1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ANTONIO GOMES DA SILVA NETO
ESTUDO DOS EFEITOS VASCULARES E RENAIS CAUSADOS
PELO 6-GINGEROL ISOLADO DO GENGIBRE.
FORTALEZA
2012
3
ANTONIO GOMES DA SILVA NETO
ESTUDO DOS EFEITOS VASCULARES E RENAIS CAUSADOS PELO 6GINGEROL ISOLADO DO GENGIBRE.
Dissertação apresentada à Coordenação
do Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia da Faculdade
de Medicina da Universidade federal do
Ceará, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em
Farmacologia.
Orientadora:
Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro
FORTALEZA
2012
2
S582e
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
Silva Neto, Antonio Go mes da.
Estudo dos efeitos vasculares e renais causados pelo 6 – gingerol isolado do gengibre /
Antonio Go mes da Silva Neto. – 2012.
103f. : il. co lor., enc. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Departamento de Fisio logia e
Farmacologia, Programa de Pós -Graduação de Farmacologia, Fortaleza, 2012.
Orientação: Pro fa. Dra. Helena Serra A zul Monteiro.
1. Gengibre. 2. Rim. 3. Farmacologia. I. Título.
CDD 616.1
4
ANTONIO GOMES DA SILVA NETO
ESTUDO DOS EFEITOS VASCULARES E RENAIS CAUSADOS PELO 6GINGEROL ISOLADO DO GENGIBRE.
Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de
Medicina da Universidade federal do Ceará, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em Farmacologia.
Aprovada em: ____/____/______.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________
Profª. Drª. Helena Serra Azul Monteiro (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará
________________________________________________
Profª. Drª. Renata de Sousa Alves
Universidade Federal do Ceará
________________________________________________
Prof. Dr. Alexandre Havt Bindá
Universidade Federal do Ceará
5
AGRADECIMENTOS
A Deus que está sempre ao meu lado abençoando-me.
À minha orientadora Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro pela
atenção, otimismo e dedicação oferecidas.
À Profa. Dra. Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista pelo carinho,
disponibilidade, apoio e amizade desde minha infância.
Ao meu amigo e companheiro de jornada doutorando Rafael Matos
Ximenes pelos conhecimentos compartilhados que foram valiosos para
realização deste trabalho e pelo auxílio sempre que precisei.
Ao Prof. Dr. Paulo Cesar Vieira e ao Dr. James Almada da Silva por
terem cedido a substância isolada para a realização dos testes farmacológicos
e pela oportunidade de trabalhar em uma nova parceria.
À minha namorada Natássia que sempre esteve ao meu lado nos
momentos difíceis juntamente com seus familiares.
Ao Prof. Dr. Dalgimar
histopatológicas e amizade.
Beserra
De
Menezes
pelas
análises
A todo corpo docente do Curso de Pós-graduação em Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará, em especial Dr. Alexandre Havt Bindá, pela
atenção fornecida em todos os momentos que busquei.
À Profa. Dra. Renata de Sousa Alves pela amizade e apoio que sempre
me deu.
Ao amigo e doutorando
companheirismo e apoio.
Antonio
Rafael
Coelho
Jorge
pelo
Aos demais companheiros de jornada do Laboratório de Farmacologia
Venenos e Toxinas (LAFAVET), da iniciação científica e pós-graduação que
proporcionaram momentos felizes e de crescimento profissional e pessoal.
Aos Funcionários Silvia Helena, Aura Rhanes, Jossiê e Bento por toda a
ajuda.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo apoio financeiro.
A todos os meus amigos pelo companheirismo e presteza.
6
―Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um
pode começar agora e fazer um novo fim‖.
Chico Xavier
7
RESUMO
O gengibre possui em sua composição inúmeras substâncias voláteis e não
voláteis. Dentre as substâncias não-voláteis destacam-se, principalmente, os
gingerols, sendo o 6-gingerol o composto mais abundante e o responsável pela
grande maioria das atividades farmacológicas descritas, como a antihipertensiva. Neste trabalho, foram investigados os efeitos renais, vasculares e
em cultura de células tubulares renais do tipo MDCK (Madin-Darby Canine
Kidney) causados pelo 6-gingerol. Foram utilizados ratos Wistar machos
pesando entre 250 e 300g, cujos rins foram isolados e perfundidos com
Solução de Krebs-Hanseleit contendo 6%p/v de albumina bovina previamente
dialisada. Foram investigados os efeitos do 6-gingerol (3 μM, 10 μM, 30 μM;
n=6) sobre a Pressão de Perfusão (PP), Resistência Vascular Renal (RVR),
Fluxo Urinário (FU), Ritmo de Filtração Glomerular (RFG), Percentual de
Transporte Tubular de Sódio (%TNa+), de Potássio (%TK+) e de Cloreto
(%TCl-). O 6-gingerol foi adicionado após 30 minutos de controle interno. As
células MDCK foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado
com 10% v/v de Soro Bovino Fetal e então avaliadas na presença do composto
em diversas concentrações em dois períodos de incubação, 6 (seis) e 24 (vinte
e quatro) horas. Após esses períodos, foram realizados ensaios de viabilidade
celular. Foi avaliada a resposta do 6-gingerol em diversas concentrações na
pressão arterial média de ratos wistar normotensos anestesiados. Os
resultados encontrados na pressão arterial dos animais foi uma queda
acentuada de maneira dose-dependente na pressão arterial destes animais.
Em relação à perfusão renal, o 6-gingerol mostrou-se um potente diurético e
com baixíssimos danos renais tanto nos dados encontrados no perfil
histológico, como nos experimentos de avaliação de viabilidade celular em
células MDCK o que está em consonância com o conhecimento da medicina
tradicional.
Os resultados encontrados não foram totalmente abolidos pelo inibidor
específico do receptor TRPV1 utilizado no estudo, demonstrando que o 6gingerol possui outras vias renais a serem exploradas em estudos posteriores.
Palavras-chave: 6-gingerol. Gengibre. Rim.
8
ABSTRACT
Ginger has many volatile and nonvolatile substances in its composition. Among
the non-volatile substances stand out, especially the gingerols, 6-gingerol being
the compound most abundant and responsible for the vast majority of
pharmacological activities described, such as anti-hypertensive. In this study,
we investigated the renal and vascular effects besides the effect in renal tubular
cell culture of the type MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) caused by 6gingerol. Male Wistar rats weighing between 250 and 300, whose kidneys were
isolated and perfused with Krebs-Hanseleit containing 6% w / v pre-dialysed
with bovine serum albumin. We investigated the effects of 6-gingerol (3 mM, 10
mM, 30 mM, n = 6) on the perfusion pressure (PP), renal vascular resistance
(RVR), urinary flow (FU), glomerular filtration rate (GFR), percentage of tubular
transport of sodium (Tna +%), potassium (TK +%) and chloride (TCL-%). The 6gingerol was added after 30 minutes of internal control. MDCK cells were grown
in RPMI 1640 culture medium supplemented with 10% v / v fetal bovine serum
and then evaluated in the prese nce of compound at various concentrations in
two incubation periods, 6 (six) and 24 (twenty four) hours . After these periods,
we performed cell viability assays. The response was evaluated in 6-gingerol at
various concentrations in mean blood pressure of normotensive anaesthetized
Wistar rats. The results found in animals' blood pressure was a sharp drop in a
dose-dependent way. With regard to renal perfusion, 6-gingerol proved to cause
a potent diuretic and very low renal damage in histological profile, as in the
experiments for evaluating cell viability in MDCK cells which are according to
the traditional medical knowledge.
The results were not totally abolished by specific inhibitor of the receiver TRPV1
used in this study, demonstrating that the 6-gingerol has other pathways renal
to be explored in subsequent studies.
Keywords: 6-gingerol. Ginger. Kidney.
9
LISTA DE FIGURAS
1.
Rizoma do gengibre (Moraes, 2008) ................................................................19
2.
Principais atividades descritas sobre o gengibre ..............................................20
3.
Representação das cadeias laterais dos componentes do gengibre (Modificado
de Reinhard, 2005) .......................................................................................... 21
4.
Estrutura molecular do 6-gingerol .................................................................... 23
5.
Representação simplificada da conversão dos gingerols em outras formas
homólogas (Modificado de Reinhard, 2005) .................................................... 24
6.
Regiões importantes para a interação com o receptor .................................... 30
7.
Representação espacial da estrutura das diferentes famílias de receptores
TRP. Adaptado de Montell, 2005 ..................................................................... 32
8.
Sistema de perfusão renal. Fonte: LAFAVET – UFC .......................................39
9.
Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado. Fonte: LAFAVET
– UFC .............................................................................................................. 40
10.
Valores de pressão de perfusão (PP) registrados durante a calibração do
sistema (n=6).................................................................................................... 41
11.
Valores registrados pelo fluxômetro (L/min) durante a calibração do sistema
(n=6) ................................................................................................................. 41
12.
Valores de volume de solução (mL/min) registrados durante a calibração do
sistema (n=6) ................................................................................................... 42
13.
Administração de manitol (100mg/mL – 3mL independentemente do peso) pela
veia femoral no animal anestesiado ................................................................ 43
14.
Identificação e dissecação do ureter (A) e ureter canulado (B) ....................... 44
15.
Visualização da artéria mesentérica (A), da artéria renal (B) e também da
artéria aorta (C) ................................................................................................ 45
16.
Canulação da artéria renal realizada através da artéria mesentérica
.......................................................................................................................... 45
17.
Rim de rato isolado no sistema de perfusão .................................................... 46
18.
Localização anatômica da artéria e veia femural e posicionamento dos
cateteres arterial (vermelho) e venoso (azul) .................................................. 50
19.
Sistema de aquisição de dados ....................................................................... 51
10
20.
Fluxograma do cultivo e tratamento das células MDCK. Fonte: LCC –
Laboratório de Cultivo Celular ......................................................................... 53
21.
Efeitos do 6-gingerol em célula tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT
.......................................................................................................................... 56
22.
Efeitos da Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT
............................................................................................... ...........................57
23.
Efeitos do 6-gingerol + Capsazepina em células tubulares renais (MDCK).
Ensaio com MTT ............................................................................................. 57
24.
Efeitos do 6-gingerol em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT
......................................................................................................................... 58
25.
Efeitos da Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT
.............................................................................................. ...........................59
26.
Efeitos do 6-gingerol + Capsazepina em células tubulares renais (MDCK).
Ensaio com MTT ........................................................................................... 60
27.
Relação dose-efeito da administração de 6-gingerol, em bolus, em ratos
anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/Kg), no percentual de redução
da pressão arterial. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por
análise de variância (ANOVA), com pós-teste de Bonferroni, e pelo teste t de
Studente, com *p < 0,05 ................................................................................. 61
28.
Relação dose-efeito da administração de 6-gingerol, em bolus, em ratos
anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/Kg), na pressão arterial média.
Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por análise de variância
(ANOVA), com pós-teste de Bonferroni, e pelo teste t de Studente, com *p <
0,05 ................................................................................................................. 62
29.
Aspecto morfológico normal do tecido cardíaco do grupo analisado através de
microscopia óptica (aumento de 400x e coloração de hematoxilina-eosina)
......................................................................................................................... 63
30.
Aspecto morfológico normal dos rins do grupo analisado através de
microscopia óptica (aumento de 400x e coloração de hematoxilinaeosina) ............................................................................................................. 64
31.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM,
10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente na pressão de
perfusão................................................................................................. 66
32.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM,
30 µM e DMSO utilizado como diluente na resistência vascular renal
......................................................................................................................... 67
11
33.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM,
10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente no fluxo urinário .......... 68
34.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM,
30 µM e DMSO utilizado como diluente no ritmo de filtração glomerular
......................................................................................................................... 68
35.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM,
10µM, 30 µM e DMSO utilizado como diluente no percentual de
transporte de sódio ............................................................................... 69
36.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM,
30 µM e DMSO utilizado como diluente no percentual de transporte de potássio
.......................................................................................................................... 70
37.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentrações de 3 µM, 10µM,
30 µM e DMSO utilizado como diluente no percentual de transporte de cloreto
.......................................................................................................................... 70
38.
Corte histopatológico de rim perfundido com solução de Krebs-Hanseleit
modificada e DMSO 1% por 120min (n=6, coloração de hematoxilina-eosina,
aumento 100x) ................................................................................................. 71
39.
Corte histológico de rim direito pefundido com 6-gingerol 3 µM (n=6, coloração
hematoxilina-eosina, aumento400x) ................................................................ 72
40.
Corte histológico de rim direito perfundido com 6-gingerol 10 µM. (n=6,
coloração de hematoxilina-eosina, aumento 400X) .............................. 73
41.
Corte histológico de rim direito perfundido com 6-gingerol 30 µM (n=6,
coloração de hematoxilina-eosina, aumento 400X) ......................................... 74
42.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e
frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM na
pressão de perfusão ............................................................................. 75
43.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao
bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM na resistência vascular
renal ................................................................................................................. 76
44.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e
frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no fluxo
urinário .................................................................................................. 77
45.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e
frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no ritmo
de filtração glomerular ........................................................................... 78
12
46.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao
bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no percentual de
transporte de sódio .......................................................................................... 79
47.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e
frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no
percentual de transporte de potássio .................................................... 80
48.
Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e
frente ao bloqueio com capzasepina na concentração de 30 µM no
percentual de transporte de sódio ......................................................... 81
13
LISTA DE QUADROS
1.
