Embrapa – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
SEG - Sistema Embrapa de Gestão
Macroprograma 2
Competitividade e Sustentabilidade
Anexo da Proposta
Aprimoramento Tecnológico para Redução de Perdas por Seca na
Cultura da Soja em Sistemas Agrícolas Sustentáveis.
Identificação do Líder
Nome: Alexandre Lima Nepomuceno
Unidade de origem: Embrapa Soja
E-mail: [email protected]
Telefone: (43)3371-6218/6200
Chamada
Edital 01/2007
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PROJETO – Descrição
Caracterização do Problema Focalizado pelo Projeto
Atualmente as perdas relacionadas à seca tem sido o principal desafio para a
produção de grãos. Eventos de seca têm aumentado nas últimas décadas, provavelmente
associadas às mudanças climáticas decorrentes do aquecimento do planeta (Stokstad,
2004). Previsões indicam que extremos climáticos tenderão a aumentar incluindo secas
mais freqüentes e prolongadas (Schiermeier, 2006). Se consideradas as perdas em todo
agronegócio, os valores são bastante expressivos. Por exemplo, na safra 04/05 as perdas
diretas no sul do Brasil atingiram >U$ 2,32 bilhões. No Rio Grande do Sul, as perdas foram
>70% na cultura da soja (Farias et al., 2005ab). As perdas diretas que os produtores vem
sofrendo a cada ano são enormes. Entretanto, se consideradas também perdas indiretas
relacionadas a todo agronegócio e ao movimento da economia das regiões produtoras de
grãos, essas perdas certamente serão bem maiores. Um outro fator a ser analisado é a
influência desses acontecimentos nas questões fundiárias principalmente nas regiões
produtoras do Brasil e os reflexos que causam em questões ambientais principalmente no
norte e centro-oeste brasileiro. Quando por várias safras consecutivas, pequenos
produtores sofrem perdas consideráveis, aliando isso ao baixo preço dos grãos e diferenças
de câmbio, isto acaba favorecendo a venda de terras por parte dos produtores ou a tomada
das mesmas por agentes financeiros. Os produtores que podem acabam migrando para
áreas onde o custo da terra é menor, como nos estados do norte e centro-oeste,
favorecendo, em muitas situações, desmatamento de áreas com vegetação nativa. Os
produtores que perdem suas terras e que ficam com grandes dificuldades financeiras
acabam agravando os problemas fundiários que afligem o país.
A Embrapa Soja, com instituições nacionais (e.g. IAPAR, ESALQ) e internacionais
(e.g. Univ. of Florida, USDA-ARS, JIRCAS), vêm conduzindo trabalhos visando identificar
estratégias associadas ao zoneamento climático, melhoramento genético e manejo do solo
e da cultura para reduzir as perdas causadas por seca. Fica claro a partir dos resultados
desses trabalhos que é impossível eliminar totalmente as perdas causadas por déficit
hídrico em lavouras comerciais de pequenos, médios ou grandes produtores, principalmente
se todas as estratégias possíveis não forem utilizadas em conjunto (Oya et al., 2004). A
complexidade de respostas que as plantas apresentam quando submetidas a condições de
seca depende da duração, da intensidade e do momento em que o déficit ocorre, assim
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como das características do solo e do ambiente em que as plantas se desenvolvem, o que
dificulta a interação entre as melhores estratégias. Por exemplo, trabalhos anteriores da
equipe (projeto 02.05.2.02.00, PA6, Ativ. 9; Stolf, 2005) identificaram e confirmaram dez
genes diferencialmente expressos em um genótipo tolerante à seca (MG/BR 46 - Conquista)
em relação a um genótipo mais sensível (BR-16). Seria possível utilizar em programas de
melhoramento a expressão desses genes individualmente, ou em conjunto, como
marcadores moleculares na identificação de outros genótipos tolerantes/sensíveis à seca?
