INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Paleogenética de populações pré-colombianas da Bolívia: Análises
do mtDNA humano, e infecções por Trypanosoma cruzi e vírus
linfotrópico das células T humanas (HTLV).
Nancy Carolina Orellana Halkyer
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo
Cruz, para a obtenção do grau de Mestre em
Biologia Parasitária
Orientadora
Dra. Ana Carolina Paulo Vicente,
Laboratório de Genética Molecular de Microrganismos IOC-FIOCRUZ
Março de 2008
i
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Título:
Paleogenética de populações pré-colombianas da Bolívia: Análises do mtDNA humano, e
infecções por Trypanosoma cruzi e vírus linfotrópico das células T humanas (HTLV).
Autor:
Nancy Carolina Orellana Halkyer
Orientador:
Dra. Ana Carolina Paulo Vicente
Aprovada em: _____/_____/_____ pela banca examinadora:
Dr. Adauto Araújo - Presidente
Dr. Adeilton Brandão
Dr. Antonio Vallinoto
Rio de Janeiro,
ii
de
de 2008
A Deus e aos meus pais.
iii
Agradecimentos
A Deus e a minha família antes de tudo, pelo amor, força, apoio incondicional.
Ao Dennis pela companhia, amor e compreensão.
Ao programa PEC-PG convênio Brasil/Bolívia e à CNPq, pela oportunidade que me deu de
ter estudado no Brasil.
A Fundação Oswaldo pela oportunidade de ser parte de uma instituição de tanto prestigio e de
excelente nível acadêmico.
A Dra. Ana Carolina Paulo Vicente e a Dra. Ana Jansen por compartilhar seus conhecimentos
e ter aberto as portas de seus laboratórios para que eu aprendesse.
Ao Dr. Luis Fernando Ferreira e Dr. Adauto Araújo muito obrigada pela sua ajuda, sua força,
seus conhecimentos, sua amizade e o contagiante amor pela paleoparasitologia e por acreditar
nos alunos.
A Dra. Sheila Mendoça por sua amizade, por compartilhar seus conhecimentos e por seu
profisionalismo, pessoa admirável.
A Rosa pela ajuda no trabalho.
A todas as amigas do laboratório de Biologia Molecular de Microorganismos por seu apoio e
amizade.
Aos meus queridos amigos: Juliana, Alexandre, Fernanda, Daniela, Cristiane, Rosa de Fátima;
as amizades colombianas, Gabicita, Cristina, Dona Aparecida, Marta e dona Cíntia por terem
sido mais que amigos a minha família aqui no Rio de Janeiro.
Muito obrigada a todos aqueles que foram parte desta etapa profissional na minha vida.
iv
Lista de abreviaturas:
aC
Antes de Cristo
AP
Antes do presente
AD
Ano Domini
aDNA ancient DNA
dC
Depois de Cristo
dNTP
Deoxinucleotídeo trifosfato
EDTA
Ácido Etilenodiaminotetracetico
HVS-I
Hipervariable Segment I
IPTG
Isopropyl ß-D-1- thiogalactopyranoside
Kb
Kilobases
kDNA DNA do kinetoplasto
LGMM Laboratório de Genética Molecular de Microorganismos
LTR
Long terminal repeats
MgCl2
Cloreto de Magnésio
m
Metros
ma
milhões de anos
mm
milímetro
mtDNA mitocondrial DNA
NaOCl
Hipoclorito de Sódio
nm
Nanometros
nt
nucleotídeos
pb
Pares de bases
PCR
Polymerase Chain Reaction
pC
Pré-colombiana
PM
Marcador de Peso
PRF
Projeto de reconstrução facial (código do museu)
v
PAAK
Abreviatura do museu referente a amostra da pirâmide de Akapana
PAGE
Gel poliacrilamida
rpm
Revoluções por minuto
SDS
Sodium dodecyl sulfate
SSC
Saline-Sodium Citrate (solução citrate salina)
TCI
Trypanosoma cruzi I
TCII
Trypanosoma cruzi II
UV
Radiação ultra violeta
[α – 32P] Fósforo radioativo-partícula alfa
µl
Microlitro
14
carbono 14
C
vi
Índice de Figuras e Tabelas
Página
Figura 1.1- DNA mitocondrial, localização da região D-loop e região dos polimorfismos nos
segmentos hipervariáveis (HVI)._________________________________________3
Figura 1.2- Mapa da expansão demográfica dos haplogrupos. _____________________5
Figura 1.3-Prováveis vias para a dispersão da infecção pelo HTLV até América._____ 11
Figura 1.4-Estrutura genômica do HTLV.____________________________________ 12
Figura 1.5-Estrutura genética do HTLV. _____________________________________13
Figura 1.6-O parasito Trypanosoma cruzi.____________________________________14
Figura 1.7-Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi._____________________________15
Figura 1.8-Organização esquemática do rDNA do Trypanosoma cruzi______________19
Figura 1.9-O locus do Miniexon apresenta unidades repetidas e esta organizada em
tandem________________________________________________________________20
Figura 1.10 -Minicirculos do kDNA de T. cruzi._______________________________ 20
Figura 3.1-Foto de uma das Múmias pré-hispânicas de Cochabamba e as Múmias hispânicas
de Chuquisaca incluídas no estudo. ________________________________25
Figura 3.2-Mapa da Bolívia com os 9 Departamentos___________________________26
Figura 3.3-Cronologia de algumas das principais culturas do Altiplano e Vale da
Bolívia._______________________________________________________________ 27
Figura 3.4- Mapa de Cochabamba, com as províncias. Inclui provincia Ayopaya, Mizque,
Campero e Carrasco, onde foram encontradas algumas das múmias deste estudo_____ 30
Figura 3.5-foto satélite do centro de Tiwanaku no departamento de La Paz._________ 34
Figura 3.6-Capital de Tiwanaku- La Paz, Bolívia.______________________________34
Figura 3.7-Coleta das amostras.____________________________________________ 36
Figura 4.1-Visualização em PAGE 8% da integridade do aDNA total de algumas das
amostras.______________________________________________________________46
Figura 4.2–Visualização em PAGE 8% de produtos amplificados das amostras de
Tiwanaku._____________________________________________________________ 47
vii
Figura 4.3 – Amplicons dos clones obtidos de mtDNA de algumas das amostras de Tiwanaku,
Chuquisaca e Cochabamba Visualizados em Agarose 3%._______________ 48
Figura 4.4-Alinhamento da região HVS-1 de amostras de Chuquisaca, Cochabamba e
Tiwanaku. _____________________________________________________________49
Figura 4.5 – Haplótipo da múmia colonial C-01do museu de Chuquisaca, alinhado com uma
seqüência do genebank.______________________________________________ 52
Figura 4.6 - haplotipo da múmia colonial C-02 do museu de Chuquisaca, alinhado com uma
seqüência do genebank._______________________________________________52
Figura 4.7 - haplotipo da múmia pré-hispânica 1590 do museu de Tiwanaku, alinhado com
uma seqüência do genebank.___________________________________________53
Figura 4.8–Visualização em PAGE 8% de produtos amplificados da amostra 1590 de
Tiwanaku._____________________________________________________________ 53
Figura 4.9 – Visualização em gel agarose 3%, amplicons obtidos das amostras 1590 e 1710 do
segmento tax de HTLV ___________________________________________ 54
Figura 4.10 - Amplicons de clones do segmento tax HTLV de clones das amostras 1590
(Tiwanaku) e 1710 (Chuquisaca) (fragmentos de 220pb). _______________________ 54
Figura 4.11 – Seqüência de HTLV-2 da múmia pré-colombiana 1590 do museu de Tiwanaku
mostra uma diferença (T) em relação a uma seqüência de HTLV-2 (C) do
genebank._____________________________________________________________ 55
Figura 4.12 – Seqüência de HTLV-1 da múmia pré-colombiana 1710 do museu de
Chuquisaca mostra uma diferença (C) em relação a uma seqüência de HTLV-1 (G) do
genebank._____________________________________________________________ 56
Figura 4.13–Alinhamento das seqüências obtidas dos clones da amostra 1590 HTLV-2 com
seqüências depositadas no GeneBank. ___________________________________57
Figura 4.14- Alinhamento das seqüências obtidas da amostra 1710 HTLV-1 comparada com
seqüências depositadas no GeneBank____________________________________57
Figura 4.15–Visualização em PAGE 8% de produtos amplificados das amostras de 1590
(Tiwanaku) e IC (Chuquisaca)._____________________________________________58
Figura 4.16–Visualização em agarose 3% dos clones amplificados das amostras de IC
(Chuquisaca).__________________________________________________________ 57
Figura 4.17 - Membrana de nylon mostrando os sinais positivos das diferentes amostras. Foi
usado um kDNA como controle positivo nas hibridações para T. cruzi.__________59
viii
Figura 4.18-Membrana de nylon mostrando os sinais positivos das diferentes amostras 1590 e
1710 e os controle positivo LTR+pX de HTLV-1 e HTLV-2 nas hibridações para HTLV.
_______________________________________________________________60
Figura 4.19-Membrana de nylon mostrando sinal positivo da amostra 1590 e do controle
positivo LTR+pX HTLV-2 na hibridação para HTLV-2_________________________61
Tabela 1.1- Distribuição do HTLV-1 e HTLV-2 nos ameríndios mediante métodos
moleculares e a identificação por sorologia de anticorpos para HTLV-1/2 nos
Ameríndios._____________________________________________________________9
Tabela 3.1 - Informação das múmias do museu de Cochabamba, referente à procedência,
idade, sexo e tipo de amostras utilizadas para nosso estudo. A datação aproximada das
múmias de Cochabamba: 1200- 800 anos ____________________________________31
Tabela 3.2- Informação das múmias do museu de Chuquisaca referente à procedência, idade,
sexo e tipo de amostras utilizadas para nosso estudo. A datação aproximada das múmias de
Chuquisaca:1200- 800 anos _____________________________________ 32
Tabela 3.3 - Informação das múmias do museu Tiwanaku, La Paz referente à procedência,
idade, sexo e tipo de amostras utilizadas para nosso estudo. A datação aproximada das
múmias de Tiwanaku: 3600-900 anos aproximadamente ___________ 35
Tabela 3.4-Iniciadores utilizados nas reações de PCR.__________________________ 39
Tabela 4.1 - Quantificação dos aDNAs extraídos das múmias de Cochabamba, Tiwanaku e
Chuquisaca. Dados sobre a concentração e pureza de ácidos núcleicos (absorbância 260/280)
e as amplificações obtidas da região HVS-I humana nos diferentes tecidos. _ 45
Tabela 4.2-Posições nucleotídicas dos polimorfismos que determinam no fragmento de 188
pb aos haplogrupos Ameríndios A, B, C e D. ______________________________50
Tabela
4.3-Resumo
dos
haplogrupos
encontrados
em
Tiwanaku,
Chuquisca
Cochabamba.___________________________________________________________51
Índice
Introdução_____________________________________________________________1
1.1 - Primeiras migrações humanas da América________________________________ 2
ix
e
1.2 - O DNA mitocondrial e os haplogrupos___________________________________ 2
1.3 - Os haplogrupos durante a expansão demográfica.___________________________4
1.4 - Variabilidade Genética no continente Americano.__________________________ 6
1.5 - Paleodemografia e a Paleoparasitoses ___________________________________ 7
1.6 - O Vírus Linfotrópico das Células-T Humanas (HTLV)______________________7
1.6.1 - Distribuição do HTLV entre ameríndios________________________________ 9
1.6.2 – Transmissão_____________________________________________________ 10
1.6.3 - Hipótese do seu espalhamento_______________________________________ 10
1.6.4 - Estrutura genômica do HTLV e seus produtos protéicos___________________12
1. 7 – A Tripanossomíase Americana _______________________________________14
1.7.1 - Ciclo Biológico___________________________________________________14
1.7.4 - Vias de Transmissão _______________________________________________17
1.7.5 - Fases da Doença de Chagas e a sintomatologia associada__________________ 18
1.7.6 - O genoma do Trypanosoma cruzi_____________________________________19
1.7.7 - Diversidade Genética do T. cruzi_____________________________________ 20
Objetivos_____________________________________________________________ 22
2.1 - Objetivo Geral_____________________________________________________ 23
2.2 - Objetivos específicos________________________________________________ 23
Materiais e métodos____________________________________________________ 24
3.1 – Material de estudo__________________________________________________25
3.1.1 - Natureza das amostras______________________________________________25
3.1.2 - Cronologia e datação das amostras ___________________________________ 26
3.1.3 - Descrição das culturas pré-hispânicas e sítios arqueológicos da Bolívia_______28
3.1.4 - Coleta das amostras_______________________________________________ 36
3.2 - Extração do DNA __________________________________________________36
3.3 – Quantificações do aDNA no espectrofotômetro Nanodrop, Uniscience ND-1000_37
3.4 - Alvos analisados___________________________________________________ 38
x
3.5 - Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ________________________________ 38
3.5.1 - PCR Reconstrutiva________________________________________________38
3.5.2 - PCR Humano ___________________________________________________ 40
3.5.3 - PCR para T. cruzi_________________________________________________40
3.5.4 - PCR para HTLV _________________________________________________40
3.6 – Clonagem ________________________________________________________40
3.7 - Purificação dos produtos de PCR______________________________________40
3.8 - Extração do plasmídeo ______________________________________________41
3.9 – Determinação das seqüências nucleotídicas ______________________________41
3.10 – Hibridação de DNA com sondas de DNA marcadas radioativamente ________ 41
3.10.1 – Dot Blot ______________________________________________________ 41
3.10.2 - Sondas moleculares utilizadas ______________________________________42
3.10.3 - Southern Blot ___________________________________________________42
3.11 - Soluções e meios de cultura. _________________________________________43
Resultados ____________________________________________________________44
4.1 – Extrações de aDNA ________________________________________________ 45
4.1.1 - Quantificações espectrofotométricas __________________________________45
4.1.2 - Amplificações da região mitocondrial D-loop humana HVS-I (188 pb) ______ 47
4.1.3 - Alinhamento completo das seqüências obtidas das múmias pré-hispânicas de
Tiwanaku, Chuquisaca e Cochabamba ______________________________________ 49
4.2 – Alvo HTLV ______________________________________________________ 53
4.2.1 - Amplificações do alvo HTLV _______________________________________ 53
4.2.2 - Clones HTLV____________________________________________________54
4.2.3 - Tipagem dos HLTVs ______________________________________________55
4. 3 - Alvo T. cruzi _____________________________________________________ 58
4.3.1 - Amplificações da região conservada dos minicírculos.de T. cruzi do aDNA___58
4.3.2 - Clones de T. cruzi (região conservada dos minicírculos) __________________ 58
4.3.3 – Gene do miniexon _______________________________________________ 58
xi
4.4 - Hibridações dos diferentes alvos ______________________________________ 59
4.4.1 - Hibridações com sonda kDNA de T. cruzi _____________________________ 59
4.4.2 - Hibridação com sonda HTLV-1 e HTLV-2 (pool das regiões pX e LTR de ambos
tipos). _______________________________________________________________ 60
4.4.3 - Hibridação com sonda das regiões pX e LTR do HTLV-2 ________________ 60
4.5 - Southern Blot para o alvo T. cruzi (sonda kDNA de T. cruzi) _______________ 61
Discussão ____________________________________________________________ 62
Conclusões ___________________________________________________________ 71
Bibliografia___________________________________________________________ 73
xii
Resumo
Restos humanos de origem arqueológica podem ser fonte de informação relevante para
o conhecimento da origem de infecções parasitarias. Tivemos a oportunidade de analisar
material de 26 múmias pré-colombianas da Bolívia datadas de 3600-900 anos atrás.
