o diagnóstico de doenças, estudos filogenéticos e melhoramento genético de
plantas, animais e microrganismos (ANDERSON STASOVSKI, 1992; OUELLET; SEIFERT,
1993).
Análises de sequencias por meio de RFLP (Restriction Fragment Lenght
Polymorphism) é uma das ferramentas que pode ser utilizada nas análises de DNA.
Variações no tamanho de fragmentos gerados por distintas amostras de DNA após a
clivagem com enzimas de restrição podem ser avaliados pela comparação entre o número e
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o tamanho dos fragmentos produzidos pela digestão do DNA com ou sem uma posterior
etapa de hibridização com sondas marcadas (MARQUES et al., 2002).
Outro marcador molecular amplamente utilizado na identificação e diferenciação de
espécies é o DNA ribossomal (DNAr) que nos eucariotos estão presentes repetidas vezes e
cada unidade consiste de regiões codificadas para os genes RNAr 18S, 5.8S e 28S e dois
espaços internos (ITS 1 e ITS 2) que separam essas regiões. Cada unidade do DNAr é
separada por um espaço intergenico (IGS). A unidade de DNAr apresenta componentes em
sua sequencia que envolve variações e podem ser usadas em estudos de sistemática para
diferentes níveis taxonomicos (FOULY; WILKINSON; CHEN, 1997).
As regiões de DNAr 18S e 28S são muito conservadas e podem ser utilizadas para a
diferenciação em nível de gênero e espécie (BERBEE; TAYLOR, 1995; GARGAS;
DEPRIEST, 1996). Por outro lado as regiões espaçadoras ITS e IGS acumulam mais
variabilidade, sendo mais utilizadas na diferenciação de espécies ou entre linhagens da
mesma espécie (RISTAINO et al., 1998; ESTEVE-ZARZOSO et al., 1999).
Técnicas como RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e rep-PCR têm sido
cada vez mais empregadas para avaliar a diversidade genética de microrganismos. O repPCR envolvendo ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus), BOX-PCR
(BOX elements) e REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic) são métodos rápidos e de
alta reprodutibilidade, que envolvem a amplificação por PCR utilizando primers que
amplificam sequências repetitivas presentes no genoma. Essas sequências repetitivas foram
inicialmente descritas em Escherichia coli e Salmonella typhimurium (STERN et al., 1984;
VERSALOVIC, et al. 1991) e têm sido utilizadas amplamente para estudos de diversidade
genética em fungos, distinguindo isolados estreitamente relacionados. No entanto, a
homologia e a sequência dos fragmentos amplificados em fungos é pouco conhecida
(GILLINGS; HOLLEY, 1997).
2.6. Diversidade genética em fungos
A taxonomia fúngica é essencial, devido ao papel que os fungos desempenham na
natureza, particularmente os entomopatogênicos utilizados no controle biológico de insetos
pragas na agricultura (LIMA, 1989). Dentre os fungos entomopatogênicos mais utilizados,
encontra-se M. anisopliae, que tem sido encontrado em formulações comerciais que têm
como base conídios dessa espécie. Nesse sentido, é importante a correta identificação do
agente fúngico quando se avalia o seu potencial como biocontrolador e quando se utilizam
formulações a serem aplicadas no campo. Assim, a precisa identificação dos isolados é um
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pré-requisito para o registro e uso de um produto comercial que tenha como base o fungo
(YIP; RATH; KOEN, 1992).
De acordo com Alves e Lecuona (1998), o desenvolvimento da biologia molecular
permitiu o surgimento de diversos métodos de detecção de polimorfismo genético,
diretamente em nível de DNA e os avanços nessas técnicas têm mostrado grande potencial
para a eficiente detecção e identificação de fungos aplicados no setor agrícola. Diversos
marcadores genéticos têm sido avaliados em diferentes trabalhos, sendo que o mais
amplamente utilizado é o gene do DNA ribossomal (DNAr) (DRIVER; MILNER; TRUEMAN,
2000; MARQUES et al., 2002).
O primeiro relato da sequência das regiões ITS1-5.8S-ITS2 foi feito por (MEHTA;
MEHTA; ROSSATO, 2002b), onde as relações genéticas entre isolados de Stemphylium
solani de diferentes regiões dos estados de São Paulo e Goiás foram estudadas por meio do
sequenciamento da região ITS e os resultados mostraram sequências distintas entre os
isolados dando indícios de que os mesmos devem pertencer a genótipos diferentes de S.
solani.
As técnicas de amplificação e posterior sequenciamento do gene 5.8 S com as
regiões intergenicas (ITS 1 e ITS 2) também foram aplicadas para Metarhizium. A análise
filogenética dos dados e sequenciamento mostrou que M. anisopliae constitui um grupo
monofilético e M. flavociride e M. album representam duas linhas evolucionárias separadas
(SOSA-GÓMEZ; TIGANO, ARANTES,1998).
Velásquez e colaboradores (2007) realizaram um estudo com 350 isolados de M.
anisopliae pertencentes ao Instituto Nacional de Pesquisas Agropecuárias do Chile (Instituto
de Investigaciones Agropecuárias - INIA, Quilamapu Chile) os quais foram caracterizados
inicialmente por morfologia, mas, no entanto, a caracterização com marcadores moleculares
possibilitou uma melhor compreensão da diversidade e estrutura genéticas de populações
chilenas deste fungo. Trinta e nove isolados foram selecionados aleatoriamente e
analisados por meio das técnicas de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR
(Simple
Sequences
Repeat)
ou
microssatélites
e
análises
de
PCR-RFLP da região ITS. Os dados de RAPD revelaram alta diversidade genética entre os
isolados com 41% de similaridade entre os isolados, enquanto que as análises por SSR
mostraram 45,2% e os marcadores ITS, 70,2% de similaridade.
Mehta
(2001)
e
Mehta;
Mehta,
Rossato, (2002a) realizaram estudos de
caracterização genética dos fungos Drechslera avenae (Eidam) Scharif, (1963) e
Stemphylium solan (G.F. Weber, 1930), utilizando a técnica de ERIC- e REP-PCR, uma vez
que estas representam uma poderosa ferramenta para estudos de diversidade genética de
microrganismos.
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Inglis, Duke, Goettel (2008) utilizaram a técnica de AFLP (Amplified Fragments
Length Polimorphism) para investigar a diversidade genética de mais de 200 isolados de M.
anisopliae var. anisopliae, no sudoeste da Columbia Britânica e verificaram que, além de se
ter acesso à diversidade genética entre a linhagem referência de M. anisopliae e os isolados
examinados, essa ferramenta possibilitou distinguir gêneros de entomopatógenos de outros
fungos.
Bischoff; Rehner; Humber (2009) utilizando sequências dos genes a partir de EF-1α,
RPB1, RPB2 e β-tubulin (de tradução e fatores de alongamento) e analise morfológica,
avaliaram a relação filogenética dentro do complexo M. anisopliae, a fim de identificar
linhagens monofiléticas e esclarecer a posição taxonômicas de algumas espécies do
gênero. Os autores propuseram reconhecer em nível de espécie M. anisopliae, M.
guizhouense, M. pingshaense, M. acridum, M. lepidiotae e M. majus. Ainda, propuseram as
novas espécies M. globosum e M. robertsii, além de sugerir a utilização do nome M.
brunneum e demostrar que M. taii é um sinônimo de M. guizhouense.
Steinwender e colaboradores (2011) avaliaram a diversidade genética no solo de
uma área experimental agrícola por meio de métodos moleculares. Para isso foram
coletados isolados de Metarhizium spp. e analisados por meio de sequenciamento do gene
18S DNAr e utilização microssatélites (SSR). Os resultados obtidos mostram que 86,3%
pertecem à espécie M. brunneum, 11,3% à M. robertsii e 3,4% à M. majus.