Cálculos para determinação dos parâmetros funcionais renais .............43
14
ABREVIATURAS
μg Micrograma
_ Alfa
°C Grau(s) centígrado(s)
%TCl- Percentual de cloro tubular total transportado
%pTCl- Percentual de cloro tubular proximal transportado
%TK+ Percentual de potássio tubular total transportado
%pTK+ Percentual de potássio tubular proximal transportado
%TNa+ Percentual de sódio tubular total transportado
%pTNa+ Percentual de sódio tubular proximal transportado
AMPc Adenosina 3´, 5´ – Monofosfato Cíclica
ANOVA Análise de varância
C60 Valores do controle no período de 60 minutos
C90 Valores do controle no período de 90 minutos
C120 Valores do controle no período de 120 minutos
CNP Peptídio natriurético do tipo c
Cosm Clearance osmótico
COX Ciclooxigenase
COX-1 Ciclooxigenase - 1
COX-2 Ciclooxigenase - 2
ECl- Cloreto excretado
EK+ Potássio excretado
ENa+ Sódio excretado
E.P.M Erro padrão médio
PLA2 Fosfolipase A2
FU Fluxo urinário
HE Hematoxilina-Eosina
IL Interleucina
IRA Insuficiência Renal Aguda
LAFAVET Laboratório de Farmacologia em Venenos e Toxinas
min. ou min Minuto (s)
mL Mililitros
mmHg Milímetros de mercúrio
MDCK Células tubulares renais do tipo Madin-Darby Canine Kidney
MS Ministério da Saúde
MTT 3-(4,5-dimetilazil-2-il)-2,5 difenil tetrazólico
NO Óxido nítrico
NOS Óxido Nítrico Sintetase
PGE2 Prostaglandina E2
PGI2 Prostaglandina I2 ou prostaciclina
pH Potencial de hidrogênio
PP Pressão de Perfusão
p/v Peso/volume
RFG Ritmo de Filtração Glomerular
RVR Resistência Vascular Renal
SBF Soro Bovino Fetal
TNF Fator de Necrose Tumoral
v/v Volume/volume
15
16
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 18
1.1 Aspectos Gerais da Fitoterapia ......................................................................... 18
1.2 Composição Química do Gengibre ................................................................... 20
1.3
Atividades
Farmacológicas
.....................................................................23
1.3.1 Atividade Anti-emética ............................................................................ 23
1.3.2 Atividades Antiinflamatória e antioxidante .............................................. 24
1.3.3 Atividade Antimicrobiana ........................................................................ 25
1.3.4 Estudos no Combate ao Câncer ............................................................. 26
1.3.5 Cardioprotetora e Anti-hipertensiva ........................................................ 27
1.4 Família de Receptores de Potencial Transiente (TRP) .................................... 28
2. JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 33
3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 35
3.1 Objetivo Geral ........................................................................................ ..........35
3.2 Objetivos Específicos ........................................................................................35
4. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 37
4.1 Perfusão de Rim Isolado .................................................................................. 37
4.1.1 Animais de experimentação ................................................................... 37
4.1.2 Substâncias Utilizadas ........................................................................... 37
4.1.3 Ensaios Biológicos ................................................................................. 37
4.1.4 Preparo da Solução Perfusora ............................................................... 38
4.1.5 Sistema de Perfusão Renal .................................................................... 39
4.1.6 Calibração do Sistema de Perfusão de Rim Isolado de Rato .................41
4.1.7 Técnica Cirúrgica ................................................................................... 46
4.1.8 protocolo Experimental .......................................................................... 46
4.1.9 Análises Bioquímicas ............................................................................. 47
4.1.10 Cálculo dos Parâmetros Funcionais Renais ........................................ 48
4.1.11 Análise Histológica ............................................................................... 48
4.2 Efeitos na Pressão Arterial Média de Ratos Anestesiados .............................. 48
4.2.1 Animais de Experimentação ................................................................... 48
4.2.2 Técnica Cirúrgica .................................................................................... 48
4.2.3 Protocolo Experimental ........................................................................... 49
17
4.2.4 Sistema de Aquisição de Dados ............................................................. 50
4.2.5 Análise Histológica .................................................................................. 50
4.3 Avaliação da Atividade do 6-gingerol sobre as Células Tubulares Renais
(MDCK) ................................................................................................................... 51
4.3.1 Linhagem Celular .................................................................................... 51
4.3.2 Cultivo e Tratamento das Células MDCK ............................................... 51
4.3.3 Ensaio Colorimétrico com Sal de Tetrazolium (MTT) ............................ .52
4.3.4 Aspectos Éticos ...................................................................................... 53
5. RESULTADOS ....................................................................................................... 55
5.1 Avaliação da Atividade do 6-gingerol e da Capzasepina sobre as Células MDCK
................................................................................................................................. 55
5.2 Experimento com Incubação de 6 horas .......................................................... 55
5.3 Experimento com 24 horas de Incubação ........................................................ 57
5.4 Avaliação da Atividade do 6-gingerol na Pressão Arterial Média de Ratos
Anestesiados .......................................................................................................... 59
5.5 Análise Histológica ............................................................................................ 61
5.6 Perfusão de Rim Isolado Frente ao 6-gingerol ................................................. 64
5.7 Efeitos do 6-gingerol nos Parâmetros Renais .................................................. 65
5.8 Análise histológica dos grupos da perfusão renal ............................................ 70
5.9 Efeitos do 6-gingerol frente ao Bloqueio do TRPV1 com Capzasepina
................................................................................................................................. 73
6. DISCUSSÃO ........................................................................................................... 82
7. CONCLUSÃO ......................................................................................................... 90
8. REFERÊNCIAS....................................................................................................... 92
18
INTRODUÇÃO
19
1. INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos Gerais da Fitoterapia
O uso de produtos naturais, principalmente as com atividades
medicinais, são utilizadas a mais de cinco mil anos por diversas civilizações.
Entretanto, suas atividades começam a serem estudas mais profundamente
pela medicina ocidental na busca por novas moléculas ativas e no
desenvolvimento de novas drogas com potencial terapeutico melhor e com
menos efeitos colaterais (CRAGG et al., 1997; DE SMET, 1997; SHU, 1998).
Na década de 60, em países como Alemanha e França, e
posteriormente transferindo-se para outras regiões da Europa e da América do
Norte, demonstrou-se um interesse crescente pela fitoterapia e, ao invés de
utilizar a infusão, cozimento ou tintura dos fármacos vegetais, bastante
utilizadas no passado, as formas farmacêuticas encapsuladas ou comprimidos
eram mais bem aceitas pela população. (CUNHA et al., 2003). Este interesse
surgiu principalmente devido às pessoas acreditarem que os fitoterápicos são
isentos ou possuem poucos efeitos colaterais, e que são aparentemente
―milagrosos‖ nos casos onde a medicina tradicional não alcançou resultados
esperados. Infelizmente nem sempre esses efeitos são confirmados pelas
pesquisas científicas que avaliam a eficácia e a segurança desses fitoterápicos
(CALIXTO, 2000; CARVALHO et al., 2008).
No Brasil, a utilização de plantas medicinais foi iniciada pelos povos
indígenas. Nosso país é rico em diversidade além de possuir em seu território
cinco principais biomas sendo designados como floresta amazônica, cerrado,
mata atlântica, pantanal e caatinga com milhares de espécies nativas. Isso
demonstra o grande potencial de diversidade e incontáveis moléculas com
potencial terapêutico ainda podem ser encontradas (CALIXTO, 2000; RATES,
2001; VEIGA-JUNIOR, 2008).
Entre inúmeras espécies utilizadas destaca-se, o gengibre que é
uma planta herbácea aromática, perene, de rizoma articulado, septante,
carnoso, revestido de epiderme rugosa, de onde desenvolve o caule aéreo
(JOLY, 2002). Na parte inferior, possui muitos rizomas cilíndricos, horizontais,
20
distribuídos lateralmente, com ramificações situadas num mesmo plano,
digitiformes, no vértice das quais se encontram cicatrizes do caule foliáceo de
14 a 16 cm de comprimento por 4 a 20 mm de espessura (FERNANDES,
2006).
Figura 1 - Rizoma do gengibre (Moraes, 2008).
O botânico Inglês William Roscoe (1753-1831) lhe deu esse nome
em uma publicação no ano de 1807,
a partir do sânscrito STRINA: ―com um corpo como um chifre‖.
O gengibre (Zingiber officinale) é uma planta utilizada como
condimento e como erva medicinal desde a antiguidade pelos povos do oriente.
Na época das grandes navegações possuía uma importante representação nas
especiarias. (Boletim, 2004). Hoje ela é encontrada comercialmente na forma
crsitalizada, pó seco e até na forma de óleo essencial, sendo que nesta forma
está contida em bebidas, ingredientes de alimentos e em produtos de higiene e
cosmética (ELPO, 2004; NEGRELLE et al., 2005; SACCHETTI et al., 2005).
Além dessa utilização como condimento, o gengibre possui
atividades farmacológicas já descritas na literatura científica. Dentre elas, estão
incluídas atividades, como analgésica, antiúlcera, antiemética, antimicrobianas,
21
ansiolíticas antilipidêmica, antihipertensiva, cardiotônica e imunoestimulante
(SUEKAWA et al., 1984; KIUCHI et al., 1992; SHUKLA e SINGH, 2007) (Fig.
2).
Antilipidêmico
Anti- hipertensivo
Cardiotônico
Anti- inflamatório
Antioxidante
Analgésico
Gengibre
Antimicrobiano
Antiemético
Figura 2 - Principais atividades descritas sobre o gengibre.
1.2 Composição Química do Gengibre
Mais de 400 compostos químicos foram isolados e identificados em
extratos de rizomas de gengibre, e os novos ainda estão sendo detectados.
Evidências atuais sugerem que uma fração contendo os compostos que possuem
estrutura relacionada com os gingerols, shogaols e paradols são responsáveis
pelas ações terapêuticas do gengibre (TJENDRAPUTRA, 2001).
O gengibre apresenta em sua composição química, componentes
voláteis (terpenos), não voláteis (compostos fenólicos e alcalóides) além das
22
oleorresinas extraíveis, gorduras, ceras, carboidratos, vitaminas e minerais e no
rizoma também contém uma enzima proteolítica potente chamada de zingibain
(JOLAD et al., 2005).
Esses compostos são descritos como secundários e embora não sejam
necessários ao ciclo da vida da planta, desempenham papel na interação com o
meio ambiente (PERES, 2004).
No grupo dos constituintes voláteis encontramos sesquiterpenos de
hidrocarbonetos: zingeberene (35%), curcumeno (18%), farneseno (10%); e mais
de 40 substâncias diferentes, se destacando o linalol, 1,8 cineol (SHUKLA et al.,
2007; SANTOS et al., 2004). Muitos destes componentes voláteis contribuem
para o distinto aroma e sabor de gengibre (JOLAD et al., 2004; JOLAD et al.
2005).
Dentre os compostos não-voláteis merecem destaque os gingerols,
shagaols e paradols. Estes compostos compartilham uma porção cetona
aromática, mas são diferentes no comprimento da sua cadeia lateral alquil e o
padrão de substituição na cadeia lateral (Fig. 3). Outros compostos fenólicos que
fazem parte da composição química do gengibre são: os gingerdiois e os
diarilheptanoides (JOLAD et al., 2005).
23
Figura 3 - Representação das cadeias laterais dos componentes do gengibre
(Modificado de Reinhard, 2005)
Entre os gingerois, o 6-gingerol é o composto mais abundante
encontrado no gengibre e o responsável pela grande maioria das atividades
farmacológicas descritas (YOUNG e CHEN, 2002). Outros gingerois presentes no
gengibre, porém em menor quantidade são o 4-gingerol, o 8-gingerol, o 10gingerol e o 12-gingerol. Esses compostos em altas temperaturas sofrem
desidratação e se transformam nos shogaols. Esses últimos quando sofrem
hidrogenação formam os paradols (JOLAD et al., 2004; JOLAD et al., 2005)
(Fig.4).
24
CH3
O
OH
O
CH3
HO
Figura 4 - Estrutura molec ular do 6-gingerol.
Shogaols e paradols apresentam pequenas quantidades no gengibre
fresco, mas estão presentes em altas concentrações no gengibre armazenado.
Essa conversão é provável que tenha um impacto significativo sobre os efeitos
nas preparações de gengibre, pois os compostos podem variar na sua
biodisponibilidade, farmacocinética e propriedades farmacológicas (Reinhard et al,
2005). Já a quantidade de gingerols presente, determina a pungência (sensação
de ―queimação‖ sentida na boca e no nariz) do rizoma. Essa varia de acordo com
a região geográfica de onde a planta é colhida e se os rizomas são frescos ou
secos (PRATO, 2010).
25
CH3
O
O
OH
CH3
(CH 2)n
HO
Gingerois
(n = 2, 4, 6, 8, 10)
Desidratação
CH3
O
O
Shogaois
(n = 2, 4, 6, 8, 10)
CH3
(CH 2)n
HO
Hidrogenação
CH3
O
O
Paradois
(n = 2, 4, 6, 8, 10)
CH3
(CH 2)n
HO
Figura 5 – Representação simplificada da conversão dos gingerols em outras formas homólogas
(Modificado de Reinhard, 2005).
1.3 Atividades Farmacológicas
1.3.1 Atividade Anti-emética
Na
medicina
oriental,
o
gengibre
é
uma
das
ervas
mais
comumente utilizadas para o tratamento de náuseas e vômitos da gravidez
(ALLAIRE et al., 2000).
O mecanismo exato dessa atividade ainda não está totalmente elucidado,
mas tudo indica que seja um efeito gástrico local, por aumentar o peristaltismo e
tônus muscular. Com o efeito local, ocorre grande diminuição dos efeitos
indesejáveis causados por antieméticos de ação central, como xerostomia e
sonolência (MICKLEFIELD, 2000).
Estudo realizado com 60 mulheres em pós -cirurgia (Obstetrícia e
Ginecologia) comparou a utilização de metoclopramida, gengibre e placebo na
incidência de eventos relacionados à atividade antiemética. O gengibre demonstrou
ser capaz de reduzir a incidência de náuseas quando comparado com o placebo.
26
Entretanto, a incidência de náuseas foi estatisticamente igual nos grupos que
utilizaram tanto gengibre quanto metoclopramida (BONE et al., 1990).
Em 2004, Smith e colaboradores compararam a redução das náuseas
com a vitamina B6 em um grupo composto de 291 mulheres com menos de 16
semanas de gestação. Constataram que o gengibre foi equivalente em reduzir as
náuseas nesse grupo em média de 20%, sendo mais eficaz na redução de náuseas
acompanhadas de vômito (50%). Nas pacientes em que as náuseas não foram
acompanhadas de vômitos a diferença foi de 30%.
1.3.2 Atividades Antiinflamatória e Antioxidante
Estudos demonstraram que o gengibre foi capaz de inibir a expressão de
COX-2 induzida por LPS (lipopolissacarídeo) e inibir a produção de PGE2
(prostaglandina E2) e estudos ―in vivo ” demonstraram que o extrato aquoso de
Zingiber officinale a quente inibiu as atividades da ciclooxigenase e lipoxigenase
sobre o ácido araquidônico (UTPALENDU et al., 1999; LANTZ et al., 2007).
A inibição da enzima cox, in vitro, pelo 6-gingerol mostrou-se dependente
da concentração, sendo 0,5 – 1,0 mM, a faixa que mostrou o melhor resultado na
inibição da quebra do ácido araquidônico (SHUKLA et al., 2007).
Em 2010 Dugasani e colaboradores provaram que o 6-gingerol possui
atividade antiinflamatória, mas quando comparado ao 6-shogaol ele perde em
atividade antiinflamatória. Isso leva a hipótese que o 6-shogaol seria um melhor
protótipo para a síntese de drogas na indústria. No entanto, mais estudos devem ser
realizados.
A atividade antioxidante está relacionada com a presença de compostos
fenólicos. O gengibre, rico nesses compostos, portanto, apresenta significativa
atividade antioxidante (JUSTO et al., 2009).
Ahmed e colaboradores (2000) induziram estresse oxidativo utilizando
pesticida (malation) em ratos e verificaram que a introdução de gengibre na dieta
desses animais abolia esse efeito. Neste mesmo estudo, foi demonstrado que o
efeito de redução da peroxidação lipídica do gengibre é tão eficaz quanto àquela
27
obtida com o ácido ascórbico. Esse efeito influenciou nos níveis enzimáticos da
superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase.
1.3.3 Atividade Antimicrobiana
O consumo de mais de uma tonelada diária de antibióticos em alguns
países da Europa tem resultado na resistência de populações bacterianas, causando
assim um sério problema de saúde pública. Isso leva à pesquisa de novas drogas e,
consequentemente, o estudo de plantas que possuem essa atividade na medicina
popular (BAQUERO e BLAZQUEZ, 1997).
Avaliações etnobotânicas do gengibre demonstraram a capacidade de
inibição de inúmeros fungos e bactérias patogênicas no homem (F ICKER et al.,
2003; JAMES et al., 1999).
Estudo realizado por James e colaboradores em 1999, demonstrou que o
gengibre foi capaz de inibir a multiplicação de bactérias fermentadoras de
carboidratos não digeridos no cólon e é capaz de inibir, in vitro, o crescimento de
Escherichia coli, Proteus sp, Staphylococcus sp, Streptococcus sp e Salmonela sp.
Estudos mais recentes mostraram que os componentes da raiz do
gengibre possuem atividade antibacteriana sobre M. luteus, B. cereus, B. subfilis,
Enterobacter
aerogenes,
Burkholderia
pseudomalle,
Staphylococcus
aureu
(PEREIRA, 2002; RUFF et al., 2006).
Aguiar e colaboradores 2009 relataram que o extrato glicólico de gengibre
e o hipoclorito de sódio têm ação fungicida sobre Candida albicans oral. Entretanto,
essa atividade foi superior com o hipoclorito de sódio, pois a atividade fungicida do
extrato glicólico de gengibre está limitada à sua concentração máxima de 12,5%.
Isso ocorre, pois em maiores concentrações o efeito pungente seria muito
pronunciado e poderia ocorrer dano a mucosa bucal.
