DETECÇÃO DO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ATRAVÉS DA
TÉCNICA DE PCR NA URINA E SANGUE DE PACIENTES
MENORES DE 15 ANOS COM TUBERCULOSE PAUCIBACILAR
Luciana de Almeida Lima1 ; Haiana Charifker Schindler2
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Estudante do Curso de Medicina-CCS – UFPE; E-mail: [email protected],
Docente/pesquisador do Depto Materno Infantil – CCS – UFPE. E-mail: [email protected]
Sumário: Este trabalho tem como propósito realizar um estudo com pacientes portadores
de tuberculose paucibacilar, a qual impõe problemas de diagnóstico, avaliando técnicas
moleculares baseadas no sistema de PCR em amostras de sangue e urina, e compará-los
com os critérios clínicos utilizados de rotina pelos médicos assistentes dos serviços de
saúde. De um total de 45 indivíduos analisados e classificados como suspeitos de
tuberculose, 36 foram selecionados para este estudo. Destes, 21 foram diagnosticados
como portadores da doença, dos quais 61,9% obtiveram resultado positivo pela técnica de
PCR. Entre os 15 indivíduos saudáveis, o método mostrou-se 100% específico. A forma
extrapulmonar da tuberculose foi responsável pelo maior número de casos; entretanto não
houve um predomínio significativo desta quanto à positividade do método em relação à
forma pulmonar. Através desse estudo, espera-se que a análise dessas alternativas
diagnósticas contribua para diminuir processos invasivos e tratamentos inadequados, no
manuseio da tuberculose e aumente a possibilidade de detecção precoce da doença, além
de ser factível sua implantação nas instituições de referência de serviços de saúde do SUS.
Palavras–chave: diagnóstico; Mycobacterium tuberculosis; PCR
INTRODUÇÃO
A Tuberculose (TB) ainda permanece como uma das infecções mais devastadoras e
difundidas do mundo, sendo assim considerada um sério problema de saúde pública. A
reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica molecular cuja escolha do DNA alvo
e definição dos primers dentro da seqüência do DNA são fatores determinantes na sua
acuidade. Ela vem sendo utilizada como alternativa de alta sensibilidade e especificidade
para o diagnóstico rápido de doenças infecciosas. Entretanto, a sua aplicação na detecção
do Mycobacterium tuberculosis tem apresentado resultados variáveis, principalmente em
relação à sensibilidade do teste.( Ogusku, M., et al., 2004). O diagnóstico também vem
avançando através da utilização de ferramentas moleculares. Recentemente, vem sendo
desenvolvidos métodos sensíveis e rápidos para a detecção do
Mycobacterium
tuberculosis em amostras clínicas, baseados na amplificação do DNA do bacilo, utilizando
a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) (Benneds en et al., 1996, Chang et al., 1996,
Folgueira et al., 1996, Hance et al., 1989, Pierre et al., 1990). Dois dos alvos preferidos
têm sido o rDNA e a seqüência de inserção IS6110. Teoricamente, a detecção de
micobactérias em amostras biológicas de naturezas variadas pode ser obtida em 24 horas
com sensibilidade de uma cópia de DNA alvo em uma única célula bacteriana (Weeks et
al., 1994). Esse estudo pretende (através da análise de novas alternativas diagnósticas)
contribuir para a modificação do perfil diagnóstico da tuberculose na criança e formas
paucibacilares da doença, para a detecção de focos endêmicos recentes e de pacientes
primoinfectados, atuando, assim, na transmissão e no controle da tuberculose.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram selecionados pacientes de ambos os sexos, sem restrição de idade, com suspeita de
tuberculose e provenientes de ambulatórios e enfermarias de hospitais de Pernambuco. O
estudo foi desenvolvido em Recife nos seguintes hospitais escolas: Hospital das Clínicas
da Universidade Federal de Pernambuco (HC-UFPE), Instituto Materno-Infantil Professor
Fernando Figueira (IMIP) e Hospital Barão de Lucena (HBL/SUS). Foram coletadas
amostras de sangue venoso periférico e urina dos pacientes com suspeita de TB.O
diagnóstico de tuberculose (infecção/doença) será efetuado, de forma cega e independente,
por um dos pesquisadores e pelo médico assistente dos serviços de saúde que tenha
“expertise” em pneumologia adulta/infantil. Os critérios para o diagnóstico foram baseados
na história clínica, epidemiológica e exames laboratoriais de rotina (teste tuberculínico de
Mantoux, RX de tórax, baciloscopia e cultura quando possíveis). Os pacientes foram
divididos em 3 grupos: O primeiro, TB infecção, sem manifestações clínicas e radiológicas
da doença, exames bacteriológicos negativos, teste tuberculínico positivo e história de
contato com portador de tuberculose bacilífera; o segundo, TB doença (controle positivo),
apresentam quadro clínico e/ou radiológico compatível com tuberculose ativa e isolamento
do M. tuberculosis em amostra clínica, através de exame direto e/ou cultura, ou melhora
clínica evidente após tratamento; finalmente o terceiro, sem TB (controle negativo),
ausência de história de contágio com adulto tuberculoso, de manifestações clínicas e de
achados laboratoriais compatíveis com TB, com presença de cicatriz vacinal de BCG. Os
pacientes ou responsáveis incluídos no estudo responderam a um questionário
padronizado, após consentimento do mesmo. As informações clínicas e epidemiológicas
foram registradas neste formulário. A análise do mesmo é feita por estudo duplo cego. O
projeto foi aprovado pela Comissão de Ética do Centro de Pesquisas Aggeu MagalhãesFIOCRUZ, Recife-PE.