Seria possível aprimorar os modelos matemáticos de previsão de safra (obtidos no projeto
02.03.1.08.00, PA6) utilizando informações mais detalhadas sobre a fisiologia e a genética
funcional dos genótipos em estudo? As linhagens de soja geneticamente modificadas para
tolerância à seca, obtidas no projeto 03.02.5.13.00 e sendo caracterizadas molecularmente
e fisiologicamente para identificação de eventos elite (projeto 03.06.5.02.00), apresentam
em campo as mesmas características de tolerância à seca observadas em condições de
contenção? Os resultados das avaliações dos parâmetros fisiológicos e agronômicos
obtidos na caracterização das linhagens GM podem ser utilizados nos modelos de
zoneamento agrícola visando identificar regiões mais propícias a sua utilização? Pretendese com o projeto, não apenas a caracterização e desenvolvimento de genótipos quanto a
tolerância à seca, mas, também, a utilização das informações coletadas no aprimoramento
dos trabalhos de zoneamento agrícola, manejo da cultura e biotecnologia, reunindo
cientistas e técnicos de diferentes áreas, através de 7 planos de ação. Pelo envolvimento de
diferentes unidades da Embrapa e de instituições de pesquisa nacionais e internacionais,
pretende-se conciliar a informação que está sendo gerada no âmbito técnico científico com
a aplicabilidade prática. A seca já é hoje um dos principais fatores de perda na cultura da
soja, sendo a Região Sul a que mais tem sofrido perdas, razão porquê os testes de campo
serão conduzidos nessa região. Contudo, os resultados do projeto poderão ser utilizados
em outras regiões sojicultoras que enfrentam problemas de déficit hídrico, como por
exemplo, o sudoeste da Bahia. Cabe ressaltar, que problemas de seca tenderão a se
multiplicar caso se confirmem as projeções de mudanças climáticas globais. Assim, uma
melhor compreensão do problema e ações imediatas tornam-se urgentes para amenizar os
efeitos adversos na produção soja.
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Hipóteses ou Questões Técnico-Científicas
A caracterização fisiológica e agronômica de variedades de soja da Embrapa permitirá a
classificação dos materiais quanto a tolerância à seca, auxiliando técnicos e produtores na
escolha de variedades?
Práticas de manejo como a rotação de culturas, com espécies de sistema radicular mais
agressivo e plantio direto, favorecem a cultura da soja com relação a preservação da água
no solo?
É possível, através do cruzamento de genótipos mais tolerantes à seca e genótipos de alta
produtividade, desenvolver linhagens mais tolerantes à seca para uso posterior na geração
de variedades comerciais mais tolerantes?
Seria possível utilizar em programas de melhoramento a expressão de genes envolvidos em
tolerância a seca, individualmente ou em conjunto, como marcadores moleculares na
identificação de outros genótipos tolerantes/sensíveis à seca?
Seria possível aprimorar os modelos matemáticos de previsão de safra utilizando
informações mais detalhadas sobre a fisiologia e a genética funcional dos genótipos em
estudo?
Linhagens de soja geneticamente modificadas para tolerância à seca apresentam em
campo as mesmas características de tolerância à seca observadas em condições de
contenção?
Os resultados das avaliações dos parâmetros fisiológicos e agronômicos obtidos na
caracterização das linhagens GM podem ser utilizados nos modelos de zoneamento
agrícola visando identificar regiões mais propícias a sua utilização?