.
1.3.4 Estudos no Combate ao Câncer
O
6-gingerol
possui
inúmeras
aplicações
na
medicina
oriental,
principalmente, como erva que ―previne‖ vários tipos de câncer. Existem inúmeros
28
tipos de câncer, mas, no Brasil, o câncer de pele é o tipo de mais freqüente,
correspondendo a cerca de 25% de todos os tumores malignos registrados no Brasil
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).
Kim e colaboradores (2007; 2005) demonstraram que o pré-tratamento
com o 6-gingerol foi capaz de reduzir, in vitro, os níveis intracelulares de espécies
reativas de oxigênio, induzidas por raios utra-violeta tipo B (UVB).
Outro estudo reportou que o 6-gingerol em concentrações de até 25µM foi
capaz de induzir apoptose em células da linhagem JB6 (referencia) e que em
concentrações a partir de 50µM causou morte dessas células aparentemente por
necrose (HUANG et al., 1996).
Estudo recente mostrou que o 6-gingerol inibiu a adesão celular, a
invasão celular e a atividade de metaloproteinases de matriz na linhagem MDA -MB231 de células tumorais de mama humanas (LEE et al., 2008).
Em 2003, Mahady e colaboradores relataram que o Helicobacter pylori é o
principal agente associado a úlceras pépticas e posterior desenvolvimento de câncer
gástrico e do cólon. O 6-gingerol inibiu o crescimento de cepas de Helicobacter pylori
CagA+. Essa atividade protetora pode ser benéfica co ntra o câncer de cólon
(ISHIGURO et al., 2007).
Em outro experimento realizado em 2009, Chung-Yi e colaboradores
mostraram que o 10-gingerol (50-100µM), em concentração dependente, diminuiu a
viabilidade celular de câncer colorretal da linhagem SW480.
Em modelos de câncer pulmonar uma preparação fitoterápica utilizada na
medicina chinesa, composta por cinco ervas, dentre elas o gengibre, inibiu a
metástase pulmonar de células de melanoma B16F10 em camundongos através da
estimulação de células TCD8 (SUZUKI et al., 1997).
Utilizando o 6-gingerol isolado, foi observado que essa substância foi
capaz de inibir a angiogênese, consequentemente, diminuir as metástases, quando
os camundongos receberam células de melanoma da linhagem B16F10 por via
intravenosa (KIM et al., 2005). Com esse resultado foi confirmada a ação dos
29
componentes do gengibre no resultado encontrado em 1997 por Suzuki e
colaboradores.
Alguns estudos sugerem que o 6-gingerol pode diminuir inflamações na
próstata, além de elevar os níveis de prote ínas, como a caspase 9 e a caspase 3,
que estão relacionadas a apoptose em células sensíveis a testosterona via
upregulacion de p53 (NONN et al., 2007; SHUKLA et al., 2007).
1.3.5 Atividade cardioprotetora e Anti-hipertensiva
Estudo mostrou que o gengibre possui efeito sinérgico à nifedipina quanto
ao efeito antiagregante plaquetário em voluntários normais e em pacientes
hipertensos. Os autores mostraram que a porcentagem da agregação plaquetária
induzida por colágeno, ADP e epinefrina em pacientes hipertensos foi maior, em
relação aos voluntários normais. Nesse mesmo estudo demonstrou-se que tanto
aspirina quanto gengibre poderiam potencializar o efeito antiagregante da nifedipina
nos grupos estudados. Uma combinação de 1g de gengibre administrado com 10mg
de nifedipina, por dia, pode ser valioso para prevenção de complicações
cardiovasculares, devido ao poder da associação na redução na agregação
plaquetária (BORDIA et al., 1997).
Estudo realizado na Arábia Saudita avaliou o efeito cardioprotetor do 6gingerol frente à Doxorubicina (DOX) - representante da classe das antraciclinas que possui elevado potencial cardiotóxico, o que limita seu uso clínico (STEARE et
al., 1995).
Ratos
wistar,
após
administração
de
DOX
(20mg/Kg)
por
via
intraperitonial, demonstraram aumento significativo da enzima lactato desidrogenase
(LDH) sérica 24 horas a administração. Essa elevação foi inibida quando os animais
receberam 6-gingerol (10mg/Kg) como pré-tratamento cinco dias antes da aplicação
da DOX (MANSOUR et al., 2008).
Nesse mesmo estudo Mansour e colaboraradores (2008) constataram que
a aplicação DOX (20mg/Kg) causou aumento de cinco vezes, após 48 horas, da
isoenzima cardíaca da creatinoquinase (CK-MB) no soro dos animais e quando o 6-
30
gingerol (10mg/Kg) foi utilizado como pré-tratamento de forma semelhante à anterior,
ocorreu uma redução de 58% na atividade dessa enzima.
Ghayur e colaboradores (2005) relataram que o extrato de gengibre
possui um efeito hipotensor importante e que os canais de cálcio dependentes de
voltagem podem estar envolvidos no mecanismo de relaxamento e vasodilatação.
Estudos com ratos wistar mostraram a utilização do extrato de gengibre
aceleram a taxa a taxa de bombeamento do cálcio, aumentando sua concentração
intracelular, sem interferir no seu efluxo, através da ativação da bomba Ca +2-ATPase
do retículo sarcoplasmático e que o gengibre possui efeito sinérgico em pacientes
que fizeram a combinação de 1g do rizoma com 10mg de nifedipina, por dia
(YOUNG et al., 2006, KOBAYSHI et al, 1988; IWASAKI et al, 2006).
Ghayur et al., (2005) demonstraram que o extrato de gengibre é capaz de
inibir canais de cálcio e que o extrato seco não possuía nenhuma ação sobre a
frequência cardíaca e pressão arterial em ratos wistar normotensos.
Entretanto, alguns estudos realizados com o extrato do gengibre
explorando o potencial anti-hipertensivo mostram resultados controversos, como
vasodilatação inicial e posterior vasoconstrição em modelos de anel de aorta
(IWASAKI et al. 1988; KOBAYSHI et al. 2006). Por isso, mais pesquisas tem que ser
realizadas com as moléculas que estão sendo isoladas para que, com isso, seja
mais seguro propor um mecanismo para seu efeito anti-hipertensivo em animais com
hipertensão pré-estabelecida.
1.4 Família de Receptores de Potencial Transiente (TRP)
Após análise dos resultados obtidos no sistema de perfusão renal, surgiu
a hipótese que o 6-gingerol estava agindo através de receptores do tipo TRPV1 que
atualmente estão ganhando repercussão por suas ações renais (CATERINA et al,
2007).
A pelve renal é bastante inervada por nervos sensoriais aferentes e essa
estrutura renal é considerada importante na detecção de estímulos mecânicos, bem
como, estímulos químicos que levam a alteração renal da função excretora, incluindo
31
diurese e natriurese (AVELINO et al, 2002; KOOP et al, 1984; GONTIJO et al,
1994).
Estudos na literatura demonstram que o TRPV1 pode ser ativado por
diversos estímulos, como o calor, compostos com baixo pH, metabólitos derivados
dos lipídeos e desequilíbrio osmótico Gontijo, et al; (1994) e Yi e Wang, (2008)
demonstraram que a ativação dos receptores TRPV1 causava diurese e natriurese.
Zhu et al, 2005 perfundiram capsaicina na pelve renal de ratos e
demonstraram que um aumento no fluxo de urina em ambos os rins e que estes
achados foram abolidos com sucesso pelo bloqueador deste receptor a
capsazepina.
Os gingerols possuem uma porção vanílica (Figura 6, a região A), que é
considerada importante para a ativação do responsável por conferir afinidade ao
sítio vanilóide, e também na região B, responsável por conferir uma conformação
estruturar favorável a interação da molécula com o receptor (WALPOLE et al., 1993).
A
CH3
B
O
OH
O
CH3
HO
Figura 6 - Regiões importantes para a interação com o receptor
A história dos receptores de potencial transitório (TRP) começa na década
de 1960, quando Cosens e Manning (1969) descreveram pela primeira vez a
existência de uma variante mutante de Drosophila meganobaster que se
apresentava cega. Analisando seu sistema visual, foi observado que o fotoceptor
apresentava uma resposta transiente à estimulação luminosa prolongada, enquanto
32
que o fotoceptor normal apresentava uma resposta contínua. Já em (1989) os
pesquisadores Montell e Rubin descreveram a presença de uma proteína composta
por 1275 aminoácidos dispostos em aproximadamente oito segmentos transmembra,
sem homologia a outros receptores descritos na literatura da época. Essas
descobertas levaram os pesquisadores na busca do gene que codificava esta
proteína e em 1992 Phillips e colaboradores encontraram o gene que foi
denominado trp-like (trpl), e, também, foi observado que esta proteína possuía
homologia com a região do sensor de voltagem de alguns canais de cálcio,
sugerindo que este gene poderia codificar subunidades de um canal permeável a
cálcio.
Atualmente, compreende-se que os receptores de potencial transitório
(TRP) são uma família de canais iônicos com a capacidade de permear cátions,
principalmente cálcio. Apesar das teorias iniciais descreverem a existência de oito
domínios transmembrana, técnicas de imagem por microscopia eletrônica e
bioquímica demonstraram que na verdade, os canais TRP são formados por seis
domínios transmembrana com a região formadora do poro entre as regiões cinco e
seis, e a região sensor de voltagem entre as regiões um e quatro (LATORRE et al,
2009). A cauda C e N terminal apresentam-se voltadas para o lado intracelular, com
caráter fortemente hidrofóbico (Fig. 7) (GAUDET, 2009).
A região C terminal apresenta variação dentre os diferentes tipos de
canais TRP, apresentando diferentes sítios e também uma região conservada
(domínio TRP ou TRP box). Esta última região apresenta-se conservada em 11 das
13 isoformas conhecidas em mamíferos atualmente, sendo utilizada como marcador
para o rastreamento destes canais. Além disso, alguns canais ainda apresentam
sítio de ligação para calmodulina, como o TRPV, ou domínios enzimáticos, como os
TRPM (Zhu, 2005). Acredita-se também que estes canais possam se apresentar
como homômeros tetraméricos (STRUBING et al., 2001).
A região N terminal apresenta-se formada por uma série de resíduos de
anquirina, presente na maioria dos canais TRP. Estes resíduos estão dispostos
como tijolos empilhados, formando uma superfície estável e rígida para o
acoplamento de diversas proteínas ao receptor. Além disso, estes domínios servem
como âncoras para o transito do receptor de vesículas até a membrana plasmática,
33
e também para a sua estabilização com a mesma e o cito esqueleto celular. Para
alguns receptores, como os TRPVs, alterações nesta região implicam em uma não
funcionalidade do mesmo (MONTELL et al., 2005).
Figura 7 - Repres entação espacial da estrutura das diferentes famílias de receptores TRP. Adaptado
de Mont ell, 2005.
34
JUSTIFICATIVA
35
2. JUSTIFICATIVA
A ciência se dedica ao estudo de muitas substâncias derivadas de
microrganismos, plantas e animais e o conhecimento dos mecanismos envolvidos
em suas ações se faz necessário, pois provenientes destes organismos milhares de
substâncias podem ser extraídas e servirem de ferramentas farmacológicas no
tratamento de inúmeras enfermidades.
Entre esses organismos as plantas são
muito importantes, pois diversas culturas as utilizam há milênios com resultados
excelentes do ponto de vista terapêutico, mas com poucos dados científicos
relacionados com suas ações.
O uso de gengibre em doenças cardiovasculares é conhecido há muito
tempo na medicina tradicional paquistanesa, pelo seu efeito diurético e por causar
redução da pressão arterial (TYLER et al, 1993; MILLER et al, 1998).
Curiosamente, alguns estudos foram realizados para tentar elucidar o
efeito hipotensor do extrato de gengibre e suas atividades, mas alguns resultados
encontrados eram contraditórios (WEIDMAR et al, 2000).
Em relação a sua ação diurética conhecida na medicina tradicional, quase
nenhum dado científico é conhecido, mas algumas moléculas com características
parecidas com o 6-gingerol, como é o caso da capsaisina (extraído da pimenta),
estão sendo estudadas por inúmeros grupos de cientistas em todo mundo e em
(2008) Li e Wang demonstraram que essa substância aumenta e ritmo de filtração
glomerular e a excreção de eletrólitos na perfusão de rim isolado. Entretanto, o uso
desta substância como diurética é limitado por possuir um elevado efeito irritante.
Portanto este trabalho objetiva avaliar os efeitos renais e pressóricos
promovidos pelo o 6-gingerol isolado do gengibre, além de avaliar se o efeito
diurético promovido pelo gengibre é causado pelo 6-gingerol.
36
OBJETIVOS
37
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos renais, cardíacos e pressóricos do 6-gingerol isolado do gengibre
(Zingiber officinale Rosce) em animais normais e hipertensos, visando obter
resultados que possam subsidiar a elucidação de seu mecanismo de ação
fisiológico, bem como confirmar aspectos farmacológicos descritos na medicina
popular na busca de novas ferramentas farmacológicas.
3.2 Objetivos Específicos
- Estudar os efeitos renais do 6-gingerol em rim isolado de rato;
- Avaliar as alterações na pressão arterial promovidas pelo 6-gingerol em ratos
anestesiados;
- Observar as alterações histológicas em rim e coração após o tratamento com o 6gingerol.
- Estudar o efeito do 6-gingerol sobre a viabilidade de células tubulares (MDCK);
38
MATERIAIS E MÉTODOS
39
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Perfusão de Rim Isolado
4.1.1 Animais de Experimentação
Serão utilizados ratos Wistar adultos, machos, entre 250 e 300g. Os
animais serão mantidos em jejum durante as 12 horas que antecedem cada
experimento apenas com água ―ad libitum” e os grupos experimentais (n = 6).
4.1.2 Substâncias Utilizadas
Foi utilizado o 6-gingerol que gentilmente foi fornecido pelo professor
pesquisador Dr. Paulo Cezar Vieira e o Dr. Jame’s Almada da Silva da Universidade
Federal de São Carlos.
No procedimento cirúrgico foram utilizados pentobarbital sódico a 3%
(Cristália), manitol (Reagen) e heparina (Cristália).
A solução empregada nos experimentos foi a de Krebs-Henseleit modificada
contendo as seguintes substãncias com suas respectivas concentrações: 114.0mM
de NaCl; 4.96mM de KCl; 1.24mM de KH2PO4; 0.5mM de MgSO4.7H2O; 24.99mM
de NaHCO3; 2.10mM de CaCl2.2H2O; 3.60mM de glicose e albumina bovina a 6%
peso por volume.
4.1.3 Preparo da Solução Perfusora
A
solução
de
Krebs-Henseleit
modificada
(FONTELES,
1998),
concentrada 20x, continha NaCl = 138g, KCl = 7g, NaH2PO4.H2O = 3,2g, MgSO4. 7
H2O = 5,8g e Uréia = 10g. Quarenta e oito horas antes dos e xperimentos, 100mL
desta solução foram separados e acrescidos de NaHCO3 = 4,2g , CaCl2 . 2 H2O =
0,74g, glicose = 2g, e penicilina G potássica cristalina = 0,05g. Em seguida, o
volume foi completado para 2000 mL com água bidestilada. Foram retirados 300 mL
desta solução, aos quais se adicionou albumina bovina (6g%). Em seguida, solução
foi dializada com albumina, auxiliada por um homogeneizador. A diálise tem como
40
objetivo retirar substâncias contaminantes como piruvatos, citratos e lactatos
(HANSON e BALLAR, 1968; COHEN, KOOK e LITTLE,1977; ROSS, 1978).
A solução de Krebs-Henseleit para a diálise foi trocada com 24 horas. No
final, após 48 horas de diálise, a solução perfusora foi acrescida com 0,15g de
inulina. O pH da solução perfusora foi ainda ajustado entre os valores de 7,3 e 7,4.