Utilizando o sistema comercial de extração de DNA antigo (GeneClean BIO101) e sob
condições especiais estabelecidas para a manipulação de aDNA (DNA antigo), ossos, dentes e
tecido mole foram processados. O aDNA recuperado por reação de polimerização em cadeia,
utilizando iniciadores específicos para os alvos humano e do vírus HTLV (Human T-cell
Lymphotropic Virus) e do protozoário Trypanossoma cruzi, foi clonado e seqüenciado. Desta
forma, foram identificadas as linhagens genéticas ou haplogrupos de 19 múmias précolombianas, assim como o haplogrupo de três múmias hispânicas do museu de Chuquisaca.
A freqüência das linhagens genéticas foi: haplogrupo B 58% (11/19), haplogrupo A 42%
(7/19) e haplogrupo D na múmia 1590 de Tiwanaku. A presença de aDNA de T. cruzi foi
revelada pela hibridação, com sondas de kDNA do protozoário, em 11/29 múmias (38%).
Três foram de Chuquisaca, quatro de Tiwanaku em La Paz e quatro de Cochabamba. Também
recuperamos aDNA de HTLV e as análises genéticas determinaram a presença de ambos tipos
do vírus: HTLV-1 e HTLV-2 nos indivíduos 1710 (Chuquisaca) e 1590 (Tiwanaku, La Paz)
respectivamente. A recuperação de aDNA de HTLV-2, da múmia pré-colombiana de
Tiwanaku, é a primeira evidencia biológica da presença ancestral deste vírus na América,
apoiando a hipótese da sua introdução no continente junto com os primeiros povoadores há
35000-15000 anos atrás.
xiii
Abstract
Archaeological human remains can be source of important data concerning the origin of
parasite infections. Here we had the opportunity to investigate 26 pre-Columbian mummies
from Bolivia dating 3600-900 years ago. Using the ancient DNA extraction comercial system
(GeneClean BIO101) and, under the special conditions established for aDNA (ancient DNA)
manipulation, bones, teeth and soft tissues samples were processed. The aDNA recovered by
polimerase chain reaction using specific primers to human, HTLV (Human T-cell
Lymphotropic Virus) and the protozoan Trypanossoma cruzi targets were cloned and
sequenced. Therefore, allowing the determination of the genetic lineages or haplogroups of 19
pre-Columbian mummies, as well as the haplogroups of three colonial human remains of
Chuquisaca museum. The genetic lineages frequences were: 58% B haplogroup (11/19), 37%
A haplogroup (7/19) and haplogroup D in 1590 mummy from Tiwanaku, La Paz. The
presence of T. cruzi aDNA was revealed, by hybridization with the protozoan kDNA probe, in
11/29 mummies (38%). Three were of Chuquisaca city, four of Tiwanaku and four of
Cochabamba city. We also recovered aDNA belonging to HTLV and the sequence analysis
determined the presence of the both virus types: HTLV-1 and HTLV-2 in subjects 1710
(Chuquisaca city) and 1590 (Tiwanaku in La Paz) respectively. The recovery of HTLV-2
aDNA, from a pre-Columbian mummy of Tiwanaku, is the first biological evidence of the
ancestral presence of this virus in the Americas supporting the hypothesis of its introduction
in the continent with the first settlers 35000- 15000 years ago.
xiv
1. INTRODUÇÃO
1
1.1 - Primeiras migrações humanas da América
A entrada e dispersão da espécie humana nas Américas tem sido matéria de intenso
debate e várias têm sido as propostas. Classicamente é admitido que o continente americano
fosse habitado inicialmente por populações que chegaram da Ásia, pelo estreito de Bering
aproximadamente 15.000 a 35.000 anos atrás (Hopkins, 1959).
Considera-se também que populações de proto-índios ou paleo-índios tenham migrado
para o continente americano pelas vias trans-pacífica e/ou trans-atlântica, provavelmente no
final da última glaciação (11.000-12.000 anos atrás), envolvendo grupos migratórios como:
australianos, africanos, melanésios e polinésios (Rivet, 1980; Lahr, 1995; Pucciarelli, 2000;
Gomez, 2006).
Provavelmente o povoamento das Américas tenha acontecido através de diversas ondas
migratórias, e que estes povos nômades se dispersaram e se assentaram por todo o continente,
constituindo o que hoje são as populações indígenas americanas (Neves, 1985).
1.2 - O DNA mitocondrial e os haplogrupos
O DNA mitocondrial (mtDNA) é uma molécula circular de aproximadamente 16,5
kilobases de tamanho que contém no seu genoma 37 genes e várias regiões sinalizadoras.
Uma destas regiões, denominado D-loop ou região controladora da replicação do mtDNA,
apresenta três segmentos hipervariáveis: HVS-I (342 pb, localizado nas posições 16.02416.365), HVS-II (268 pb. 73 - 340) e HVS-III (137pb. 438 – 574) (Anderson et al., 1981,
Ingman et al., 2000) (figura 1.1). Na seqüência da região HVS-I é possível identificar
polimorfismos que caracterizam diferentes haplogrupos e definem as linhagens genéticas
humanas. A identificação dos polimorfismos característicos das diversas populações ao redor
do mundo permitiu refinar os estudos para traçar a história evolutiva dos humanos (Lutz et al.,
2000).
Os haplogrupos são uma coleção de haplótipos que compartilham pelo menos uma
variação genética, e são também referidos como linhagens genéticas ou linhagens do mtDNA
(Neel et al., 1994). Os haplogrupos são utilizados como marcadores antropológicos devido às
características do mtDNA: herança estritamente materna, ausência de recombinação e por
apresentar grande quantidade de cópias em uma única célula (Pakendorf & Stoneking, 2005).
2
Figura 1.1 - DNA mitocondrial, localização da região D-loop e região dos polimorfismos nos segmentos
hipervariáveis (HVI). Fonte: www.herkules.oulu.fi; Lutz, 2000.
3
1.3 - Os haplogrupos durante a expansão demográfica.
A distribuição e frequência atual dos haplogrupos nas populações tem contribuído para
a construção da história da expansão geográfica da espécie humana a partir da África. Para
isto, considerou-se um tipo particular de mtDNA de uma mulher como sendo a linhagem
materna ancestral dos humanos modernos (Eva mitocondrial) que teria existido no Leste ou
no Sul da África, há mais de 130 mil anos (Forster et al., 2001; 2004).
Esta primeira mulher da espécie humana (Homo sapiens), provavelmente, viveu em um
ambiente de condições favoráveis que permitiu aumentar a freqüência do seu haplogrupo.
Durante a história humana, alguns descendentes apresentaram variações na seqüência que
determinaram os polimorfismos, que se fixaram no genoma mitocondrial tornando o tipo
inicial cada vez menos comum ou extinto (Forster et al., 2001).
Atualmente, são poucas as linhagens diretamente relacionadas às linhagens ancestrais
africanas, sendo uma delas o haplogrupo L1 restrito atualmente à África e em menor
freqüência (aproximadamente 1 %) na Arábia e no Mediterrâneo. Outras linhagens antigas
descendentes diretas da primeira linhagem são: L1d e L1k que ocorrem somente no Sul da
África; L1c no Centro e Oeste da África (nos pigmeus); L1e e L1f no Leste da África (Watson
et al., 1997).
Este padrão de distribuição geográfica dos haplogrupos sugere uma expansão inicial
através da África, datada aproximadamente de 130 mil anos ou mais (figura 1.2) (Forster,
2004).
4
Figura 1.2 - Mapa da expansão demográfica dos haplogrupos (Fonte: www. worldfamilies.net).
Por volta de 80-60 mil anos atrás houve uma nova expansão que repovoou a África com
os haplogrupos L2 e L3, sendo que os haplogrupos L1 originais diminuiramu, exceto nos
ancestrais de algumas populações do Oeste Africano. Após dispersão na África, os
haplogrupos L2 e L3 participaram da única migração com êxito do homem moderno indo para
fora da África há 80-54mil anos atrás (Forster et al., 2001). É provável que a população que
saiu da África tenha sido muito pequena, posto que só o haplogrupo L3 sobreviveu.
Considera-se que os haplogrupos modernos não africanos sejam descendentes deste
haplogrupo (Oppenheimer, 2003; Lahr & Foley, 1994).
Posteriormente e a partir do haplogrupo L3, surgiram os haplogrupos M e N. Ainda não
está claro se estes haplogrupos surgiram na África justo antes do Êxodo ou se foi depois, no
Leste da Índia (devido à grande diversidade de M nesta região) (Forster et al., 2001).
Estudos mais recentes sugerem que os haplogrupos M e N tenham sido introduzidos por
uma migração ao subcontinente da Índia e ao Sudeste da Ásia, sendo possível também que
uma migração independente ao norte da Índia tivesse introduzido o haplogrupo N (Barnabas
et al., 2005). As evidências arqueológicas da migração do homem moderno desde o Leste da
África até a Índia são compatíveis com a idade da expansão do homem moderno e o tempo de
coalescência do grupo M (Quintana- Murci et al., 1999; Forster, 2004).
5
Kong et al (2003), indica que os primeiros humanos modernos também teriam
carregado até o Sudeste da Ásia o haplogrupo euroasiático R.
Aproximadamente a metade da população do Leste Asiático, incluindo os Siberianos,
apresenta o haplogrupo M. Duas variantes foram reconhecidas como subgrupos do M,
haplogrupos C e D, que posteriormente foram identificados como dois dos haplogrupos
fundadores do Novo Mundo (Quintana- Murci et al., 1999).
1. 4 - Variabilidade Genética no continente Americano.
Schurr et al (1990) foram os primeiros a sugerir que a variabilidade do mtDNA nos
nativos americanos estaria reduzida a quatro haplogrupos fundadores: A, B, C e D.
Posteriormente, o trabalho de Bailliet et al (1994) reconhece nestas linhagens, os
subhaplogrupos A1, A2, C1, C2, D1 e D2, com características de linhagens fundadoras. O
termo mtDNA fundador indica que um tipo de mtDNA entrou numa determinada região, por
exemplo nas Américas, junto com as migrações e o descobrimento de um novo continente,
com condições mais favoráveis que levaram a aumentar a freqüência e sobrevivência desses
tipos de mtDNA nos descendentes (Torroni et al., 1993; Forster et al., 1996; Richards et al.,
2000).
Posteriormente, um quinto haplogrupo denominado X, ausente na Ásia, é identificado
entre os Ameríndios. Os polimorfismos que o caracterizam ocorrem nos Navajos e Ojibwa da
América do Norte (Torroni & Wallace 1995; Scozzari et al., 1997; Brown et al., 1998).
Identificou-se entre os europeus o haplogrupo X, representando 4% do mtDNA nos europeus.
Todas as análises sugerem que o haplogrupo X entre os nativos americanos e os europeus
compartilha um ancestral materno, que teria divergido um do outro há muito tempo atrás
(Brown et al., 1998).
A ancestralidade do haplogrupo X nas Américas pode ser corroborada por sua
identificação em restos humanos pré-coloniais. Foram recuperadas seqüências parciais da
região controladora no mtDNA em vestígios de ameríndios da cultura Oneota de Illinois
River Valley datados de 1300 A.D. Esta região apresentava as assinaturas determinantes do
haplogrupo X, demonstrando a presença deste nas Américas antes da colonização européia
(Stone & Stoneking, 1993; Stone & Stoneking, 1998).
Os haplogrupos A, B, C e D também foram identificados em populações pré-hispânicas
do Chile e Peru, indicando que estes haplogrupos possivelmente em diferentes freqüências
representam os haplogrupos ancestrais dos ameríndios (Lalueza-Fox et al., 2001; Moraga et
al., 2005; Shinoda et al., 2006).
6
1.5 - Paleodemografia e a Paleoparasitologia
A Paleopatologia e a Paleoparasitologia se estabelecem no século XX como as ciências
dedicadas respectivamente ao diagnóstico e interpretação de quadros patológicos em
populações pré-históricas e ao estudo de parasitos encontrados em material arqueológicos ou
paleontológicos, com o objetivo de conhecer a origem e dispersão de parasitos e seus
hospedeiros (Ferrreira,1988).
Ancestralmente, as populações migrantes trouxeram para América novos hospedeiros e
parasitos e passaram a conviver com os parasitos que, até então, circulavam entre os animais
das Américas. Este contato foi se estabelecendo e evoluindo, de acordo com a interação dos
humanos com a natureza e foi neste cenário que surgiram novos parasitos do hospedeiro
humano (Rothhamer, 1985; Araújo & Ferreira, 2000).
Diversos são os trabalhos em paleoparasitologia que determinaram, em material
biológico mumificado, utilizando técnicas imunológicas e moleculares, a presença de
parasitos tais como: Schistosoma haematobium, Plasmodium falciparum, Trichuris trichiura,
Enterobius vermicularis, Ancylostoma duodenale, Trypanosoma cruzi entre outros. Também
trabalhos com alvos humanos como: grupos sanguíneos e mtDNA, que são considerados
marcadores migracionais e cuja informação permitiu inferir sobre a origem de determinadas
populações humanas (Sauca, s/a; Ferreira et al., 1987; Fornacieri et al., 1995; Cerruti et al.,
1999; Guhl et al., 1999; Ferreira et al., 2000; Iñiguez et al., 2003; Orellana, 2004).
Acompanhar o processo evolutivo das infecções parasitárias nas populações ancestrais
em diversos territórios significa recuperar eventos sucedidos no espaço e no tempo da história
humana (Araújo & Ferreira, 2000), podendo auxiliar para a compreensão de sua distribuição
no presente, além de fornecer subsídios para avaliação de fatores de risco da transmissão.
É neste cenário que se insere o presente estudo, que pretende compreender a
distribuição e a antiguidade no continente Americano de duas infecções, causadas pelos
parasitos: vírus linfotrópico das células T humanas (HTLV) e Trypanosoma cruzi nas
populações pré-hispânicas da Bolívia.
7
1. 6 - O Vírus Linfotrópico das Células-T Humanas (HTLV)
O vírus linfotrópico das células T humanas (HTLV) pertence à família Retroviridae
(Coffin 1992) e foi o primeiro oncoretrovirus humano isolado e é classificado em dois tipos:
tipo 1 (HTLV-1) e tipo 2 (HTLV-2). É um vírus caracterizado por sua baixa patogenicidade e
sua alta estabilidade genômica. Os provirus HTLV-1 e HTLV-2 são as versões no homem dos
retrovírus de macacos: STLV-1 e STLV-2 (Salemi et al., 1999).
A infecção por HTLV-1 é classificada em vários subtipos, que possivelmente surgiram
de distintas passagens de STLV-1 do macaco para o homem, em distintas regiões geográficas
(Ásia e África), enquanto que o HTLV-2, com quatro subtipos, parece ter evoluído a partir de
uma única passagem macaco/homem na África (Salemi et al., 1999).
A infecçaõ por HTLV-1 é endêmica (1-5% prevalência) em muitas regiões do mundo:
Japão, Índia, Irã, Caribe, África, América Central e do Sul e também (>1% prevalência),
Oriente Médio Melanésia, Austrália, Estados Unidos, Portugal e França, enquanto que o
HTLV-2 é encontrado principalmente em duas populações: comunidades indígenas da
América do Norte, Central e Sul e usuários de drogas nos EUA, Europa e Ásia (Fujiyoshi et
al., 1999).
