Ácido Ribonucleico
RNA
AAAAAA
cap 5’UTR
“open reading frame”
coding region
3’UTR
Definição de gene: um conceito indefinido
Gene: unidade de transcrição, que consiste de um segmento de
DNA que se estende do sítio de início de transcrição ao sítio de
término de transcrição. O promotor deveria ser incluído?
Nem todos os genes codificam proteínas. Muitos genes têm RNA
como produto final.
Organismos simples como bactérias têm cerca de 500 genes
Humanos: cerca de 25.000 genes
Sítios de início de transcrição alternativos, splicing alternativo,
poliadenilação alterantiva e edição de mRNAs aumentam muito o
número de diferentes proteínas originadas desses genes.
Ácido Ribonucleico
• Para que os genes se expressem, eles devem ser transcritos
em moléculas de RNA
• O RNA é uma réplica (com poucas diferenças) da fita de DNA
complementar à fita que serve de molde
• O processo de síntese de RNA é denominado TRANSCRIÇÃO
do DNA
• A escolha dos genes a serem transcritos e como são
transcritos e processados é o que determina todo o processo
vital
ESTRUTURA DO RNA
• Fita única de Ácido Ribonucleico
• As unidades monoméricas são constituídas de:
• Uma base: Adenina, Citosina, Guanina e URACILA
• Um açúcar: RIBOSE
• Um grupo fosfato
Pirimidinas do RNA
Pirimidinas do DNA
Nucleosídeos do RNA
Estrutura secundária do RNA
RNA-POLIMERASES
POLIMERIZAÇÃO: 5’ 3’
• Para a atividade de síntese de RNA:
– Precisam de uma região promotora no DNA
– Requerem uma fita de DNA molde
– Precisam de rNTPs
– Não requerem “primer”
– Não têm atividade de exonuclease
( não fazem “proofreading”)
RNA polimerase
começa a síntese de
um RNA a partir de
nucleotídeos livres do
meio.
Não precisa de
“primer”
Promotor:
Essencial para a montagem do complexo transcricional em procarioto
Promotor é o local do DNA onde se monta o complexo que irá iniciar a transcrição
Figure 7-35 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
No promotor existem
sequências consensuais
que são sítios de
reconhecimento para
fatores de transcrição
(elementos cis)
Promotor em procarioto:
No operador pode se ligar um regulador
σ
RNA Polimerase
de procarioto
requer o fator
sigma para
começar a
transcrição
Figure 6-11 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Em bactérias, o RNA pode se estender por 105 pb.
A RNA polimerase tem que sintetizá-lo de uma só vez.
Múltiplos RNAs sendo transcritos em um gene de bactéria
Os ribossomos já se juntam ao RNA para síntese da
proteína mesmo antes do término da transcrição
O que define qual fita do DNA será molde para síntese do RNA é a
localização do promotor
O término de transcrição em
procarioto requer a formação de
uma estrutura secundária na
extremidade 3’ do RNA que
desestabiliza a RNA polimerase
Término de transcrição
RNA de procariotos não têm intros e são policistrônicos
Cistron: a sequência de nucleotídeos que codifica um único peptídeo
Em eucariotos três tipos de RNA-polimerases
• RNA - Polimerase I: rRNA (ribossômico)
• RNA - Polimerase II: mRNA (mensageiro)
• RNA - Polimerase III: tRNA e outros RNAs pequenos
(transferência)
RNA polimerase II – RNA mensageiro
Promotor
a
b
5’
3’
c
intron
d
e
f
g
exon
3’
5’
h
Gene c
Fita molde
Trancrição – RNA pol II
5’
5’
Pré-mRNA do gene c
Processamento
AAAAAAA
mRNA maduro
• Os pré-mRNA de eucariotos podem ter desde algumas
centenas até centenas de milhares de nucleotídeos.