4.1.4 Sistema de Perfusão Renal
Necessidade do conhecimento dos mecanismos de controle da função
renal levou inúmeros pesquisadores a desenvolverem a técnica de perfusão de rim
isolado. Esta técnica permite o estudo da função renal na ausência de influências
sistêmicas (NIZET, 1975). O nosso sistema consiste na perfusão de rim isolado com
recirculação (FONTELES et al., 1983) com dois subsistemas, um in situ e outro em
circuito fechado, para perfusão in vitro, ambos mantidos à temperatura de 37 ºC.
Este sistema apresenta a vantagem da manutenção constante de
parâmetros funcionais renais com utilização de albumina na solução perfusora, em
menor volume, mantendo constante as substâncias dialisáveis com oxigenação
adaptada ao próprio sistema como demonstrado nas figuras 8 e 9.
Figura 8 - Sistema de perfusão renal. Fonte: LAFAVE T – UFC
41
Figura 9 - Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado. Fonte: LAFAVE T –
UFC.
4.1.5 Calibração do Siste ma de Perfusão de Rim Isolado de Rato
A calibração do sistema foi realizada antes de cada experimento com uma
solução de cloreto de sódio a 0,9% mantida a 37°C. Foram observados para cada
unidade da bomba de perfusão (1, 2, 3, 4 e 5) a pressão de perfusão (mmHg), o
fluxo da solução no sistema (L/min) e o volume de solução coletado em um minuto
42
(mL/min). Para uma melhor adaptação do sistema às unidades, a coleta de dados foi
realizada em intervalos de 2 minutos. As figuras 10, 11 e 12 mostram que o sistema
manteve-se constante em todos os grupos experimentais.
Figura 10- Valores de pressão de perfusão (PP) registrados durant e a calibração do sistema (n=6).
Figura 11 - Valores registrados pelo fluxômet ro (L/min.) durante a calibração do sistema (n=6).
43
Figura 12- Valores de volume de solução (mL/min) registrados durante a calibraç ão do sistema (n=
6).
4.1.6 Técnica Cirúrgica
As cirurgias foram realizadas segundo o método descrito por Balhlmann et
al. (1967); Nishiitsutji-Uwo et al. (1967); Ross, (1978) e Fonteles et al. (1983). Os
animais (n=6) foram anestesiados com pentobarbital sódico na dose de 50mg/Kg de
peso corporal. Inicialmente, a veia femoral foi isolada e manitol (100mg/mL – 3 mL
independentemente do peso) foi administrado (Figura 13), a fim de facilitar a
visualização e a fixação da cânula ao ureter.
Após assepsia da parede abdominal, procedeu-se uma incisão mediana e
duas incisões perpendiculares à linha alba para uma melhor observação das
estruturas anatômicas.
44
Figura 13 - Administração de manit ol (100mg/mL – 3mL independentemente do peso) pela veia
femoral no animal anestesiado.
Com uma lupa (aumento de 7 vezes) o ureter foi identificado, dissecado e
canulado – tubo de polietileno PE-30 (Fig. 11), bem como a artéria mesentérica
superior, artéria renal (Fig. 12) e a glândula supra-renal identificadas. O rim direito foi
descapsulado e a glândula supra-renal isolada. Outra cânula metálica foi introduzida
na artéria mesentérica superior até a artéria renal, onde foi fixada (Fig. 13).
45
Figura 14 - Identificação e dissecação do ureter (A) e ureter canulado (B).
46
Figura 15 - Visualização da artéria mesentérica (A), da artéria renal (B) e também da art éria aorta
(C).
Figura 16 - Canulaç ão da artéria renal realizada através da artéria mesent érica.
47
Durante o procedimento cirúrgico, uma parte da solução já oxigenada
(40mL) foi desviada para o sistema de perfusão in situ, para perfundir o rim ainda in
vivo, evitando qualquer isquemia ao órgão. Finalmente, o rim foi transportado para o
sistema de perfusão in vitro, sem a interrupção do fluxo (Fig. 17).
Figura 17 - Rim de rato isolado no sistema de perfusão.
48
4.1.7 Protocolo Experimental
Os experimentos foram iniciados após a estabilização e adaptação do
órgão às novas condições. Após os 30 minutos iniciais, considerados como controle
interno, foi adicionada a substância-teste e observadas as mudanças nos
parâmetros renais até os 120 minutos.
A cada cinco minutos foram registrados a pressão de perfusão e o fluxo
de perfusão em manômetro e fluxômetro, respectivamente. Amostras de urina e
perfusato foram coletadas a cada dez minutos, e depois congeladas a -20 °C para
posterior dosagem de sódio, potássio, cloreto, inulina e osmolaridade, importantes
no cálculo dos parâmetros da função renal.
4.1.8 Análises Bioquímicas
Nas amostras de urina e perfusato foram realizadas determinações de
sódio, potássio e cloreto pelo método do íon eletrodo seletivo (RapidChem 744 Bayer®diagnóstica). Essas determinações foram realizadas no Laboratório de
Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Farmácia, Odontologia e
Enfermagem da Universidade Federal do Ceará.
A inulina do perfusato e da urina foi determinada por hidrólise direta,
conforme Walser et al. (1955) e Fonteles et al. (1983), com modificações que
reduziram as quantidades de amostras e reagentes utilizados. Esse parâmetro foi
determinado no Laboratório de Farmacologia de Venenos e Toxinas (LAFAVET) do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará.
A osmolaridade das amostras de urina e perfusato foram medidas
utilizando um osmômetro (Osmômetro de Pressão a Vapor - modelo WESCOR®
Vapro 5520).
49
4.1.9 Cálculo dos Parâmetros Funcionais Renais
-1
-1
1. FU (mL.g . min ) = Fluxo urinário
FU = (Peso do volume urinário / Peso do rim esquerdo) x 10
2. PP (mmHg) = Pressão de perfusão. Leitura em manômetro
-1
-1
3. RFG (mL.g .min ) = Ritmo de filtração glomerular
RFG = (DOU in / DOP in x FU) sendo DOU in = densidade ótica da inulina na urina e DOP in =
densidade ótica da inulina no perfusato
-1
-1
4. FPR (mL.g .min ) = Fluxo de perfusão renal (registrado a cada 10 min/peso do rim/intervalo de
tempo)
-1
-1
5. RVR (mm Hg/mL.g .min ) = Resistência vascular renal
RVR = PP (mmHg) / FPR
+
-1
-1
6. FNa (μEq.g . min ) = Sódio filtrado
+
+
FNa = RFG x PNa+ (PNa = Concentração de sódio no perfusato)
+
-1
-1
7. ENa (μEq.g . min ) = Sódio excretado
+
+
+
ENa = FU x UNa (UNa = Concentraç ão de sódio na urina)
+
-1
-1
8. TNa (μEq.g . min ) = Sódio transportado
+
+
+
TNa = FNa - ENa
+
9. %TNa = Percentual de sódio transportado
+
+
+
%TNa = TNa x 100 / FNa
10. %TpNa+ = Percentual de sódio proximal transportado
+
+
+
%TpNa = TpNa x 100 / FNa
+
-1
-1
11. FK (μEq.g . min ) = Potássi o filtrado
+
+
+
FK = RFG x PK (PK = concentração de potássio no perfusat o)
+
-1
-1
12. EK (μEq.g . min ) = Potássio excretado
+
+
+
EK = FU x UK (UK = Concent ração de potássio na urina)
+
-1
-1
13. TK (μEq.g . min ) = Potássi o transportado
+
+
TK = FK - EK
+
+
14.TK = Percentual de potássi o transportado
+
+
%TK = TK x 100 / FK
+
+
15. %TpK = Percentual de potássio proximal transportado
+
+
%TpK = TpK x 100 / FK
-1
+
-1
16. TCl- (μEq.g . min ) = Cloreto transportado
TCl
–
= FCl
–
- ECl
–
17. % TCl- = Percentual de cloreto transportado
% TCl
–
= TCl
–
x 100 / F TCl
–
18. % TpCl- = Percentual de cloreto proximal transportado
% TpCl
–
= TpCl
–
x 100 / F TCl
–
Quadro 1 - Cálc ulos para determinação dos parâmetros funcionais renais.
50
4.1.10 Análise Histológica
Após cada experimento, ambos, rim direito (perfundido) e rim esquerdo
(controle), foram coletados e fixados numa solução de formal a 10%, para posterior
análise histológica.
Os fragmentos obtidos foram submetidos à desidratação, diafanização, e,
em seguida, cortados em uma espessura de 5μm. Foram realizadas colorações de
hematoxilina-eosina (HE) e as lâminas analisadas através de um microscópio óptico
(NIKON). Todas as lâminas foram confeccionadas e analisadas no Laboratório de
Patologia-BIOPSE pelo Prof. Dr. Dalgimar Beserra de Menezes.
4.1.11 Análise Estatística
Foi usado o programa estatístico GraphPrism 5.0 para análise dos dados,
que foram expressos como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de seis
experimentos em cada grupo.
Todas as tabelas e gráficos que avaliaram os parâmetros renais foram
estudados de acordo com a variável tempo, compilados em quatro grupos de 30
minutos denominados: 30, 60, 90 e 120 minutos. Os dados foram avaliados através
de Análise da Variância (ANOVA), com pós-teste de Dunnett´s (múltipla comparação
entre os grupos) e teste t de Student como comparativo entre os grupos controle e
tratado. O critério de significância utilizado foi p<0,05.
4.2 Efeitos na Pressão Arterial Média de Ratos Anestesiados
4.2.1 Animais de Experimentação
Ratos Wistar, machos, pesando de 250-300 g foram submetidos a jejum de
24 horas.
4.2.2 Técnica Cirúrgica
Após o jejum os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (50
mg/kg) e submetidos à cirurgia. A traquéia foi isolada e uma curta cânula de
polietileno (PE 120) foi inserida nos animais por meio de traqueostomia, permitindo
51
um fluxo respiratório espontâneo e a fácil aspiração de eventuais secreções
brônquicas.
Figura 18 - Localização anatômica da artéria e veia femural e posicionamento dos cateteres
arterial (vermelho) e venoso (azul).
Após a traqueostomia, dois cateteres de polietileno (PE10 conectado a
PE50) pré-enchidos com heparina (500 UI.mL -1 em salina isotônica) foram
implantados na aorta abdominal (para registro da Pressão Arterial Média
e
Frequência Cardíaca) e na veia cava inferior (para administração de drogas), ambos
1 cm abaixo da artéria renal, conforme técnica descrita previamente (LAHLOU et al.,
1999; SIQUEIRA, 2005).
4.2.3 Protocolo Experimental
Foram utilizadas quatro doses para executar a curva dose-resposta 30,
100, 300 e 1000 µg/Kg e os resultados foram expressos em percentagem de queda
frente ao valor basal.
52
4.2.4 Sistema de Aquisição de Dados
No momento do experimento, o cateter aórtico foi acoplado a um
transdutor de pressão piezo-elétrico (Braile BXSN) acoplado ao sistema de
amplificação de sinal com interface USB (DATAQ DI-148U) e utilizando o software
de aquisição de dados WinDaq/Lite. A P.A.M. e a F.C. foram diretamente calculadas
pelo software (Figura 19).
Figura 19 - Sistema de aquisição de dados.
4.2.5 Análise Histológica
Após cada experimento os rins e o coração foram coletados e fixados em
uma solução de formal a 10%, para posterior análise histológica.
Os fragmentos obtidos foram submetidos à desidratação, diafanização, e,
em seguida, cortados em uma espessura de 5μm. Foram realizadas colorações de
hematoxilina-eosina (HE) e as lâminas analisadas através de um microscópio óptico
(NIKON). Todas as lâminas foram confeccionadas e analisadas no Laboratório de
Patologia-BIOPSE pelo Prof. Dr. Dalgimar Beserra De Menezes.
53
4.3 Avaliação da Atividade do 6-gingerol sobre as Células Tubulares Renais
(MDCK)
4.3.1 Linhagem Celular
As células utilizadas foram células tubulares renais do tipo MDCK (MadinDarby Canine Kidney) que foram cultivadas no Laboratório de Cultura Celular (LCC)
do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal do
Ceará.
4.3.2 Cultivo e Tratamento das Células MDCK
Foram cultivadas em garrafas de polietileno para cultura (volume de
250mL) e o meio de cultura usado foi o RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 10%
v/v de Soro Bovino Fetal (SBF), penicilina (100UI/mL) e estreptomicina (100μg/mL).
As células foram incubadas a 37ºC, em atmosfera com 95% de umidade e 5% de
CO2.
Antes de cada experimento as células foram armazenadas em meio sem
SBF por 24h para a obtenção de células na fase G0 do ciclo celular. Para cada
experimento o meio de cultura foi removido e as células foram incubadas com
tripsina-EDTA (0,25/0,02% v/v) a 37ºC por aproximadamente 10min. A tripsina foi
inativada adicionando o mesmo volume de meio com SBF. A suspensão foi então
centrifugada a 200g por 10min (MARTINS et al. 2005; CHAIM, 2005). O
sobrenadante foi descartado e as células re-suspensas em meio de cultura. As
células foram então quantificadas em câmara de Neubauer e plaqueadas
(1x105céls/poço) permitindo o crescimento confluente por 2h.
As
células
então
foram
avaliadas
na
presença
de
diferentes
concentrações de 6-gingerol, solubilizadas em DMSO a 1% e pH 7.4. Foram
realizados experimentos com os tempos de 6 horas e 24 horas. Após esses períodos
também foram realizados ensaios de viabilidade (Figura 26).
54
Figura 20 – Fluxograma do cultivo e tratamento das células MDCK. Font e: LCC – Laborat ório de
Cultivo Celular.
As alíquotas de células para estoque foram mantidas em meio de cultura
RPMI 1640 acrescido de SBF a 50% e DMSO a 10%, congeladas primeiramente à 80°C e mantidas em nitrogênio líquido (F RESHENEY, 2000).
4.3.3 Ensaio Colorimétrico com Sal de Tetrazolium (MTT)
As células MDCK foram divididas em três grupos:
 Grupo 1: Células tratadas com 6-gingerol nas concentrações (1µM; 3 µM; 10
µM; 30 µM; 100 µM)
 Grupo 2: Células tratadas com Capzasepina nas concentrações (1 µM; 3 µM;
10 µM; 30 µM; 100; 300 µM)
 Grupo 3: Células tratadas com 6-gingerol (10 µM), capzasepina (30 µM) e
combinação destas.
55
Antes dos tratamentos as células foram adicionadas a placas de 96 poços
com densidade de 1 x 10 5 e tratadas de acordo com os grupos citados acima em
dois tempos de encubação; 6 horas e 24 horas. Após a exposição das células as
substâncias, 100μL de sobrenadante de cada poço foi retirado e então adicionado 3(4,5-dimetilazil-2-il)-2,5 difenil tetrazólico (MTT) (Sigma) 2,5 mg/mL dissolvido em
PBS. Este método baseia-se na atividade metabólica de células viáveis, formando
um produto colorido (sal de formazan, que é insolúvel em água). Após incubação por
4 horas, à 37ºC, em estufa com 5% de CO2, o sobrenadante foi removido e então foi
adicionado dodecil sulfato de sódio 10% (SDS – 10%) em HCL 0,01N para
solubilizar os cristais de formazan formados. As placas foram incubadas por 17h e
em seguida foi realizada a leitura em espectrofotômetro (570nm). Os ensaios foram
realizados em triplicata (MOSMANN,1983) e a viabilidade celular foi determinada por
comparação entre as absorbâncias encontradas nos grupos tratados e a
absorbância média do grupo controle (representa 100% de células viáveis).