A infecção por HTLV-1 está associada ao desenvolvimento de duas doenças: a
paraparesia espástica tropical e a leucemia das células T do adulto. Em relação ao HTLV-2
existem poucos relatos de sua associação a quadros clínicos (Shindo et al., 2002).
8
1.6.1 - Distribuição do HTLV entre Ameríndios
Ameríndios
HTLV-1
HTLV-2
HTLV1/2
Sorologia
- Bolívia
Quechuas
Aymaras
- Argentina
Mataco
Toba
Susques
- Chile
Atacameños
Aymara
Mapuche
Huiliche
Alakalf
Papa Nui
- Brasil
Tyriyos
Mekranoiti
Yanomamí
Galibé
Kayapo
Arara do Laranjal
Kraho
-Peru
Karumas
Wayku
Quéchuas
Aymara
- Colômbia
Chibchas
Tunebo
Wayuu
Palikurs
- Paraguai
Sanapaná
Populações do Chaco Paraguaio
- Panamá
Guaymi
- Venezuela
Guahibo
- Guiana Francesa Arawaks
Palikurs
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
- Estados Unidos
Seminole
Pueblo
Navajo
+
+
+
Tabela 1.1 - Distribuição do HTLV-1 e HTLV-2 nos Ameríndios mediante métodos moleculares e a
identificação por sorologia de anticorpos para HTLV-1/2 nos ameríndios (Ref.: Reeves et al., 1990; Lairmore et
al., 1990; Hjelle et al., 1990; Maloney et al., 1992; Hjelle et a.,l 1992; Dueñas-Barajas et al., 1993, Levine et al.,
1993; Cartier et al., 1993; Fuyiyoshi e cols., 1999; Shindo et al., 2002, Ishak et al., 2003, Vallinoto et al., 2006).
9
1.6.2 - Transmissão
O HTLV é transmitido por contato com os linfócitos infectados e/ou vírus livre presente
no sangue. As vias de transmissão podem ser principalmente: aleitamento, sexual e sangue
(transfusão e hemoderivados) (Black, 1997).
Inicialmente, é possível que a transmissão do STLV dos macacos tenha passado para o
homem pela ingestão ou manipulação de carne crua (Azran et al., 2004).
1.6.3 - Hipótese do seu espalhamento
A distribuição geográfica e prevalência entre grupos indígenas do HTLV-1 e HTLV-2
levantaram a hipótese de que estes vírus possam ter acompanhado as migrações humanas
ancestrais (Figura 1.3) (Fujiyoshi et al., 1999).
A soroprevalência do HTLV-2 entre os grupos indígenas isolados das Américas
(Fujiyoshi et al., 1999) e a falta de positividade para STLV, entre os macacos do Novo
Mundo, apontam para a hipótese de que o HTLV-2 tenha sido introduzido nas Américas
acompanhando as primeiras migrações humanas (Salemi et al.,1999). Estudos de
epidemiologia molecular apenas detectaram nos grupos indígenas das Américas o HTLV-2
enquanto que, o HTLV-1 estaria presente nas populações urbanas. Além disto, o subtipo de
HTLV-1 encontrado nas Américas é o subtipo Cosmopolita, que se encontra espalhado por
todo o mundo. Considerando estas evidências especula-se que o HTLV-2 seria um vírus
ancestral dos primeiros povoadores das Américas, enquanto que o HTLV-1 teria sido
introduzido no continente principalmente durante o intenso tráfico de escravos que ocorreu
entre a África e o continente americano, nos séculos XVIII e XIX, e nas imigrações japonesas
do século XX (Azran et al., 2004).
10
Migração
Via Bering
Migrações
Recentes desde Japão
Tráfico de
escravos
Figura 1.3 - Prováveis vias para a dispersão da infecção pelo HTLV até América (Fonte: adaptado de
National Geographic Society. www.nationalgeographic.com).
Uma evidência sobre a antiguidade do HTLV nas populações indígenas pré-hispânicas
das Américas, é estabelecida por Li et al (1999) que recuperaram material genético do HTLV1 de uma múmia do Chile, datada de aproximadamente 1500 anos.
11
1.6.4 - Estrutura genômica do HTLV e seus produtos protéicos
O HTLV possui uma estrutura morfológica similar a de outros retrovírus, apresenta uma
construção complexa que consiste de um envelope e um nucleocapsideo (Figura 1.4) (Goff,
2001).
Figura 1.4-Estrutura genômica do HTLV (Fonte: http://www.dinep.ufba.br/endemias/htlv1/imagens/manual_021.gif).
12
O HTLV tem um genoma diplóide de RNA de fita simples, de em torno de 9000pb,
com uma organização similar aos outros retrovírus, ou seja, as regiões gag, pol e env, além da
região que flanqueia das extremidades do genoma LTR (long terminal repeats). Caracteriza-o
uma seqüência próxima à extremidade 3´ conhecida como região pX, a qual contém os genes
reguladores tax e rex. As LTRs são essenciais na integração do DNA proviral no DNA
nuclear dos linfócitos humanos (provírus) e também para a regulação transcricional do
genoma do HTLV (Fig. 1.5) (Green & Chen, 2001).
Figura 1.5 - Estrutura genética do HTLV (Fonte: http://www.dinep.ufba.br/endemias/htlv1/imagens/manual_022.gif).
13
1. 7 – A Tripanossomíase Americana
A tripanossomíase americana ou Doença de Chagas é primitivamente uma parasitose
de animais silvestres. Estende-se atualmente do sul dos Estados Unidos até a Patagônia. Na
Bolívia, a área endêmica inclui 80 % do território, com maior incidência nos vales Andinos e
no Chaco e, a população comprometida é de aproximadamente 3 milhões de pessoas (WHO,
1991; Alfred et al., 1999; Breniere et al., 2002). O agente etiológico da doença de Chagas,
Trypanosoma cruzi, é um protozoário flagelado, da família Trypanosomatidae, da ordem
Kinetoplastida (Figura 1.6) (Levine, 1980).
Figura 1.6-O parasito Trypanosoma cruzi
1.7.1 - Ciclo Biológico
T. cruzi apresenta quatro estágios evolutivos básicos durante seu complexo ciclo
biológico: na luz do tubo digestivo do vetor são encontradas a forma multiplicativa,
epimastigota, e a forma infectante, tripomastigota metacíclica. No hospedeiro mamífero são
encontradas a forma amastigota que é multiplicativa e intracelular e a forma tripomastigota
sanguínea. Ambas as formas encontradas no mamífero são infectivas. Quando o triatomíneo
vetor suga o sangue de um mamífero infectado pode ingerir os tripomastigotas, estas formas
se diferenciam no tubo digestivo do vetor para epimastigota e metacíclico. Os triatomíneos
infectados, ao picar novamente o homem ou outros animais, defecam e eliminam as formas
metacíclicas. Os tripomastigotes metacíclicos são fagocitados pelos macrófagos da região e se
14
diferenciam em amastigotas, reiniciando o ciclo (Figura 1.7) (Carvallo & Martinez, 1972;
Brener, 1997).
A plasticidade biológica do T. cruzi, um organismo bem adaptado ao parasitismo,
provavelmente resultou de um longo processo de evolução clonal desde a sua divergência,
ocorrida aproximadamente há 100ma (Henriksson et al., 1996). Este processo de evolução
incluiu a adaptação aos distintos taxa de mamíferos com os quais foi entrando em contato
sucessivamente, na medida em que estes foram povoando o continente americano.
Figura 1.7 - Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi - No vetor (a) formas epimastigotas (b) se multiplicam no
lúmen do intestino. Diferenciam-se para tripomastigotas metacíclicos (c) ocorre na porção final do intestino.
Estas formas infectam mamíferos (1). Após adesão, penetram nas células, os tripomastigotas se diferenciam em
amastigotas multiplicativos (2). Após diferenciação e liberação de tripomastigotas sangüíneos (3), estas formas
podem invadir músculos e outros tecidos. O ciclo se fecha quando o indivíduo infectado é picado por outro
triatomíneo.
15
1.7.2 - O vetor
Os vetores do T. cruzi, são hemípteros hematófagos, que pertencem à ordem Hemíptera
e a Família Reduviidae, subfamília Triatominae. Incluem atualmente 123 espécies das quais
110 estão difundidas pelo novo mundo, e uma grande proporção delas atualmente encontrada
naturalmente infectada (Carvallo & Martinez, 1985; Bermudez & Balderrama, 1991; Alfred et
al., 1999).
Na Bolívia, o vetor mais importante é o Triatoma infestans, presente em sete de seus
nove departamentos: La Paz, Cochabamba, Tarija, Sucre, Potosí, Santa Cruz e Beni
(Albarracin - Veizaga et al., 1999). Encontrando-se focos silvestres em grandes quantidades
nos vales dos departamentos de Cochabamba, La Paz, Sucre e recentemente encontrado na
região do Chaco Boliviano (Noireau et al., 2005). Compreendendo uma área de transmissão
vetorial, entre 300 e 3000 metros de altitude.
Foi possível também encontrar estes
triatomíneos até 4100 m de altitude na Bolívia (Castro & Torrico, 1999).
1.7.3 – Origem
Várias hipóteses são sugeridas em relação a origem da infecção humana pelo T. cruzi,
a mais frequentemente citada, atribui às habitações humanas construídas a partir da
colonização européia, o processo de domiciliação do triatomíneo vetor e conseqüente infecção
do homem pelo T. cruzi (Rothahammer et al., 1985; Fornacieri et al., 1992). Ossos não
cozidos e pêlos de roedores foram achados em coprólitos humanos, indicando que as
populações humanas pré-históricas provavelmente consumiam carne crua infectada destes
animais. Evidências apontam para a existência da infecção humana nas Américas mesmo
quando o homem vivia como nômade alimentando-se de carne crua de animais silvestres,
indicando a via oral como a forma mais provável de transmissão (Reinhard, 1992; Schofield,
2000). A via oral é um mecanismo eficiente de transmissão de T. cruzi entre mamíferos
selvagens e humanos. Os recentes surtos da doença de Chagas aguda, que têm acontecido no
Brasil por consumo de açaí e caldo de cana, estão associados à via oral. Estes se caracterizam
por quadros clínicos bastante graves e letalidade de 6% (Dias, 2006).
Outra hipótese sugere que o homem tenha se infectado com o T.cruzi, a partir de sua
sedentarização. Durante este processo, houve inicialmente a estocagem de grãos e alimentos
que teriam atraído animais (mamíferos e triatomíneos) com potencial de sinantropização. O
ciclo de transmissão originalmente silvestre passa então a acontecer na área ocupada pelo
homem (Rothhammer, 1985).
16
1.7.4 - Vias de Transmissão
Via Vetorial: Via de transmissão através do contato com as fezes do vetor infetadas por
T.cruzi. Oral: pela ingestão de alimentos contaminados pelo parasito, do próprio triatomíneo
ou de carne crua de mamíferos infectados. Transfusional: através de sangue contaminado ou
por transplante de órgãos. Transmissão vertical: transmissão da mãe infectada para o filho
durante a gravidez, via placentária, corresponde a 5% das infecções na Bolívia (Kirchhoff,
1995; Flores et al., 2003).
Em relação ao vetor, existem três tipos de transmissão do T. cruzi: o ciclo de
transmissão silvestre, o peridomiciliar e o domiciliar (Alfred, 1999).
T. infestans é o vetor mais importante na Bolívia, tendo como hipótese de sua expansão
a partir da Bolívia, até os vales do norte chileno e sul peruano. Muito depois, teria alcançado a
Argentina pela cordilheira dos Andes e por último o Brasil no início do século XX. O
deslocamento populacional pelo continente, assim como o intercambio comercial de produtos
entre países vizinhos pode ter facilitado a dispersão passiva dos vetores (Schofield, 1988;
Alfred et al., 1999).
No Chile foram encontrados restos de T. infestans em urnas funerárias das culturas précolombianas Tafi, Santamaria e La Aguada. A forma de fechamento destas urnas, antes do
enterramento, impossibilitaria a penetração dos barbeiros, portanto o triatomíneo estaria entre
as roupas do indivíduo, no ato do sepultamento. Esta é uma evidência que aponta para a
intensa domiciliação dos triatomíneos e o estreito contato deste com as comunidades précolombianas (Carpintero& Viana, 1980).
Lesões associadas à Doença de Chagas e a identificação de T. cruzi em múmias das
culturas Chinchorro encontradas em Tarapacá, Chile, assim como também em múmias da
cultura Wankarani, (Rothhammer et al., 1985; Fornacieri et al., 1995; Guhl et al., 1999; Guhl
et al., 2000; Ferreira et al., 2000), datadas de 9000 anos a.C. demonstraram, definitivamente,
que a entrada do homem no ciclo de transmissão do T. cruzi foi anterior à colonização
européia (Aufderheide et al., 2004). Vale mencionar que a cultura Chinchorro e Wankarani
eram originárias da Bolívia, e que migraram para o Sul do Peru e Norte do Chile
respectivamente, onde se estabeleceram, podendo ter dispersado a infecção por T. cruzi
durante o processo migratório.
É claro que, com a colonização européia, foram introduzidas novas relações de
produção, novas formas de ocupação da terra e novos modos de morar, entre eles as casas de
adobe na região dos Andes e os casebres de palha, o que propiciou a domiciliação e, posterior
17
dispersão para o resto do continente, do T. infestans (Briones et al., 1999). Esta hipótese
explica apenas parcialmente a origem da Doença de Chagas nas Américas: nunca foram
explicados os casos de áreas endêmicas onde a presença do T. infestans nunca foi registrada.
É interessante que somente na Bolívia, T. infestans é encontrado no ecótopo silvestre,
naturalmente infectado (Dujardin et al., 1998; Noireau et al., 2005).
1.7.5 - Fases da Doença de Chagas e a sintomatologia associada
A Tripanossomíase Americana apresenta as seguintes fases no hospedeiro mamífero:
aguda na que se produz uma inflamação no local da inoculação ou de ingresso do parasito,
posteriormente febre, fadiga, dores de cabeça, diarréias que desaparecem em algumas
semanas. A parasitemia aumenta e é detectável sorologicamente após 10 a 12 dias da
infecção. Na fase indeterminada ou assintomática, geralmente a infecção passa inadvertida,
este período começa de 8 a 10 semanas após o contato com o parasito e pode durar muitos
anos até o individuo desenvolver alguma lesão cardíaca ou intestinal que resultam em
megaórgãos na fase crônica (Kirchhoff, 1995; Andrade, 1999).
18
1.7.6 - O genoma do Trypanosoma cruzi
Todos os parasitos pertencentes à ordem Kinetoplastida apresentam uma mitocôndria
única, cujo DNA se apresenta em um arranjo peculiar, concatenado, formando uma rede. Os
elos desta rede são formados por minicírculos e maxicírculos. Os maxicírculos são moléculas
de aproximadamente 20 Kb e são representadas em dezenas de cópias, contendo seqüências
codificadoras. Os minicírculos são moléculas menores (0.6- 5.0 Kb) presentes em grande
número de cópias (milhares) e codificam RNAs guias, envolvidos nos processos de edição de
mRNA oriundo dos maxicirculos. A molécula de um minicírculo em T. cruzi contém quatro
regiões conservadas (121pb) específicas desta espécie, intercaladas por quatro regiões
variáveis (330pb) (Figura 1.8) (Guhl et al., 2002; Junqueira et al., 2005). No material genético
nuclear a região espaçadora do gene de miniéxon é utilizada para tipagem da espécie T. cruzi
(Souto et al., 1996).