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3. OBJETIVO

Caracterização morfológica e molecular de quarenta e sete isolados do fungo
entomopatogênico Metarhizium anisopliae.

Avaliação da virulência de isolados de Metarhizium anisopliae sobre Diatraea
saccharalis.
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4. MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi realizado nos Laboratório de Controle Biológico e Laboratório de
Bacteriologia Vegetal do Centro Experimental do Instituto Biológico, sediado em Campinas,
SP.
4.1. Isolados de Metarhizium anisopliae
Nos experimentos foram utilizados 47 isolados do fungo Metarhizium anisopliae
relacionados na Tabela 1.
Os isolados foram provenientes da Coleção de Fungos Entomopatogênicos “Oldemar
Cardim Abreu” do Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico, localizado no
Centro Experimental Instituto Biológico, em Campinas - SP. Estes isolados são mantidos
armazenados em “freezer” a -4°C, sob a forma de conídios puros, acondicionados em
microtubos e em tubos de cultura com óleo mineral.
Os isolados são provenientes de três usinas sucroalcooleiras: Usina São João
(U.S.J.), Usina Santo Antonio/ Grupo Balbo (U.S.A.) e Usina Açúcar Guarani (U.G.),
localizadas, respectivamente nos municípios de Araras, Sertãozinho e Olímpia, no estado de
São Paulo. Todas as coletas foram realizadas no período de outubro de 2009 a abril de
2010 e fizeram parte do estudo realizado por Miranda (2011) com o objetivo de avaliar a
ocorrência natural do mesmo em diferentes regiões do estado de São Paulo.
Dentre esses, foram selecionados 31 isolados de áreas onde não ocorreu aplicação
de M. anisopliae e 16 isolados de áreas onde foi efetuada aplicação artificial desse fungo. O
isolado IBCB 425 foi considerado neste estudo como isolado padrão. Cabe ressaltar que os
isolados de áreas provenientes da Usina Santo Antonio pertencem a uma área onde ocorre
produção orgânica de cana-de-açúcar.
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Tabela 1: Isolados de Metarhizium anisopliae.
n
o
Hospedeiro
Data
Local
Coordenadas
Área com aplicação de
fungo
long. 24°, 5865'/ lat - 48° , 5948'
long. 22° , 3526'/ lat - 47° , 3881'
long. 22° , 3526'/ lat - 47° , 3881'
long. 22° , 3526'/ lat - 47° , 3881'
long. 22° , 3526'/ lat - 47° , 3881'
long. 22° , 3526'/ lat - 47° , 3881'
long. 22° , 3526'/ lat - 47° , 3881'
long. 22° , 3526'/ lat - 47° , 3881'
long. 22° , 3526'/ lat - 47° , 3881'
long. 22° , 3526'/ lat - 47° , 3881'
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
IBCB 425
IBCB 639
IBCB 640
IBCB 643
IBCB 644
IBCB 645
IBCB 646
IBCB 647
IBCB 650
IBCB 654
Solo
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
06/10/2009
06/10/2009
26/10/2009
26/10/2009
26/10/2009
26/10/2009
26/10/2009
26/10/2009
26/10/2009
Mata Atlântica
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
IBCB 655
IBCB 658
solo – cana
solo – cana
26/10/2009
26/10/2009
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
long. 22° , 3526'/ lat - 47° , 3881'
long. 22° , 3526'/ lat - 47° , 3881'
Não
Não
IBCB 659
IBCB 660
IBCB 662
IBCB 665
IBCB 667
IBCB 669
IBCB 685
IBCB 695
IBCB 698
IBCB 697
IBCB 700
IBCB 701
IBCB 702
IBCB 703
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
23/10/2009
23/10/2009
23/10/2009
23/10/2009
23/10/2009
10/12/2009
13/11/2009
13/11/2009
10/12/2009
10/12/2009
06/01/2010
06/01/2010
06/01/2010
06/01/2010
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Olímpia (Usina Guarani)
Olímpia (Usina Guarani)
Olímpia (Usina Guarani)
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 20° , 7355/ lat - 48°, 9070'
long. 20° , 7355/ lat - 48°, 9070'
long. 20° , 7355/ lat - 48°, 9070'
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Não
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Instituto Biológico - 2012
Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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Continuação da tabela 1
IBCB 704
IBCB 705
IBCB 713
solo – cana
solo – cana
solo – cana
06/01/2010
06/01/2010
01/02/2010
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Araras (Usina São João)
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
Não
Não
Sim
IBCB 717
IBCB 718
IBCB 720
IBCB 722
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
01/02/2010
01/02/2010
01/02/2010
01/02/2010
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
Araras (Usina São João)
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
Sim
Não
Não
Não
IBCB 724
IBCB 725
IBCB 726
IBCB 729
solo – cana
solo – cana
solo – cana
solo – cana
27/02/2010
27/02/2010
16/03/2010
16/03/2010
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
Não
Sim
Sim
Sim
IBCB 737
IBCB 756
IBCB 761
IBCB 789
solo – cana
M. fimbriolata
27/02/2010
16/03/2010
15/02/2009
25/01/2010
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Sertãozinho (Usina Santo Antonio)
Olímpia (Usina Guarani)
Olímpia (Usina Guarani)
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 21°, 1440'/ lat - 48° 0116'
long. 20° , 7355/ lat - 48°, 9070'
long. 20° , 7355/ lat - 48°, 9070'
Não
Não
Sim
Sim
solo – cana
solo – cana
IBCB 810
solo – cana
14/04/2010
Araras (Usina São João)
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
IBCB 811
solo – cana
14/04/2010
Araras (Usina São João)
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
IBCB 812
solo – cana
14/04/2010
Araras (Usina São João)
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
IBCB 815
solo – cana
14/04/2010
Araras (Usina São João)
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
IBCB 825
solo – cana
14/04/2010
Araras (Usina São João)
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
IBCB 827
solo – cana
14/04/2010
Araras (Usina São João)
long. 47° 25, 9081' / lat - 22° 24, 8363
IBCB Coleção de Fungos Entomopatogênicos “Oldemar Cardim Abreu” do Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico.
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Instituto Biológico - 2012
Não
Sim
Não
Não
Não
Não
Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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4.2. Meios de cultivo e soluções
Os meios de cultivo utilizados para a manutenção e crescimento das colônias, assim
como as soluções e tampões de rotina estão descritos abaixo.
4.2.1. Meio de cultivo BDA
BDA (Batata – Dextrose – Ágar)
40 g
Água destilada
1.000 mL
4.2.2. Soluções e tampões
EDTA 0,5 M pH 8,0
EDTA
372,24 g
Água destilada
1.000 mL
Acertou pH com NaOH 1N
NaCl 5 M
NaCl
58,44 g
Água destilada
1.000 mL
Tris- HCL 1 M
Tris
T
Água destilada
121,14 g
1.000 mL
Acertou o pH para 8,0 com HCl 1N
T
Tampão de Extração CTAB (2% CTAB, 100 mM Tris-Hcl pH 8,0, 1,4 M NaCl, 0,02M
EDTA, 2% mercaptoetanol).