4.3.4 Aspectos Éticos
Todos os nossos experimentos foram feitos de acordo com as
recomendações do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais (CEPA) da
Universidade Federal do Ceará, sob o número 55/09.
56
RESULTADOS
57
5. RESULTADOS
5.1 Avaliação da Atividade do 6-gingerol e da Capzasepina sobre as Células
MDCK
O 6-gingerol apresentou redução da viabilidade apenas na dose de 30µM
no período de incubação de 6 (seis) horas, quando comparados com o controle
(Controle: 100,0 ±1,024; 1µM: 112,7 ± 7,736; 3µM 107,2 ± 0,1138; 10µM 111,4 ±
3,640; 30µM 92,95* ± 0,2275) (Fig. 21).
Não foi observada redução da viabilidade das células MDCK no grupo da
capzasepina e no grupo da combinação das duas substâncias quando comparados
ao controle (Figura. 21 e Figura. 22, respectivamente).
5.2 Experimento com 6 horas de Incubação
Figura 21 - E feitos do 6-Gingerol em células tubulares renais (MDCK ). Ensaio com MTT os dados
são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) da absorbância e representam o percentual
de células viáveis após um período de incubação de 6 horas. Os dados foram avaliados através de
Análise da Variância (A NOVA ), com pós-teste de Dunnett´s (múltipla comparação entre os grupos). O
critério de significância utilizado foi de p<0,05. * significa p< 0,05 em relação ao grupo cont role (n=9) .
58
% Viabilidade capsazepina
Viabilidade celular (%)
150
100
50
0
Controle
1
3
10
30
Concentrações (/M)
Figura 22 - E feitos da Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT os dados
são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) da absorbância e representam o percentual
de células viáveis após um período de incubação de 6 horas. Os dados foram avaliados através de
Análise da Variância (A NOVA ), com pós-teste de Dunnett´s (múltipla comparação entre os grupos). O
critério de significância utilizado foi de p<0,05. * significa p< 0,05 em relação ao grupo cont role (n=9) .
% Viabilidade combinação
Viabilidade celular (%)
150
100
50
0
Controle 6-Ging 10
Cap 30 Cap+6-Ging
Concentrações (/M)
Figura 23 - Efeitos do 6-Gingerol + Capsaz epina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com
MTT os dados são ex pressos por média ± E rro Padrão Médio (E.P.M.) da absorbância e representam
o percent ual de células viáveis após um período de incubação de 6 horas. Os dados foram avaliados
através de Análise da Variância (A NOVA), com pós-teste de Dunnett´s (múltipla comparação ent re os
grupos). O critério de significância utilizado foi de p<0,05. * significa p<0, 05 em relação ao grupo
controle (n=9).
59
5.3 Experimento com 24 horas de Incubação
O 6-gingerol causou uma redução da viabilidade das células MDCK
analisadas nas concentrações de 30 µM e 100 µM (30 µM 65,22* ± 2,47; 100 µM
6,347* ± 0,03534) (Figura 24).
A capsazepina causou uma redução da viabilidade das células MDCK nas
doses de 100 µM e 300 µM (100 µM 73,793* ± 2,13; 300 µM 40,293* ± 1,88) (Figura
25).
No grupo de união das duas substâncias 6-gingerol 10 µM e capsazepina
30 µM não houve redução significativa da viabilidade (Figura 26). Neste mesmo
gráfico pode ser visto um aumento da viabilidade com a capsazepina na dose de 30
µM.
Figura 24 - E feitos do 6-Gingerol em células tubulares renais (MDCK ). Ensaio com MTT os dados
são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) da absorbância e representam o percentual
de células viáveis após um período de incubação de 24 horas. Os dados foram avaliados através de
Análise da Variância (A NOVA ), com pós-teste de Dunnett´s (múltipla comparação entre os grupos). O
critério de significância utilizado foi de p<0,05. * significa p< 0,05 em relação ao grupo cont role (n=9).
60
Figura 25 - E feitos da Capsazepina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com MTT os dados
são expressos por média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) da absorbância e representam o percentual
de células viáveis após um período de incubação de 24 horas. Os dados foram avaliados através de
Análise da Variância (A NOVA ), com pós-teste de Dunnett´s (múltipla comparação entre os grupos). O
critério de significância utilizado foi de p<0,05. * significa p< 0,05 em relação ao grupo cont role (n=9) .
Figura 26 - Efeitos do 6-Gingerol + Capsaz epina em células tubulares renais (MDCK). Ensaio com
MTT os dados são ex pressos por média ± E rro Padrão Médio (E.P.M.) da absorbância e representam
o percentual de células viáveis após um período de incubação de 24 horas. Os dados foram
avaliados através de Análise da Variância (ANOVA ), com pós -teste de Dunnett´s (múltipla
comparação entre os grupos). O critério de significância utilizado foi de p< 0,05. * significa p<0,05 em
relação ao grupo controle (n=9).
61
5.4 Avaliação da Atividade do 6-gingerol na Pressão Arterial Média de Ratos
Anestesiados
Administrações
consecutivas
de
doses
crescentes
do
6-gingerol
produziram redução significativa da pressão arterial média em relação ao controle
em todas as doses utilizadas. A análise estatística destes percentuais máximos de
redução da pressão arterial mostrou que a redução foi significativa em relação aos
valores da dose imediatamente menor em todas as doses utilizadas, conforme
ilustrado na Figura 27.
Os percentuais de redução foram: dose 30 µg/Kg (19,47 ± 3,055); dose 100
µg/Kg (24,09 ± 3,644 ); 300 µg/Kg (41,00 ± 6,092 ); 1000 µg/Kg (52,88 ± 3,372).
6-GINGEROL
 Pressão Arterial
(%)
0
-20
*
*
-40
*
-60
30
100
300
1000
Dose (g/kg)
Figura 27 - Relaç ão dos e-efeit o da administração de 6-gingerol, em bolus, em ratos anestesiados
com pent obarbital sódico (50 mg/Kg), no percent ual de reduç ão da pressão arterial. Dados expressos
como média ± E.P.M. e analisados por análise de variância (A NOVA), com pós -t este de B onferroni, e
pelo teste t de Studente, com *p < 0,05.
A figura 28 demonstra a redução significativa na pressão arterial média em
valores absolutos quando comparados com controle.
As médias dos grupos controle (120,30 ± 3,022); (121,95 ± 3,055); (117,60 ±
4,644); (116,20 ± 4,092); (119,40 ± 5,372) e tratados com o 6-gingerol nas doses de
30 µg/Kg, 100 µg/Kg, 300 µg/Kg, 1000 µg/Kg, respectivamente: (119,84 ± 3,049);
(98,100* ± 3,001); (94,950** ± 3,644); (81,550** ± 6,092); (56,670*** ± 4,372).
62
Pressão Arterial em Valores Abasolutos
Controle
Tratado
Pressão Arterial
140
120
*
100
*
80
**
***
60
40
20
0
0
30
100
300
1000
Dose (g/kg)
Figura 28 - Relaç ão dos e-efeit o da administração de 6-gingerol, em bolus, em ratos anestesiados
com pentobarbital sódico (50 mg/Kg), na pressão arterial média. Dados expressos como média ±
E.P.M. e analisados por análise de variância (ANOVA), com pós-teste de Bonferroni, e pelo teste t de
Studente, com *p < 0,05.
5.5 Análise Histológica
Na análise histológica do tecido cardíaco após o experimento de
pressão arterial com 6-gingerol não foi observada nenhuma alteração. (Figura 29).
63
Figura 29 - Aspecto morfológico normal do tecido cardíaco do grupo analisado através de
microscopia óptica (aument o de 400x e coloração de hematoxilina-eosina).
Na análise histológica dos rins após o experimento de pressão arterial com 6gingerol não foi observada nenhuma alteração. Os glomérulos e túbulos não
apresentaram deposição de material proteináceo e os vasos e o interstício
apresentaram aspecto normal. (Figura. 29).
64
Figura 30 - Aspecto morfológico normal dos rins do grupo analisado através de microscopia óptica
(aumento de 400x e coloração de hematoxilina-eosina).
5.6 Perfusão de Rim Isolado Frente ao 6-gingerol
Com a realização deste estudo pode-se observar um aumento na pressão
de perfusão aos 90 e 120 minutos na dose de 3µM quando comparada ao grupo
controle interno (c) (PPc 101.0 ± 1.615; PP90’108.5* ± 1.889; PP 120’ 118.2** ± 2.949;
p<0,05, ** p<0,01; *** p<0,0001). Em relação às outras doses utilizadas 10 µM e 30
µM houve aumento significativo em todos os tempos estudados quando comparados
ao grupo controle interno (PPc 108.2 ± 2.322; PP60 113.7 ± 5.975** ; PP90 124.9 ±
4.346**; PP120 133.5 ± 3.947**); (PPc 94.08 ± 1.669; PP60 101.1 ± 1.834**; PP90
109.9 ± 2.714***; PP120 119.4 ± 3.856***) (Fig. 31).
65
A resistência vascular renal sofreu aumento significativo em nossos
estudos apenas nos tempos de 90 e 120 minutos quando comparados com o
controle interno na dose de 10 µM (RVRc 5.416 ± 0.4566; RVR90 6.417 ± 0.431*;
RVR120 6.644 ± 0.423*) (Fig. 32).
O fluxo urinário mostrou aumento significativo nos tempos de 90 e 120
minutos quando comparados com o controle interno, nas doses de 10 µM e 30 µM
(FUc 0.09042 ± 0.007655; FU60 0.1198 ± 0.01258**; FU90 0.1494 ± 0.01426**; FU120
0.1759 ± 0.01473***); (FUc 0.06346 ± 0.002895; FU60 0.07322 ± 0.002686**; FU90
0.1249 ± 0.008615***; FU120 0.1785 ± 0.02449***) (Fig. 33).
Outro parâmetro estudado e que sofreu redução significativa em todas as
doses utilizadas 3 µM, 10 µM e 30 µM e em todos os períodos analisados, quando
foram comparados com o controle interno, foi o ritmo de filtração glomerular (RVRc
0.4260 ± 0.035200; RVR60 0.1810 ± 0.018330***; RVR90 0.1815 ± 0.007558***;
RVR120
0.1944 ± 0.023520***); (RVRc 0.40950 ± 0.05275; RVR60 0.26820 ±
0.04320**;
RVR90 0.24630 ± 0.03700**; RVR120 0.20250 ± 0.02703***); (RVRc
0.41080 ± 0.02037;
RVR60 0.29120 ± 0.02258**;
RVR90 0.30513 ± 0.01768**;
RVR120 0.28280 ± 0.02631**) (Fig.34).
O transporte tubular de sódio foi reduzido de forma significativa em todas
as doses 3 µM, 10 µM e 30 µM utilizadas e em todos os tempos estudados quando
comparados com o controle interno (%TNac 81.88 ± 1.856; %TNa60 63.30 ±
2.312***; %TNa90 63.38 ± 2.316***; %TNa120 61.32 ± 3.494***); (%TNac 83.13 ±
1.856; %TNa60 68.93 ± 3.627**;
%TNa90 69.06 ± 1.600**; %TNa
120
46.47 ±
2.907***); (%TNac 83.51 ± 2.541; %TNa60 61.78 ± 5.842***; %TNa90 62.20 ± 4.255
***; %TNa120 61.30 ± 3.943 **) (Fig.35).
O transporte tubular de potássio sofreu alterações da mesma forma que o
transporte de sódio, ocorrendo redução de maneira semelhante: (%TKc 70.21 ±
2.596; %TK60 39.75 ± 4.264 ***; %TK 90 41.22 ± 3.495***; %TK 120 39.56 ± 4.560***);
(%TKc 72.08 ± 4.108; %TK 60 45.21 ± 5.822 **; %TK 90 46.23 ± 2.523 **; %TK 120
37.78 ± 2.259***); (%TKc 65.28 ± 4.321; %TK 60 34.78 ± 6.734 ***; %TK 90 33.05 ±
7.716***; %TK 120 39.68 ± 5.918**) (Fig. 36).
66
O transporte de cloretos também foi reduzido em todos os tempos
estudados e com as doses utilizadas 3 µM, 10 µM e 30 µM de 6-gingerol (%TClc
78.25± 4.284; %TCl60 51.79 ± 1.675***; %TCl90 51.80 ± 1.060***; %TCl120 52.62 ±
2.302***); (%TClc 80.95 ± 2.955; %TCl60 64.14 ± 4.572**; %TCl90 66.42 ± 2.410**;
%TCl120 36.08 ± 3.974***); (%TClc 81.27 ± 2.567; %TCl60 60.78 ± 4.999**; %TCl90
56.95 ± 4.598**; %TCl120 61.09 ± 5.209**) (Fig. 37).
5.7 Efeitos do 6-gingerol nos Parâmetros Renais.
Figura 31 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol nas concentraç ões de 3 µM, 10µM, 30 µM e
DMSO utilizado como diluente na pressão de perfusão os dados são ex pressos por média ± Erro
Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro perí odos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A
análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.
67
RVR
RVR (mmHg.mL/g/min)
8
6
*
*
DMSO
3
10
30
4
2
0
30
60
90
120
Tempo (min)
Figura 32 - Efeitos renais promovidos pelo 6 -gingerol nas concentraç ões de 3 µM, 10µM, 30 µM e
DMSO utilizado como diluente na resistência vascular renal os dados são expressos por média ± Erro
Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro perí odos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120 minutos). A
análise estatística foi feita por A NOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0,05 em re lação
ao controle interno (n=6).
Figura 33 - Efeitos renais promovidos pelo 6 -gingerol nas concentraç ões de 3 µM, 10µM, 30 µM e
DMSO utilizado como diluente no fluxo urinário os dados são expressos por média ± E rro Padrão
Médio (E.P.M.) compilados em quat ro períodos de 30 minut os (30, 60, 90 e 120 minutos). A análise
estatística foi feita por A NOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p<0,05 em relação ao
controle interno.
68
Figura 34 - Efeitos renais promovidos pelo 6 -gingerol nas concentraç ões de 3 µM, 10µM, 30 µM e
DMSO utilizado como diluente no ritmo de filtraç ão glomerular os dados são expressos por média ±
Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minut os (30, 60, 90 e 120
minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p< 0,05
em relaç ão ao controle interno (n=6).
Figura 35 - Efeitos renais promovidos pelo 6 -gingerol nas concentraç ões de 3 µM, 10µM, 30 µM e
DMSO utilizado como diluente no percentual de transporte de s ódio os dados são expressos por
média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120
minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p< 0,05
em relaç ão ao control e interno (n=6).
69
Figura 36 - Efeitos renais promovidos pelo 6 -gingerol nas concentraç ões de 3 µM, 10µM, 30 µM e
DMSO utilizado como diluente no percentual de transporte de potássio os dados são expressos por
média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120
minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p< 0,05
em relaç ão ao controle interno (n=6).
Figura 37 - Efeitos renais promovidos pelo 6 -gingerol nas concentraç ões de 3 µM, 10µM, 30 µM e
DMSO utilizado como diluente no percentual de transporte de cloreto os dados são expressos por
média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120
minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p< 0,05
em relaç ão ao controle interno (n=6).
70
5.8 Análise histológica dos grupos da perfusão renal.
Na análise histológica dos rins perfundidos com 6-gingerol na dose
com DMSO 1% não apresentaram deposição de material proteináceo e os vasos e o
interstício apresentaram aspecto normal (Figura 38).
Figura 38 - Corte histopatológico de rim perfundido soment e com solução de K rebs -Hanseleit
modificada e DMSO 1% por 120 min (n=6, coloração de hematoxilina-eosina, aumento 100X).
Na análise histológica dos rins perfundidos com 6-gingerol na dose de 3 µM
não foi observado nenhuma alteração nos glomérulos, túbulos, interstícios e vasos
(Figura 39).