Figura 1.8 - Organização esquemática do rDNA do Trypanosoma cruzi. O rDNA esta constituido de sequencias
repetidas nas que as regiões codificadoras das SSU (small subunits) e LSU (Large subunits) estão separadas por
dois espaciadores internos transcritos (ITS). O ITS 1 separa a região codificadora da subunidade 18S e a 5.8 S
rDNA, e o ITS2 separa as sequencias 5.8 S rDNA e do 24S rDNA (Macedo et al., 2004).
19
INTRON
EXON
MINIEXON
Figura 1.9 - O locus do Miniexon apresenta unidades repetidas e esta organizada em tandem. A região do Exon
esta representada na figura em preto, em cinza a região dos introns. A região espaçadora não transcrita esta
representada pela linha preta conectora (Macedo et al., 2004).
4 Regiões
conservadas
121
pb
4 Regiões
variáveis
Figura 1.10- Minicirculos do kDNA do T. cruzi (Sturm et al., 1989).
1.7.7 - Diversidade Genética do T. cruzi
A diversidade genética do parasito é um dos aspectos interessante deste táxon que
apresenta um amplo espectro de hospedeiros mamíferos (oito ordens) nos quais infecta quase
qualquer tipo de tecido. Dois genótipos principais foram reconhecidos entre as numerosas
sub-populações do parasito TCI e TCII (mais recentemente foi proposta uma linhagem
ancestral, TCIII) (Macedo & Pena, 1998; Brisse et al., 2000; Macedo et al., 2004; Freitas et
al., 2006). No entanto as correlações destas linhagens com determinado bioma, ecótopo,
hospedeiro ou doença humana ainda são controversas.
20
O T. cruzi I (TCI) tem sido relacionado ao ciclo de transmissão silvestre e o T. cruzi II
(TCII) identificado nos ciclos de transmissão domésticos. Apesar deste postulado é possível
encontrar ambos os genótipos do parasito no ambiente silvestre (Jansen et al., 1999; Lisboa et
al., 2004).
Considerando as evidências já obtidas em relação à presença de T. cruzi em material
humano arqueológico, proveniente das regiões andinas do Peru e Chile, e a atual prevalência
da infecção por este parasita na Bolívia nosso projeto visa: recuperar material genético de T.
cruzi a partir de tecidos de múmias, representantes de culturas ancestrais da Bolívia. Ainda,
investigaremos a presença do provírus HTLV nas mesmas amostras já que este vírus é
prevalente entre populações atuais de ameríndios e considerado ancestral nas Américas.
21
2. OBJETIVOS
22
2.1 - Objetivo Geral.
Determinar a presença de HTLV e T. cruzi em material mumificado das culturas
Mojocoya, Colla Aymara, Presto Puno, Puqui e Tiwanaku, datadas entre 3600-900 anos
atrás.
2.2 - Objetivos específicos.
- Determinar as linhagens genéticas (haplogrupos) das múmias pré-hispânicas e
hispânicas dos museus arqueológicos através das análises do mtDNA.
- Diagnosticar molecularmente a presença do vírus linfotrópico das células T humanas
(HTLV) e do T. cruzi nas múmias.
- Recuperar e analisar material genético do T. cruzi e HTLV do material arqueológico.
23
3. MATERIAIS E MÉTODOS
24
3.1 – Material de estudo.
3.1.1 - Natureza das amostras
Foram analisadas amostras de tecidos de 29 corpos mumificados encontrados nos
departamentos de Cochabamba, Chuquisaca e Tiwanaku em La Paz, Bolívia, pertencentes a
diferentes culturas pré-hispânicas estabelecidas no território boliviano (Figura 3.2). Destes,
nove múmias eram do museu Tiwanaku (La Paz), encontradas na pirâmide de Akapana,
Município de Tiwanaku; proveniente do Departamento de Sucre, dez múmias, três do período
colonial da Bolívia e sete múmias do período pré-hispânico (dados de procedência das
amostras tabela 3.1, 3.2 e 3.3) e tecidos de dez múmias pré-hispânicas de Cochabamba.
Recomenda-se, a utilização de dentes e ossos para este tipo de estudos, já que
preservariam melhor o material genético (aDNA).
Tecidos moles das amostras de
Cochabamba foram incluídos no estudo, pois eram os únicos disponíveis.
O material mumificado apresentava boa preservação. A mumificação foi espontânea
devido ao clima seco e frio das regiões onde foram encontradas as múmias (Figura 3.1).
Múmia pré-hispânica
Múmias hispânicas – Chuquisaca
Figura 3.1- Foto de uma das Múmias pré-hispânicas de Cochabamba e as Múmias hispânicas de Chuquisaca
incluídas no estudo.
25
Figura 3.2 - Mapa da
mapas/mapa/bolivia.jpg).
Bolívia
com
os
9
Departamentos
(Fonte:
www.paises-america.com/
3.1.2 - Cronologia e datação das amostras
O material obtido dos três museus abrange restos mumificados das culturas Mojocoya do
Período Formativo ao Intermediário Inicial (1-800 anos d.C.), Colla Aymará do Período
Intermediário (600 a 1400 anos d.C.), Puqui do Período Intermediário (600- 1400 anos d.C.),
Presto Puno do Período Intermediário (600- 1400 d.C.); e Tiwanakota (Período 1500 anos
a.C. até 1100 anos d.C) (Figura 3.3) (Escalante, s/a; Salinas, 2004; Pereira et al., 2004) .
A cronologia das diferentes populações incluídas neste estudo foi definida pela
informação obtida da estratigrafia, radiocarbono (C14) e contexto cultural (Ponce Sanginés,
2000; Salinas, 2004; Pereira, 2004).
26
Figura 3.3 - Cronologia de algumas das principais culturas do Altiplano e Vale da Bolívia. (adaptado de
Escalante, J. s/a).
27
3.1.3 - Descrição das culturas pré-hispânicas e sítios arqueológicos da Bolívia
A Bolívia é um país que apresenta mais de 33 grupos étnicos desde os Andes até as
planícies do Chaco, onde os quéchuas e aymaras atualmente são os maiores representantes
indígenas (FAO, 2006).
Outros vários grupos indígenas existiram ancestralmente, e deixaram evidências que
consistem em utensílios primitivos, tecidos e pinturas rupestres encontradas dentro de
cavernas e enterramentos em distintos lugares. Os achados mostram que estes povos, ainda
em estado nômade, subsistiam de coleta de frutos, raízes e a caça de animais silvestres. Em
função do freqüente deslocamento pela busca do alimento, utilizavam estas grutas ou cavernas
como um refúgio temporário, depósito para alimento ou santuário (Correal et al., 1990). O
sedentarismo das populações aborígines americanas foi conseqüência da gradual mudança nas
suas formas de moradias ou refúgios até o surgimento das casas construídas de adobe.
Ainda hoje a alimentação e atividade das populações dos Andes da Bolívia constam
basicamente de alimentos tradicionais e milenares principalmente tubérculos, milho, diversos
outros grãos. Os preás (cuíes, roedores do gênero Cavia) eram partes da sua alimentação; a
caça de animais silvestres e a domesticação de alguns animais como as llamas, alpacas e
guanacos, são atividades também muito antigas. Das atividades envolvidas na agricultura e
domesticação de animais sabe-se que a llama, especialmente no altiplano, servia a estas
populações para o transporte de produtos de consumo alimentício. As evidências fósseis
destes animais, em distintos lugares, sugerem um significativo deslocamento pela atividade
comercial entre países vizinhos (Ponce, 1977; Correal et al., 1990).
- Cochabamba.
O departamento de Cochabamba localizado no centro da Bolívia (Figura 3.4), a uma
altitude de 2548m, apresenta uma cronologia arqueológica de quatro períodos: Formativo
(1150a.C.-200 d.C), Intermediário Inicial (200a.C–600 d.C.), Intermediário Final (600d.C.1400 d.C) (Pereira, 2004).
As primeiras populações de caçadores e coletores estabelecidas em Cochabamba
deixaram evidências de sua presença na região de Kayarani (Província Carrasco). Durante o
Período Formativo (1500a.C. e 600 d.C), outras populações estabeleceram-se, principalmente
em Aiquile (Província Campero), onde foram encontrados artefatos de cerâmica monocroma,
keros (espécie de taças), pipas, instrumentos musicais em cerâmica e osso. Estas populações
também desenvolveram a metalurgia, fabricaram tecidos, cestas, e artefatos de uso cotidiano e
28
para rituais religiosos, sendo encontrados seus mortos dentro de vasos de cerâmica, que
dependendo da hierarquia dentro da população, eram decorados luxuosamente (Pereira, 2004).
Posteriormente as culturas distribuídas nos vales cochabambinos (principalmente no
Municipio Omereque, Província Campero) foram influenciadas pela cultura tiwanakota
durante a etapa expansiva do império, devido ao interesse pelas terras férteis de cultivo e pelo
milho dos vales (Pereira, 2004).
A coleção de múmias pré-hispânicas de Cochabamba foram doações feitas ao Museu
de Cochabamba. Nem todas as amostras apresentam informação sobre sua procedência (tabela
3.1). A maioria é da fazenda Pocanchi ao norte de Independencia, Província Ayopaya. Nesta
região, as múmias Aymaras, anteriores a conquista incaica, foram achadas dentro de
“chullpares”, denominação tradicional das pequenas construções feitas de adobe onde eram
colocados os corpos dentro de cestas feitas de totora (tecido vegetal), junto às múmias ou
Chullpas também eram encontradas oferendas (Pereira, 2004).
As múmias do Museu de Cochabamba também incluem indivíduos da cultura Puqui,
que parecem estar relacionados com os caravaneiros de llamas da época do domínio
Tiwanakota. Esta cultura se estende principalmente entre as regiões de Coipasa e Uyuni, em
Potosí e Oruro (Pereira, 2004).
29
Figura 3.4-Mapa de Cochabamba, com as províncias. Inclui provincia Ayopaya, Mizque, Campero e Carrasco,
onde foram encontradas algumas das múmias deste estudo
(Fonte:http://www.pizarra.edu.bo/index.php/Cochabamba/MAPAPOLITICODECOCHABANBA).
30
Tabela 3.1 – Informação das múmias do museu de Cochabamba, referente à procedência, idade, sexo e
tipo de amostras utilizadas para nosso estudo. A datação aproximada das múmias de Cochabamba: 1200- 800
anos (Fonte: Museu de Cochabamba: “Instituto de Investigaciones Antropológicas, Museos Arqueológicos”.
Múmia
(Código museu)
275
Procedência
Gênero
Ayopaya
Desconhecido
277
Desconhecido
Desconhecido
221
Adulto
279
Idade
Adulto
Criança
Tipo de amostra
Tecido mole
Ossos
Desconhecido
Adulto
Tecido mole
Masculino
Adulto
Tecido mole
268
Desconhecido
Ayopaya
Masculino
Adulto
Tecido mole
405
Quillacollo,
Feminino
Adulto
dente
429
Desconhecido
Adulto
dentes
348
Mojocoya norte de
Sucre
Vinto
323
Omereque
Adulto
Masculino
dente
206
Omereque
Adulto
Masculino
dente
Desconhecido
Desconhecido
dente
- Chuquisaca
Sobre as práticas funerárias das populações pré-hispânicas se conhece muito pouco, os
abrigos naturais ou cavernas têm sido utilizadas pelos habitantes pré-hispânicos da região,
como tumbas nas ladeiras e mesetas de alguns lugares de Chuquisaca e Cochabamba (Salinas,
2004).
Em Chuquisaca (2700m), os mortos geralmente eram colocados dentro das cavernas,
tampando a entrada com uma parede de pedra. No interior da caverna é possível achar vários
corpos mumificados separados por este tipo de paredes; provavelmente, os indivíduos
achados em uma mesma caverna, pertenceram a uma única família (Salinas, 2004).
Os corpos mumificados da coleção do museu de Chuquisaca foram encontrados
embrulhados em várias camadas de tecido de fibras vegetais e animais, formando fardos
funerários. Junto a cada múmia foram encontradas cerâmicas e objetos de madeira (Salinas,
2004) na sua maioria da cultura Mojocoya.
Esta cultura apresentou-se no Sudeste de
Cochabamba e no Norte de Chuquisaca (Salinas, 2004).
31
As múmias hispânicas do museu de Chuquisaca pertencem ao século XVIII e foram
encontradas no interior de uma parede da Igreja de Santo Domingo. Na época as igrejas eram
utilizadas como cemitérios, até o ano 1826, quando foi proibida esta prática, por motivos de
saúde publica. O processo de mumificação natural destes indivíduos foi favorecido pela
ambiente seco (tabela 3.2) (Salinas, 2004).
Tabela 3.2 – Informação das múmias do museu de Chuquisaca referente à procedência, idade, sexo e tipo de
amostras utilizadas para nosso estudo. A datação aproximada das múmias de Chuquisaca:1200- 800 anos (Fonte:
Museos Universitários de Charcas; Salinas et al., 2000).
Múmia
(Código museu)
Múmias Colonias:
C-01
Procedência
Gênero
Sucre- Catedral
Sto. Domingo
Sucre- Catedral
Sto. Domingo
Sucre- Catedral
Sto. Domingo
Masculino
Sem número (S/N)
RC
Região Cultura
Presto Puno
Meseta de SaucaProvíncia
Sudanês, cultura
Mojocoya
Meseta de SaucaProvíncia
Sudanês, Cultura
Mojocoya
Meseta de SaucaProvíncia
Sudanês,Cultura
Mojocoya
Sudañes- Icla
Cultura
Mojocoya
Río
Chico
1710
Sem procedência
C-02
C-03
Múmias
Pré-hispânicas:
Ph.-01
Ph.-02
Ph.-03
Ph.-04
1990
IC
Idade
Tipo de Amostra
Tecido mole
Masculino
criança aprox. 10
anos
criança aprox. 16
anos
Aprox. 65 anos
Masculino
8- 10 anos
Tecido mole
Feminino
3- 5 anos
Dente
Feminino
25 anos
Dente
Desconhecido
Aprox. 10 meses
Dente
Masculino
30- 40 anos
Feminino
Osso
Osso
Dente
Feminino
30- 40 anos
Dente
Masculino
20- 30 anos
Dente
32
- Tiwanaku
As amostras da cultura Tiwanaku incluídas neste estudo foram extraídas de corpos
encontrados na Pirâmide de Akapana (tabela 3.3). Esta pirâmide de 800m de perímetro
apresenta na entrada peças esculpidas do homem puma ou “chachapuma” em basalto preto e
tem no interior templos semi-subterrâneos. A estrutura piramidal, réplica das montanhas
simboliza na base o âmbito terrestre e no topo, o âmbito celestial, considerado morada dos
deuses (Escalante, s/a; Ponce Sanginés, 2000).
O palácio dos Sarcófagos ou “Putuni”, no mesmo centro tiwanakota, é uma construção
com uma plataforma de 1.20m de altitude onde, também é possível achar nas paredes
interiores câmaras funerárias. Estas câmaras apresentam um sistema de fechamento que
consiste de uma porta de pedra que desliza ao umedecer o piso (Escalante, s/a; Ponce
Sanginés, 2000).