• Os mRNA maduros variam entre algumas dezenas de
nucleotídeos até pouco mais de 10.000 nucleotídeos.
• Os RNAs são moléculas pequenas, comparados ao DNA
PROMOTOR essencial (core promoter)
• Mínimo necessário para a montagem do complexo
de pré-iniciação (PIC) e à transcrição basal
- 40
+1
+ 40
Arcabouço para montagem do PIC (sequência de nts bastante variável)
PIC
RNA polimerase II
+
Transcription factors II (TFII)
TFIIA
TFIIB
TFIID
TFIIE
TFIIH
Total: ~ 3,5 MDa
Elementos regulatórios comuns no promotor de eucariotos
Figure 6-17
DPE: típico de promotores sem TATA box
INR e TATA têm efeito sinérgico
INR
pode Science
funcionar
Molecular Biology of the Cell
(© Garland
2008) sem TATA
Algumas sequências são inovações específicas da linhagem
Lenhard B et al Nature 13:233, 2012
BRE: factor B recognition factor
DPE: downstream promoter element
MTE: motive ten element
TBP(TFIID)
TFIIB
DCE: downstream core element
TFIID
TFIIB
TFIID/TAF6-TAF9
TFIID/TAF1
• Promotor proximal:
Entre -45 e -250 pares de base na região flaqueadora 5’ do gene (5’FS)
• Reguladores positivos (enhancers) e “reguladores negativos” (inhibitors)
estendendo-se por milhares de pares de bases
• Isoladores: englobando regiões maiores
• TSS: transcription start
site
• TFBS: tanscription
factor binding sites
• CRM: Cis Regulatory
Module
Tipo I
Promotores com TATA-box têm sítio de início de transcrição
bem definido. Correspondem a 10-12% dos genes, e são
genes regulados.
Tipo II
Promotores com ilhas CpG – estendem por 100-200 nts
Sem TATA-box
Promotores com início de transcrição disperso
Genes de expressão constitutiva (79-88% dos genes)
Promotores ricos em sequências consensuais para Sp1
Montagem dos fatores gerais de
transcrição observada in vitro
TATA binding protein: TBP - Uma subunidade do TFIID
TBP induz uma dobra no DNA
O mediador é um complexo com 26 subunidades (1,2 MDa)
Um complexo que permite a interação de vários fatores
(scafolding)
O mediador também pode ser incluído como um fator geral de transcrição
Montagem dos fatores gerais de transcrição
• O mediador é recrutado precemente na montagem do PIC
• Mediador recruta a acetilase p300.
• P-300 acetila todos os alvos e de dissocia do promotor
• A montagem do PIC continua
Fatores gerais de transcrição:
TFIID (com TATA biding protein – TBP e TAFs),
TFII A, - B, -D, -E, -F e –H
Mediator
SAGA
TF
TFIID
Ac A
TBP
Ac
B
F
Ac
Ac
E
PIC = Pré-Iniciation Complex
Complexo remodelador
Mediador: MD1-26
Mediador pode funcionar como ativador ou inibidor
MD1/MID14: interagem com receptores nucleares (p/ horm. tireoide; glicocorticoides ...)