Estado da Arte
Apesar dos avanços na compreensão de como o déficit hídrico induz a expressão de
genes e como esses interagem com outros genes gerando mecanismos que levam às
características agronômicas que cada genótipo apresenta em defesa contra à seca (Shao et
al., 2006), pouco se tem para apresentar ao produtor que não implique em aumentos
significativos nos custos de produção, como por exemplo, o uso de irrigação. É grande a
demanda pela caracterização de genótipos que respondem diferencialmente sob condições
adversas. Genótipos de soja identificados como tolerantes à seca (Oya et al., 2004)
permitem a descoberta de QTLs (Bianchi-Hall et al., 2000) e genes diferencialmente
expressos (Casagrande et al., 2001; Stolf, 2005) relacionados com a tolerância. Essas
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informações têm sido usadas em melhoramento clássico, ou assistido por marcadores, e no
desenvolvimento de Plantas Geneticamente Modificadas (PGM) mais tolerantes (Yamada et
al., 2005). O uso de PGM para tolerância à seca ainda encontra-se em fase de “prova de
conceito” em várias culturas, países e instituições. Entretanto, os resultados com o uso de
construções gênicas que utilizam promotores estresse induzidos em combinação com
fatores de transcrição (genes que controlam a expressão de outros genes de
defesa)(exemplo: construção rd29:DREB1A) tem demonstrado que é possível aumentar a
capacidade das plantas em suportar períodos maiores de déficit hídrico, sem comprometer
definitivamente as características agronômicas de interesse (Shinozaki e YamaguchiShinozaki, 2007). Os resultados preliminares, obtidos em regime de contenção, na Embrapa
Soja demonstram o potencial do uso de PGM para redução de perdas devido à seca
(Beneventi, 2006)(Fig.1). Dados gerados a partir da caracterização molecular, fisiológica e
agronômica viabilizam modelos de simulação, integrando efeitos de diferentes condições
edafoclimáticas, e dando suporte aos trabalhos de zoneamento de risco climático,
monitoramento e previsão de safras (Farias et al., 2005a)(Fig.2). A diminuição de perdas
também pode ser potencializada se genótipos tolerantes forem utilizados com corretas
práticas de manejo, pois as inúmeras interações que ocorrem influenciam propriedades do
solo diretamente relacionadas com o potencial produtivo (Franchini et al., 2007)(Fig.3).
Resultados anteriores da equipe, obtidos em parceria com outras instituições, definiram
parâmetros agronômicos (e.g. taxa crescimento relativo), fisiológicos (e.g. teor relativo de
água, discriminação de carbono) e moleculares (e.g. expressão de determinados genes),
que podem ser usados na identificação de genótipos mais tolerantes em programas de
melhoramento (Projetos: 02.02.205.00, 02.03.108.00, 02.05.2.02.00, 01.02.105.03). Novas
tecnologias como PGM tolerantes à seca também estão sendo desenvolvidas e testadas
pela equipe em regime de contenção. (Fig.1). Ajustes de modelos de simulação permitirão
avaliações dos impactos de mudanças climáticas. Face aos novos conhecimentos,
cultivares e metodologias, é imprescindível a continuação dos trabalhos de busca de
alternativas para diminuir perdas por seca, integrando ações e resultados anteriores e
aqueles a serem obtidos neste projeto. Tolerância à seca é uma característica multigênica
e, portanto, complexa. Assim, nunca teremos uma única solução definitiva para o problema.
Entretanto,
o
uso
integrado
de
várias
medidas
consideravelmente as perdas durante eventos de seca.
de
mitigação
poderá
reduzir
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Metodologia
Plano de Ação 1: Gestão
O PA1 (Gestão do Projeto) integrará as ações de pesquisa, através da troca de
informações por meios eletrônicos e reuniões semestrais entre os lideres dos PAs e será
gerenciado por uma equipe de membros das diferentes unidades envolvidas na proposta.
Ao final de cada ano do projeto pretende-se também reunir os responsáveis por todas as
atividades para apresentação, discussão e compatibilização dos resultados.
Plano de Ação 2: Caracterização Fisiológica e Agronômica de Genótipos de Soja quanto a
tolerância à seca.
No PA2 as unidades da Embrapa Soja/Trigo, JIRCAS, UEL, IAPAR, e ESALQ,
realizarão avaliações fisiológicas/agronômicas, utilizando novos parâmetros e parâmetros já
consagrados em trabalhos anteriores das equipes na análise das novas variedades da
Embrapa e de outros genótipos. Pretende-se utilizar as informações sobre os mecanismos
de tolerância conhecidos classificando os genótipos para fins de informação à assistência
técnica, produtores, melhoristas e cientistas. As PGM desenvolvidas pela Embrapa no
projeto 03.02.5.13.00 e as linhagens a serem obtidas no PA3 também serão caracterizadas
quanto à tolerância, dentro desse PA, à medida que forem sendo disponibilizadas.
a) Delineamentos experimentais para indução de déficit hídrico em variedades e
linhagens de soja em condições de campo.
O delineamento experimental será o de blocos ao acaso em parcelas sub-divididas.