A cultura Tiwanaku é a mais antiga e importante do período pré-colombiano
boliviano. Originou-se no Período Formativo Altiplânico (1500a.C.-1200d.C.) sendo
reconhecidas três épocas durante seu desenvolvimento: Período Aldeão (Épocas I e II
1500a.C.-45d.C.), Período Urbano Clássico (Épocas III e IV 45d.C.-700d.C.) e Período
Expansivo (Épocas V 700d.C.-1200d.C.). A cultura Tiwanaku durou três milênios, desde os
anos 1150a.C. até 1172d.C. No início, Tiwanaku era uma pequena vila, constituída por
populações provenientes do lago Titikaka e pouco depois por populações de diversas regiões.
A capital deste império, localizada a 71km da cidade de La Paz na Bolívia, no município
Tiwanaku, localiza-se entre 16°33’ de Latitude Sul e 68°40’ de Longitude Oeste. A superfície
do território é de 314,833Km² e a latitude de 3,850m (figura 3.5 e 3.6). Durante o Período
Formativo de Tiwanaku as condições climáticas eram favoráveis para o assentamento de
grupos nômades. As evidências arqueológicas sugerem a existência de manifestações não
relacionadas a essa região, constituindo a prova da presença de outras associações entre
grupos diferentes no mesmo local. Durante o Período Aldeão, começou a construção de casas
e a agricultura e criação de animais com técnicas trazidas por outros grupos. No Período
Urbano Clássico levantaram-se palácios e templos, considerando-se a época da engenharia. O
Período Expansivo Imperial foi a época na qual Tiwanaku começou a construção da rede
fluvial para entrar a outros pisos ecológicos na busca de novos recursos naturais, estendendo
se até alcançar o Norte da Argentina e Chile e a costa do Peru. Muitos dos caminhos hoje
atribuídos aos incas, denominados “Caminhos dos Incas” foram construídos muito antes pelos
tiwanakotas no período expansivo (Escalante, s/a; Ponce Sanginés, 2000).
33
Figura 3.5- foto satélite do centro de Tiwanaku no departamento de La Paz (Fonte: www.googleearth.com).
Figura 3.6- Capital de Tiwanaku- La Paz, Bolívia (Fonte: Ponce Sanginés, 2000).
34
Tabela 3.3 – Informação das múmias do museu Tiwanaku, La Paz referente à procedência, idade, sexo e tipo de
amostras utilizadas para nosso estudo. A datação aproximada das múmias de Tiwanaku: 3600-900 anos
aproximadamente (Fonte: Museo Tiwanaku, La Paz- Bolívia: Unidad Nacional de Arqueologia”.
Múmia
(Código museu)
Múmias Préhispânicas
01
02
Individuo no1
PAAK 2004
Unidade
10/12/2003
UE 5019
N° 1071
UE 6013
N° 1590
EU 5418
N° 1306
Unidade 10/11/
2009
EU 5326
Unidade 10/12/
2007
Individuo # 1
Unidade
28/03/2004
Procedência
Gênero
Idade
Tipo de amostra
Tiwanakotas, na
pirâmide de
Akapana
Tiwanakotas, na
pirâmide de
Akapana
Tiwanakotas, na
pirâmide de
Akapana
Tiwanakotas, na
pirâmide de
Akapana
Masculino
Adulto
Dente
Desconhecido
Feto
Tecido mole
Masculino
Criança
Dente
Masculino
Criança
Dente e osso
Tiwanakotas, na
pirâmide de
Akapana
Tiwanakotas, na
pirâmide de
Akapana
Tiwanakotas, na
pirâmide de
Akapana
Masculino
Adulto
Osso
Feminino
Adulto
Dente e osso
Masculino
Adulto
Osso
Tiwanakotas, na
pirâmide de
Akapana
Tiwanakotas, na
pirâmide de
Akapana
Feminino
Adulto
Osso
Feminino
Adulto
Dente
35
3.1.4 - Coleta das amostras
Durante todo o trabalho, tanto de coleta de amostras quanto no laboratório, foram
usadas luvas, máscara e jalecos descartáveis. As amostras foram coletadas com pinças e
bisturi e depositadas em tubos falcon estéreis e irradiados com UV e guardadas a -20oC.
Utilizaram-se materiais estéreis e luz ultravioleta/60 minutos nas áreas de trabalho e
materiais, tal como sugeriu Kalmár (2000).
Figura 3.7 - Coleta das amostras.
3.2 - Extração do DNA
- Preparação das amostras.
Segundo Hofreiter et al. (2001) e Yang & Watt (2005), é importante utilizar diferentes
ambientes para cada etapa de manipulação das amostras, especialmente na extração de aDNA
e durante a PCR. Considera-se que, no caso de ossos e dentes das múmias, os contaminantes
só estejam nas superfícies. Portanto as superfícies das amostras foram descontaminadas
utilizando-se solução de hipoclorito de sódio (6%), que atua como solução quelante de DNA
exógeno (Kemp & Smith, 2005).
Todos os experimentos foram desenvolvidos em um laboratório exclusivo para DNA
antigo, sala de paleogenética do Laboratório de Genética Molecular de Microrganismos/IOC.
O processamento inicial de descontaminação das amostras inclui a limpeza com
bisturi para a eliminação de restos de solo ou sedimentos nas superfícies dos tecidos,
seguidamente limparam-se as amostras com gaze previamente imersa em solução de
hipoclorito 6%. Cada face dos ossos, dentes e tecidos moles foi exposta à radiação UV por 15
minutos. Após estas etapas as amostras são colocadas dentro de sacolas plásticas estéreis que
36
foram previamente expostas a UV por 15 minutos para evitar contaminação com DNA
exógeno. Seguidamente as amostras foram imersas no nitrogênio líquido e posteriormente
trituradas com ajuda de martelo, aproximadamente 400mg do pó recuperado da amostra é
colocado em tubos eppendorf de 2ml.
– Extração do DNA com o sistema comercial Geneclean Bio 1001, Vista, CA.
A extração de DNA foi realizada mediante o sistema comercial (GENECLEAN® Kit
for Ancient DNA-Bio101). A utilização deste kit reduz os riscos de contaminação e aumenta a
eficiência de recuperação de aDNA (Pääbo, 2004). O kit comercial foi desenvolvido
especificamente para isolamento de DNA antigo de tecidos mumificados, ossos e dentes;
algumas modificações foram feitas e serão detalhadas a continuação. Alíquotas
individualizadas dos componentes do kit foram preparadas no fluxo laminar.
Na etapa de pré-incubação, na extração de aDNA, as quantidades de soluções
sugeridas pelo kit comercial, foram modificadas da seguinte forma: no tubo com a amostra
triturada colocamos: 400µl de SDS, 250µl de Proteinase K e 5µl de EDTAincubadas 24 horas
a 37oC.
O kit tem três soluções para a etapa de incubação (A, A2 e B); as três foram testadas
e os melhores resultados foram obtidos com a combinação das soluções A + A2 (800µl
solução A + 200µl A2). Esta combinação de soluções foi usada no decorrer de todo o trabalho.
As amostras foram incubadas a 60oC por 20 horas.
As modificações na etapa de pré-incubação e incubação aumentaram a eficiência da
recuperação de aDNA. Após estas etapas continuamos com o protocolo do kit.
Durante as extrações foram introduzidos controles negativos, estes consistem em a
utilização de todos os reagentes que avaliam que não este sendo introduzida nenhuma
contaminação durante os procedimentos de extração.
3.3 – Quantificações do aDNA no espectrofotômetro Nanodrop, Uniscience ND-1000
O aDNA extraído de todas as amostras foi quantificado por espectrofotometria,
utilizando 1µl do material para obter dados sobre a pureza do material e conhecer a
concentração de ácido nucléicos recuperados.
37
3.4 - Alvos analisados
Os alvos de estudo incluídos neste trabalho foram o DNA mitocondrial-região D-Loop
humana; gene de miniexon e regiões conservada e variável do kDNA do protozoário
Trypanosoma cruzi e o gene tax do vírus linfotrópico das células T humanas. Para tal,
aplicamos a técnica de PCR utilizando iniciadores delimitando regiões de em torno de 250pb,
devido a qualidade do aDNA, geralmente bastante fragmentado.
3.5 - Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Os iniciadores utilizados nas reações de PCR estão indicados na Tabela 4. Os
iniciadores foram definidos a partir de literatura e testados quanto a sua especificidade.
Para a amplificação de regiões específicas, a reação de PCR foi realizada em um
volume final de 50 µl. As reações individuais foram compostas de água Mili-Q esterilizada,
tampão de reação 1X (Invitrogen), MgCl (Invitrogen) 2,5mM, dNTP (dATP, dCTP, dGTP e
dTTP) (Promega) 0,4mM. Taq polimerase (Platinum) 2,5U, 200 ng de cada iniciador e 3-5µl
do aDNA obtido nas extrações pelo kit comercial. Os produtos de PCR foram visualizados
em PAGE 8% e corados em Brometo de Etidio.
3.5.1 – Polimerização Reconstrutiva
A finalidade da utilização deste procedimento é recompor as moléculas de aDNA
fragmentadas (Golemberg et al., 1996). Utilizou-se para conseguir recuperar aquelas amostras
que não amplificaram com a PCR normal. As reações são preparadas para um volume final de
25µl e utilizado 5µl do aDNA. Para as demais PCR convencionais, foram utilizados 5µl deste
aDNA reconstruído.
O procedimento foi o seguinte: 20 ciclos com 98oC/8 segundos, 50oC/8 segundos e
72oC/20 segundos.
38
Tabela 3.4 - Iniciadores utilizados nas reações de PCR
Nome do
Seqüências dos oligonucleotídeos
Iniciador
Alvo e fragmento
Referencias
esperado
TcMcF (S67)
TGGTTTTGGGAGGGG(G:C)(G:C)(G:T)TCAA(A:C)TTT
TcMcR
TATATTACACCAACCCCAATCGAACC
121pb
Sturm et al. (1980)
Trypanosoma cruzi
Souto et al. (1996)
(S34A)
TC
CCCCCCTCCCAGGCCACACTG
TC1
GTGTCCGCCACCTCCTTCGGGCC
TC2
CCTGCAGGCACACGTGTGTGTG
Exon
TACCAATATAGTACAGAAACT
Trypanosoma cruzi
TcI
TTGCTCGCACACTCGGCTGCAT
Mini-exon (200-250pb)
TcII
ACACTTTCTGTGGCGCTGATCG
L16234(F)
CACATCAACTGCAACTCCAAA
H16422(R)
ATTGATTTCACGGAGGATGG
L15996(F)
CTCCACCATTAGCACCCAAAGC
H16401(R)
TGATTTCACGGAGGATGGTG
AV 45(F)
GGACGCGTT(A/G)TC(A/G)GCTC
AV46(R)
(G/T)GG(A/G)GAIAG(C/T)TGGTA(G/T)AGGTA
302pb
AV42(F)
CTCCCCTCCTTCCCCAC
219pb
AV43(R)
CCA(G/C)(A/G)(G/T)GGTGTAIAIGTTTTGG
Mini-exon (300-350 pb)
mtDNA humano-HVS-I
Fernandez et al. 2001
LGMM
(188pb)
mtDNA humano-HVS-I
LGMM
(405pb)
HTLV Região gene Tax
39
Vandame et al. 1997
3.5.2 - PCR Humano
A região utilizada para a definição dos haplogrupos humanos é a região hipervariável
do genoma mitocôndrial, sendo a região HVS-I a mais utilizada para este tipo de estudo. Para
a análise da região HVS-I, a PCR (Reação de Polimerização em Cadeia) foi realizada com os
seguintes iniciadores: L16234 e H16422, que delimitam um fragmento de 188 pb.
A reação de PCR foi realizada com as seguintes condições: pré-desnaturação a 94oC/1
minuto, seguido de 40 ciclos de 94○C/20 segundos, 50○C/20 segundos e finalmente 72○C/20
segundos.
3.5.3 - PCR para T. cruzi
Foram analisadas as seguintes regiões na procura de T. cruzi: região conservada do
minicírculo de 121pb (TcMc Reverso e Forward), região espaçadora do gene de miniexon
(TCI 350 e TCII 300pb), assim como outros iniciadores multiplex para a região de miniexon
de 250pb para TCI e 200pb para TCII.
A reação de PCR para as regiões de miniexon e região conservada dos minicírculos foi
realizada com as seguintes condições: 95oC/5 minutos, seguido de 40 ciclos de 94○C/20
segundos, 55○C/20 segundos e finalmente 72○C/20 segundos.
3.5.4 - PCR para HTLV
Nosso alvo foi um segmento do gene tax, utilizando o nested PCR genérico para
HTLV-1/2 com os seguintes iniciadores: externos AV45 (F) e AV46(R) e internos AV42 (F)
e AV43(R) que delimitam um fragmento de 302pb e 219pb respectivamente.
A reação de PCR foi realizada com as seguintes condições: pré-desnaturação a 94oC
por 30 segundos, seguido de 45 ciclos de 94○C/20 segundos, 48○C/20 segundos e finalmente
72○C/20 segundos, utilizou-se 3µl do aDNA total na primeira reação e 5µl do produto da
primeira reação na segunda PCR.
3.6 - Clonagem
A Clonagem dos produtos amplificados foi realizada seguindo o protocolo do kit
pGEM®-T Easy Vector System I (Promega). Utilizamos células competentes DH5α para a
etapa da transformação. Semeamos as células competentes transformadas em meio de LB
Agar com ampicilina 50µg/ml, Xgal e IPTG durante 24 horas a 37○C. Posteriormente as
colônias brancas (aproximadamente 60% das colônias brancas contém o inserto) foram
inoculadas em tubos contendo 3ml de caldo LB com ampicilina 50µg/ml e incubados a 37oC
por 12-18 horas.
40
- Extração de DNA pelo método de choque térmico
A cultura das colônias dos transformantes (semeados em LB caldo) foi transferida para
um tubo tipo Eppendorf e centrifugados a 14000rpm por 3 minutos. O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi solubilizado em 500µl de água Mili-Q estéril e esta suspensão
foi submetida a banho-maria fervente (100oC) por 20 minutos, sendo imediatamente
submetida a uma temperatura de -20oC por 1 hora. Este material foi posteriormente
descongelado e centrifugado novamente a 14000rpm por 3 minutos para o sobrenadante ser
utilizado nas reações de PCR.
3.7 - Purificação dos produtos de PCR
Os produtos da PCR que amplificaram para os alvos específicos foram purificados
seguindo o protocolo do kit comercial Perfectprep Gel Clean-up de Eppendorf e Wizard®
Plus SV minipreps DNA Purification System da Promega.
Os produtos purificados foram visualizados em Agarose 3%, corados em Brometo de
Etídio e posteriormente seqüenciados.
3.8 - Extração do plasmídeo
Após a clonagem os produtos do PCR foram purificados utilizando o kit comercial
Wizard® Plus SV minipreps DNA Purification System da Promega, mediante o qual
extraímos o plasmídeo, visualizando a extração em gel de agarose 1%.
3.9 – Determinação das seqüências nucleotídicas
Os fragmentos amplificados e purificados foram utilizados como molde de DNA para
a reação de seqüênciamento de suas duas fitas com o sistema comercial BigDye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit® (Applied Biosystems – Perkin Elmer Co.) e
separadas em seqüenciador automático ABI PRISMTM 377DNA Sequencer (Applied
Biosystems-Perkin Elmer Co.).
