Modulação da Expressão Gênica em Microorganismos Patogênicos
Geise dos Santos Camargo1
Ellen Luzia Brancucci 2,
Reginaldo Pereira Santos3,
Jose Augustin Quincoces4
Márcia Regina Machado dos Santos 5
Área do Conhecimento: Ciências da Vida
Palavras-chaves: Trypanosoma cruzi, diferentes cepas, expressão diferencial de genes
INTRODUÇÃO
METODOLOGIA
O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da
Doença de Chagas, descoberta em 1909 em Lassance,
MG, pelo cientista Carlos Chagas quando trabalhava no
combate à malária que atingia aquela região. O parasita
apresenta diferentes formas nas fases aguda e crônica da
doença, sendo as formas epimastigotas e tripomastigotas
metacíclicas encontradas no inseto vetor e as formas
amastigotas intracelulares e tripomastigotas sanguínea
no hospedeiro humano. A expressão diferencial de
genes nas diferentes cepas T. cruzi, expostas a diferentes
concentrações de benzonidazol, mostrou a existência
de parasitas resistentes ao medicamento (Villarreal et
al, 2005). Outro importante aspecto é a diferença de
sensibilidade às drogas usuais de tratamento das diferentes
cepas do parasita. Dessa maneira, faz-se necessário e
urgente o desenvolvimento de novas drogas, mais baratas
e fáceis de administrar e que sejam também eficazes para
o tratamento da fase crônica da doença.
Substâncias bioativas sintéticas derivadas de
compostos prenilados constituintes da própolis brasileira
foram desenvolvidas pelo grupo do Dr. José Quincoces
(Pisco et al, 2006) e mostraram ter uma eficiente atividade
anti-tumoral, antimicrobiana, fungicida e leishmanicida
(comunicação pessoal), sugerindo que essa ação seja, por
meio de sua atividade antioxidante, predita anteriormente
pelo modelo em TOPS-MODE. No nosso projeto,
analisamos a atividade anti-Trypanosoma cruzi de
compostos sintéticos derivados da própolis brasileira. As
estruturas químicas dos compostos estão sob sigilo devido
a processo de patentes.
OBJETIVOS
Teste de viabilidade celular pela técnica de
Exclusão pelo Azul Tripan: com a finalidade de determinar
a viabilidade das células, foi acrescentado à suspensão de
células 100 µl de Azul Tripan (2%). Após homogeneização,
uma gota da suspensão foi colocada entre lâmina e lamínula
e realizada a contagem percentual, sendo consideradas
mortas (inviáveis) as células que incorporavam o corante
e, viáveis as que excluíam o azul Tripan.
Neste projeto utilizaremos como modelo o
parasita T. cruzi sob ação de um painel de compostos
sintéticos em testes de citotoxicidade (IC50) e análise da
susceptibilidade de diferentes cepas em relação a estas
substâncias. Objetivamos encontrar uma suposta droga
com maior eficácia e especificidade e menos tóxica quando
comparada ao benzonidazole no tratamento da forma
aguda da doença.
O efeito citotóxico dos compostos foi avaliado
pelo cálculo do IC50, ou seja, a concentração onde obtemos
um efeito tóxico para 50 % das células adicionadas no
poço. Esse efeito foi avaliado por teste de exclusão de
viabilidade pelo Azul de Tripan (Gibco, Invitrogen) e MTT
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide, da Sigma-Aldrich).
Laboratório de Pós Graduação e Pesquisa em Farmácia, Universidade
Bandeirante de São Paulo, UNIBAN
Estudante do Curso de Biomedicina1
Estudante do Curso de Biomedicina2
Técnico do Laboratório de Farmácia, UNIBAN3;
Professor da Universidade Bandeirante de São Paulo4
Professor orientador da Universidade Bandeirante de São Paulo5; e-mail:
[email protected]
1,2,3,4,5
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MTT - Método colorimétrico de avaliação
da sensibilidade do parasita aos compostos: um ensaio
colorimétrico baseado no 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide, um sal tetrazólico
amarelo que é convertido a formazan, um precipitado
violeta, por desidrogenases das células vivas ( Abate et al.,
1998). As placas de 96 poços contendo os parasitas e os
compostos serão incubadas a 28 ºC por 48 h. Em seguida,
10µl de solução de MTT (5 mg/ml) serão adicionados
a cada poço das placas e reincubadas por 16 h. Se um
precipitado violeta (formazan) aparecer, 50 µl de solução
de solubilização (1:1 SDS 20 % e N, N-dimetilformamida
50%) serão adicionados e incubados por 3 horas. A mudança
de cor, de amarelo para violeta, indica viabilidade celular
e a quantidade de formazan resultante é proporcional ao
número de parasitas vivos. Os controles serão realizados e
os experimentos feitos em triplicatas.
Atividade antiparasitária em culturas das formas
epimastigotas de T.cruzi. Em testes iniciais de toxicidade
e sensibilidade aos compostos utilizaremos as formas
epimastigotas de T. cruzi cepas G e CL cultivadas em
meio LIT (triptose mais infusão de fígado), suplementado
com 10% de Soro Fetal Bovino de 24 a 48 horas. Em
seguida, um ml contendo 106 parasitas será colocado em
placas de 24 poços e diferentes concentrações (0,5 a 250
µg) do composto serão adicionadas aos respectivos poços
e as placas mantidas em cultura por 96 horas a 28° C. A
atividade antiparasitária será avaliada pela contagem do
número de parasitas em câmara hemocitométrica e pelos
métodos já descritos que avaliam a viabilidade celular para
cálculo do IC50. Serão realizados dois experimentos em
diferentes ocasiões e com duplicatas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Culturas de Trypanosoma cruzi de cepas G e
Cl: foram utilizados 3.104 de parasitas/ml distribuídos
em placas de 96 poços contendo 200μl. Os compostos
usados foram diluídos de acordo com sua solubilização
(H2O ou DMSO). Adicionamos aos poços as diferentes
concentrações dos compostos e, transcorrido o intervalo
de tempo entre 24 e 72 horas, foram feitas contagens
em câmara de Newbauer para avaliar a atividade antiparasitaria. Os resultados estão representados nos gráficos
da Figura1 e Figura 2.
Figura 1. Diferentes cepas de T. cruzi tratadas com diferentes
concentrações dos compostos DB2,HB2,VN02,R5, VBr2,
V4
Figura 2. Trypanosoma cruzi : cepas G e CL tratadas com diferentes concentrações dos compostos em
duplicatas que foram analisadas no período transcorrido entre 24 e 72 horas, respectivamente.
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CONCLUSÕES
Os experimentos “in vitro “ realizados para exposição do parasitas às substâncias (entre 24 e 72 horas).
avaliar a atividade antiparasitária de 12 compostos Tais dados são preliminares e serão agora analisados por sua
sintéticos, nas formas epimastigotas de T. cruzi cepa G significância estatística. Estão em andamento experimentos
e CL, mostraram atividade tripanocida nas diferentes de análise da atividade destes compostos em outras cepas
concentrações utilizadas. Os dados também sugerem uma de T. cruzi, ação sob as formas amastigota intracelular e
diferença de susceptibilidade entre parasitas das cepas G obtenção do RNA dos parasitas tratados, verificando o
e CL em relação aos compostos bem como ao tempo de papel do composto na modulação da expressão de genes.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Pisco L, Kordian M, Peseke K, Feist H, Michalik D, Estrada E, Carvalho J, Hamilton G, Rando
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review
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Chagas
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