O subcomplexo MD12-MD13-Ciclina C- Cdk8: impede o recrutamento da RNA pol II
• TFIIB e TFIIF são necessários para o recrutamento da RNA Pol II
• TFIIE junta-se após Pol II
• TFIIE recruta TFIIH e modula sua atividade de helicase e cinase
NC2
Mediator
TFIID
TF
TBP
TF
Mot1
B
RNA Pol II
F
E
Ac
Ac
H
PIC pronto para dar a largada
Início ineficiente: pequenos segmentos de RNA com 3 a 4 nts
RNA polimerase II está desfosforilada ao juntar-se ao PIC
Início da fosforilação de serinas (Ser5) na cauda C-terminal da Pol II
Perda de afinidade pelos FGT
RNA com 9 nts  aumento da estabilidade
DSIF: DRB-Sensitive Inducing Factor
NELF: Negative Elongator Factor
5,6-Dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB): inibidor da fase de alongamento da pol II
P-TEFb (Positive Trancription Elongation Factor b) cinase
P-TEFb: heterodímero Cck9/Ciclina T  fosforila Serinas da posição 2 (Ser2)
P-TEFb: fosforila NELF e este se desprende da Pol II
P-TEFb: fosforila DSIF que troca sua interação com alguns fatores, como
enzimas do CAP, pela interação com outros moduladores que alteram a
estrutura da cromatina e com enzimas do splicing
Atuam ainda na regulação da transcrição de genes:
- Locus control regions: LCR
Estes elementos regulatórios regulam uma região cromossômica
inteira, por ex.: Locus gênico da beta-globina, no qual existem 5 genes,
numa extensão de 90 kb.
-“Boundary elements” ou isoladores:
Funcionam como delimitadores da região de um grupo de genes, de
modo a prevenir a interferência de elementos regulatórios vizinhos
Processamento do pré-mRNA:
1) adição do CAP
CAP é adicionado quando o transcrito atinge ~30 nts. Este é o momento em que a
extremidade 5’ emerge da RNA Pol II
O complexo enzimático liga-se à cauda C-terminal da Pol II fosforilada em Ser5
Complexo enzimático do CAP
•Fosfatase: remove o fosfato g do
nucleotídeo trifosfato inicial
•Guanilil transferase: transfere GMP numa
ligação 5’ – 5’
•Metil transferase: adiciona metil à
guanosina
CBC: Cap Binding Complex
Importante para:
• Proteger a extremidade 5’
• Interagir com outras proteínas
que processam o RNA
• Exportação do núcleo para o
citoplasma
• Tradução pelos ribossomos
CBC
Processamento do pré-mRNA:
2) Remoção dos introns (poda ou “splicing”)
A porção codificante do pré-RNA de eucariotos é fragmentado por
sequências intervenientes, que se interpõem entre os exons: os INTRONS
As porções expressas são os EXONS
Os introns são bem maiores que os exons.
Os intros não têm armação de leitura aberta. São cheios de códigos de
parada (stop condons)
Cerca de 95% dos genes apresentam splicing alternativo
UTR = untranslated region
Maquinaria de splicing
Spliceosome:
• 5 small nuclear RNAs – snRNAs: U1, U2, U4/U5 e U6
• Os snRNAs + proteínas que a eles se associam – snRNPs
(small nuclear ribonucleoproteínas)
Outros fatores:
•Fatores protéicos de splicing: U2AF, SF1, SRFs e outras enzimas
(helicases/RNPases, cinase, fosfatases etc)
•Proteínas que se ligam ao RNA – RBPs
U2AF: U2 Auxiliary Factor
SF1: splicing factor 1
SRFs: Splicing regulator factos
Y = pirimidina (C/T/U)
R = purina (A/G)
A reação de corte consiste em duas reações de transesterificação
1) U2AF liga-se ao trato
polipirimidina e 3’ SS
BBP/SF1 liga-se ao branch point
2) U1-snRNP liga-se ao 5’ SS e
U2-snRNP liga-se ao branch
point
3) Juntam-se ao complexo
U4/U6.U5 formando
spliceosome maduro
4) Forma-se o laço (lariat) e ocorre