EDTA 0,5 M pH 8,0
4 mL
NaCl 5 M pH 8,0
28 mL
Tris-HCl 1M pH 8,0
10 mL
CTAB
2g
Mercaptoetanol
2 mL
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Água Milli-Q
q.s.p. 1.000 mL
Clorofórmio: Álcool isoamílico
Clorofórmio
29 mL
Álcool isoamílico
1 mL
Etanol 70%
Etanol Absoluto
70 mL
Água destilada
q.s.p. 100 mL
Tampão TAE
Tris
242g
Acido glacial acético
57.1 mL
EDTA 0,5M
100 mL pH8,0
Água destilada
q.s.p. 100 mL
TE
EDTA 0,5 M 100 mL pH8,0
2 mL
Tris 1 M pH 8
10 mL
Água MilliQ
q.s.p. 100 mL
RNAse
RNAse
10 mg
Água MilliQ
q.s.p. 100 mL
Cloreto de Lítio 4 M
Cloreto de Lítio
16,95 g
Água destilada
q.s.p. 100 mL
4.3. Obtenção dos conídios para a repicagem em meio sólido e cultura
monospórica
Os conídios de M. anisopliae, foram repicados, com auxílio de alça de platina, em
placas de Petri (90mm de diâmetro), devidamente esterilizadas e contendo meio BDA.
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Posteriormente as placas foram vedadas com filme plástico e incubadas em câmara tipo
B.O.D. (Biological Oxigen Demand) a 28 o C e fotofase de 12 horas por 10 dias. Todo esse
procedimento foi realizado sob condições de assepsia em câmara de fluxo laminar.
As colônias monospóricas foram obtidas observando-se o crescimento da colônia e
produção de esporos, por microscopia óptica. Em seguida, pequenas quantidades do fungo
foram coletadas diretamente de cada placa e macerada em água destilada esterilizada. A
suspensão de esporos foi colocada em lâminas de microscopia e observada por.
microscopia óptica (M.O.) com aumento de 400X. Com o auxílio de um alfinete entomológico
de espessura 0,3 mm foi retirado 1 conídio de cada suspensão, repicados para placas de
Petri contendo meio BDA, os quais foram incubadas sob as mesmas condições descritas,
por 15 dias. O procedimento foi repetido individualmente para cada um dos isolados
analisados.
4.4. Caracterização Morfológica
A caracterização morfológica dos isolados de M. anisopliae foi realizada utilizando
culturas monospóricas e foram analisados com base no formato, crescimento micelial,
aspecto da colônia e na sua coloração no verso e reverso da placa em meios de cultura
BDA. Os ensaios foram realizados em duplicata. O diâmetro das colônias foi medido a partir
do terceiro dia de crescimento até o décimo segundo dia, quando o crescimento da maioria
começou a estabilizar.
4.5. Caracterização Molecular
A caracterização molecular consistiu na extração do DNA genômico dos isolados,
seguido de amplificação por rep-PCR.
4.5.1. Obtenção de micélio utilizado para a extração do DNA
Para as extrações de DNA, os micélios dos fungos foram obtidos diretamente das
colônias monospóricas frescas, com 20 dias de crescimento. O micélio foi raspado das
placas com espátula no momento da extração e colocado diretamente em microtubos de
1,5 mL.
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4.5.2. Extração de DNA em pequena escala
As extrações de DNA de fungo em pequena escala foram realizadas com base na
metodologia descrita por Murray e Thompson (1980), modificada.
Em um microtubo de 1,5 mL foram adicionados aproximadamente 50 mg de micélio
do fungo; o conteúdo foi macerado com o auxílio de um pistilo em 500 µL de tampão de
extração CTAB (2% CTAB, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,4 M NaCl, 0,02 M EDTA, 2%
mercaptoetanol) e incubado a 65 oC por 1 hora. Terminado o período de incubação foram
adicionados 500 µL de clorofórmio: álcool isoamílico (29:1) e a suspensão foi
homogeneizada em agitador de tubos por cerca de 2 minutos. Posteriormente, a mistura foi
submetida à centrifugação de 10.000 rpm por 10 minutos a 4 oC. A fase aquosa,
aproximadamente 400 µL contendo DNA, foi transferida para um novo microtubo, adicionouse 500 µL de isopropanol e misturou-se por inversão. Os tubos foram mantidos em freezer a
-20o durante a noite.
Após este período, os tubos foram centrifugados a 12.000 rpm por 15 minutos a 4 oC.
O sobrenadante foi descartado, o sedimento foi lavado com 500 µL de etanol 70% e
novamente submetido a uma centrifugação de 10.000 rpm por 10 minutos à 4ºC. Em
seguida o sobrenadante foi descartado, o DNA foi seco e suspenso a 50 µL de H 2O Milli-Q
previamente autoclavada. Posteriormente, adicionou-se 2 µL de RNAse (10 mg/mL), 200 µL
de tampão TE pH 8,0 e incubou-se novamente por 1 hora a 37°C. Depois, adicionou-se
40 µL de cloreto de lítio (4M), 240 µL de clorofórmio álcool isoamílico e misturou-se
manualmente até a emulsificação completa. Centrifugou-se por 10 minutos a 12.000 rpm
para separar as duas fases e transferiu-se o sobrenadante para outro microtubo. Precipitouse o DNA com 400 µL de etanol absoluto e misturou-se por inversão até a visualização de
um precitado fibroso branco. Centrifugou-se por 2 minutos a 12.000 rpm, em seguida os
sedimentos foram lavados duas vezes com etanol 70% e o DNA foi seco e suspendido em
50 µL de água milli-Q. Os DNAs extraídos foram estocados em freezer a -20ºC.
4.5.3 Confirmação da identidade dos isolados de M. anisopliae por primers
específicos
Antes de serem iniciados os experimentos de rep-PCR, foi realizada a confirmação
da identidade biológica dos isolados como o M. anisopliae através de amplificação por PCR
utilizando-se primers específicos de acordo com Destéfano et al., (2004). As reações de
amplificação foram efetuadas em volumes de 25 µL contendo: 1X tampão de reação da
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enzima Taq polimerase; 1% de BSA (soro albumina bovina); 3,5 mM MgCl2, 0,6 mM do
primer ITSMet (5’ TCT GAA TTT TTT ATA AGT AT 3’), 0,4 mM do primer ITS4 (5’ TCC TCC
GCT TAT TGA TAT GC 3’), 0,2 mM de dNTPs e 2 U da enzima Taq DNA polimerase
(Fermentas) e 100 ng do DNA genômico de cada isolado. A amplificação foi realizada em
um termociclador Axygen Maxygene, e o programa para amplificação das amostras
constituiu de um ciclo de desnaturação inicial 95 °C por 3 minutos, seguido de 32 ciclos de 1
minuto a 94 °C, 61 °C por 1 minuto, 72 °C por 1 minuto e um ciclo de extenção final a 72 °C
por 3 minutos.
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose
2,5 %/tampão TAE 1X, corados com brometo de etídio (MANIATIS; FRITSCH; SAMBROOK,
1982), visualizados em fonte de luz U.V. e registrados pelo sistema de fotodocumentação
digital Alpha Innotech 2200.
4.5.4. Caracterização dos isolados por rep-PCR
Com base nos trabalhos de Mehta; Mehta; Rossato, (2002a) modificados, foram
utilizados aproximadamente 100 ng de DNA de cada isolado, nas reações dos experimentos
de REP-, ERIC- e BOX-PCR. As reações de amplificação foram efetuadas em volume de 25
µL contendo: 1 X tampão de reação da enzima (Fermentas); 1% de BSA; 3,5 mM MgCl 2;
2mM de cada primer para o ERIC- e REP-PCR e 4mM de primer para o BOX-PCR; 0,2 mM
de dNTPs, 1 U de enzima Taq DNA polimerase (Fermentas). A amplificação foi realizada em
um termociclador Axygen Maxygene, e o programa de amplificação das amostras consistiu
de:

REP-PCR: um ciclo de desnaturação inicial a 95 ºC por 6 minutos; seguido de 30
ciclos a 94 ºC por 1 minuto; 40 ºC por 1 minuto e 65 ºC por 8 minutos e um ciclo de
extensão final a 65 ºC por 16 minutos.