71
Figura 39 - Corte histológico de rim direito perfundido com 6-gingerol 3 µM (n=6, coloração de
hematoxilina-eosina, aumento 400X).
Na análise histológica dos rins perfundidos com 6-gingerol na dose de 10
µM não foi observado nenhuma alteração nos glomérulos, túbulos, interstícios e
vasos (Figura 40).
72
Figura 40 - Corte histológico de rim direito perfundido com 6-gingerol 10 µM. (n= 6, coloração de
hematoxilina-eosina, aumento 400X).
Na análise histológica dos rins perfundidos com 6-gingerol na dose de 30
µM
foi observado deposição de material proteináceo no espaço de Bowman e
intensa deposição de material proteináceo nos túbulos. Entretanto, os vasos e os
interstícios não apresentaram nenhuma alteração (Figura 41).
73
Figura 41 - Corte histológico de rim direito perfundido c om 6-gingerol 30 µM (n=6, coloraç ão de
hematoxilina-eosina, aumento 400X).
5.9 Efeitos do 6-gingerol frente ao Bloqueio do TRPV1 com Capzasepina.
A administração do 6-gingerol causou um aumento na pressão de
perfusão aos 60, 90 e 120 minutos na dose de 10 µM quando comparada ao grupo
controle interno (c) (PPc 94.08 ± 1.669; PP60’ 101.10* ± 1.834; PP90’ 109.90* ± 2.714;
PP120’ 119.40* ± 3.856) *p<0,05 (Figura 42).
No grupo controle com capsazepina 30 µM houve uma aumento
significativo apenas no tempo de 60 minutos (PP60 100.15* ± 4.800) (Figura 42)
O grupo da combinação do 6-gingerol 10 µM e da capsazepina 30 µM
demonstrou uma atenuação do aumento da pressão de perfusão nos tempos de 60
e 90 minutos, mas não no tempo de 120 minutos (PP 90 115.90* ± 6.698) (Figura 42).
74
Figura 42 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio
com capzasepina na concentração de 30 µM na pressão de perfusão os dados são expressos por
média ± Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro p eríodos de 30 minutos (30, 60, 90 e 120
minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p< 0,05
em relaç ão ao controle interno (n=6).
A resistência vascular renal sofreu aumento significativo em todos os
tempos de 60, 90 e 120 minutos quando comparados com o controle interno na dose
de 10 µM (RVRc 3.973 ± 0.1700; RVR60 4.266 ± 0.1739*; RVR90 4.632 ± 0.1872*;
RVR120 5.039 ± 0.2480*) (Figura 43)..
A utilização da capsazepina 30 µM mostrou um aumento significativo na
resistência vascular renal no tempo de 60 minutos quando comparado com o
controle interno (RVR60 4.33 ± 0.187*) (Figura 43.
O grupo da combinação do 6-gingerol 10 µM e da capsazepina 30 µM não
conseguiu reverter o aumento da resistência vascular renal. No entanto, a
comparação entre grupos no mesmo período de tempo 120 minutos, demonstrou
uma redução significativa neste parâmetro. (RVR120 5.039 ± 0.2480; 4.933# ± 0.2429)
(Figura 43).
75
Figura 43 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio
com capzasepina na concentração de 30 µM na resistência vascular renal os dados são expressos
por média ± Erro P adrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minut os (30, 60, 90 e
120 minut os). A análise estatística foi feita por A NOVA e teste t de student com p<0,05. * significa
p<0,05 em relação ao controle interno (n= 6); # significa p<0,05 em relação ao grupo trat ament o (n= 6)
no mesmo período avaliado.
O fluxo urinário foi aumento de forma significativa no grupo com 6gingerol na dose de 10 µM quando comparados de maneira tempo dependente (FUc
0.09942 ± 0.007655; FU60 0.11980 ± 0.010580*; FU90 0.14940 ± 0.012260*; FU120
0.17590 ± 0.012730*) (Figura 44).
A utilização da capsazepina 30 µM não demonstrou alteração significativa
no fluxo urinário nos tempos estudados (Figura 44).
O grupo da combinação do 6-gingerol 10 µM e da capsazepina 30 µM não
conseguiu reverter o aumento do fluxo urinário. No entanto, a comparação entre
grupos no mesmo período de tempo 120 minutos, demonstrou uma redução
significativa neste parâmetro. (FU120 0.11000 ± 0.013600; 0.1466# ± 0.017600)
(Figura 44).
76
Figura 44 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio
com capzasepina na concentração de 30 µM no fluxo urinário os dados são expressos por média ±
Erro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minut os (30, 60, 90 e 120
minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05. * significa p< 0, 05
em relação ao controle interno (n=6); # signific a p<0,05 em relação ao grupo tratamento (n=6) no
mesmo período avaliado.
O ritmo de filtração glomerular foi reduzido em todos os tempos estudados
houve uma queda no grupo do 6-gingerol na dose 10 µM quando comparados com o
controle interno (RFGc 0.40500 ± 0.04875; RFG60 0.26820 ± 0.04320**; RFG90
0.24630 ± 0.03700**; RFG120 0.20250 ± 0.02703**) (Figura 45)..
O grupo da capsazepina 30 µM não alterou de forma significativa o ritmo
de filtração glomerular (Figura 45).
O grupo da combinação do 6-gingerol 10 µM e da capsazepina 30 µM não
conseguiu reverter a queda do ritmo de filtração glomerular, mas o bloqueio com a
capsazepina consegui recuperar parcialmente este ritmo no tempo de 120 minutos
quando comparado com o grupo do 6-gingerol no mesmo período estudado, 120
minutos (RFG120 0.20250 ± 0.02703; 0.3308# ± 0.03859) (Figura 45).
77
Figura 45- Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio
com capzasepina na conc entraç ão de 30 µM no ritmo de filtração glomerular os dados são expressos
por média ± Erro P adrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minut os (30, 60, 90 e
120 minut os). A análise estatística foi feita por A NOVA e teste t de student com p<0,05. * significa
p<0,05 em relação ao controle interno (n= 6); # significa p<0,05 em relação ao grupo trat ament o (n= 6)
no mesmo período avaliado.
.
O transporte tubular de sódio foi reduzido de forma significativa em todos
ostempos estudados na dose 10 µM utilizadas quando comparados com o controle
interno (%TNac 83.13 ± 1.856; %TNa60 72.93 ± 3.627*; %TNa90 75.06 ± 1.600*;
%TNa120 46.47 ± 2.907*) (Figura 46).
O percentual de transporte de sódio não foi alterado de forma significativa
no grupo com capsazepina 30 µM (Figura 46).
O grupo da combinação do 6-gingerol 10 µM e da capsazepina 30 µM não
conseguiu reverter a redução do percentual de transporte tubular de sódio,mas o
bloqueio com a capsazepina consegui reduzir esta perca no tempo de 120 minutos
quando comparado com o grupo do 6-gingerol no mesmo período estudado, 120
minutos (%TNa120 46.47 ± 2.907; 56.65# ± 4.886) (Figura 46).
78
Figura 46- Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio
com capzasepina na concentração de 30 µM no percentual de transporte de sódio os dados são
expressos por média ± E rro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos
(30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0, 05.
* significa p< 0,05 em relação ao controle interno (n=6); # significa p<0,05 em relação ao grupo
tratamento (n= 6) no mesmo período avaliado.
.
O transporte tubular de potá ssio foi reduzido de forma significativa em
todos ostempos estudados na dose 10 µM utilizadas quando comparados com o
controle interno (%TKc 76.08 ± 4.108; %TK60 54.21 ± 5.822*; %TK90 61.23 ± 2.523*;
%TK120 37.78 ± 2.259**) (Figura 47).
O percentual de transporte de potássio não foi alterado de forma
significativa no grupo com capsazepina 30 µM (Figura 47).
O grupo da combinação do 6-gingerol 10 µM e da capsazepina 30 µM não
conseguiu reverter a redução do percentual de transporte tubular de potássio, mas o
bloqueio com a capsazepina potencializou a redução do transporte no tempo de 90
minutos quando comparado com o grupo do 6-gingerol no mesmo período estudado
(%TK90 61.23 ± 2.523; 39.44# ± 2.231) e voltou logo após, no tempo de 120 minutos,
houve uma recuperação em relação ao 6-gingerol no mesmo período estudado
(%TK120 37.78 ± 2.259; 41.54# ± 4.282) (Figura 47).
79
Figura 47 - Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio
com capzasepina na concentração de 30 µM no percentual de transporte de potássio os dados são
expressos por média ± E rro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos
(30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05.
* significa p< 0,05 em relação ao controle interno (n=6); # significa p<0,05 em relação ao grupo
tratamento (n= 6) no mesmo período avaliado.
O transporte tubular de cloreto foi reduzido de forma significativa em todos
os tempos estudados na dose 10 µM utilizadas quando comparados com o controle
interno (%TClc 80.95 ± 2.955; %TCl60 67.14 ± 4.572*; %TCl90 69.42 ± 2.410*;
%TCl120 36.08 ± 3.974*) (Figura 48).
O percentual de transporte de cloreto não foi alterado de forma
significativa no grupo com capsazepina 30 µM (Figura 48).
O grupo da combinação do 6-gingerol 10 µM e da capsazepina 30 µM não
conseguiu reverter a redução do percentual de transporte tubular de cloreto, mas o
bloqueio com a capsazepina potencializou a redução do transporte no tempo de 90
minutos quando comparado com o grupo do 6-gingerol no mesmo período estudado
(%TK90 69.42 ± 2.410; 52.64# ± 2.339) e voltou logo após, no tempo de 120 minutos,
houve uma recuperação em relação ao 6-gingerol no mesmo período estudado
(%TK120 36.08 ± 3.974; 51.54# ± 4.036) (Figura 48).
80
Figura 48- Efeitos renais promovidos pelo 6-gingerol na concentração de 10µM e frente ao bloqueio
com capzasepina na concentração de 30 µM no percentual de transporte de sódio os dados são
expressos por média ± E rro Padrão Médio (E.P.M.) compilados em quatro períodos de 30 minutos
(30, 60, 90 e 120 minutos). A análise estatística foi feita por ANOVA e teste t de student com p<0,05.
* significa p< 0,05 em relação ao controle interno (n=6); # significa p<0,05 em relação ao grupo
tratamento (n= 6) no mesmo período avaliado.
.
81
DISCUSSÃO
82
6. DISCUSSÃO
Os resultados encontrados de redução na pressão arterial demonstram
que o 6-gingerol possui excelente ação hipotensora, o que está de acordo com as
observações da medicina tradicional onde há muitos anos o gengibre é utilizado
para o tratamento de doenças cardiovasculares. É conhecido por ter um potencial
diurético na medicina oriental e ser capaz de reduzir a pressão arterial sanguínea,
sendo prescrito, na medicina paquistanesa, à pacientes hipertensos para utilização
após o jantar (GHAYUR et al, 2005; MILLER et al, 2000).
O gengibre também é recomendado pelos curandeiros no Sul da Ásia
para o uso em cardiopatias, hipertensão e para melhorar a circulação, devido ao seu
potencial de inibir a agregação plaquetária (KAPOOR, 1990; DUKE, 2002).
Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS, 2011), indicam
que a há cerca de 600 milhões de hipertensos no mundo e que a doença atinge, em
média, 25% da população brasileira, chegando a mais de 50% da população
brasileira e, supreerdentemente, a 5% dos 70 milhões de crianças e adolescentes do
Brasil.
A elevação prolongada da pressão arterial lesiona os vasos sanguíneos
por todo o corpo, principalmente em órgãos-alvo, como o coração, rins, cérebro e
olhos, além de provocar espessamento e perda de elasticidade das paredes arteriais
e
aumento
da
resistência
vascular periférica
nos
vasos
acometidos. As
conseqüências usuais da hipertensão descontrolada prolongada são o infarto do
miocárdio, insuficiência cardíaca e renal, acidentes vasculares cerebrais e visão
prejudicada. O ventrículo esquerdo do coração pode ficar aumentado (hipertrofia
ventricular esquerda), à medida que age para bombear o sangue contra a pressão
elevada (POTTER e PERRY, 2001; SMELTZER e BARE, 2006).
Na hipertensão arterial, o rim exibe um comportamento ambivalente,
podendo ao mesmo tempo ser a causa da hipertensão ou sofrer seus efeitos lesivos,
o que contribui, à medida que a lesão evolui. Por outro lado, além de sua função
excretora, o rim exerce importantes funções hormonais capazes de influenciar o
sistema cardiovascular como um todo, bem como é importante determinante do
83
comportamento farmacológico dos medicamentos, modificando sua absorção,
distribuição, concentração e meia-vida plasmática (CARVALHO e ALMEIDA, 2001).
Especula-se que as drogas empregadas para o tratamento antihipertensivo não protegem o rim, ou que o tratamento deveria ser instituído mais
precocemente para melhoria da morbidade (MULINARI, 2000).
Estudos com ratos wistar mostraram a utilização do extrato de gengibre
aceleram a taxa a taxa de bombeamento do cálcio, aumentando sua concentração
intracelular, sem interferir no seu efluxo, através da ativação da bomba Ca +2-ATPase
do retículo sarcoplasmático e que o gengibre possui efeito sinérgico em pacientes
que fizeram a combinação de 1g do rizoma com 10mg de nifedipina, por dia
(YOUNG et al., 2006, KOBAYSHI et al, 1988; IWASAKI et al, 2006).
Muhammad et al., (2005) demonstraram que o extrato de gengibre é
capaz de inibir canais de cálcio e que o extrato seco não possuía nenhuma ação
sobre a frequência cardíaca e pressão arterial em ratos wistar normotensos.
Entretanto, alguns estudos realizados com o extrato do gengibre
explorando o potencial anti-hipertensivo mostram resultados controversos, como
vasodilatação inicial e posterior vasoconstrição em modelos de anel de aorta
(IWASAKI et al. 1988; KOBAYSHI et al. 2006).
Ghayur e Gilani,(2005) demonstraram que o extrato fenólico apresenta
efeito hipotensor em ratos anestesiados através de bloqueio de canais de cálcio,
além de possuir um componente colinérgico adicional. Vale salientar que essas
atividades dependem do sistema de extração utilizados, pois o componente
colinérgico está inserido na fase aquosa do extrato, enquanto o componente
bloqueador dos canais de cálcio é mais potente na fração não polar (GILANI et al,
2005).
Alguns estudos relatam que o 6-gingerol tem uma resposta inibitória sobre
contrações espontâneas em modelos que utilizam veias porta de camundongos
(Kimura et al.,1988). Outra observação importante é que a hipotensão em modelo
de aorta é depende do endotélio e que o 6-gingerol possui um componente
bloqueador de canais de cálcio (GHAYUR e GILANI, 2005).
84
Como foi visto o endotélio é importante na ação do 6-gingerol e estudos
demonstram que os receptores do tipo TRPV1 ao TRPV4 estão sendo relatados na
aorta e artéria pulmonar de ratos (INOUE et al., 2006). Isso nos traz mais uma via a
ser estudada em modelos de pressão arterial, pois o 6-gingerol é um potente
ativador desses receptores.
Os estudos em modelos animais que avaliam a pressão arterial trazem
grande ajuda na elucidação do mecanismo de ação do 6-gingerol, mas por ser um
componente que possui muitas atividades e potencial de ativar inúmeros receptores,
mais estudos têm de ser realizados para finalmente buscar um mecanismo principal
e seus auxiliares em sua ação hipotensora.
A descoberta de que os gingerols são potentes ativadores dos receptores
do tipo TRPV 1 serve como parâmetro de explicação para o uso do gengibre em
diversas doenças e inclusive em casos de hipertensão na medicina oriental.
(BLUMENTHAL e WERNER, 1998; SRIVASTAVA e MUSTAFA, 1992).