a clivagem da extremidade 5’do
intron
SS = splicing site
Cerca de 200
proteínas são
envolvidas
nesse processo
As demais informações necessárias para o splicing correto estão contidas
dentro de sequencias relativamente pequenas (~6 nts) localizadas dentro de
exons e introns (elementos cis), às quais se ligam proteínas (elementos trans)
• ESEs (exonic splicing enhancers)
• ESSs (exonic splicing silencers)
• ISEs (intronic splicing enhancers)
• ISSs (intronic splicing silencers)
Splicing alternativo: processo regulado pelas interações entre RBPs e pré-mRNA
RBP = RNA binding proteins
Muitas destas proteínas interagem com a cauda C-terminal da Pol II
A ação combinada de fatores da maquinaria basal de splicing +
fatores auxiliares resulta na modulação do splicing alternativo
O comprometimento com o splicing ocorre durante a transcrição
O corte pode ocorrer depois, embora seja comum que ocorra durante a transcrição
Nova1/2: Neuro-oncological ventral antigen – específico de tecido neural. Binding site: cluster of YCAY
Fox-1 family (Fox) proteins: [Fox-1 (A2BP1), Fox-2 (Rbm9) and Fox-3 (NeuN)]. Binding site: UGCAUG
PTB: Polypyrimidine binding proteins
Efeitos silenciadores
Witter JT e Ule J. Trends in genetics, 2011
T-cells intracellular antigen 1 (TIA1)
Efeitos ativadores
Witter JT e Ule J. Trends in genetics, 2011
RNABPs: RNA binding proteins
(podem ser regulados por mecanismos pós-tradução, como fosforilação)
Inclusão do exon 2
Exclusão do exon 2
Fatores reguladores com
expressão tecido específica
Estrutura da cromatina e modificações epigenéticas de histonas
Modulam o processo de splicing
Nucleossomos
Intron
Exon
Intron
Pseudo-exon
Intron
Depletado de nucleossomos
Nucleossomos estão mais concentrados na junções intron/exon
Auxiliam na marcação dos exons
Marcas da cromatina nos exons:
Maior número de: H3K36me3, H3K4me3 e H3K27me2
Depleção de: H3K9me3
Diferentes marcas da cromatina interagem com diferentes adaptadores
Exemplos de adaptadores da cromatina que interagem com fatores de splicing
Modelo de modificação em histonas interferindo com o processo de splicing
PTB: polypyrimidine tract binding protein
“Splicing” alternativos do gene da a-tropomiosina.
Após o corte, as junções exon-exon são marcadas com um complexo protéico:
Exon-Junction-Complex: EJC
Stop
Exon 1
exon 2
intron
Stop
SKAR
EJC
5'
MAGOH
PYM
Y14
eIF4AIII
AAAA 3'
Processamento do pré-Mrna:
3) Clivagem e poliadenilação
Todos os mRNAs têm cauda Poli-A, com exceção dos mRNAs de histonas
Elementos no mRNA (cis) importantes para a maturação da extremidade 3’
10 a 30 nts
Upstream
Sequence
Element
(auxiliar)
Sinal de
poliadenilação
PAS
~30
nts
Auxiliar
Downstream
Sequence
Element
Downstream
Sequence
Element
Sítio de
clivagem
Elementos principais
PAS: presente em 95% dos mRNAs; 70% (AAUAAA) e 15% (AUUAAA)
DSE: YGUGUUYY (Y = pirimidina) ou UUUUU
USE: UUUU ou UGUA ou UAUA
Na ausência de PAS é necessário USE - UGUA
Complexos protéicos essenciais para a maturação da extremidade 3’
CPSF: cleavage and polyadenylation specific factor
CstF: cleavage stimulation factor
CFI: cleavage factor I
CFII: cleavage factor II
Participam também da maquinaria básica ....
PAP: poly-A polymerase
PABP: poly-A binding protein
Symplekin: proteína “andaime”
RNA Pol II: domínio C terminal, fosforilado em Ser2
RNA Polimerase II
Cap
mRNA
Após a clivagem, a RNA Pol II continua transcrevendo por
algumas centenas de nucleotídeos ...