ERIC-PCR: um ciclo de desnaturação inicial a 95 ºC por 7 minutos; seguido de 30
ciclos a 94 ºC por 1 minuto; 52 ºC por 1 minuto e 65 ºC por 8 minutos e um ciclo de
extensão final a 65 ºC por 16 minutos.

BOX-PCR: um ciclo de desnaturação inicial a 95 ºC por 7 minutos; seguido de 30
ciclos a 94 ºC por 1 minuto; 43 ºC por 1 minuto e 56 ºC por 8 minutos e um ciclo de
extensão final a 65 ºC por 16 minutos.
As sequências dos primers utilizados estão descritas na Tabela 2.
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Tabela 2: Sequência dos primers utilizados nas reações de ERIC-, BOX- e REP-PCR.
No.
nucleot.
22
Código
Sequência do primer (5’  3’)
ERIC1R
ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C
ERIC2
AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G
22
Enterobacterial
Repetitive
Intergenic
Consensus
sequence
BOX
A1R
CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G
22
Elementos Box
15
Repetitive
Extragenic
Palindromic
REP1R-I
ICG ICG ICA TCI GGC (Onde I = A, C, G, T)
REP2-I
ICG ICT TAT CIG GCC TAC (Onde I = A, C,
G, T)
18
Especificidade
Enterobacterial
Repetitive
Intergenic
Consensus
sequence
Repetitive
Extragenic
Palindromic
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose
2,5 %/tampão TAE 1X, corados com brometo de etídio (MANIATIS; FRITSCH; SAMBROOK,
1982), visualizados em fonte de luz U.V. (Ultra Violeta) e registrados pelo sistema de
fotodocumentação digital Alpha Innotech 2200.
4.5.4.1. Análise dos padrões de fingerprinting
Os perfis obtidos por rep-PCR foram analisados através do sistema binário (bandas
presentes, 1 ou ausentes, 0 para cada linhagem). Os fragmentos abaixo de 50 pb não foram
considerados nas análises. A matriz de similaridade foi construída utilizando-se o programa
de similaridade para dados qualitativos (SIMQUAL), com o coeficiente de Jaccard (SJ). Os
dendrogramas foram construídos utilizando-se o algorítmo de agrupamento UPGMA
(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean) por meio do programa NTSYS-PC
(ROHLF, 1992).
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4.6. Ensaio de virulência
Após a caracterização molecular dos 47 isolados, foram selecionados os doze
isolados que mais se destacaram em cada grupo (perfil) para os bioensaios de virulência.
As lagartas de D. saccharalis foram provenientes de criação do Laboratório de
Controle Biológico do Instituto Biológico - CEIB, Campinas, SP. Os conídios de cada isolado
foram produzidos em placas de Petri contendo meio BDA, e estas foram incubadas em
câmara climatizada do tipo B.O.D. (25±1ºC e fotofase de 12 horas) durante 10 dias. Após o
período de incubação, os conídios foram quantificados utilizando-se câmara de Neubauer e
M.O. com aumento de 400X. A viabilidade dos conídios também foi determinada através da
porcentagem de germinação obtida em meio de cultura (BDA). As suspensões utilizadas no
experimento tinham concentração de 1x108 conídios/mL e viabilidade superior a 90%
(FRANCISCO, 2006). A estas suspensões foram acrescidas espalhante adesivo Tween® na
concentração de 1% por litro de água.
Os tratamentos foram constituídos pelos doze isolados selecionados e a testemunha
foi representada pela água destilada e Tween.
Com o emprego de torre de Potter (15 Ib/pol2) foram pulverizados 1 mL da
suspensão de cada tratamento, constituído por 40 lagartas divididas em quatro repetições
de dez lagartas de D. saccharalis de 4° ínstar.
Os insetos pulverizados foram mantidos nas placas de Petri, sem dieta, por 24
horas, e em seguida individualizados em novas placas de Petri, contendo pedaços de dieta
artificial (HENSLEY E HAMMOND 1968 modificado por KING; HARTLEY, 1985). O
bioensaio foi mantido em sala climatizada (27 ± 1 ºC e fotofase de 14 horas, 70 ± 10% UR) e
as avaliações de mortalidade foram realizadas após 7 dias. As lagartas mortas foram
submetidas à câmara úmida por 5 dias, a fim de confirmar a morte causada pelo fungo.
4.7. Análise Estatística
Os bioensaios de virulência seguiram o delineamento inteiramente casualizado
(DIC), sendo que os dados foram submetidos à análise de variância pelo teste F, e na
significância deste, as médias foram comparadas por meio de teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
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5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1. Caracterização Morfológica
Os 47 isolados de M. anisopliae analisados apresentaram diâmetro de 3,8 a 6 cm
após 12 dias de crescimento em meio BDA, além de conformação circular e a maioria delas
bem definidas, com uma massa de conídios mais concentrada (Figura 1), o que segundo
Alves (1998), são conidióforos simples que, justapostos resultam em uma massa regular.
A
B
C
D
E
F
G
H
I
Figura 1: Variação morfocultural de M. anisopliae cultivados em meio
BDA (A) IBCB 639, (B) IBCB 660, (C) IBCB 662, (D) IBCB 703, (E) IBCB
705, (F) IBCB 724, (G) IBCB 737, (H) IBCB 815 e (I) IBCB 827.
A coloração de todas as colônias foi observada e as mesmas apresentaram esporos
que variaram do verde escuro até verde claro e algumas delas apresentaram crescimento
micelial mais vigoroso (Figura 2) confirmando assim o que foi relatado por Yip; Rath; Koen,
(1992), que efetuaram um estudo envolvendo 204 isolados de M. anisopliae de solo de
pastagem na Tasmânia e observaram que as colônias apresentam três cores básicas: verde
acinzentado, verde escuro e cinza escuro, considerando assim essas colorações típicas da
espécie (var. anisopliae) e sendo este uma característica estável e confiável para a
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diferenciação de isolados. Já com relação ao verso das placas, muitas delas apresentaram
coloração amarelada com o centro mais escuro, e algumas outras alaranjadas com aspecto
transparente nas bordas (Figura 3).
A
B
Figura 2: Características do crescimento micelial vigoroso
de algumas colônias. (A) isolado IBCB 722 e (B) isolado
IBCB 756.
A
B
C
D
Figura 3: Coloração das colônias e verso das placas. (A) e
(B) isolado IBCB 640 e (C) e (D) isolado IBCB 665.
A taxonomia baseada nas características morfológicas do gênero descrita por
Tulloch (1976); Rombach; Humber; Evans, (1987) tem sido constantemente revista,
associando diferentes métodos moleculares para a identificação das espécies com o
objetivo de tentar esclarecer possíveis relações entre variedades e espécies do gênero.
Parâmetros morfológicos, relacionados ao crescimento, forma e coloração das
colônias,
podem
ser
importantes
indicadores
da
variabilidade
entre
isolados
(ALVES et al., 1986), parâmetros esses que foram observados por Macedo (2005), que
afirma que ao selecionar isolados de M. anisopliae patogênicos para Mahanarva fimbriolata,
observou que pode ocorrer diferenças morfológicas entre os isolados.
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5.2. Caracterização Molecular
5.2.1. Extração de DNA
A extração do DNA genômico de todos os isolados foi efetuada com base no
protocolo (MURRAY; THOMPSON; 1980), e o mesmo foi considerado eficiente tendo-se
obtido a quantidades de DNAs suficiente para o desenvolvimento de todo o trabalho
(Figura 4).
1
2
3
4
5
6
7
8
Figura 4: Quantificação de DNA de isolados de M. anisopliae. (1) marcador
DNA do fago λ 100 ng (2) marcador λ 200 ng, (3) IBCB 425, (4) IBCB 639,
(5) IBCB 640, (6) IBCB 643, (7) IBCB 644, (8) IBCB 645.