Os tratamentos na parcela serão: irrigado (I), não irrigado (NI) e sob coberturas móveis
(CM) (rain out shelters; que serão programados para fechar toda vez que ocorrerem chuvas
num período de 30 dias entre os estádios mais sensíveis a falta de água em soja, estádios
R3 a R6). Os tratamentos nas sub-parcelas serão: Cultivares de soja e linhagens
desenvolvidas no PA3. Dez genótipos serão utilizados em cada experimento a princípio.
Somente a partir do segundo ano do projeto (safra 2009/10), as linhagens desenvolvidas no
PA3 serão introduzidas nos experimentos (pretende-se avançar várias gerações num ano
utilizando casas de vegetação). Os tratos culturais (adubação, espaçamento e densidade de
semeadura, etc) serão conduzidos conforme as recomendações técnicas da Embrapa para
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a cultura da soja na região. Todo o monitoramento das condições edafoclimáticas do
experimento (balanço hídrico, precipitação pluviométrica, conteúdo de água no solo por
sonda de nêutrons, radiação solar, temperatura e umidade do ar, etc) será feito conforme
protocolos estabelecidos pela equipe de Ecofisiologia da Embrapa Soja.
b) Delineamentos experimentais para indução de déficit hídrico em regime de
Liberação Planejada no Meio Ambiente de PGM tolerantes à seca.
O líder do projeto estará preparando conforme normas da CTNBio (Instrução
Normativa No 3) proposta de liberação planejada no meio ambiente para instalação de
experimentos a campo na Embrapa Soja, em novembro de 2008.
O delineamento experimental será o de blocos ao acaso em parcelas sub-divididas.
Os tratamentos na parcela serão: irrigado (I), não irrigado (NI) e sob coberturas móveis
(CM) (rain out shelters; que serão programados para fechar toda vez que ocorrerem chuvas
num período de 30 dias entre os estádios mais sensíveis a falta de água em soja, estádios
R3 a R6). Os tratamentos nas sub-parcelas serão: eventos de soja GM com o gene
AtDREB1A e a variedade BR16 não GM (controle). Os tratos culturais (adubação,
espaçamento
e
densidade
de
semeadura,
etc) serão
conduzidos
conforme
as
recomendações técnicas da Embrapa para a cultura da soja na região. Todo o
monitoramento das condições edafoclimáticas do experimento (balanço hídrico, precipitação
pluviométrica, conteúdo de água no solo por sonda de nêutrons, radiação solar, temperatura
e umidade do ar, etc) será feito conforme protocolos estabelecidos pela equipe de
Ecofisiologia da Embrapa Soja.
Parâmetros Moleculares, Fisiológicos e Agronômicos a serem avaliados.
As variáveis a serem amostradas e analisadas nos experimentos de caracterização
no campo serão: área foliar, taxa de crescimento relativa (TCR), taxa fotossintética (A),
condutância estomática (gs), concentração intercelular de CO2 (Ci), teor de clorofila,
discriminação de carbono (13C/12C) e macro e micronutrientes nas folhas.
A área foliar será amostrada através de um medidor de área foliar automático (Area
Meter, modelo LI-3100)
A TCR será calculado usando a fórmula TCR=ln(MSF)-ln(MSI)/tempo, onde MSF é a
massa seca final e MSI é a massa seca inicial (Ferri, 1985).
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Taxa fotossintética, condutância estomática e concentração intercelular de CO2,
serão aferidas através de um aparelho portátil de fotossíntese (LICOR, Inc., LI-6400), no
folíolo mediano do 3º par foliar completamente expandido, com intensidade luminosa de,
2000 µmoles.m-2.s-1. Esta intensidade luminosa é programada no próprio equipamento que
possui fonte luminosa própria. O valor de 2000 µmoles.m-2.s-1 foi estipulado pois se
aproxima das intensidades luminosas que ocorrem na região na época do ano em que os
experimentos serão conduzidos e para que as leituras fossem padronizadas numa mesma
quantidade de radiação.
