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VARIABILIDADE GENÉTICA DOS GENES PERIOD E DEFENSINA
NAS POPULAÇÕES DE Lutzomyia longipalpis (DIPTERA:
PSYCHODIDAE) DE NATAL (RIO GRANDE DO NORTE) E
TRIUNFO (PERNAMBUCO)
Moises Thiago de Souza Freitas1 ; Valdir de Queiroz Balbino2
1
Estudante do Curso de Ciências Biológicas Bacharelado- CCB – UFPE; E-mail: [email protected],
2
Docente/pesquisador do Depto de Genética – CCB – UFPE. E-mail: [email protected].
Sumário: Por ainda não haver um consenso entre os pesquisadores sobre o status
taxonômico de Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) no Brasil, faz-se necessário o
desenvolvimento e a aplicação de métodos de análise mais robustos que contribuam para o
esclarecimento desta questão. Neste trabalho, foram avaliados os polimorfismos de um
segmento do gene period em duas populações simpátricas de Sobral, Ceará,
correspondentes aos fenótipos “uma pinta” e “duas pintas”, simbolizadas por 1S e 2S,
respectivamente. Foram analisadas 46 sequências nucleotídicas de 493 pb de extensão, nas
quais estão inseridas um trecho de 266 pb frequentemente frequentemente utilizado em
estudos de genética de populações e filogeografia de Lu. Longipalpis. Os resultados
derivados do uso das diferentes metodologias de análise genético-populacional aqui
empregadas (e.g. Fst e ad hoc [∆K]) mostraram que o marcador period não se apresenta
como uma ferramenta útil para estudos filogeográficos de Lu. longipalpis, uma vez que
foram identificados haplótipos compartilhados entre indivíduos com fenótipos distintos
pertencentes a populações diferentes.
Palavras-chave: genética de populações; Leishmaniose; Lutzomyia longipalpis
INTRODUÇÃO
A controvérsia acerca do status taxonômico de Lutzomyia longipalpis foi levantada pela
primeira vez por Mangabeira (1969), ao observar que espécimes machos coletados nos
Estados do Ceará e do Pará diferiam quanto ao número de pintas presentes nos tergitos
abdominais – um ou dois (1S e 2S, respectivamente). Desde então, a possibilidade da
existência de espécies crípticas de Lu. longipalpis tem sido um tema recorrente na
literatura, motivando a realização de uma série de trabalhos voltados para o esclarecimento
do status taxonômico desta espécie. A primeira espécie formalmente reconhecida como
integrante do complexo Lu. longipalpis foi descrita com base no estudo de caracteres
morfométricos, sendo denominada Lu. pseudolongipalpis (Arrivillaga et al, 2001). Mais
recentemente, Vigoder et al. (2010) propuseram o reconhecimento de Lu. cruzi também
como integrante do complexo Lu. longipalpis. Diversos estudos têm sido realizados para o
reconhecimento das espécies do complexo Lu. longipalpis, envolvendo a análise de um
grande número de populações representativas de áreas das Américas do Sul e Central
(Bauzer et al. 2007). De uma forma geral, os resultados obtidos sugerem a existência de
um número ainda indefinido de espécies no complexo Lu. longipalpis na Região
Neotropical (Lanzaro et al. 1993, Arrivillaga et al. 2002). O status taxonômico da Lu.
longipalpis no Brasil também é bastante controverso, uma vez que alguns autores
consideram as populações distintamente separadas no Brasil como associadas a uma
espécie única (e.g. Mukhopadhyay et al. 1997, Balbino et al. 2006), enquanto que outros
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reconhecem a existência de espécies crípticas alopátricas e simpátricas (e.g. Bauzer et al.
2002a, Hamilton et al. 2004). Recentemente, Peixoto et al. (2001) isolaram novos
marcadores (cac e desat), considerados como marcadores de especiação, por interferirem
na determinação do nicho ecológico dos insetos. É neste mesmo contexto que o marcador
molecular period também se encontra inserido, controlando assim o ciclo circadiano dos
insetos, além de ser geralmente considerado como uma boa opção uso para se traçar
padrões filogenéticos de Lu. longipalpis (Bauzer 2002a). Neste trabalho, descreve-se uma
análise de 46 sequências do gene period na população Lu. longipalpis de Sobral (CE),
através de softwares de análise populacional e filogenética.
MATERIAIS E MÉTODOS
Inicialmente foram realizadas coletas no município de Sobral, Ceará; os espécimes
pertencentes à espécie Lutzomyia longipalpis foram triados com auxilio de um
estereomicroscópio e posteriormente armazenados em recipientes contendo álcool 90%.