5.2.2. Confirmação da identidade dos isolados de M. anisopliae por primers
específicos
Todos os DNAs extraídos foram submetidos à amplificação por PCR utilizando-se
primers específicos ITSMet e ITS4, para a confirmação da identidade biológica dos isolados
como M. anisopliae var. anisopliae. Utilizou-se a linhagem de M. anisopliae E9 como
controle positivo da amplificação (Figura 5). Foi possível a obtenção do fragmento específico
de 440 pb para todos os isolados testados.
A utilização de primers específicos é uma alternativa para a identificação e
diferenciação de fungos.
Hegedus e Khachatourians (1996) utilizaram primers específicos, correspondentes a
segmentos de DNA específicos de B. bassiana, para identificação e diferenciação deste
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Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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fungo através das técnicas de PCR e SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism
Analysis) em isolados deste
entomopatógeno
infectando
Melanoplus sanguinipes
(gafanhotos migratórios).
No presente trabalho, a confirmação da identidade dos isolados foi obtida
empregando-se a metodologia desenvolvida por Destéfano et al. (2004). Os autores
utilizaram sequencias da região ITS1 – 5.8S – ITS2 analisadas em diferentes espécies do
fungo entomopatogênico Metarhizium incluindo M. anisopliae, M. album e M. flavoviride
para desenvolver primers específicos para a detecção e identificação de linhagens de M.
anisopliae var. anisopliae em larvas de D. saccharalis infectadas artificialmente.
M
1
2
3
4
5
6
M
500 pb
Figura 5: Produtos da amplificação do DNA de isolados de M. anisopliae
utilizando-se os iniciadores ITSMet e ITS4. (M) marcador de peso molecular
100 pb (Fermentas), (1) E9, (2) IBCB 425, (3) IBCB 639, (4) IBCB 640, (5)
IBCB 643, (6) IBCB 644.
5.2.3. Caracterização dos isolados por rep-PCR e análise dos padrões de
fingerprinting
A diversidade genética de 47 isolados de M. anisopliae foi avaliada por meio da
análise comparativa entre os padrões eletroforéticos gerados pela amplificação de
sequências conservadas e repetitivas do DNA genômico. As análises possibilitaram a
construção de dendrogramas com base na similaridade dos perfis genéticos determinados
pelo uso dos iniciadores REP, BOX e ERIC-PCR. Ainda, uma análise conjunta desses
marcadores moleculares também foi efetuada.
Para apresentação e discussão dos resultados de caracterização molecular dos
isolados, a expressão “área aplicada” refere-se-à às áreas onde foram efetuadas aplicações
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Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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artificiais de M. anisopliae e a expressão “área não aplicada”, às áreas onde tais aplicações
não ocorreram.
5.2.3.1 REP-PCR
Nas análises de REP-PCR foram avaliados fragmentos de 150 a 2.800pb. Os
padrões de bandas gerados com os primers REP1R-I e REP2-I para alguns isolados de M.
anisopliae estão ilustrados na Figura 6.
M
1
2
3
4
5
6
M
7
8
9
10
11
12
M
2.000 pb
300 pb
Figura 6: Produtos da amplificação do DNA de isolados de M. anisopliae
utilizando-se os iniciadores REP1R-I e REP2-I. (M) marcador de peso
molecular 100 pb (Fermentas), (1) IBCB 640, (2) IBCB 645, (3) IBCB 643,
(4) IBCB 659, (5) IBCB 660, (6) IBCB 662, (7) IBCB 667, (8) IBCB 695, (9)
IBCB 697, (10) IBCB 703, (11) IBCB 722 e (12) IBCB 815.
Para se verificar o grau de similaridade dos isolados de M. anisopliae, os resultados
de REP-PCR (Figura 6) foram analisados por meio da construção de um dendrograma de
similaridade com o auxílio do algoritmo de agrupamento UPGMA (Unweighted Pair Group
Method with Arithmetic Mean), executado pelo programa NTSYS-PC (ROLF, 1992). As
análises revelaram a formação de dois grupos (I e II) com similaridade entre si de
aproximadamente 13%. O grupo I ficou representado apenas pelo isolado IBCB 725, oriundo
de área aplicada na Usina Santo Antonio, Sertãozinho, SP. O grupo II ficou composto pelos
isolados restantes, sendo subdividido em “a” e “b”. O subgrupo “b” alocou somente o isolado
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Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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IBCB 789 obtido de área onde foi efetuada aplicação do isolado de M. anisopliae IBCB 425
na Usina Guarani, Olímpia, SP. O subgrupo “a” englobou os outros 45 isolados, sendo que
os isolados obtidos de áreas aplicadas formaram dois grupos distintos com similaridade de
aproximadamente 39% entre si, exceto o isolado IBCB 695, proveniente também de área
onde ocorreu aplicação do isolado IBCB 425 na Usina Guarani e que ficou alocado em um
ramo distinto. Em um desses grupos, ficaram alocados dez dos 16 isolados e estes, com
100% de similaridade entre si, incluindo o isolado IBCB 425.
Os outros seis isolados
provenientes também de áreas aplicadas, ficaram alocados em outros grupos, mas distinto
daqueles de áreas não aplicadas. Os grupos gerados com isolados provenientes de áreas
aplicadas exibiram aproximadamente 55% de similaridade. Cabe salientar ainda que, a
maioria dos isolados obtidos de mesmas áreas não aplicadas (Usina Santo Antônio
município de Sertãozinho, SP e Usina São João, Araras, SP) ficaram alocados num mesmo
grupo (Figura 7).
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Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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0,00
0,00
0,25
0,25
0,50
0,50
I
IIII
iii
ba
ii
1,00
1,00
IBCB 425 – Padrão (+)
IBCB 698 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 669 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 685 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 700 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 811 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 761 – U.G., Olímpia SP (+)
IBCB 701 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 702 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 729 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 639 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 654 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 640 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 644 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 645 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 650 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 697 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 643 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 646 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 647 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 658 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 718 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 722 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 720 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 724 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 756 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 812 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 827 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 825 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 815 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 655 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 810 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 659 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 660 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 667 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 662 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 665 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 703 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 704 – Usina Snt .Antonio, Sertãozinho, SP (-)
IBCB 705 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 737 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 695 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 713 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 717 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 726 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 789 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 725 – U.S.A., Sertãozinho (+)
i
a
0,75
0,75
30
b
I
Figura 7: Dendrograma gerado de acordo com os perfis de amplificação de 47 isolados de M. anisopliae utilizando-se os iniciadores REP1R-I e REP2-I,
baseado no método
UPGMA e coeficiente de Jaccard. Onde (+) áreas aplicadas; (-) áreas não aplicadas.
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5.2.3.2 BOX-PCR
Nas análises de BOX-PCR foram avaliados fragmentos de 220 à 3.000 pb. Os
resultados obtidos com alguns isolados estão ilustrados na (Figura 8).
16
M
1
M
2
3
4
5
6
7
M
8
9
10
11 12
13 14
M
2.000 pb
300 pb
Figura 8: Produtos da amplificação do DNA de isolados de M. anisopliae
utilizando-se o iniciador BOX A1R. (M) marcador de peso molecular 100 pb
(Fermentas), (1) IBCB 668, (2) IBCB 669, (3) IBCB 685, (4) IBCB 700, (5)
IBCB 701, (6) IBCB 702, (7) IBCB 713, (8) IBCB 717, (9) IBCB 725, (10)
IBCB 726, (11) IBCB 761, (12) IBCB 729, (13) IBCB 789 e (14) IBCB 811.