RESULTADOS
Neste estudo foram analisados, um total de 45 pacientes provenientes dos hospitais
participantes da pesquisa. Destes, 9 foram excluídos (amostras biológicas inaplicáveis e/ou
ausentes para análise laboratorial, falta de dados clínicos, não retorno do paciente ao
serviço) restando 36 pacientes. Quanto à faixa etária, considerando os menores de 15 anos,
a maioria tinha menos de 10 anos (com ênfase na faixa menor que 5 anos). A maior parte
deles proveio das enfermarias dos hospitais envolvidos na pesquisa. Quanto ao diagnóstico
clínico dos 36 pacientes estudados, 22,22% eram portadores da forma pulmonar da doença,
não havendo predomínio do tipo de TB extrapulmonar. Dos 36 indivíduos quanto a
existência ou não de tuberculose, 21 foram diagnosticados clinicamente como
tuberculosos. Entre estes, observou-se um predomínio da tuberculose extrapulmonar. A
PCR foi realizada em amostras de sangue e urina, de uma forma geral; outros fluidos
corporais foram testados em alguns pacientes (líquor, líquido pleural, líquido ascítico)
dependendo da forma clínica apresentada. Obteve-se 33,3% de positividade da técnica
quando se considerou, isoladamente, o sangue e 19% a urina. Entre os pacientes com
tuberculose, houve um predomínio (61,9%) da tuberculose extrapulmonar em relação à
forma pulmonar da doença. Já ao se analisar os resultados da PCR em ambas as amostras
(sangue e urina), pode-se observar que não houve um predomínio significativo quanto à
positividade do método em relação às formas de TB pulmonar e extrapulmonar. Dentro do
grupo controle, a PCR foi negativa em 73,3% dos 15 indivíduos saudáveis.
DISCUSSÃO
Neste estudo, dos 36 pacientes com suspeita da doença, 21 obtiveram o diagnóstico clínico
de tuberculose pelo médico assistente. Os 15 restantes, que tiveram a doença descartada
pelo especialista (negativos para tuberculose), funcionaram como grupo controle. No
primeiro grupo (21 pacientes com a doença), o método molecular foi positivo nas amostras
de 13 indivíduos. Pôde-se verificar que as amostras sanguíneas mostraram-se mais
sensíveis ao método que as de urina (de um mesmo indivíduo), demonstrando que a
amostra de sangue deve ser mais bem investigada como uma alternativa à realização da
PCR e a importância de se realizar a PCR em diferentes espécimes biológicas do paciente
para se obter uma maior positividade do teste. A negatividade da técnica nos 8 indivíduos
restantes deste grupo (38,1% dos tuberculosos), demonstra que o método não é de todo
sensível. Dentro do grupo controle, a PCR foi negativa em 73,3% dos 15 indivíduos
saudáveis, o que denota uma especificidade de 100% do método. Neste mesmo grupo (que
deu entrada na pesquisa como TB suspeita, mas que a doença foi descartada pelo médico
assistente) a PCR foi positiva em 26,7%. Este achado sugere que o padrão-ouro utilizado
para confirmação de TB doença – baseado em critérios clínicos, epidemiológicos e
resposta positiva do paciente ao tratamento específico – por conter muitos dados
subjetivos, pode ser considerado falho. Constatou-se, portanto, que a técnica isoladamente
apresentou uma alta especificidade e relativa sensibilidade. Todavia, como as crianças
além de apresentarem a forma paucibacilar da doença têm dificuldade para expectorar,
acreditamos ser importante dar continuidade a esta pesquisa. Para a obtenção do
desempenho dos sistemas desenvolvidos, faz-se necessário a validação, com uma
casuística maior, em diferentes espécimes biológicos de pacientes com suspeita de TB para
uma melhor compreensão da real efetividade da técnica de PCR como ferramenta auxiliar
no diagnóstico precoce da tuberculose paucibacilar.
CONCLUSÕES
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é a mais promissora técnica para o diagnóstico
rápido da tuberculose. Não se acredita que a PCR possa substituir ou superar plenamente
as ferramentas diagnósticas atualmente disponíveis para a confirmação da tuberculose. O
benefício deste estudo será o desenvolvimento e aprimoração de técnicas mais sensíveis e
específicas que possam ser adequadas à realidade do nosso sistema público de saúde, e a
padronização de critérios mais eficazes que irão beneficiar o diagnóstico e tratamento
precoces da tuberculose, sobretudo, nas crianças e adolescentes que vivem em países
pobres, permitindo também a identificação mais rápida dos focos de transmissão.
AGRADECIMENTOS
À Propesq, PDTIS/FIOCRUZ, ao Aggeu Magalhães/FIOCRUZ e à equipe da pesquisa e
colaboração dos hospitais participantes.
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