Em seguida, foram realizadas as extrações de DNA dos espécimes utilizando-se uma
metodologia baseado no uso de Chelex 5% (Bio Rad). A quantidade de DNA das amostras
foi definida por espectrofotômetro, onde foram observadas a concentração e razão (medida
da eficiência da extração). Em seguida, foram realizadas as reações de amplificação com o
kit Go Taq (PROMEGA), seguindo as orientações do fabricante. Os produtos de PCR
foram purificados com o kit Kit Wizard® Genomic DNA Purification e seqüenciados na
Plataforma de Sequenciamento do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (Fiocruz/Recife).
Foi utilizado o kit BygDye Terminator v3.1 Matrix Standard (Applied Biosystems) e os
mesmos iniciadores usados nas reações de amplificação. Para cada espécime foram
realizadas quatro reações de seqüenciamento, sendo duas reações com cada iniciador. Foi
analisado o índice de fixação (Fst) pareado, que estima a diferença genética entre os pares
de populações (Hudson, 1992), com a ajuda do software Arlequin versão 3.1 (Excoffier et.
al., 2005) utilizando-se 1000 permutações aleatórias. As análises de estruturação genética
das populações de Lu. longipalpis foram realizadas com a metodologia ad hoc (∆K)
(Evanno et al. , 2005 ), através do software Structure 2.3 (Pritchard, 2000), que se baseia
num algoritmo de agrupamento bayesiano para estimar a probabilidade de um indivíduo
pertencer a um dado grupo/população. A análise foi realizada com amostras da população
de Sobral (CE) por meio da sua divisão em dois grupos correspondentes aos fenótipos 1S e
2S, sendo que cada um desses grupos foi analisado quanto a sua estruturação genética.
RESULTADOS
Para a análise dos polimorfismos do gene period, observou-se que os valores de Fst
obtidos ao se comparar os fenótipos 1S e 2S de Sobral foram estatisticamente
significativos, indicando que essas populações podem, de fato, representar espécies
geneticamente diferentes. Esta tendência foi observada ao se utilizar tanto o fragmento de
493 pb quanto o fragmento de 266 pb, sendo que o valor de Fst obtido com o fragmento
maior foi estatisticamente mais significativo. Demonstrou-se, assim, que a utilização de
fragmentos com um maior número de sítios polimórficos resulta na obtenção de padrões
mais condizentes com a história evolutiva de uma população. As análises de estruturação
genética para populações simpátricas de Sobral (1S e 2S), por sua vez, também indicaram
uma subdivisão em dois subgrupos principais (valor ad hoc de K = 2).
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DISCUSSÃO
A análise feita com o Arlequin versão 3.1 (Excoffier et. al., 2005) demonstrou que a
formação dos dois principais grupos nas análises de Fst baseadas no marcador per são
similares às descrições de Araki et, al. 2009. Os resultados apontados pela análise com a
metodologia ad hoc (∆K) (Evanno et al., 2005 ) mostraram que algumas das
inconsistências deste marcador se devem ao fato de existirem haplótipos compartilhados
entre indivíduos com fenótipos distintos pertencentes a populações fenotípicas diferentes.
Isto ocorre em decorrência de duas possibilidades: (1) retenção de polimorfismo ancestral,
ou (2) introgressão gênica. Embora a primeira possibilidade seja mais parcimoniosa e
esteja associada a um processo de especiação incipiente, é difícil determinar qual processo
esteja ocorrendo. Contudo, é evidente a existência de espécies irmãs, mesmo que estas não
apresentem uma distribuição geográfica uniforme. As espécies irmãs podem apresentar
capacidades vetoriais distintas, conferindo a este processo de especiação incipiente uma
importante conseqüência epidemiológica (Mazzoni et al. 2008).
CONCLUSÕES
O estudo dos polimorfismos do gene period com as metodologias aqui apresentadas
demonstraram que o marcador apresenta limitações nas análises filogeográficas,
decorrentes da identificação de haplótipos compartilhados entre indivíduos com fenótipos
distintos e pertencentes a populações diferentes.
AGRADECIMENTOS
Ao Programa PIBIC/CNPq e à PROPESQ, pelo auxilio financeiro; aos membros dos
Laboratórios de Genética Molecular Humana (LGMH) e de Bioinformática e Biologia
Evolutiva (LABBE) do Departamento de Genética da UFPE, pelo apoio recebido.
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