O dendrograma obtido a partir das análises dos padrões de fingerprinting revelou
também a formação de dois grupos (I e II) com similaridade de aproximadamente 13% entre
si, sendo que o grupo I alocou apenas quatro isolados (IBCB 713, 717, 726 e 725) obtidos
de áreas aplicadas das Usinas São João e Santo Antonio. Ainda que obtidos de áreas
aplicadas, esses quatro isolados mostraram-se geneticamente bem distintos dos demais
provenientes das mesmas áreas, apresentando diferenças nos fragmentos de DNA acima
de 500 pb.
O grupo II ficou subdividido em “a” e “b”, onde os isolados IBCB 825 e IBCB 827
provenientes da Usina São João representaram o subgrupo “b”, enquanto que o subgrupo
“a” se constituiu dos isolados restantes, incluindo dez isolados oriundos de áreas aplicadas,
entre eles o isolado IBCB 425. Como observado nas análises de REP-PCR, dez isolados de
áreas aplicadas formaram um grupo distinto com 100% de similaridade. Cabe salientar que
nos grupamentos de isolados provenientes de áreas não aplicadas foram incluídos dois
isolados de áreas aplicadas (IBCB 695 e 789) (Figura 9).
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Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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0,00
0,25
0,50
0,75
a
aa
IIII
bb
b
I II
32
1,00
IBCB 425 – Padrão (+)
IBCB 698 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 669 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 685 – U sina Guarani, Olímpia, SP (+)
IBCB 700 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 811 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 729 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 761 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 702 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 701 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 655 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 643 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 646 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 647 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 650 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 654 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 658 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 639 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 695 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 697 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 815 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 644 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 645 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 640 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 659 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 660 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 662 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 665 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 667 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 703 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 722 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 789 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 718 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 756 – U.S.A., Serãozinho, SP (-)
IBCB 724 – U.S.A., Sertãozinho SP (-)
IBCB 812 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 704 – U.S.A., Sertãozinho SP (-)
IBCB 705 – U.S.A., Sertãozinho SP (-)
IBCB 720 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 810 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 737 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 825 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 827 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 713 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 717 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 726 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 725 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
Figura 9: Dendrograma gerado de acordo com os perfis de amplificação de 47 isolados de M. anisopliae utilizando-se os iniciadores BOX A1R, baseado
no método UPGMA e coeficiente de Jaccard. Onde (+) áreas aplicadas; (-) áreas não aplicadas.
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5.2.3.3 ERIC-PCR
Nas análises de ERIC-PCR foram avaliados fragmentos de 50 a 2.800 pb
e os resultados obtidos com alguns isolados estão ilustrados na (Figura 10).
M
1
2
3
4
5
6
M
7 8
9
10 11 12 M 13 14 15 16 M
2.000 pb
300 pb
Figura 10: Produtos da amplificação do DNA de isolados de M. anisopliae
utilizando-se os iniciadores ERIC1R-I e ERIC2. (M) marcador de peso
molecular 100 pb (Fermentas), (1) IBCB 425, (2) IBCB 640, (3) IBCB 643,
(4) IBCB 647, (5) IBCB 650, (6) IBCB 654, (7) IBCB 704, (8) IBCB 705, (9)
IBCB 718, (10) IBCB 720, (11) IBCB 724, (12) IBCB 737, (13) IBCB 756,
(14) IBCB 810, (15) IBCB 825 e (16) IBCB 827.
Nessas análises o dendrograma revelou a formação de dois grupos I e II, sendo que
o grupo I ficou representado apenas pelo isolado IBCB 726. O grupo II ficou dividido em
subgrupos “a” e “b”, sendo que nesse subgrupo foram inclusos quatro isolados oriundos das
Usinas Guarani, São João e Santo Antonio, todos de áreas aplicadas. No subgrupo “a”
verificou-se que a grande maioria dos isolados oriundos da Usina São João, formaram um
grupo distinto dos isolados provenientes da Usina Santo Antonio, todos de áreas não
aplicadas. Esse subgrupo também alocou outros 11 isolados de áreas aplicadas dentre eles,
o isolado IBCB 425 que agrupou com os isolados IBCB 698, 669, 685, 761, 811 e 729
também de áreas aplicadas com 100% de similaridade entre si. Os isolados IBCB 700, 702
e 701 também de áreas aplicadas formaram outro grupo do mesmo modo com 100% de
similaridade entre si. Os dois grupos apontados apresentam aproximadamente 87% de
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Análise da Diversidade Morfológica e Genética de M. anisopliae e Avaliação da Virulência em D. saccharalis.
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similaridade. O isolado IBCB 695, proveniente da Usina Guarani, ficou em um grupo distinto
entre os isolados de áreas não aplicadas das usinas São João e Santo Antonio. Com
relação aos isolados de áreas não aplicadas, dos 20 isolados pertencentes à Usina São
João, 16 deles ficaram alocados no mesmo grupo (Figura 10).
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0,00
0,25
0,50
0,75
35
1,00
IBCB 425 – Padão (+)
IBCB 698 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 669 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 685 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 761 - U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 811 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 729 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 700 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 702 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 701 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 639 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 640 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 643 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 646 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 647 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 650 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 655 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 697 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 827 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 810 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 644 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 645 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 654 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 658 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 812 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 815 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 695 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 718 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 724 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 756 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 659 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 825 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 660 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 662 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 737 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 665 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 722 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 720 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 667 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 705 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 704 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 703 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 789 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 713 – U.S.J., Araras (+)
IBCB 725 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 717 – U.S.J., Araras (+)
IBCB 726 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
a
II
III
a
b
b
I
Figura 11: Dendrograma gerado de acordo com os perfis de amplificação de 47 isolados de M. anisopliae utilizando-se os iniciadores ERIC1R-I e
ERIC2-I, baseado no método UPGMA e coeficiente de Jaccard. Onde (+) áreas aplicadas; (-) áreas não aplicadas.
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5.2.3.4 Análise por rep-PCR
Utilizando-se em conjunto as matrizes resultantes das análises de REP, BOX e
ERIC, foi construído um dendrograma que possibilitou uma análise geral do polimorfismo
entre os isolados testados. Nesta análise combinada, foram avaliados fragmentos de 50 a
2.800 pb.
O dendrograma obtido revelou a formação de dois grupos (I e II) com similaridade
aproximada de 18% entre si. O grupo II ficou subdividido em “a” e “b”. O subgrupo “b” ficou
representado apenas pelo isolado IBCB 789 de área onde ocorreu aplicação do isolado
IBCB 425, oriundo da Usina Guarani, e o subgrupo “a” englobou à maior parte dos isolados,
sendo 11 isolados de áreas aplicadas e 31 isolados de áreas não aplicadas. Com relação
aos isolados de áreas aplicadas, eles ficaram agrupados em dois diferentes grupos com
similaridade entre si de aproximadamente 97%, em um subgrupo ficaram os isolados
IBCB 425, 668, 669, 815, 761, 811 e 729 oriundos das três diferentes usinas e
apresentaram 100% de similaridade entre si, já no outro subgrupo ficaram alocados os
isolados IBCB 700, 701 e 702 oriundos da Usina Santo Antonio. Como verificado nos
dendrogramas individuais o isolado IBCB 695 ficou em um braço distinto e entre os isolados
de outras usinas de áreas não aplicadas. Com relação aos isolados de áreas não aplicadas
foi observada aproximadamente 49% de similaridade, sendo que os isolados ficaram
subdivididos em grupos de acordo com a sua origem (Figura 12).
O grupo I, subdividido em “a” e “b”, alocou quatro isolados de áreas aplicadas, porém
diferentes entre si e apenas 25% de similaridade com o grupo do isolado IBCB 425 utilizado
para aplicações nas áreas. No subgrupo “a” ficaram incluídos os isolados IBCB 713 e 717
obtidos da Usina São João e IBCB 726 obtido da Usina Santo Antonio todos com
similaridade entre si de aproximadamente 57%, e no grupo “b” ficou composto pelo isolado
IBCB 725 oriundo também da Usina Santo Antonio.