A extremidade 5’ sem CAP sofre clivagem pela exonuclease Xm2
Quando a velocidade da Xm2 se iguala a velocidade da Pol II, esse
resto mRNA se desprende, o desprendimento da Pol II ocorre em seguida
Cerca de 50% dos genes apresentam poliadenilação alternativa
APA: alternative polyadenylation
Stop pA3
Stop
pA2
pA1
m7G
pA1
m7G
AAAAAAAAAAA
siRNA
pA2
m7G
AAAAAAAAAAA
UTR-APA: untranslated alternative polyadenilation
Codificam a
mesma proteína
Mesma proteína, com RNAs com estabilidades diferentes
3’ UTR mais curtos são mais eficientemente transcritos
Stop pA3
Stop
pA2
pA1
m7G
pA1
m7G
pA3
m7G
AAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAA
CR-APA: coding region alternative polyadenilation
Codificam proteínas
distintas
10 a 30 nts
Upstream
Sequence
Element
(auxiliar)
Sinal de
poliadenilação
PAS
~30
nts
Auxiliar
Downstream
Sequence
Element
Downstream
Sequence
Element
Sítio de
clivagem
Elementos principais
PAS canônicos + DSE  maior afinidade pela maquinaria basal de PA
PAS não canônicos em geral à montante do mais favorecido
Aumento do nível de expressão de fatores basais de PA (CPSF160 e Cst64)
Favorece a utilização do sítio menos favorecido (não canônico)
Donny D. Licatalosi and Robert B. Darnell
Nature Genetics 10:75, 2010
Processamentos distintos do mRNA
propicia uma grande variedade de
mRNAs e proteínas sem aumento
do tamanho do genoma.
Todos os passos da biogênese do
mRNA involve rigoroso controle de
qualidade para detectar possíveis
erros.
Os reprovados, assim como introns,
são degradados no núcleo
(exsossoma)
Edição de mRNA pós-transcrição – RNA guia (gRNA):
Remoção ou adição de nucleotídeos para aquisição
do “frame” correto de leitura.
Edição de RNA do gene coxII de tripanossoma
Edição de mRNA do gene da apolipoproteína B humana
Introdução de stop codon por deaminação de uma citosina
que resulta em uracila (CAA  UAA)
mRNA + proteínas = mRNP (messenger ribonucleoprotein)
m7G
AAAAAAAAAAA
CAP binding complex
PolyA binding protein
Exon junction complex
Exportação do mRNP do núcleo para o citoplasma
Última fase nuclear do mRNA
Figure 6-40 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Síntese de RNAs ribossomais (rRNA)
rRNAs: 75% da massa de RNA das células
Genes de rRNA: múltiplas cópias no genoma
• Humanos: ~200 cópias no genoma haplóide (cromossomos 13, 14, 15. 21 e 22)
A biogênese dos ribossomos requer a participação da três RNA-polimerases:
Pol I – rRNA 37S que da origem a rRNAs 18S, 5,8S e 28S
Pol II – mRNAs das proteínas que compõem o ribossomo
Pol III – rRNA 5S
A síntese ocorre nos nucléolos, para onde se estendem
as alças dos cromossomos com genes de rRNA ativos
Nucléolo
Genes de rRNA sendo transcritos
Figure 6-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Espaçadores não transcritos
Organização estrutural dos clusters de genes rRNA
Promotor
A transcrição é feita pela RNA polimerase I
Figure 6-42 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-63 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
RNAs de transferência – tRNAs e outros RNAs pequenos
• Várias cópias dos genes distintos que codificam tRNAs em
humanos, espalhados no genoma
• tRNAs maduros: 74 a 95 nts
• Transcritos pela RNA polimerase III:
Pol III transcreve genes menores de 400 nts
tRNAs, rRNA 5S, U6 snRNA, Alu RNA, RNAs envolvidos no
processamento dos tRNAS e outros RNA pequenos
RNA Pol III utiliza três tipos de promotores:
Promotor do tipo I: para rRNA 5S
+1
ICR
+120
TTTTTT
A IE C
box box
Promotor
ICR: Internal Control Region
Promotor tipo I
Fatores gerais de transcrição: RNA Pol III, TFIIIA, TFIIIB e TFIIIC
Promotor do tipo II: em genes de tRNAs
+1
+80
TTTTTT
A
B
box
box
Promotor
A-box e B-box, além de funcionarem como promotores, também
codificam as alças D e T dos tRNAs
Promotor tipo II
Fatores gerais de transcrição: RNA Pol III, TFIIIB e TFIIIC
Promotor do tipo III, dos genes:
• U6 snRNA  componente do spliceosome
• 7SK  envolvido na regulação do complexo Cdk9/Ciclina T do complexo pTEFb
• H1-RNA  componente da RNase P, envolvida no processamento dos tRNAs
• MRP-RNA  envolvido no processamento do pré-rRNA de
mitocôndrias
16 nts
-215 a -240
+1
+106
TTTTT
DSE
PSE
TATA
box
Promotor tipo III
Fatores gerais de transcrição: RNA Pol III, TFIIIB e SNAPc
(snRNA activating protein complex)
Maturação dos tRNAs
1) Remoção da extremidade 5’ pela RNase P
Rnase P: RNA H1 + 10 subunidades protéicas
2) Remoção da extremidade 3’pela ação de endo e exonucleases
3) Adição de CCA na extremidade 3’ pela ação da tRNA
nucleotidil transferase
4) Remoção dos introns pela ação de uma endonuclease
Que remove os introns e de uma ligase que liga os exons
5) Numerosas modificações em vários nucleotídeos do tRNA
Figure 6-55 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 6-52 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Extração de moléculas de RNA no laboratório
Uma célula típica de mamíferos contém ~10-5 mg de RNA
• 80 a 85% RNA ribossomal (28S, 18S, 5.8S e 5S).
• 15-20% consiste de uma variedade de RNAs de baixo peso
molecular: RNAs de transferência e pequenos RNAs
nucleares com funções diversas.
• 1 a 5% consiste de RNAs mensageiros de tamanho
heterogêneo. A maioria destes tem cauda poliA.
RNA: Uma Molécula INSTÁVEL
• O grupo 2’OH da ribose e o
fato de ser fita única torna o
RNA facilmente degradável
• As ribonucleases que degradam
o RNA são enzimas muito
estáveis e que não precisam de
cofatores
• Ribonucleases estão
amplamente presentes no meio
ambiente
Material e soluções livres de RNases
• LUVAS: absolutamente indispensável;
trocar luvas com frequência
• Tubos, pipetas volumétricas, ponteiras, pipetadores ... livres de
RNases
• Limpeza de superfícies para retirada de RNases:
H2O2 3%: tratar pentes, bandejas e cubas de eletroforese
etc
20 a 30 minutos em H2O2; em seguida lavar muito com
água livre de RNases
NaOH 0,5 N + SDS 0,5%: limpar as superfícies e depois
Água e soluções sem RNases:
• ÁGUA: tratar com Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) – 0,05%
Agitar levemente por algumas horas ou vigorosamente por 30
min.
Autoclavar por 30 min e deixar no autoclave após término do
ciclo por mais 30 min.
DEPC tem que ser removido pois modifica a propriedades do
RNA
inviabilizando sua utilização posterior.
(DEPC  CO2 + etanol)
• Químicos sólidos: pesar usando espátula RNase-FREE
• Soluções: tratar com DEPC 0,05%
Soluções que não devem ser autoclavadas:
- SDS
- NP-40
- NaOH
Preparar essas soluções com água já livre de RNAses
Para remover RNases, pode-se também filtrar a solução em
membrana de nitrocelulose (0,22 mm), por duas vezes.
Observação:
Não trate cubas, bandejas e pentes com DEPC.
Para extração de RNA:
• Fragmentos de tecidos podem ser armazenados em “RNA later” até o
momento do processamento ou congelados em Nitrogênio líquido.