O teor de clorofila será calculado utilizando-se os valores de absorção de luz na
folha em dois comprimentos de onda medidos em aparelho portátil de medição de
fotossíntese (SPAD-502), após a devida calibração. As avaliações serão feitas no mesmo
folíolo em que serão feitas as medidas de taxa fotossintética.
A discriminação de carbono será feita em espectrometro de massa (ThermoFinnigan
Delta XP Plus), utilizando amostras da parte aérea das plantas, secas e trituradas.
A análise de nutrientes será realizada em ICP-OES (Inductively Coupled Plasma –
Optic Emission Spectrometry), Optima 3300 DV, Perkin Elmer, utilizando-se 0,5g da
amostra, sendo feita digestão seca por maceração em mufla elétrica (450-550 oC).
Para a análise de nitrogênio será utilizado o aparelho Kjeltec auto Sampler System,
1035, com 0,1g de amostra, sendo a digestão feita com ácido sulfúrico e peróxido de
hidrogênio.
Rendimento, estatura, número de legumes, peso seco de 100 sementes, número de
grãos por legume, e peso seco da parte aérea serão os parâmetros agronômicos avaliados.
As épocas de amostragem para parâmetros fisiológicos e agronômicos ocorrerão no
início de cada estádio de desenvolvimento das plantas, sendo que somente uma
amostragem será feita no estágio vegetativo Vn antes e aproximado do estádio R1. Todos os
dados coletados oriundos das avaliações fisiológicas, agronômicas e moleculares serão
analisados pelo programa SAS (SAS Institute, 1990).
Plano de Ação 3: Desenvolvimento de Linhagens
No PA3 melhoristas da Embrapa Soja/Trigo/Clima Temperado, utilizarão os
genótipos, caracterizados como tolerantes no PA2 e em trabalhos anteriores no
desenvolvimento de linhagens mais tolerantes e com potencial produtivo. Não se pretende
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nesse PA o desenvolvimento de cultivares tolerantes, mas sim iniciar o desenvolvimento de
linhagens que serão futuramente utilizadas no desenvolvimento de cultivares.
Material Genético
Variedades de soja caracterizadas como tolerantes à seca serão selecionadas para
compor um dialelo e serão cruzadas com variedades elites precoces altamente suscetíveis
à seca do programa de melhoramento de soja.
Exemplos de genótipos utilizados como tolerantes à seca e que possuem características
diferenciadas associadas à tolerância à seca:
a) PI 416937 – Houjaku kuwazu (Bianchi-Hall et al., 2000, genótipo mais utilizado como
tolerante à seca em trabalhos publicados);
b) H2L16
c) N95-SH-259
d) PI 407859-2
e) PI 471938 (Boerma comunicação pessoal)
f)
Jackson (BAG Brasil, Jackson TG41 e Jackson 4028). Tolerância à seca e murcha
retardada.
g) Young. Uso eficiente de água (WUE.)
h) Tokyo (Mian et al., 1998)
i)
BR-4
j)
Embrapa 48
k) BRS 184
l)
PI 578315 B
m) MG/BR 48 (Garimpo RCH)
Genótipos altamente suscetíveis ao estresse hídrico:
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a) BR-16
b) Demais a serem selecionados de acordo com informações do programa de
melhoramento de soja da Embrapa Soja.
Plantas F1 oriundas dos cruzamentos serão analisadas por meio de marcadores
moleculares para confirmação do cruzamento. Em seguida, essas plantas F1 serão
retrocruzadas com seus respectivos genitores, originando as plantas RC1F1. Marcadores
moleculares que forem associados às características de tolerância à seca e que forem
confirmados/testados nos parentais poderão ser usados nessa etapa para acompanhar o
processo de introgressão da característica. As plantas RC1F1 serão novamente
retrocruzadas com seus parentais para recuperação do genoma do genitor recorrente. Este
processo se repetirá até se obter plantas RC2F1, que possuirão 87,5% do genoma do
genitor recorrente e 13,5% do genoma do doador. O objetivo desse PA 3 é a geração de
linhagens isogênicas com características de tolerância à seca e com genes de adaptação
do parental cultivado. As plantas oriundas de cada cruzamento RC2F1 serão
autofecundadas originando a RC2F2, as quais serão avaliadas fenotipicamente para
caracteres de tolerância à seca (enraizamento profundo, enraizamento prolífico, tolerância
ao calor, uso eficiente da água). Os indivíduos selecionados de cada população de
cruzamento serão então submetidos a vários avanços de gerações, num mesmo ano em
casa de vegetação, atingir homozigose, para acelerar o processo até atingir RC2F5. Nesse
momento serão novamente avaliados a campo para tolerância à seca. Plantas individuais
de cada população com tolerância à seca (capacidade produtiva sob condições de estresse
hídrico) serão selecionadas, originando progênies. As progênies serão então avaliadas para
características agronômicas (estatura de planta, acamamento, ciclo, resistência a doenças,
rendimento de grãos, etc) e aquelas de melhor comportamento agronômico serão
selecionadas para originar linhagens tolerantes à seca com bom desempenho agronômico.