Treze isolados pertencentes a Usina São João apresentaram valores de
aproximadamente 66% com o grupo que incluiu o isolado IBCB 425. Esse resultado pode
ser explicado de acordo Miranda (2011) que relata que esses isolados foram coletados de
uma área próxima de um talhão onde ocorre a aplicação do isolado IBCB 425 por cerca de
10 anos até a presente data. Desse modo ao longo desses anos pode ter ocorrido a
disseminação de inóculos fúngicos de uma área para outra, seja através de agentes
disseminadores, como por insetos contaminados, maquinário ou até mesmo o homem ou,
ainda, por fatores abióticos como chuva e ventos.
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0,00
0,25
II
I
I
0,50
37
0,75
1,00
IBCB 425 – Padrão (+)
IBCB 698 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 669 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 685 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 761 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 811 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 729 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 700 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 701 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 702 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 639 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 658 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 640 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 643 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 646 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 647 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 650 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 644 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 645 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 854 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 697 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 655 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 815 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 695 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 718 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 724 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 756 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 812 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 827 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 825 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 810 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 659 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 660 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 662 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 665 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 667 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 703 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 704 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 705 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 720 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 722 – U.S.J., Araras, SP (-)
IBCB 737 – U.S.A., Sertãozinho, SP (-)
IBCB 789 – U.G., Olímpia, SP (+)
IBCB 713 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 717 – U.S.J., Araras, SP (+)
IBCB 726 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
IBCB 725 – U.S.A., Sertãozinho, SP (+)
a
I
b
I
Figura 12: Dendrograma gerado em conjunto das matrizes dos iniciadores de REP1R - I e REP2 - I, BOX AR1, ERIC1R e ERIC2 baseado no
método UPGMA e coeficiente de Jaccard. Onde (+) áreas aplicadas; (-) áreas não aplicadas.
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Conforme relatado por Miranda (2011) deve-se levar em consideração o tipo de solo
existente na área sem aplicação do isolado. Trata-se de um latossolo vermelho, um solo
evoluído, rico em argilo-minerais, e com maiores índices de matéria orgânica, fator relevante
para o acréscimo de depósitos de M. anisopliae. Já o solo encontrado na área com
aplicação, um cambissolo, é menos desenvolvido, pouco profundo portador de horizonte B
incipiente e com elevados teores de silte e cascalho (SIBCS, 2012), o que confirma os
resultados dos estudos realizados por Lanza, Monteiro e Malheiros (2004), que observaram
que a sobrevivência desse fungo foi favorecida em solos que apresentaram textura arenoargilosa e elevada porcentagem de matéria-orgânica. Ainda, esses dados também são
corroborados por Oliveira, Chaves e Loures (1981) que observaram que o fungo M.
anisopliae sobrevive melhor em solos com maiores teores de matéria-orgânica, podendo
permanecer por períodos de até 90 dias a uma taxa de infestação de 1,41x10 6
conídios/grama de solo.
Com relação os isolados pertencentes à Usina Santo Antonio, esses se
apresentaram mais distribuídos confirmando os relatos de Miranda (2011), que verificou que
tanto os isolados de área com aplicação do IBCB 425 quanto os de área sem aplicação
eram provenientes de um latossolo vermelho, solo favorável à ocorrência de reservas
naturais de M. anisopliae. Além disso, a área sem aplicação pode ser mais favorável por
tratar-se de uma área de produção orgânica de cana-de-açúcar, que apresenta inúmeras
vantagens pelo sistema (MIRANDA, 2011).
Em estudos realizados por Miranda (2011) na Usina Guarani, não foram encontrados
isolados de ocorrência natural em áreas não aplicadas, pois nessas áreas ocorreu a
utilização de inseticidas químicos para o controle de insetos praga. No presente estudo, de
cinco isolados provenientes da Usina Guarani na área onde ocorreu a aplicação artificial do
isolado IBCB425, foram encontrados dois isolados (IBCB 695 e IBCB 789) que mostraram
perfis genéticos distintos do isolado padrão.
Para a diferenciação de isolados de Metarhizium anisopliae tem sido empregadas
técnicas baseadas em RFLP (PIPE et al., 1995; LEAL et al., 1997) e RAPD-PCR (LEAL et
al., 1994; TIGANO-MILANI; GOMES; SOBRAL, 1995). Contudo, a técnica de PCR-RAPD
apresenta algumas limitações, entre elas a suscetibilidade à contaminação (interferência)
por DNA não alvo, além de que a mesma só pode ser realizada de modo seguro com o DNA
de culturas puras (LEAL et al., 1997; THOMSEN; JENSEN, 2002).
Por outro lado, análises filogenéticas, baseadas no sequenciamento da região ITS,
possibilitaram
uma
identificação
mais
precisa
de
grupos
de
variedades
desse
entomopatógeno (CURRAN et al., 1994). Driver, Milner, Trueman (2000) reavaliaram a
taxonomia de Metarhizium spp. baseando-se em análises dessas sequências e moldes de
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RAPD e encontraram um alto nível de diversidade genética entre os isolados, observando
novas variedades dentro do gênero Metarhizium spp. Assim, dez grupos distintos foram
nitidamente reconhecidos, incluindo duas novas variedades de M. anisopliae: M. anisopliae
var. lepidiotum e M. anisopliae var. acridume, e duas novas variedades de M. flavoviride: M.
flavoviride var. novazealandicum e M. flavoviride var. Pemphigum.
Está técnica também foi utilizada para diferenciar espécies, variedades e isolados do
gênero Hirsutella (STRONGMAN; MACKAY, 1993; MOZES-KOCH et al., 1995), assim como
para diferenciar isolados em espécies do gênero Zoophtora (HODGE et al., 1995).
Miranda (2011) realizou o sequenciamento da região ITS de treze desses isolados e
não conseguiu chegar a uma diferenciação desses e do isolado fúngico IBCB425, pois as
sequências apresentavam elevada porcentagem de similaridade entre si, caracterizando
todos como M. anisopliae var. anisopliae.
No presente trabalho, a técnica de rep-PCR foi utilizada pela primeira vez em fungos
entomopatogênicos e as técnicas de REP, BOX ou ERIC-PCR aplicadas individualmente,
assim como a análise combinada de rep-PCR possibilitou observar que existe diferença
interespecífica nos 47 isolados analisados, além observar que ocorre desenvolvimento de
outros isolados em áreas onde ocorre a aplicação do isolado IBCB 425.
No entanto, provavelmente os resultados de diversidade genética seriam mais
expressivos com uma seleção de isolados de origem e hospedeiros mais diversificados, pois
como verificamos em todos os dendrogramas (Figuras 7, 9, 11 e 12) o fungo M. anisopliae
encontra-se amplamente distribuído no solo das áreas consideradas, porém com baixo nível
de polimorfismo e como relata Tigano-Milani et al., (1995) o genótipo de um isolado parece
estar mais relacionado com o hospedeiro do que com o local de origem geográfica porque o
solo apresenta muitos isolados de M. anisopliae com grande variedade genética em uma
área específica.
Este também pode ser comprovado por Fungaro et al., (1996) que realizaram um
estudo com M. anisopliae var. anisopliae e demonstraram com a metodologia de RAPD que
a diversidade entre os isolados de Deois flavopicta é inferior comparado a isolados
provenientes de solo, indicando que existe relação de especificidade entre hospedeiros.