O principal ativador deste receptor, a capsaicina, possui excelente
afinidade, mas sua utilização na medicina é limitada, pois sua pungência e
neurotoxicidade são elevados (WOOD, 1993).
Um resultado importante no nosso estudo foi que o 6-gingerol não possui
efeito citotóxico nas células MDCK, nas doses utilizadas no experimento de perfusão
renal, em períodos de incubação de 6 (seis) horas e 24 (vinte e quatro) horas,
demonstrando que essa substância poderia ser utilizada com segurança nos
experimentos de perfusão renal.
Sabe-se que o 6-gingerol exerce efeito inibitório sobre a síntese de DNA
de células cancerosas e causam apoptose em células de leucemia promielocítica da
linhagem humana (LEE, et al 1998).
Chen e colaboradores (2006) utilizaram células MDCK com 6-gingerol nas
doses de 5 µM a 20 µM para testar a influência dessa substância nestas células
tubulares, que possuem muitas semelhanças com as células humanas, e
demonstraram que as concentrações utilizadas de 6-gingerol induziram o aumento
intenso do influxo de cálcio nestas células.
85
Entretanto o trabalho supracitado não traz nenhum dado de biologia
molecular sobre os receptores envolvidos nesta ação e nenhum ensaio de
viabilidade sobre tais células.
Silva e colaboradores (2012) utilizaram alguns gingerols, dentre eles o 6gingerol, inibiu a proliferação de células da linhagem 231-MDA-MB com IC 50 666.2 ±
134.6 µM. Outro dado encontro foi a inibição de fibroblastos humanos normais,
porém em concentrações maiores que 500 µM.
Estes resultados são um pouco diferentes dos encontrados pelo nosso
grupo, onde foi visto uma diminuição da viabilidade das células em concentrações
menores que 500 µM. No entanto, vale ressaltar que as células são de linhagens
diferentes e possuem suas particularidades.
Na experimentação em rim isolado de rato, a análise da urina, do
perfusato, dos parâmetros funcionais é útil para estabelecer um perfil razoável dos
efeitos funcionais e morfológicos de uma substância sobre o rim. Com as
informações obtidas dessas análises, pode-se estabelecer uma hipótese de
mecanismo de ação da substância estudada.
Os resultados encontrados demonstraram que o 6-gingerol possui várias
ações renais e uma potente ação diurética, confirmando algumas ações descritas
pela medicina oriental.
Com os resultados vasculares obtidos com a realização deste estudo
pode-se observar um aumento na pressão de perfusão aos 90 e 120 minutos na
dose de 3µM quando comparada ao grupo controle interno e com as outras doses
utilizadas 10 µM e 30 µM houve aumento significativo em todos os tempos
estudados, acompanhado do aumento significativo da resistência vascular renal nos
tempos de 90 e 120 minutos quando comparados com o controle interno na dose de
10 µM.
Esses dados são conflitantes quando comparados com os resultados
observados na pressão arterial de animais anestesiados que mostraram uma
redução da resistência vascular. Isso pode ser explicado, em parte, pela
86
complexidade do sistema renal que é controlado por milhares de vias de sinalização
endócrina.
Estudo recente demonstrou que a capsaicina, análogo do 6-gingerol e
agonista específico do receptor TRPV1, causou uma redução da pressão de
perfusão e aumento da taxa de filtração glomerular quando o rim era pré-contraído
com fenilefrina e que este mecanismo era pela liberação de substância P e
calcitonina por nervos sensoriais sensíveis a capsaicina (Li e Wang, 2008).
Entretanto, vale ressaltar que o 6-gingerol é ativador inespecífico deste
receptor e que quando foi realizado o antagonismo com capsazepina, antagonista
inespecífico do receptor TRPV1, não houve grande alteração na resposta inicial.
Baylie e Brayden (2011) relataram que a ativação do TRPV2 causa
aumento de uma corrente de cálcio em miócitos de aorta de rato e que isso poderia
proporcionar uma vasoconstrição, mas sua identificação em células renais ainda é
controversa.
Outros estudos realizados por Liu et al, 2001;. Sawynok e Liu, 2003,
mostraram que a ativação do TRPV1 na medula espinhal e na periferia promove a
liberação aumentada de adenosina, indicando que essa liberação também pode ser
promovida a nível renal, entretanto os dados na literatura ainda são insuficientes.
Vale ressaltar que estudos demonstram que a adenosina liberada poderia
participar de uma via de feedback do receptor TRPV1 (PUNTAMBEKAR et al.,
2004).
Adenosina atua na hemodinâmica de órgãos como rins, cérebro e
coração. Além disso, evidências obtidas nos anos 60 sugerem que a vasculatura
renal difere dos demais leitos vasculares e ação da adenosina no rim seria
potencialmente vasoconstrictor (HANSEM e SCHNERMANN, 2003).
Em relação ao fluxo urinário nossos resultados mostraram aumento
significativo nos tempos de 90 e 120 minutos quando comparados com o controle
interno, nas doses de 10 µM e 30 µM e que com o bloqueio do receptor TRPV1
houve uma redução significativa deste fluxo urinário no tempo de 120 minutos
quando comprado com o 6-gingerol no mesmo período de tempo. Confirmando o
87
conhecimento tradicional do efeito diurético do gengibre e mostrando que o bloqueio
do receptor TRPV1 pela capsazepina traz uma redução deste aumento de fluxo
urinário causado pelo 6-gingerol, mostrando sua importante participação neste
mecanismo.
O 6-gingerol também alterou o transporte tubular de sódio, potássio e
cloro. O transporte tubular de sódio foi reduzido de forma significativa em todas as
doses 3 µM, 10 µM e 30 µM utilizadas e em todos os tempos estudados quando
comparados com o controle e que esta redução do transporte de sódio foi atenuada
no tempo de 120minutos no grupo do bloqueio com capsazepina.
O transporte tubular de potássio sofreu alteração da mesma forma que o
transporte de sódio em todos os tempos estudados no grupo com 6-gingerol e
seguindo os resultados encontrados com o sódio e o potássio, os íons de cloro
também sofreram redução de transporte, demonstrando que o 6-gingerol aumentou
a excreção de todos os eletrólitos. Isso ratifica ainda mais sua ação diurética.
Lembrando que no grupo do bloqueio com a capsazepina, nos dois últimos
parâmetros citados ocorreu uma atenuação da redução do transporte desses dois
eletrólitos. Isso reforça a hipótese que o 6-gingerol está exercendo sua ação
diurética através da ativação do receptor TRPV1.
Zhu e colaboradores (2008) demonstraram que a ativação do receptor
TRPV1 na pelve renal leva a um aumento da natriurese e da diurese, indicando que
a ativação deste receptor que é expresso em nervos sensoriais renais, desempenha
um papel importante na modulação excretória a nível renal.
Em 2008, Jianping e Donna mostraram que a ativação do receptor TRPV1
no rim isolado pela capsaicina, agonista específico, causou um aumento do fluxo
urinário, consonantes com nossos dados, e elevação do ritmo de filtração glomerular
(RFG).
Este último parâmetro citado foi conflitante com os dados encontrados
pelo nosso grupo no estudo com o 6-gingerol que demonstrou uma redução
importante do RFG em todas as doses utilizadas. Entretanto, vale ressaltar que o 6gingerol é agonista inespecífico e isso pode influenciar em suas ações vasculares.
88
Wang e Zhu (2008) demonstraram que a ativação do TRPV1 aumenta a
excreção de água devido a um aumento da taxa de filtração glomerular e uma maior
entrega distal de sódio e não por supressão de reabsorção proximal, sendo que este
mecanismo ainda não é totalmente elucidado.
Essa entrega aumentada de sódio a nível distal pode explicar, em parte, a
redução de ritmo de filtração glomerular através da ativação do sistema de feedback
túbulo glomerular. Esse mecanismo de defesa é ativado em situações onde o aporte
de sódio está elevado na porção final do túbulo contorcido distal, mais
especificamente na mácula densa. O sinal liberado é a adenosina que através de
sua ação nos receptores A1 na arteríola aferente causa vasoconstrição de início
rápido e conseqüente redução do ritmo de filtração glomerular e diminuição na perca
de sódio e água pelos rins (OSSWALD et al., 1980).
A adenosina reduz o fluxo sanguíneo renal predominantemente do córtex
externo e ocasiona uma diminuição persistente na taxa de filtração glomerular
(VANDER et al., 1970).
Gutierrez e colaboradores (1999) demonstraram que a vasoconstrição
arteriolar aferente é acompanhado por um aumento sustentado do cálcio livre
citosólico.
Bloqueadores específicos A1 específicos demonstram inibir respostas de
queda no ritmo de filtração glomerular quando administrados diretamente no lúmem
tubular ou em capilares peritubulares (SCHNEMANN et al., 1990).
Portanto, mais estudos tem de ser realizados para elucidar e verificar a
participação destes mecanismos acessórios nas respostas induzidas pelo 6-gingerol.
89
CONCLUSÃO
90
7. CONCLUSÃO
O 6-gingerol mostrou potente ação diurética em todos os experimentos
realizados e uma importante redução da pressão arterial em ratos wistar
normotensos.
Outras importantes observações foram às baixas influências em células
renais, demonstrando sua segurança na utilização na medicina popular .
Contudo, mais estudos são necessários para a melhor elucidação dos
mecanismos envolvidos com a ação diurética, como estudo com outras doses,
modelos animais e estudos de modelagem molecular, serão necessários para
esclarecer o mecanismo de ação.
91
REFERÊNCIAS
92
8. REFERÊNCIAS
AGUIAR, A.P.S.; CAIRES, L.P.; MAEKAWA, L.E. et al. Avaliação in vitro da ação do
extrato glicólico de gengibre sobre Candida albicans. Revista de Odontologia da
Universidade Cidade de São Paulo, mai-ago; 21(2): 144-9,2009.
AHMED, R.S.; SETH, V.; PASHA, S.T.; BANERJEE, B.D. Influence of dietary ginger
(Zingiber officinales Rosc.) on oxidative stress induced by malathion in rats. Food
Chem. Toxicol, 38: 443–450, 2000.
ALLAIRE, A.D.; MOOS, M.K.; WELLS, S.R. Complementary and alternative medicine
in pregnancy: A survey of North Carolina certified nurse-midwives. Obstet Gynecol,
95:19 –23, 2000.
AVELINO, A; CRUZ, C; NAGY, I;CRUZ, F. Vanilloid receptor 1 expression in the rat
urinary tract. Neuroscience. 2002;109:787–798.
BALHLMANN, J.; GIEBISCH, G. e OCHWADT, B. Micropuncture study of isolated
perfused rat kidney. Am J Physiol. 212 : 77-82, 1967.
BAQUERO F.; BLÁZQUEZ J. Evolution of antibiotic resistance, ree 12:482-487,
1997.
BAYLIE, R. L. e BRAYDEN, J. E. TRPV channels and vascular function. Acta Physiol
2011, 203, 99–116
BLUMENTHAL, M. & WERNER, B.R. (1998). The complete German Commission E
monographs: therapeutic guide to herbal medicines. Austin, Tex.: American Botanical
Council; Boston, MA.: Integrative Medicine Communications.
BOLETIM MENSAL DE COMÉRCIO AGRÍCOLA. Preços de cereais registram
subida desde meados de 2003. Fonte: Boletim Mensal do Comércio Agrícola. n. 67,
p. 4, 2004.
93
BONE, M. E. et al. Ginger root- antiemetic. The effect of ginger root on postoperative
nausea and vomiting after major gynaecology surgery. Anaesthesia, London, v. 45,
n. 8, p. 669-71, 1990.
BORDIA, A.; VERMA, S.; SRIVASTAVA, K.C. Effect of ginger ( Zingiber officinale
Rosc.) and fenugreek (Trigonella foenumgraecum L.) on blood lipids, blood sugar,
and platelet aggregation in patients with coronary artery disease. Prostag. Leukotr.
Ess. Fatty Acids, 56: 379–384, 1997.
CALIXTO, J.B. 2000. Effi cacy, safety, quality control, marketing and regulatory
guidelines for herbal medicines (phytoterapeutic agents). Braz J Med Biol Res 33:
179-189.
CARVALHO, A.C.B.; BALBINO, E.E.; MACIEL, A; PERFEITO, J.P.S. 2008. Situação
do registro de medicamentos fi toterápicos no Brasil. Rev Bras Farmacogn 18: 314319.
CARVALHO, JGR; ALMEIDA, RV. O papel do rim na hipertensão essencial–
Correlações e abordagem terapêutica. Revista Brasileira Hipertensão vol 8(3):
julho/setembro de 2001.
CATERINA, MJ; SCHUMACHER, MA; TOMINAGA, M; ROSEN, TA; LEVINE, JD;
JULIUS, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain
pathway.Nature 1997;389:816–24.
CHAIM, O.M. Estudo da atividade citotóxica da proteína dermonecrótica do veneno
da aranha marrom (Loxosceles intermédia) com ênfase no efeito nefrotóxico. 2005.
Dissetação (Mestrado em Biologia Celular). Setor de Ciências Biológicas, UFPR,
Curitiba, 2005.
CHEN, C.; LI, Y.; KUO, S. Effect of [10]-Gingerol on [Ca2+]i and Cell Death in
Human Colorectal Cancer Cells. Molecules, 14, 959-969, 2009.
94
Chung-Yi Chen, Ching-Hsein Chen, Chiu-Hu Kung, Shih-Hsing Kuo, and Soong-Yu
Kuo; [6]-Gingerol Induces Ca2+ Mobilization in Madin-Darby Canine Kidney Cells J.
Nat. Prod. 2008, 71, 137–140
COHEN, J. J.; KOOK, Y. J.; LITTLE JR. Substrate-limited function and metabolism of
the isolated perfused rat kidney: effects of lactate and glucose. J Physiol., v. 66, n.1,
p. 103-121, 1977.
COSENS, DJ; MANNING, A. Abnormal electroretinogram from a Drosophila mutant.
Nature. 1969; 224:285-7.
CRAGG, GM; NEWMAN, DJ; SNADER, KM. (1997). Natural products in
drug discovery and development. J Nat Prod 60, 52– 60.
CUNHA, P; SILVA, AP; ROQUE, OR. 2003. Plantas e produtos vegetais em
fitoterapia. Lisboa: Calouste Gulbenkian.
DE SMET, P. A. G. M. (1997). The role of plant-derived drugs and herbal
medicines in healthcare. Drugs 54, 801–840.
DUGASANI,
S.;
PICHIKA,
M.R.;
NADARAJAH,
V.D.,
et
al.
Journal
of
Ethnopharmacology, 127,2, 515–520, 2010.
DUKE, J.A., 2002. Handbook of Medicinal Herbs. CRC Press, Boca Raton,
FL, pp. 327– 329.
FERNANDES, J.M. Revisão Bibliográfica do Gengibre (Zingiber officinale Roscoe).
Artigo. Educação Ambiental em Ação. n. 17, 2006.
FICKER, C.E.; SMITH, M.L.; SUSIARTI, S.; et al. Inhibition of human pathogenic
fungi by members of Zingiberaceae used by the Kenyah (Indonesian Borneo). J.
Ethnopharmacol, 85: 289–293, 2003.
95
FONTELES, M. C.; MOREIRA LIMA, A. A. A study of tachyphylaxis and vascular
escape in the isolated rabbit kidney: effects of PGE. Rev. Med. Univ. Fed. Ceará, v.
24, n. 2, p. 39- 44, 1983.
GAUDET, R. 2009. Divide and conquer: high resolution structural information on TRP
channel fragments. J Gen Physiol 133, 231–237.
GHAYUR, MN; GILANI, AH. Ginger lowers blood pressure through blockade of
voltage-dependent calcium channels. Cardiovasc Pharmacol 2005;45 (1):74–80.