As seqüências nucleotídicas foram editadas, alinhadas e analisadas com auxilio do
programa CHROMAS, BioEdit e Seqman.
As seqüências foram comparadas àquelas
depositadas no banco de seqüências GeneBank.
3.10 – Hibridação de DNA com sondas de DNA marcadas radioativamente
3.10.1 – Dot Blot
Utilizada para a detecção de HTLV e T. cruzi. A hibridação foi realizada utilizando
30µl do aDNA total. As amostras foram denaturadas e fixadas em membranas de nylon
HybondTM-XL (Amersham Biosciences).
41
3.10.2 - Sondas moleculares utilizadas
Para a confecção de sondas se seguiu o protocolo do sistema comercial RediprimeTM II
(Random Prime Labelling Sistem, Amersham Biosciences). As marcações foram feitas
utilizando [α-32P] dCTP.
- T. cruzi: kDNA total de T. cruzi (5µl de uma concentração de 80ng/ml).
- HTLV: pool de produtos de PCR corespondentes às regiões tax, env e LTR de HTLV-1 e de
HTLV-2.
As sondas foram purificadas através de centrifugação em coluna MicroSpinTM
(Sephacryl S-200 HR). A resina no interior de cada coluna foi ressuspensa com o auxílio do
vórtex e o lacre inferior foi retirado. A coluna foi colocada em um tubo Eppendorf que serviu
de suporte e foi centrifugada a 6000rpm por 1 minuto, este tubo foi descartado e a sonda foi
aplicada no centro do topo da resina da coluna em um outro tubo e novamente centrifugou se
a 6000rpm por 2 minutos. A sonda purificada foi utilizada na hibridação.
- Pré-hibridação: As amostras fixadas na membrana foram incubadas a 42oC por 1 hora em
contato com a solução de pré-hibridação e em agitação: SDS 0.5%, Formamida 50%, SSC
6X, Denhardt 5X. Após este tempo a sonda preparada foi adicionada a esta solução. Deixou–
se em agitação por 18 horas, após este tempo lavamos a membrana com SSC 0,1% e 0,5%
SDS quatro vezes cada 15 minutos e uma última lavagem por uma hora/60oC. A membrana
foi seca a temperatura ambiente e exposta ao filme de raio X (Kodak X-OMAT AR) a -70oC
por uma semana. A revelação do filme foi realizada no equipamento automático M35 XOMAT Processor (Kodak).
3.10.3 - Southern Blot
Foi utilizada esta técnica após corridos em gel de agarose 3%, os produtos de PCR
amplificados para a região conservada dos minicírculos, este gel foi transferido para uma
solução de desnaturação (NaCl 1.5M, NaOH 0.5M) onde permaneceu a temperatura ambiente
por 35 minutos sob leve agitação. A solução foi substituída por uma de neutralização (NaCl
1.5M, 1.0 tris-HCl pH 8) por mais 30 minutos também sob agitação. Após este tratamento, o
DNA contido no gel foi transferido por capilaridade para uma membrana de nylon HybonTMN+ (Amersham Life Science) utilizando SSC 10X. A transferência foi deixada durante 24
horas. Após a transferência a membrana foi seca a temperatura ambiente e posteriormente o
DNA foi fixado a membrana sob luz ultravioleta (300nm) por 15 minutos e a membrana foi
deixada hibridando durante a noite com a sonda de kDNA de T. cruzi.
42
3.11 - Soluções e meios de cultura
Todas as soluções e meios de cultura utilizados neste estudo foram preparados de
acordo com os protocolos do Maniatis et al., 1989.
43
4. RESULTADOS
44
4.1 – Extrações de aDNA
As extrações de aDNA de todas as amostras foram quantificadas por
espectrofotometria (tabela 4.1).
Durante as extrações foram introduzidos controles para monitorar contaminação
exógena. Em nenhum caso foi constatada a ocorrência de contaminação.
CHUQUISACA
(800 - 1200 d.C)
TIWANAKU
(1500a.C -1200 d.C.)
COCHABAMBA
(800 - 1200 d.C.)
4.1.1 - Quantificações espectrofotométricas
Múmias
(Código
Museu)
323
429
277
348
279
221
268
275
206
405
02
5418
#1
01
5019
PAAK
5326
1590
Ind 1
C-01
C-02
C-03
01Ph
02 Ph
03 Ph
04 Ph
RC
1710
PRF
Icla PRF
Concentração
ng/µ
µl
188,88
115,35
214,93
67,52
32,74
4,95
30,26
22,26
328,8
27,33
88,20
91,76
38,2
14,49
33,28
54,66
123,93
38,28
69,78
114,54
99,50
48,87
73,10
99,5
63,99
62,27
43,88
20,33
10,2
Amplificações da
região
HVS-I (mtDNA)
humana
260/280
2,98
6,1
2,56
3,92
1,55
2,19
2,02
4,52
1,76
2,83
1.45
9,31
8,88
2,28
6,66
5,19
6,09
2,66
10,44
1,61
3,05
1,62
1.30
3,05
1,73
1,49
2,97
1,93
1,9
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Tipo de tecido
Tecido mole
Dente
Osso
Dente
Tecido mole
Tecido mole
Tecido mole
Tecido mole
Dente
Dente
Tecido mole
Osso
Dente
Dente
Osso
Dente e osso
Osso
Dente e osso
Dente
Tecido mole
Osso
Osso
Tecido mole
Dente
Dente
Dente
Dente
Dente
Dente
Tabela 4.1 – Quantificação dos aDNAs extraídos das múmias de Cochabamba, Tiwanaku e Chuquisaca. Dados
sobre a concentração e pureza de ácidos nucléicos (absorbância 260/280) e as amplificações obtidas da região
HVS-I humana nos diferentes tecidos. A marcação em amarelo indica a não amplificação dessas amostras e os
tipos de tecidos utilizados.
45
Em relação ao tipo de tecido e a recuperação de aDNA amplificável há uma relação
positiva quando o tecido é osso ou dente. 14.3% das amostras de osso ou dente não
amplificaram, enquanto que 50% das amostras de tecido mole não amplificaram (tabela 4.1).
- Determinação da integridade e concentração de DNA em gel PAGE 5%
O aDNA total de todas as amostras foi aplicado em PAGE 5%. Os resultados neste gel
mostraram o estado do aDNA extraído. Foi colocado também um Ladder de 100pb.
Pode se notar na pista 6 (5019) um rastro que mostra o aDNA fragmentado. Nas pistas
3 (#1) e 4 (02PC), 5 (405), 7 (03PC), 8 (IC), 9 (04PC) e 10 (277 Ph) conseguimos ver rastros
muito tênues, enquanto não se observa aDNA nas pistas 2 (206).
PM
206
#1
02PC 405 5019
03PC
IC
04PC 277
Figura 4.1 – Visualização em PAGE 8% da integridade do aDNA total de algumas das amostras. Pista
1: PM (ladder Invitrogen 100pb).
46
4.1.2 - Amplificações da região mitocondrial D-loop humana HVS-I (188 pb)
Conseguimos amplificar aDNA de 21 amostras. Os produtos destas foram clonados
e seqüenciados.
As fotos mostram os produtos de PCR de 188pb resolvidos em gel PAGE 8%
(Figura 4.2) e para o caso dos clones visualizados em géis de agarose 3% (Fig. 4.3).
C-
C+
MP
(190pb)
1590
PAAK
02PC
01
188pb
Figura 4.2 – Visualização em PAGE 8% de produtos amplificados das amostras de Tiwanaku. O alvo tem
tamanho aproximado de 188pb e o marcador de peso molecular (MP) utilizado é de aproximadamente 190 pb.
Foram incluídas em todas as reações de PCR e durante as extrações de aDNA,
controles negativos para os reagentes. Os controles positivos (para os reagentes) foram feitos
em outro laboratório. Os resultados demonstram que não foi introduzida nenhuma
contaminação de origem humana durante a montagem da reação de PCR.
Em relação à amostra 01 de Tiwanaku e 277 de Cochabamba só conseguimos
amplificações após PCR reconstrutiva. Não foi possível amplificação do alvo humano das
amostras pré-hispânicas 01PC, 02PC e 1710 de Chuquisaca e das amostras: 206, 268, e 279
de Cochabamba. Das nove amostras de Tiwanaku apenas a amostra 02 foi negativa. Embora
tenha sido possível recuperar o aDNA de quase todos os indivíduos (tabela 4.1), devido a
antiguidade e conservação das amostras, o DNA pode estar muito degradado ou com a
presença de inibidores da PCR.
47
O tipo de amostra (dentes ou ossos) e as condições do ambiente seco e frio das
regiões possivelmente foram fatores determinantes para a recuperação do aDNA dos 22
indivíduos (tabela 4.1).
1590
277 5326c8
03PC
IC
MP
C+
C-
188 pb.
Figura 4.3–Amplicons dos clones obtidos do mtDNA de algumas das amostras de Tiwanaku, Chuquisaca e
Cochabamba (fragmentos de 188pb). Visualizados em Agarose 3%.
48
4.1.3 - Alinhamento das seqüências obtidas da região HVS-1 humana das múmias
pré-colombianas de Tiwanaku, Chuquisaca e Cochabamba.
Figura 4.4- Alinhamento da região HVS-1 de amostras de Chuquisaca, Cochabamba e Tiwanaku. As três últimas
seqüências correspondem às amostras Colonias da Igreja de Santo Domingo de Chuquisaca. Ref. Corresponde à
seqüência referencia de Anderson et al. (1981). M1-M3, são as seqüências dos manipuladores do laboratório.
Encontram-se marcadas as assinaturas que definem aos 4 haplogrupos principais dos ameríndios (Alves-Silva et
al., 2000)
49
As seqüências obtidas das múmias foram alinhadas com a seqüência referência de
Anderson et al (1981), da região D-loop mitocondrial. Mediante o alinhamento foi possível
identificar os polimorfismos que definem os haplogrupos ameríndios (figura 4.3 e tabela 4.3).
As seqüências das três múmias hispânicas achadas na Igreja de Santo Domingo também
foram incluídas neste alinhamento e não apresentaram nenhuma das assinaturas dos
haplogrupos ameríndios. As seqüências das amostras hispânicas foram comparadas com as do
banco GeneBank e sua maior identidade é com amostras européias. Apesar de o manipulador
pertencer ao haplogrupo A todas as múmias com este haplogrupo, apresentam haplótipo
distinto ao do manipulador.
- Posições nucleotídicas que definem haplogrupos ameríndios
Posições nucleotídicas
Haplogrupos
16276 16284 16304 16311 16313
Hapl A
T
-
A
-
-
Hapl B
-
-
-
-
-
Hapl C
-
C
-
C
T
Hapl D
-
-
-
C
-
Tabela 4.2 - Posições nucleotídicas dos polimorfismos que determinam os haplogrupos Ameríndios A, B, C e
D na região D-loop HVS-I.
50
Conseguimos seqüências de 22 múmias, destas 3 foram européias e 19 ameríndias. Os
haplogrupos ameríndios A, B e D foram identificados nas múmias de Tiwanaku, Chuquisaca e
Cochabamba. Entre as seqüências ameríndias 11 pertencem ao haplogrupo B, sete a A e uma
a D (Tabela 4.4).
Procedência
Tiwanaku
Pré-hispânicas
Chuquisaca
Hispânicas
Cochabamba
Amostras
Haplogrupo
1590
D
Indi1
A
5418
A
5326
A
PAAK2004
B
5019
B
#1
B
01
B
03
B
04
A
RC
B
IC
B
C-01
U
C-02
T
C-03
U
277
B
348
A
275
A
323
B
405
B
429
B
221
A
Tabela 4.3 - Resumo dos haplogrupos encontrados nas múmias de Cochabamba, Chuquisaca e Tiwanaku.
51
- Comparação das seqüências das múmias hispânicas com o banco de dados.
As seqüências das múmias hispânicas C-01 e C-03 têm identidade total com
seqüências correspondentes ao haplogrupo U encontrado na Europa (Figura 4.5).
>
gb|DQ856317.1|
Length=16569
Homo sapiens haplotype U6a7 mitochondrion, complete genome
Adhispânico 1 GCCACCCCTCACCCACTAGGATATCAACAAACCTACCCACCCTTAACAGTACATAGTACA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 16255 GCCACCCCTCACCCACTAGGATATCAACAAACCTACCCACCCTTAACAGTACATAGTACA
60
Adhispânico 1 TAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 16315 TAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGA
120
Adhispânico 1 CCCCCCTCAGATAGGGGTCCCTTGACCA
||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 16375 CCCCCCTCAGATAGGGGTCCCTTGACCA
16314
16374
148
16402
Figura 4.5 - Haplotipo da múmia colonial C-01do museu de Chuquisaca, alinhado com uma seqüência do
GeneBank.
Enquanto que a seqüência da amostra da múmia hispânica C-02, apresentou 99% de
identidade com seqüências do haplotipo T encontradas na Espanha (Figura 4.6).
>
gb|EU369395.1|
Length=16569
mulherhisp 1
Sbjct
16255
Mulherhisp
Sbjct
16315
Homo sapiens haplotype T1 mitochondrion, complete genome
GCCACCCCTCACCCACTAGGATATCAACAAACCTACCCATCCTTAACAGTACATAGTACA
||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCCACCCCTCACCCACTAGGATACCAACAAACCTACCCATCCTTAACAGTACATAGTACA
60
TAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGA
120
Mulherhisp121 CCCCCCTCAGATAGGGGTCCCTTGACCA
||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 16375 CCCCCCTCAGATAGGGGTCCCTTGACCA
16314
16374
148
16402
Figura 4.6 - Haplotipo da múmia colonial C-02 do museu de Chuquisaca, alinhado com uma seqüência do
GeneBank.
52
Interessantemente, a amostra 1590 Tiwanaku em que foi identificada a presença
do HTLV-2, que pertence ao haplogrupo D, apresentou identidade de seqüência com um
indivíduo da Mongólia (Figura 4.7).
>
gb|DQ098340.1|
sequence;
mitochondrial
Length=546
1590 1
Sbjct 232
Homo sapiens isolate Hohhot Mongolian54 D-loop, partial
GCCACCCCTCACCCACTAGGATACCAACAAACCTACCCACCCTTAACAGTACATAGTACA 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCCACCCCTCACCCACTAGGATACCAACAAACCTACCCACCCTTAACAGTACATAGTACA 291
1590 61
TAAAGCCATTCACCATACACAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGCCCCCATGGATGA
|||||||||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 292 TAAAGCCATTCACCGTACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGCCCCCATGGATGA
1590
121
Sbjct 352
CCCCCCTCAGATAGGGGTCCCTTGACCA
||||||||||||||||||||||||||||
CCCCCCTCAGATAGGGGTCCCTTGACCA
120
351
148
379
Figura 4.7 - Haplotipo da múmia pré-hispânica 1590 do museu de Tiwanaku, alinhado com uma seqüência do
GeneBank. A marcação vermelha mostra a diferença encontrada entre as duas seqüências.
4.2 – Alvo HTLV
4.2.1 - Amplificações do alvo HTLV
Conseguimos amplicons do segmento do gene Tax de HTLV de aproximadamente
(220pb) das amostras 1590 e 1710 (figuras 4.8 e 4.9).
PM
1590
~220pb.
Figura 4.8 – Visualização em PAGE 8% de produtos amplificados da amostra 1590 de Tiwanaku. O alvo tem
tamanho aproximado de 220pb e o Ladder utilizado é de 100 pb.