Resultados semelhantes foi observado por Fegan et al., (1993) trabalhando com M.
anisopliae var. anisopliae,
flavoviridae e M. anisopliae e
Bidochka et al., (1994) trabalhando com isolados de M.
Cravanzola et al., (1997) com Beauveria bassiana. E ainda
assegurando esses resultados Vargas et al., (2003) caracterizando isolados de Nomurea
rileyi observaram alta homologia entre os isolados testados provenientes de locais distintos.
Shoabi, F., Jin, F. L. e Ren S. X., (2011) utilizaram as técnicas de SSR e ITS-rDNA
para avaliar a prevalência e a variabilidade genética do fungo entomopatogênico M.
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anisopliae var. anisopliae em quatro países asiáticos e um país europeu e obtiveram baixa
variação entre os mesmos, com a distância máxima de 34% entre eles. A razão para a
esses resultados é desconhecida, mas acredita-se que esteja relacionada com condições
climáticas desfavoráveis, fatores bióticos e abióticos.
Para Fegan et al. (1993) as características morfológicas empregadas na taxonomia
de M. anisopliae var. anisopliae falham na definição de um grupo geneticamente uniforme e
que isolados com genomas exibindo mais de 70% de dissimilaridade têm sido incluídos na
mesma subespécie.
A explicação para isso seria o modo de reprodução de M. anisopliae, pois a
incompatibilidade somática pode prevenir a formação de heterocários estáveis entre
isolados que diferem significativamente em seus genótipos, favorecendo a existência de
clones isolados reprodutivamente (COBB; CLARKSON, 1993). Isso porque fungos
assexuais geralmente possuem menor diversidade quando comparados aos microrganismos
que se reproduzem sexuadamente por causa da ausência de recombinação genética, porém
a ampla distribuição geográfica e alta gama de hospedeiros dos fungos anamorficos, sugere
que existe alta variabilidade genética nessas espécies (CASTRILLO; BROOKS, 1998).
5.3. Ensaio de virulência
O isolado IBCB 695 mostrou-se mais virulento provocando a morte de 50% da
população de lagartas, seguido dos isolados IBCB 725 (50,25%), IBCB 717 (40,50%), IBCB
726 (40,00%), IBCB 425 e IBCB 658 (30,75%), IBCB 685 (30,50%), IBCB 729 (30,25%),
IBCB 724 (20,50%), IBCB 655 (10,75%), IBCB 810 (10,75%) e por último o isolado IBCB
698 (10,50%) (Tabela 3).
Ressalta-se que os dois isolados que apresentaram maior mortalidade de lagartas
(IBCB 695 e IBCB 725) são provenientes de locais diferentes, além de permaneceram em
grupos distintos em todas as análises de rep-PCR (Figuras 7, 9, 11 e 12). Contudo, não foi
possível observar maiores relações entre as análises de rep-PCR e os demais isolados
avaliados no bioensaio.
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Tabela 3: Mortalidade de lagartas de Diatraea saccharalis após a aplicação do fungo
entomopatogênico Metarhizium anisopliae.
Tratamento
Mortalidade (%)
Desvio Padrão
Erro Padrão
Testemunha
2,50 b
5,00
2,50
IBCB 425
37,50 a
17,07
8,53
IBCB 655
17,50 a
9,57
4,78
IBCB 658
37,50 ab
33,04
16,52
IBCB 685
35,00 ab
12,90
6,45
IBCB 695
55,00 ab
36,96
18,48
IBCB 698
15,00 ab
12,90
6,45
IBCB 717
45,00 ab
30,00
15,00
IBCB 724
25,00 ab
17,32
8,66
IBCB 725
52,50 ab
9,57
4,78
IBCB 726
40,00 ab
8,16
4,08
IBCB 729
32,50 ab
5,00
2,50
IBCB 810
17,50 ab
17,07
8,53
Teste F
2,56*
CV (%)
5,37
Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem pelo teste de Tukey a 5% (p<0,05).
Valores originais, mas análise estatística realizada com dados transformados em Log x + 10.
*Significativo a 5% de probabilidade.
Vargas e colaboradores, (2003) caracterizando isolados de Nomuraea riley
provenientes de locais e hospedeiros distintos, observaram alta homologia entre os isolados
testados sugerindo que não existe relação entre parâmetros de virulência e análise de
RAPD. O mesmo também foi observado por Tigano-Milani e colaboradores (1995) para
Paecilomyces fumosoroseus e Driver, Milner, Trueman (2000) para fungos M. anisopliae, M.
flavoviridae e M. album.
A variação da mortalidade pode ser observada com frequência em bioensaios de
seleção e pode estar associada a fatores como patogenicidade, virulência, especificidade,
tolerância do hospedeiro, entre outros (ALVES, 1998).
As testemunhas apresentaram mortalidade de 2,50% (Figura 13). A mortalidade pelo
fungo pôde ser confirmada pelo exame dos insetos contaminados que foram mantidos em
câmara úmida após a morte (Figura 14). O isolado IBCB 695 foi o mais virulento e as
lagartas por ele colonizadas foram as que apresentaram visualmente maior esporulação
(Figura 15). De acordo com estudo realizado por Macedo (2005), em alguns insetos pode-se
notar a interferência do fungo no processo de ecdise, que também pudemos observar nesse
bioensaio.
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Figura 13: Testemunha de D. saccharalis não colonizada por
M. anisopliae.
Figura 14: Lagartas de D. saccharalis mortas por ataque de diferentes isolados de
M. anisopliae. (A) IBCB 725 e (B) IBCB 425.
Figura 15: Lagarta de D. saccharalis morta com o isolado de
M. anisopliae IBCB 695.
Variações fenotípicas como alterações na patogenicidade e caracterizações
morfológicas foram observadas em isolados de M. anisopliae associados a M. fimbriolata,
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essas foram demonstradas com a variabilidade genética apresentada por RAPD
(MACEDO, 2005).
Ainda de acordo com Macedo (2005), esse polimorfismo genético pode ser explicado
por acúmulos de mutações ou simplesmente pelo modo de reprodução do fungo. E esse
polimorfismo genético, permite ao fungo adaptar-se e sobreviver em um meio heterogênio, e
mesmo que a maioria dos isolados testados sejam oriundos do mesmo hospedeiro, em
parte da sua vida o fungo permanece no solo, na forma de esporos e provavelmente
compete com outros microrganismos para sua sobrevivência quando a população de insetos
é baixa.
Por isso, antes do desenvolvimento de um produto microbiano é importante efetuar
bioensaios para a seleção de isolados e avaliar a relação de patogenicidade e virulência dos
mesmos (ALVES, 1998).
Embora existam relatos na literatura de que o fungo entomopatógeno Beauveria
bassiana é mais eficiente no controle de lagartas de D. saccharalis, o conhecimento da
eficiência de meios alternativos ao uso de C. flavipes é de grande importância para alcançar
o sucesso do controle biológico nos canaviais brasileiros, contribuindo para a
sustentabilidade da agricultura em nosso país.
Os resultados apresentados na tabela 3, também foram expressos em forma de
gráfico para melhor visualização e compreensão (Figura 16).
A
A
AB
AB
AB
AB
AB
AB
AB
AB
AB
AB
B
Figura 16: Mortalidade de lagartas de Diatraea saccharalis após a aplicação
do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae. Dados originais, porém
transformados em Log x+10 para análise estatística.
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey a
5% de probabilidade.
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6. CONCLUSÃO
 As características morfológicas observadas, assim como a amplificação por primers
específicos confirmaram que todos os isolados estudados pertencem à espécie M.
anisopliae var. anisopliae.
 A técnica de rep-PCR permite analisar a diversidade genética de M. anisopliae var.
anisopliae.
 O isolado IBCB 695 é mais virulento para Diatraea saccharalis que o padrão
IBCB 425.
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