GONTIJO, JR; KOPP, UC. Renal sensory receptor activation by calcitonin generelated peptide. Hypertension. 1994;23(part 2):1063–1067.
GUTIERREZ, AM; KORNFELD, M; PERSSON, AEG. (1999) Acta Physiol. Scand.
166, 175–181
HANSEN, PB; SCHNERMANN, J. Vasoconstrictor and vasodilator effects of
denosine in the kidney.Am J Physiol Renal Physiol. (Review) 285(4):F590-9, 2003.
HANSON, R. W.; BALLARD, F. J. Citrate, pyruvate, and lactate contaminants of
commercial serum albumin. J Lipid Res., v. 9, n. 5, p. 667-8, 1968.
HUANG, C.; MA, W.Y.; DONG, Z. Requirement for phosphatidylinositol 3-kinase in
epidermal growth factor-induced AP-1 transactivation and transformation in JB6
Pcells. Mol. Cell. Biol., 16: 6427–6435, 1996.
INOUE, R; JENSEN, LJ; SHI, J; MORITA, H; NISHIDA, M; HONDA, A; ITO,Y.
Transient receptor potential channels in cardiovascular function and disease. Circ
Res 2006;99:119–131. [PubMed: 16857972]
ISHIGURO, K.; ANDO, T.; MAEDA, O.; et al. Ginger ingredients reduce viability of
gastric cancer cells via distinct mechanisms. Biochem. Biophys. Res. Commun., 362:
218–223, 2007.
96
IWASAKI, Y; MORITA, A; IWASAWA, T. et al. A nonpungent component of steamed
ginger – [10]-shogaol – increases adrenaline secretion via the activation of TRPV1.
Nutr Neurosci 2006;9(3-4):169–76.
JAMES,
M.E.;
NANNAPANENI,
R,;
JOHNSON,
M.G.
Identification
and
characterization of two bacteriocin producing bacteria isolated from garlic and ginger
root. J. Food Prot., 62: 899, 1999.
JIANPING, L. Donna H. Wang Increased GFR and renal excretory function by
activation of TRPV1 in the isolated perfused kidney. Pharmacological Research 57
(2008) 239–246
JOLAD, S.D.; LANTZ, R.C.; SOLYOM, A.M.; et al. Fresh organically grown ginger
(Zingiber officinale): Composition and effects on LPS-induced PGE(2) production.
Phytochemistry, 65: 1937–1954, 2004.
JOLAD, S.D.; LANTZ, R.C.; CHEN, G.J.; et al. Commercially processed dry ginger
(Zingiber officinale): Composition and effects on LPS-stimulated PGE2 production.
Phytochemistry, 66: 1614–1635, 2005.
JOLY, A.B. Botânica: introdução à taxonomia vegetal. 13. ed. São Paulo: Ed
Nacional, p. 722-723, 2002.
KAPOOR, LD. 1990. Handbook of A yurvedic Medicinal Plants. CRC Press, Boca
Raton, FL, pp. 341–342.
KAPOOR, A. Antifungal activities of fresh juice and aqueous extracts of turmeric and
ginger (Zingiber officinale). J. Phytolog. Res., 10: 59, 1997.
KIM, J.K.; KIM, Y.; NA, K.M.; et al. [6]-gingerol prevents UVB-induced ROS
production and COX-2 expression in vitro and in vivo. Free Rad. Res., 41: 603–614,
2007.
97
KIM, S.O.; KUNDU, J.K.; SHIN, Y.K.; et al. [6]-gingerol inhibits COX-2 expression by
blocking the activation of p38 MAP kinase and NF-kappaB in phorbol esterstimulated mouse skin. Oncogene, 24: 2558–2567, 2005.
KIMURA, I; PANCHO, LR; SHIORI, T; KIMURA, M. 1988. Suppression of
spontaneous calcium spikes and contraction in isolated portal veins of mice by
gingerols and chemically related compounds. Jpn. J. Pharmacol. 48, 257–262.
KIUCHI, F.; IWAKAMI, S.; SHIBUYA, M.; et al. Inhibition of prostaglandin and
leukotriene
biosynthesis
by
gingerols
and
diarylheptanoids.
Chemical
and
Pharmaceutical Bulletin, 40, 387– 391, 1992.
KOBAYSHI, M; ISHIDA, Y; SHOJI, N; OHIZUMI, Y. Cardiotonic action of [8]gingerol,
an activator of
the
Ca++-pumping
adenosine
triphosphatase
of
sarcoplasmic reticulum in Guinea pig atrial muscle. J Pharmacol Exp Ther
1988;246(2):667–73.
KOPP, UA; OLSON, LA; DIBONA, GF. Renorenal reflex responses to mechano- and
chemoreceptor stimulation in the dog and rat. Am J Physiol. 1984;246:F67–F77.
KUHAD, A.; TIRKEY, N.; PILKHWAL, S.; CHOPRA, K. 6-Gingerol prevents cisplatininduced acute renal failure in rats. BioFactors, 26 (2006) 189–200, 2006.
LANTZ, R.C.; CHEN, G.J.; SARIHAN, M.; et al. The effect of extracts from ginger
rhizome on inflammatory mediator production. Phytomedicine, 14: 123–128, 2007.
LATORRE, R; ZAELZER, C; BRAUCHI, S. Structure-functional intimacies of transient
receptor potential channels. Q Rev Biophys 2009; 42: 201-46.
LEE, H.S.; SEO, E.Y.; KANG, N.E.; KIM, W.K. [6]-gingerol inhibits metastasis of
MDA-MB-231 human breast cancer cells. J. Nutr. Biochem., 19: 313–319, 2008.
LEE, E; SURH, Y. J. Cancer Lett 1998, 134, 163–168.
98
LIU, XJ; WHITE, TD; SAWYNOK, J. (2001) Involvement of primary sensory afferents,
postganglionic sympathetic nerves and mast cells in the formalinevoked peripheral
release of adenosine. Eur J Pharmacol 429:147–155.
Mahmoud A. Mansour*, Saleh A. Bakheet, Abdulaziz M. Aleisa, Salim S. Al-Rejaie,
Abdulaziz A. AL-Yahya, Mubarak El-Ameen and Othman A. Al-Shabanah. Protective
Effect of 6-Gingerol Against Cardiotoxicity Induced by Doxorubicin. The Open
Pharmacology Journal, 2008, 2, 20-23
MARTINS, A. M. C.; SOUSA, F. C. M; BARBOSA, P. S. F et al. Action
ofantibothropic factor isolated from Didelphis marsupialis on renal effects of Bothrops
erythromelas venom. Toxicon, v. 46, p. 595-599, 2005.
MILLER, LG; KAZAL, LA. Herbal medications, nutraceuticals and hypertension. In:
Miller LG, Murray WJ, eds. Herbal Medicinals—A Clinician’s Guide. New York:
Pharmaceutical Products Press, 1998:135–162.
MILLER, LG; KAZAL, LA. Herbal medications, nutraceuticals and hypertension. In:
Miller LG, Murray WJ, eds. Herbal Medicinals—A Clinician’s Guide. New York:
Pharmaceutical Products Press, 1998:135–162. Weidner MS, Sigwart K. The safety
of a ginger extract in the rat. J Ethnopharmacol. 2000;73:513–520.
MINISTÉRIO DA SAÚDE, Câncer de pele. Instituto Nacional do câncer, 2010.
Disponível em: <http://www.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=333>. Acesso em: 20
abril 2010.
MONTELL, C. The TRP superfamily of cation channels. Sci STKE. 2005 Feb
22;2005(272).
MONTELL, C; RUBIN, GM. Molecular characterization of the Drosophila trp locus: a
putative integral membrane protein required for phototransduction. Neuron 1989; 2:
1313-23.
99
MORAES D.I.C. Rendimento e composição do óleo essencial de rizomas de
gengibre Zingiber officinale Roscoe sob diferentes épocas de colheita e períodos de
secagem, 2008. Dissertação (Mestrado em Agronomia) Programa de PósGraduação de Produção Vegetal, Universidade Federal do Paraná.
MOSMANN, T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to
proliferation and citotoxicity. J Immunol Methods, v. 65, p. 55-63, 1983.
Mulinari, RA. O rim na hipertensão arterial.MÓDULO TEMÁTICO Volume 3 / Número
1 / 2000
MUSTAFA, T., SRIVASTAVA, K.C. & JENSEN, K.B. (1993). Drug development
report: 9. Pharmacology of ginger, Zingiber o cinale. J. Drug Dev., 6, 25 ± 39.
NISHIITSUJI-UWO, G. M.; ROSS, B. D. and KREBS, H. A. Metabolic activities of
isolated perfused kidney. Biochem J, v. 103, p. 852-862, 1967.
NIZET, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney
Int, v. 7, p. 1-11, 1975.
NONN, L.; DUONG, D.; PEEHL, D.M. Chemopreventive anti-inflammatory activities
of curcumin and other phytochemicals mediated by MAP kinase phosphatase -5 in
prostate cells. Carcinogenesis, 28: 1188–1196, 2007.
Osswald H, Nabakowski G, and Hermes H. Adenosine as a possible mediator of
metabolic control of glomerular filtration rate. Int J Biochem 12: 263_267, 1980.
PEREIRA, A.C.P. Efeito do Zingiber officinale sobre o processo de reparo de lesões
ulceradas na mucosa bucal de ratos-análise clinica e morfológica-. Relatório
apresentada ao PIBIC. Pontifícia Universidade Católica do Paraná, 2002.
PERES, L.E.P. Metabolismo Secundário. Piracicaba – São Paulo: Escola Superior
de Agricultura Luiz de Queiroz – ESALQ/USP, p. 1-10, 2004.
100
POTTER,P.A.; PERRY,A.G. Grande tratado de enfermagem prática. São Paulo:
Editora Santos livraria, 2001, 3ºed.
PRATO, T. S. Influência da secagem sobre compostos medicinais e pungência do
gengibre, 2010. Dissertação (Mestrado em Engenharia e Ciência de Alimentos).
Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos do Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista ―Júlio de
Mesquita Filho‖, Campus de São José do Rio Preto.
PUNTAMBEKAR, P; BUREN, JA; RAISINGHANI, M et al. Direct Interaction of
Adenosine with the TRPV1 Channel Protein. The Journal of Neuroscience, April 7,
2004 • 24(14):3663–3671 • 3663
REINHARD, G; LANDMARK, L e FRONDOZA, CG. Frondoza: Ginger—An Herbal
Medicinal Product with Broad Anti-Inflammatory Actions. JOURNAL OF MEDICINAL
Food 8 (2) 2005, 125–132FOOD J Med
ROSS, B. D. The isolated perfused rat kidney. Clin. Sci. Mol. Med. Suppl., v. 55, n. 6,
p. 513-521, 1978.
RUFF, M.L.; MCCLANABAN, S.B.; BABEL, B.S. In vitro antifungal efficacy of four
rrigants as a final rinse. J Endod, Apr; 34(2): 331-3, 2006.
SANTOS, F.A.; SILVA, R.M.; CAMPOS, A.R.; et al. 1,8-cineole (eucalyptol),
a monoterpene oxide attenuates the colonic damage in rats on acute TNBS-colitis.
Food Chem. Toxicol., 42(4): 579–584, 2004.
SAWYNOK, J; LIU, XJ. (2003) Adenosine in the spinal cord and periphery: release
and regulation of pain. Prog Neurobiol 69:313–340.
SCHNERMANN, J; WEIHPRECHT, H e BRIGGS, JP. (1990) Am. J. Physiol. 258,
F553–F561.
101
SHU, Y; -Z. (1998). Recent natural products based drug development: a
pharmaceutical industry perspective. J Nat Prod 61, 1053– 1071.
SHUKLA, Y.; SINGH, M. Cancer preventive properties of ginger: a brief review. Food
and Chemical Toxicology, 45, 683–690, 2007.
SILVA, JÁ; BECCENERIB, AB; MUTTIB, HS et al. Purification and differential
biological effects of ginger-derived substances on normal and tumor cell lines.
Journal of Chromatography B,2012.
SIQUEIRA, R. J. B. Estudo dos efeitos cardiovasculares do óleo essencial de Croton
zehntneri e de seus principais constituintes, anetol e estragol, em ratos normotensos.
Dissertação (Mestrado) – Centro de Ciências da Saúde, Departamento de Fisiologia,
UFPE, 2005.
SMELTZER,S.C.; BARE,B.G. Tratado de enfermagem médico-cirúrgica. Rio de
janeiro: Editora Guanabara Koogan, 2006, 10º ed, v.2.
SMITH, C.; CROWTHER, C.; WILLSON, K.; et al. A randomized controlled trial of
ginger to treat nausea and vomiting in pregnancy. Obstet Gynecol, 103:639–45,
2004.
STEARE, S.E.; YELLON, D.M. J. Mol. Cell Cardiol., 276, 65, 1995.
STRUBING, C; KRAPIVINSKY, G; KRAPIVINSKY , L; CLAPHAM, DE. TRPC1 and
TRPC5 form a novel cation channel in mammalian brain. Neuron 2001; 29: 645-55.
SUEKAWA, M.; ISHIGE, A.; YUASA, K., et al. Pharmacological studies on ginger. I.
Pharmacological actions of pungent constitutents, (6)-gingerol and (6)-shogaol.
Journal of Pharmacobio-Dynamics, 7, 836–848, 1984.
SUZUKI, F; KOBAYASHI, M.; KOMATSU, Y.; et al. Keishika- kei-to, a traditional
Chinese herbal medicine, inhibits pulmonary metastasis of B16 melanoma.
Anticancer Res., 17: 873–878, 1997.
102
TAGAWA, H; VANDER, AJ. (1970) Circ. Res. 26, 327–338.
TJENDRAPUTRA, E; TRAN, VH; LIU-BRENNAN, D et al. Effect of ginger
constituents and synthetic analogues on cyclooxygenase - 2 enzyme in intact cells.
Bioorg Chem 2001;29: 156–163.
TYLER, VE. The Honest Herbal, 3rd ed. New York: Pharmaceutical Products Press,
1993:147–148.
VEIGA-JUNIOR, VF 2008. Estudo do consumo de plantas medicinais na Região
Centro-Norte do Estado do Rio de Janeiro: aceitação pelos profi ssionais de saúde e
modo de uso pela população. Rev Bras Farmacogn 18: 308-313.
WALPOLE, C.S.J., WRIGGLESWORTH, R., BEVAN, S., CAMPBELL, E.A., DRAY,
A., JAMES, I.F., PERKINS, M.N., REID, D.J. & WINTER, J. (1993a). Analogues of
capsaicin with agonist activity as novel analgesic agents; Structure-activity studies: 1.
The Aromatic `A-region'. J. Med. Chem., 36, 2362 ± 2372.
WALSER, M.; DAVIDSON, D. G.; ORLOFF, J. The renal clearance of alkali-stable
inulin. J. Clin. Invest., v. 34, p. 1520-1523, 1955.
WEIDNER, MS; SIGWART, K. The safety of a ginger extract in the rat. J
Ethnopharmacol. 2000;73:513–520
WOOD, J.N. (ed.). (1993). Capsaicin in the study of pain. New York: Academic press.
YOUNG, H.Y.; CHEN, G.L. Analytical and stability of ginger reparations. Journal of
Food, Drug Analysis, 10, 149–153, 2002.
YOUNG, H-Y.; LUO, Y_L.; cheng, H-Y, et al. Analgesic and anti-inflammatory
activities of [6]- gingerol. Journal of Ethnopharmacology, 96 , 207–210, 2005.
103
ZHU, Y; WANG, Y e WANG, DH.
(2005) Diuresis and natriuresis caused by
activation of VR1-positive sensory nerves in renal pelvis of rats. Hypertension 46:
992–7.
ZHU, Y e WANG, DH. Journal Cardiovascular Pharmacologic. 2008 May ; 51(5):
437–442.