53
1590
1710
PM
~220pb
Figura 4.9 – Visualização em gel agarose 3%, amplicons obtidos das amostras 1590 e 1710 do segmento tax de
HTLV, marcador de peso molecular (PM) 100 pb.
4.2.2 - Clones HTLV
Os amplicons dos clones das amostras 1590 e 1710 foram visualizados em agarose
3%, mostrando um tamanho de 220 pb (Figura 4.10).
MP
~220pb.
Figura 4.10 - Amplicons de clones do segmento tax HTLV das amostras 1590 (Tiwanaku) e 1710 (Chuquisaca)
(fragmentos de 220pb), MP (marcador de peso).
54
4.2.3 - Tipagem dos HLTVs
O seqüênciamento dos amplicons relativos ao segmento do gene tax permitiu a
tipagem do HTLV recuperado das múmias 1590 e 1710. Revelando, que a primeira estava
infectada com o HTLV-2, enquanto que a segunda com HTLV-1(Figura 4.11 e 4.12)
>
gb|M63884.1|HL2TAXD Human T-cell leukemia-lymphoma virus type II (from
individual
DS) tax-2 gene, partial cds
Length=956
1590
Sbjct
CTCCCCTCCTTCCCCACCCAGAGAACCTCAAGGACCCTCAAGGTCCTTACCCCTCCCACC 61
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
203 CTCCCCTCCTTCCCCACCCAGAGAACCTCAAGGACCCTCAAGGTCCTTACCCCTCCCACC 262
1590
62
Sbjct
1590
1
ACTCCTGTCTCCCCCAAGGTTCCACCTGCCTTCTTTCAATCAATGCGAAAGCACACCCCC 121
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
263 ACTCCTGTCTCCCCCAAGGTTCCACCTGCCTTCTTTCAATCAATGCGAAAGCACACCCCC 322
122
Sbjct 323
1590
182
Sbjct 383
TACCGAAATGGATGCCTGGAACCAACCCTCGGGGATCAGCTCCCCTCCCTCGCCTTCCCT181
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACCGAAATGGATGCCTGGAACCAACCCTCGGGGATCAGCTCCCCTCCCTCGCCTTCCCT 382
GAACCTGGTCTCCGTCCCCAAAACCTCTACACCCCCTGG
|||||||| ||||||||||||||| |||||||| |||||
GAACCTGGCCTCCGTCCCCAAAACATCTACACCACCTGG
220
421
Figura 4.11 – Seqüência de HTLV-2 da múmia pré-colombiana 1590 do museu de Tiwanaku mostrando uma
diferença (T) em relação a uma seqüência de HTLV-2 (C) do GeneBank (marcação vermelha). Com amarelo a
sequencia dos primers utilizados.
55
Na amostra 1710 de Chuquisaca foi identificada a presença de HTLV-1.
>
gb|DQ323883.1|
(tax)
gene, partial cds
Length=1000
1710
2
Sbjct 189
1710
62
Sbjct 249
Human T-lymphotropic virus 1 strain BRRP464 tax protein
CTCCCCTCCTTCCCCACCCAGAGAACCTCTAAGACCCTCAAGGTCCTTACCCCGCCAATC 61
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTCCCCTCCTTCCCCACCCAGAGAACCTCTAAGACCCTCAAGGTCCTTACCCCGCCAATC 248
ACTCATACAACCCCCAACATTCCACCCTCCTTCCTCCAGGCCATGCGCAAATACTCCCCC 121
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ACTCATACAACCCCCAACATTCCACCCTCCTTCCTCCAGGCCATGCGCAAATACTCCCCC 308
1710
122 TTCCGAAATGGATACATGGAACCCACCCTTCGGCAGCACCTCCCAACCCTGTCTTTTCCA
|||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 309 TTCCGAAATGGATACATGGAACCCACCCTTGGGCAGCACCTCCCAACCCTGTCTTTTCCA
1710
181
Sbjct 369
GACCCCGGACTCCGGCCCCAAAACCTCTACACCCCCTGG
|||||||||||||||||||||||||| ||||||| ||||
GACCCCGGACTCCGGCCCCAAAACCTGTACACCCTCTGG
180
368
219
407
Figura 4.12 – Seqüência de HTLV-1 da múmia pré-colombiana 1710 do museu de Chuquisaca mostrando uma
diferença (C) em relação a uma seqüência de HTLV-1 (G) do GeneBank, em vermelho e em amarelo a seqüência
dos primers.
Ver o alinhamento das seqüências dos clones achados nas amostras 1590 e 1710,
que mostram as diferenças encontradas (figura 4.13 e 4.14).
56
- HTLV-2
Figura 4.13 - Alinhamento das seqüências obtidas dos clones da amostra 1590 HTLV-2 com seqüências
depositadas no GeneBank. Os números de acesso das seqüências contemporâneas são: HTLV-2
(U32875.1/HTU2875); ref 1(H63884.1/HL2TAXD), ref 2 (AF326584.1, AV273635.1); ref 3 (AV2735.1);
ref 4 (H10060.1/HL2V2CG). Em amarelo e azul as diferenças encontradas nos clones da múmia 1590.
- HTLV-1
Figura 4.14 – Alinhamento das seqüências obtidas da amostra 1710 HTLV-1 comparada com seqüências
depositadas no GeneBank.
Os números de acesso das seqüências contemporâneas são: HTLV-1
(DQ323875.1); ref 1(DQ323883.1), ref 2 (AB373952.1); ref 3 (AB045559.1); ref 4 (DQ227164.1). Em
amarelo e verde as diferenças encontradas nos clones da múmia 1710.
57
4. 3 - Alvo T. cruzi
4.3.1 - Amplificações da região conservada dos minicírculos.de T. cruzi do aDNA,
Os primers utilizados amplificam uma região de 121pb, amplicons compatíveis com este
tamanho foram observados para as amostras: IC e 1590. Também foram positivas as
amostras: 277, 04PC e PAAK (Figura 4.15).
PM
1590
IC
121pb.
Figura 4.15 – Visualização em PAGE 8% de produtos amplificados das amostras de 1590 (Tiwanaku) e IC
(Chuquisaca). O alvo tem tamanho aproximado de 121pb e o PM é de 100 pb.
4.3.2 - Clones de T. cruzi
Amplicons dos clones da região conservada dos minicírculos foram visualizados em
agarose 3% (Figura 4.16).
121pb.
Figura 4.16 – Visualização em agarose 3% dos clones amplificados das amostras de IC (Chuquisaca).
Fragmentos amplificados de 121pb.
4.3.3 – Gene do miniexon
Não conseguimos amplificações utilizando ambos pares de iniciadores para o gene
de miniexon (200-250 e 300-350pb).
58
4.4 - Hibridações dos diferentes alvos
4.4.1 - Hibridações com sonda kDNA de T. cruzi
Foram obtidos resultados na hibridação com a sonda de kDNA de múmias dos três
museus. Onze das 29 múmias foram positivas, apresentando sinais muito tênues. As amostras
03PC, IC, 04PC de Chuquisaca; 268, 323, 405, 277 de Cochabamba e 5418, PAAK, 5326 e
1590 de Tiwanaku. Correspondendo a 3/9 Chuquisaca, 4/10 de Cochabamba e 4/10 de
Tiwanaku (Figura 4.16).
Figura 4.17 - Membrana de nylon mostrando os sinais positivos das diferentes amostras na hibridação para T.
cruzi. Foi utilizado um kDNA de T. cruzi como controle positivo.
59
4.4.2 - Hibridação com sonda HTLV-1 e HTLV-2 (pool das regiões pX e LTR de ambos
tipos).
Foram aplicados aDNA total de todas as amostras para o Dot-Blot de HTLV. Duas
apresentaram um sinal tênue, as amostras 1710 de Chuquisaca e 1590 Tiwanaku, La Paz
(Figura 4.17).
Figura 4.18 - Membrana de nylon mostrando os sinais positivos das diferentes amostras 1590 e 1710 e os
controle positivo LTR+pX de HTLV-1 e HTLV-2 nas hibridações para HTLV.
4.4.3 - Hibridação com sonda das regiões pX e LTR do HTLV-2
Na tentativa da obtenção de um sinal mais significativo, para as amostras positivas,
colocamos o dobro de aDNA total da amostra 1590, já que não tínhamos mais material da
1710. Esta amostra foi positiva para PCR de HTLV-2.
Os resultados desta segunda hibridação revelam um sinal forte confirmando com
uma outra técnica molecular a presença do HTLV-2 no individuo tiwanakota (Figura 4.18).
60
Figura 4.19 - Membrana de nylon mostrando sinal positivo da amostra 1590 e do controle positivo LTR+pX
HTLV-2 na hibridação para HTLV-2.
4.5 - Southern Blot para o alvo T. cruzi (sonda kDNA de T. cruzi)
Vários clones da amostra IC (icla) de Chuquisaca amplificaram para o alvo do
minicírculo. Na tentativa de determinarmos a identidade destes amplicons com T. cruzi,
este material foi submetido à Southern blot e posterior hibridação com sondas de kDNA
de T. cruzi. Não obtivemos sinais de hibridação.
61
5. DISCUSSÃO
62
Uma das grandes limitações de trabalhos com aDNA é a disponibilidade do material
arqueológico nos museus, que restringem a coleta de amostras em função da preservação das
múmias. No nosso trabalho nos foi concedido apenas um dente ou pequenas frações de osso
ou tecido mole. Todo material foi coletado em apenas uma viagem feita a Bolívia. Portanto,
tivemos restrições significativas nas extrações o que limita em algumas situações a
abordagem experimental. Ou seja, experimentos casados: determinação de absorbância,
discriminação no gel, PCR para vários alvos, a partir de uma mesma extração em alguns casos
não foi possível.
Os trabalhos que envolvem a recuperação e análise de aDNA têm dois pontos críticos
a serem considerados: a qualidade do DNA e a contaminação do material arqueológico com
DNA exógeno, que pode acontecer durante a escavação e estocagem em Museus e/ou durante
os procedimentos no laboratório.
Todas as amostras que fizeram parte de nosso estudo, tecidos humanos mumificados,
foram recuperadas de sítios arqueológicos na Bolívia e vêm sendo mantidas em coleções de
diferentes museus do país. Na ocasião das escavações, e durante a estocagem, dentro dos
museus, não foram tomados cuidados específicos para evitar contaminações modernas do
material biológico, a única exceção foi o Museu Chuquisaca, que instalou lâmpadas UV, na
sala onde estavam armazenadas todas as múmias pré-colombianas . Pruvost et al., (2007),
mostrou que o ponto mais crítico para preservação de aDNA, seria a alteração das condições
de temperatura e umidade após a retirada do material do sítio arqueológico, e posterior
estocagem. A mudança destas condições acelera o processo de degradação, portanto
recomenda-se a retirada do material em condições estéreis, sem limpeza do mesmo, além do
imediato congelamento e estocagem em temperaturas entre -20 oC a -70oC.
As múmias do nosso estudo foram retiradas de sítios arqueológicos que apresentam
temperaturas anuais médias de 18oC e clima extremamente seco, condições favoráveis à
preservação de material biológico e muito semelhantes àquelas em que foram mantidas nos
Museus. Por exemplo, o material proveniente de Tiwanaku, em La Paz, onde as temperaturas
se mantêm numa média de 16oC e ambiente seco, foram aquelas com melhor recuperação de
aDNA, apesar de serem os mais antigos, corroborando com os resultados de Pruvost et al.,
(2007).
Todo o trabalho experimental foi desenvolvido na sala de paleo-genética, que fica
isolada e distante fisicamente (em outro andar) do laboratório principal. Esta sala é equipada
com luz UV para descontaminação do ambiente e de capelas, para processamento
independente do material, durante todo o processo que envolve: limpeza do material,
63
trituração, isolamento do DNA (utilizando kit), montagem da PCR e reação de PCR. Além
disto, temos em todas as etapas, controles negativos. Estas são as metodologias sugeridas para
evitar/contornar a contaminação do material mumificado por material exógeno (Cooper et al.,
2000; Malmström et al., 2005; Sampietro et al., 2006). Três múmias hispânicas do museu de
Chuquisaca foram incluídas como forma de controle de contaminação moderna, tanto
considerando o local de estocagem quanto a manipulação no laboratório.
Após a morte, com a ausência do sistema de reparo das células vivas, a molécula do
DNA vai sendo rapidamente degradada. Por tal motivo, em estudos envolvendo a recuperação
de aDNA, normalmente se consideram segmentos de em torno de 200pb, na PCR (Pääbo,
1988, Madden, 2001). Quando possível, é recomendável que se utilizem genes com várias
cópias. Salvo em situações muito especiais, a obtenção de produtos de PCR maiores que
300pb é uma evidência de contaminação com material moderno.
O DNA extraído de material arqueológico pode ser avaliado quanto à sua
concentração, pureza e integridade. Pela espectrofotometria pode-se estimar a concentração e
pureza de ácidos nucléicos (Sambrook & Russell 2001). Nossos resultados indicam pela
relação de absorbância OD260:OD280, que temos a efetiva presença de DNA, mas este pode
estar degradado, de qualquer maneira, a visualização obtida em um gel, é que pode nos dar o
conjunto de
informações: presença de DNA/quantidade/integridade. Portanto, já que
obtivemos, da maioria das amostras 22/29, a recuperação de aDNA humano podemos
considerar que o material tinha condições mínimas de integridade e pureza, já que as reações
de PCR não foram inibidas.
Em relação à recuperação de aDNA humano, nosso alvo era o segmento de 188pb de
DNA mitocondrial correspondente a região HVS-I, que ocorre em várias cópias. E como
sugerido por Malmström et al., (2007), para evidenciar a contaminação do material por DNA
humano atual, tentamos também, amplificar da mesma região um fragmento de 405pb. Não
obtivemos, para nenhuma das amostras, o fragmento de 405pb enquanto que, o segmento de
188pb foi amplificado da maioria (22/29) das amostras. Além disto, nenhum dos haplótipos
obtidos para as múmias tinha identidade total com o do manipulador ou pessoal do
laboratório. Com isto, podemos considerar que os haplótipos recuperados e identificados no
material arqueológico, eram oriundos das populações ameríndias pré-colombianas
pertencentes às culturas Tiwanaku, Colla Aymara, Puqui, Mojocoya e Presto Puno da Bolívia.
Os haplótipos identificados nas múmias apresentaram as assinaturas que determinam
os haplogrupos ameríndios A, B e D, e mostraram padrões de distribuição já descritos para as
regiões andinas. Contudo, pela primeira vez, determinaram-se haplogrupos de populações pré64
colombianas bolivianas, informação importante para entender o povoamento desta região. As
múmias hispânicas apresentaram haplótipos de origem européia, o que além de fornecer
informação sobre seus haplogrupos e as origens destes indivíduos, demonstram que não
existiu contaminação humana atual durante a manipulação do material no laboratório, já que
os manipuladores apresentam haplótipos diferentes.
O haplogrupo T presente na múmia hispânica (C-03) foi identificado na Espanha
(Alvarez et al., 2007). Estudos antropológicos com estas múmias sugeriram a provável origem
espanhola destes indivíduos (Salinas, 2004). Nossos achados são a evidência biológica para
esta afirmação.