• Lisar as células ou homogeneizar o tecido em solução com agente
desnaturante (agente caotrópico).
Os mais indicados: guanidinium hydrochloride (G.HCl) ou guanidinium
thiocyanate (GTC).
• Os demais passos incluem extração com fenol/clorofórmio para remover
proteínas, seguida de precipitação com isopropanol ou etanol.
Fenol oxida-se facilmente.
Cuidado com fenol oxidado!!!
Isso compromete seriamente a qualidade do RNA
• São também agentes desnaturantes:
- SDS ou lauryl sulfate
- N-laurylsarcosine (similar a SDS mas solúvel em solução
com
alta concentração de sal)
• Tampão de lise mais leve, para preservar separadamente RNA
citoplasmático e de núcleo ou mitocôndrias:
- NP-40
tudo no
e adicionar
inibidores
de RNases
à
ApósFazer
separação
dasgelo
frações,
prosseguir
a extração
com GTC
e/oupreparação
fenol e clorofórmio
Extração com GTC:
1) 106 células – 100 uL solução D - (TECIDO: 1 mg por 100 uL)
• Solução D:
4 M GTC; 25 mM citrato de sódio, pH 7,0;
0,5% Sarcosyl; 100 mM 2-mercaptoetanol
2 – Para cada 1 mL de solução D:
0,1 mL 2 M acetato de sódio, pH 5,2
1 mL fenol saturado com água (pH 4,0)
0,2 mL clorofórmio:ácool isoamil (49:1)
Agitação vigorosa e gelo por 15 min
Centrifugue a 4oC por 5 min para separar as fases
3 – Transfira o sobrenadante contendo RNA para outro tubo e
adicione 0,75 volume de isopropanol gelado. Incube a –20oC
por 1 h e centrifugue a 10.000 g a 4oC por 20 minutos
- Redissolva o pellet em 300 uL de solução D e transfira para
tubo de 1,7 mL
- Adicione 0,75 volume de isopropanol gelado e incube a –20oC
por 1 h
- Centrifugue a 10.000 g a 4oC por 10 min. Descarte o
sobrenadante.
- Lave o pellet com etanol 70% (500 uL) por 3 a 4 vezes
- Seque em ar ambiente e dissolva o pellet no menor volume
possível de tampão TE ou água previamente tratada com DEPC.
Freezer –80oC
Caso a quantidade de RNA seja muito pequena, é recomendável
adicionar um carreador para auxiliar a precipitação:
- Acrilamida linear
- tRNA de levedura
- Glicogênio
Fundamental para o sucesso da purificação de RNA: RAPIDEZ!
RNases devem ser inativadas imediamente após a coleta
do tecido ou células
Verificação da integridade em gel de agarose
28 S
18 S
Integridade do RNA
íntegro
degradado
Diferença na migração eletroforética
Diferentes concentrações de sal na amostra
RNA não completamente dissolvido:
Contaminação com DNA genômico:
Quantificação em espectrofotômetro:
[RNA] ug/mL = A260 x diluição x 40
A260 = absorbância (em densidade óptica) a 260 nm
40 = coeficiente médio de extinção do RNA
A solução na qual é medida a absorbância deve pH entre 7,5 e 8.5
(TE ou tampão fosfato)
A diluição deve ser tal que A260 não seja menor que 0,1
Contaminação com outras moléculas:
Proteínas
Medir a absorbância a 280 nm
Razão A260/A280 = 2,0 é o ideal para RNA
< 2,0 – Refazer extração com fenol/clorofórmio
Guanidinium ou beta-mercaptoetanol
Medir a absorbância a 230 nm
Razão A260/A230: maior que 2 e menor 2,4
> 2,4: guanidinium ou BME em excesso
Precipitar novamente em acetato de sódio e etanol e
lavar
bem com etanol 70%
Purificação de
mRNA a partir de
RNA total
Purificação de mRNA com esferas magnéticas