Em relação à preservação destas múmias hispânicas, Salinas (2004), sugere que a
forma de enterramento, o ambiente seco e as temperaturas estáveis dentro das igrejas
permitiram a mumificação espontânea e minimizaram a contaminação, colaborando com a
preservação do material genético. De um modo geral o material mumificado obtido na Bolívia
encontra-se em condições favoráveis para recuperação de aDNA quando comparado a
amostras do Brasil (Fernandes, 2007). O que evidência o papel das condições ambientais
(temperatura e umidade) na preservação do material biológico.
Analisando material moderno e arqueológico, Moraga et al (2001), sugerem que as
populações quéchuas e tiwanakotas das regiões andinas, têm um ancestral comum de origem
amazônica. Da mesma forma, Rothhameer et al (2003) sugerem também esta origem para as
populações dos Andes. Este postulado parte da obtenção de freqüências maiores para os
haplogrupo C e D seguidos de B e A. Sendo que esta é a distribuição atual dos haplogrupos
nas populações amazônicas.
Bert et al., 2004, analisam 53 indivíduos da região oriental da Bolívia (amazônica)
(Llanos de Moxos, Beni), nos quais encontraram os quatro haplogrupos Ameríndios nas
seguintes proporções: A 18.5% (n=10), B 24.1% (n=13), C 50% (n=27) e D 5,6% (n=3), esta
população, segundo os autores, apresenta a maior diversidade encontrada em ameríndios.
Considerando que esta população ocupa uma pequena região, sugere-se duas hipóteses: os
quatro haplogrupos entraram nessa região há muito tempo atrás, ou a introdução destes por
migrações recentes (miscigenação). Os dados genéticos, linguísticos e culturais dão suporte
para que a variabilidade possa ser ancestral e não produto da miscigenação.
Estudos posteriores revelam que os haplogrupos B e A representaram as maiores
freqüências em populações andinas, inclusive nas análises do material arqueológico do Chile
e Peru é reportado o mesmo padrão (Moraga et al., 2005; Rodriguez- Delfin et al.,1999;
Merriwether et al., 1995; Garcia et al., 2006). Nossos resultados concordam com os
65
encontrados nas regiões andinas. Nas múmias da Bolívia, encontramos em maior proporção o
haplogrupo B, seguido de A, unicamente o indivíduo 1590, de Tiwanaku, apresentou o
haplogrupo D.
Shinoda et al., 2006, analizaram o mtDNA de 57 múmias do Império Inca em Machu
Pichu, Peru. O estudo novamente revelou o haplogrupo B como o mais freqüente, seguido de
C, A e por último D. Este padrão sugere uma afinidade genética com as populações modernas
dos Andes centrais, principalmente da Bolívia e do Peru.
Na América do Sul, em geral, as freqüências de A e B diminuem de Norte a Sul,
enquanto que as dos haplogrupos C e D aumentam (Shimada et al., 1999; Moraga et al., 2000;
Garcia et al., 2006).
As seqüências das múmias pré-colombianas de nosso trabalho são encontradas
também em populações da Mongólia e da Sibéria, contribuindo com a hipótese de origem dos
primeiros povoadores das Américas terem se originado destas regiões.
As reconstruções históricas, apoiadas em análises genéticas sugerem que a forma
doméstica do T. infestans e, portanto da tripanossomíase americana, tenha se disseminado,
desde a Bolívia para os países vizinhos, através das migrações humanas. Uma destas
dispersões pode ter estado associada aos índios Chinchorro ou Wankarani, que migraram da
Bolívia para se estabelecer no Norte do Chile e Peru (Rothamer et al., 1985; Rojas &
Schofield, 2003). Lesões associadas à Doença de Chagas e à identificação de T. cruzi em
múmias destas culturas (Rothamer et al., 1985; Fornacieri et al., 1992; Guhl et al., 1999;
Ferreira et al., 2000), datadas de 4000 até 9000 anos a.C. demonstraram, definitivamente, que
a entrada do homem no ciclo de transmissão do T. cruzi foi muito anterior à colonização
(Aufderheide et al., 2004). É claro que, com a colonização européia, foram introduzidas novas
relações de produção, novas formas de ocupação da terra e novos modos de morar, entre eles
as casas de adobe na região dos Andes, o que facilitou a domiciliação e, posterior dispersão
para o resto do continente, do T. infestans (Briones et al., 1999). É sugerido que esta dispersão
tenha acontecido a partir da Bolívia pela presença do T. infestans dark morph encontrado no
ecótopo silvestre, naturalmente infectado (Noireau et al., 2005).
A caça do roedor (Galea musteloides) e sua criação, como fonte de alimento, são
atividades antigas das populações bolivianas que podem ter propiciado a rota inicial para a
domiciliação de T. infestans à aproximadamente 3000-4000 anos (Dujardin et al., 1998). O
consumo da carne do roedor (reservatório de T. cruzi), o que pode ter sido na antiguidade uma
das vias de transmissão oral do parasito.
66
Trabalhos determinaram a presença de T. cruzi em material mumificado do Chile e
Peru. Como alvo utilizaram a região variável do minicírculo de 330pb (Guhl et al., 1999;
Ferreira et al., 2000; Madden et al., 2001), enquanto que Aufderheide et al., (2004),
analisaram a região conservada do minicírculo, que possui múltiplas cópias, e tamanho de
121pb.
A identidade dos produtos das PCRs foi indiretamente determinada por hibridação
dos mesmos com sonda de kDNA total de T. cruzi. Madden et al. (2001), foram os únicos
que clonaram e seqüenciaram os produtos amplificados (85pb e 70pb) obtidos pela técnica de
semi-nested PCR. Recentemente foi realizada a primeira tipagem de T. cruzi recuperado de
material humano mumificado do Brasil datado 5000-2500 anos atrás. A linhagem identificada
por seqüênciamento da região espaçadora do gene de mini-exon e TCI (Lima et al., 2008).
Nossa abordagem envolvia a amplificação das regiões conservadas dos mini-círculos,
clonagem e seqüenciamento dos amplicons e paralelamente a hibridação com sondas de
kDNA de T.cruzi versus aDNA total recuperado do material arqueológico. Em 11 dos 29
aDNA total das múmias, conseguimos sinal positivo de hibridação para T. cruzi em: 3/9
Chuquisaca, 4/10 de Cochabamba e 4/10 de Tiwanaku. Enquanto que, só 05 (NH, 04PC, 277,
1590 e PAAK) das amostras tiveram resultado positivo da PCR relativos à região do
minicírculo (121pb). Já em relação à PCR do alvo mini-exon (200-350pb), não obtivemos
positividade. 02 (206, 268) das 11 amostras positivas para hibridação, possivelmente
continham inibidores para reação de PCR, já que não foi possível recuperar mtDNA humano
das mesmas. Poderíamos então esperar a recuperação de aDNA de T. cruzi de 09 das
amostras, mas mesmo aquelas, em que houve a amplificação de um segmento de em torno de
121pb, o seqüenciamento dos clones obtidos de 03 delas (IC, 04PC, 1590), não revelou a
presença de DNA de T. cruzi.
O resultado da hibridação, que foi feita em condições de alta especificidade, é robusto o
suficiente para indicar a presença do parasito em múmias bolivianas pré-colombianas. A não
identidade do aDNA recuperado (minicírculo região conservada 121pb) com T. cruzi, nestas
mesmas amostras, pode ser conseqüência da amplificação preferencial de material genético de
organismos contaminantes, e DNA humano, que estejam em maior concentração e
integridade. Portanto há a possibilidade de os amplicons obtidos, não corresponderem de fato
ao parasito e isto foi constatado pelo sequênciamento de clones do fragmento de 121pb.
Gulh et al., (2000) e Aufderheide et al., (2004), analisando múmias do Chile e Peru de
9000-600 anos atrás revelaram a prevalência da infecção por T. cruzi entre 26%-41%
respectivamente. Estas prevalências são concordantes com a frequencia encontrada em nosso
estudo (38%).
67
Salemi et al., (2000), realizaram análise de genomas completos de PTLVs, Vírus
Linfotrópico das Células T de Primatas, que são os STLVs e os HTLVs , visando determinar
quando se estabeleceram como linhagens independentes, em seus atuais hospedeiros. Toda a
construção se baseou tanto nos dados relativos a presença atual do vírus/hospedeiro assim
como nas migrações ancestrais de símios e humanos.
Existem evidências de migrações de macacos da África para a Ásia 2.000.000 anos
atrás, estes estariam infectados com PTLVs, que teriam dado origem aos STLV-1 e aos
demais PTLV-1, a 93.000 anos atrás na Ásia. A presença destes vírus na África é
conseqüência de migrações humanas e /ou símios, a partir da Ásia entre 60.000-19.500 anos
atrás, em um movimento de volta à África. Assim, determinaram que o ancestral símio do
HTLV-1b, HTLV-1a Africano e os subtipos Cosmopolitas divergiram em torno de 19.500
anos atrás, na África e o HTLV-1a 12.700 anos atrás.
O HTLV-2 teria emergido, a partir de STLV-2, na África há 400.000 anos sendo,
portanto uma virose humana muito mais antiga que o HTLV-1. O que explicaria sua menor
capacidade de causar doenças em humanos, já que teriam um longo tempo de evolução
juntos. O tipo HTLV-2d Africano teria se separado dos HTLV-2a e HTLV-2b Ameríndios
58.000 anos atrás enquanto que os HTLV-2a e HTLV-2b se estabeleceram como linhagens
independentes em torno de 22.000 anos atrás.
O vírus HTLV encontra-se presente em populações ameríndias de toda a América.
Estudos mostram que, dentre 17 grupos nativos Sul Americanos, oito grupos étnicos dos
Andes e das terras baixas, há soropositividade para este vírus. Os resultados mostram que
indivíduos HTLV-1 positivos foram encontrados entre os grupos étnicos dos Andes, enquanto
os casos positivos de HTLV-2 entre os grupos étnicos das terras baixas. Foi também
identificada a presença do HTLV-1 entre os Aymara do Peru e Bolívia e os Quéchuas da
Bolívia, na Puna Argentina e no deserto de Atacama no Chile. Enquanto o HTLV-2 foi
achado entre os Kayapó do Brasil, Chaco do Paraguai e entre os Alakalf do Chile. (Fujiyoshi
et al 1999).
Até 1993, a presença do HTLV-2 foi identificada em 11 das 38 tribos examinadas de
Norte à Sul do Continente Americano (Reeves et al 1990; Lairmore et al 1990; Hjelle et al
1990; Dueñas-Barajas et al 1992; Maloney et al 1992; Hjelle et al 1992; Levine et al 1993),
algumas delas ainda bastante isoladas do contato com populações cosmopolitas. A ampla
distribuição deste vírus em populações ameríndias atuais e a falta de evidência da presença do
vírus dos símios (STLV) no continente sugerem que o vírus tenha migrado ancestralmente
para continente Americano junto com os primeiros povoadores.
68
Sobre a existência de HTLV na Bolívia, Ohtsu et al (1987) e Tsugane et al (1988),
analisaram imigrantes japoneses, provenientes de regiões endêmicas de HTLV-1. Nestas
populações estabelecidas unicamente, nas terras baixas amazônicas do departamento de Santa
Cruz, foram identificados anticorpos para HTLV-1, que segundo o estudo se incrementam
com a idade. A maior prevalência estava entre as mulheres indígenas. Os resultados obtidos
para os nativos bolivianos podem ser conseqüência da co-habitação com os imigrantes
japoneses ou a existência prévia do vírus nestas populações.
A recuperação de aDNA de HTLV-2 da múmia 1590, de Tiwanaku, com idade
estimada entre 3600-800 anos, é a primeira evidência biológica da ancestralidade do HTLV-2
em populações ameríndias. A informação genética recuperada é da região do gene tax, e
encontramos uma/duas variações nucleotídicas quando comparada com seqüências
contemporâneas. Considerando que esta é a região mais conservada nos genomas dos HTLVs,
a variação encontrada é significativa. Demonstrando também não ser uma contaminação
contemporânea. Quanto a este aspecto, temos a evidência da hibridação do aDNA total da
múmia 1590, com sondas específicas para HTLV-2, o que afasta uma contaminação e
confirma a infecção. Além disto, conseguimos determinar o haplogrupo (D) deste indivíduo.
Interessantemente o haplótipo do indivíduo 1590 apresenta 99% de identidade com haplótipos
presentes em populações da Mongólia, local sugerido com origem dos ameríndios. Esta
hipótese é sustentada pelas analises do mtDNA e a distribuição dos quatro haplogrupos (A, C,
D e X), dos cinco haplogrupos ameríndios, nas populações da Sibéria, e do haplogrupo B na
Mongólia (Neel et al., 1994).
Salemi et al (2000) observaram que, de acordo com seus cálculos, o período de
separação do HTLV-2a e HTLV-2b estaria em torno de 12.000-38.000 anos atrás, que seria
coincidente com o das migrações humanas, via estreito de Bering, da Ásia para o
assentamento nas Américas. Esta evidência, somada aos dados de prevalência destes vírus em
populações ameríndias, apontariam para a ancestralidade do HTLV-2 no continente.
Sustentando mais uma vez esta hipótese o HTLV-2 foi identificado em nativos da Mongólia
(Hall et al 1994b).
A partir da amostra 1710, de 1200-800 anos de idade, da região de Chuquisaca,
Bolívia, foi possível recuperar seqüência nucleotídica da região do gene tax do HTLV-1. Esta
é a segunda evidência biológica, da presença do vírus HTLV-1 em populações précolombianas andinas. Li et al., (1999), reportaram a identificação, em múmia chilena de 1500
anos, do HTLV-1. Considerando a coincidência da datação e da origem andina das duas
múmias, a do Chile e a de nosso estudo, temos agora evidências biológicas, da presença do
69
HTLV-1, nos tempos pré-colombianos e, portanto a hipótese, mais aceita atualmente, da
introdução do HTLV-1 nas Américas, via o tráfico de escravos nos séculos XVI e XVII,
talvez não seja a única (Van Doreen et al., 1998; Vandame et al., 2000). Nossa seqüência
apresenta uma variação nucleotídica quando comparada às seqüências contemporâneas. Mais
uma vez, temos a considerar que, o gene tax é a região, dos genomas dos HTLVs, mais
conservada. A maioria das seqüências dos clones da múmia chilena, correspondentes a
segmento deste gene, apresentavam nenhuma ou uma diferença, quando comparadas com a
seqüência referência ATK. Além de recuperação de informação genética, tivemos a evidência,
da presença do provirus HTLV-1, no aDNA desta amostra, através do resultado positivo da
hibridação do aDNA total da múmia 1710, com sondas para HTLV, o que afasta a
possibilidade de contaminação moderna.
70
6. CONCLUSÕES
71
Nas populações das culturas Tiwanaku, Mojocoya, Colla Aymara, Presto Puno e Puqui
da Bolívia o haplogrupo B foi predominante, seguido do haplogrupo A. Os haplótipos
encontrados nestes indivíduos têm identidades com haplótipos encontrados em populações
atuais da Mongólia e da Sibéria.
Os genótipos das múmias, caracterizadas como coloniais segundo os dados
arqueológicos dos museus de Charcas em Chuquisaca, confirmaram sua origem européia.
Existia a infecção por T. cruzi na Bolívia entre populações pré-hispânicas de
Chuquisaca, La Paz e Cochabamba datadas de 3600-900 anos atrás.
As evidências biológicas da presença de HTLV-1 na múmia 1710 (1200-800 anos) e do
HTLV-2 na múmia 1590 (3600-900 anos) corroboram a hipóteses da introdução ancestral dos
virus nas Américas.
72
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