Algumas linhagens selecionadas com potencial produtivo poderão diretamente compor os
ensaios de rendimento de grãos para originar uma variedade. Os materiais mais
promissores para tolerância à seca poderão então compor o programa de melhoramento,
dessa vez visando à obtenção de variedades produtivas com tolerância à seca.
Durante o processo de obtenção de linhagens tolerantes à seca serão testados
marcadores moleculares já descritos na literatura como associados a caracteres de
tolerância à seca e outros marcadores moleculares serão avaliados para mapeamento de
genes associados à tolerância ao estresse hídrico.
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Outros cruzamentos e retrocruzamentos (RC) serão executados, concomitamente ao
programa de melhoramento para tolerância à seca, para reduzir o número de cópias da
construção rd29:DREB1A presente em linhagens de soja geneticamente modificadas
tolerantes à seca. Algumas das linhagens de Soja DREB1A desenvolvidas na Embrapa
Soja apresentam número de cópias do inserto que variam de 5 a 8 cópias. O objetivo dos
cruzamentos/retrocruazamentos será o de reduzir o número de cópias do inserto para uma
cópia por linhagem, e também já introduzir a construção rd29:DREB1A, que confere
aumento na tolerância à seca, em variedades de maior potencial produtivo da Embrapa.
Este
processo
será
feito
em
casa
de
vegetação
e
serão
feitos
quantos
cruzamentos/retrocruzamentos forem necessários para diminuição do número de cópias. As
plantas retrocruzadas ou o DNA das plantas serão enviados ao laboratório de Biologia
Molecular da Embrapa Soja para análise do número de cópias. A soja GM resistente aos
herbicidas da classe das imidazolinonas, em fase final de desenvolvimento pela Embrapa
em parceria com a empresa BASF, também passou por esse processo com grande
sucesso.
Plano de Ação 4: Caracterização Molecular
No PA4 a Embrapa Soja, Cenargen, JIRCAS, UEL e UNESP, utilizarão os genótipos
e linhagens segregantes para tolerância à seca, caracterizados/desenvolvidos nos
PA2/PA3, respectivamente, para analisar a expressão de genes diferencialmente expressos
identificados em projetos anteriores (PRODETAB 140-01/02, PADCT 62.0524/98-7,
01.02.105.03) e de outros grupos de pesquisa (Maruyama et al, 2004; Oono et al., 2003;
Pellegrineschi et al, 2002; Shinozaki et al., 2003) como genes chave envolvidos em
respostas de defesa contra a desidratação. O nível de expressão será avaliado por PCR em
Tempo Real utilizando-se genótipos submetidos a diferentes combinações de déficit na
Embrapa Soja que possui sistemas de controle e monitoramento precisos de irrigação e de
precipitação pluviométrica, respectivamente. Visualiza-se nesse PA a possibilidade de
utilizar a expressão de determinados genes como marcas moleculares em programas de
seleção.
Três técnicas para confirmação de expressão e análise de níveis de expressão
serão utilizadas: Será utilizada a técnica de Ribonuclease Protection Assay (RPA) e
Northern Blots com sondas marcadas com
32
P de acordo com Ausubel et al. (1995) para
confirmação da presença de expressão. A técnica de PCR em Tempo Real será utilizada
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para quantificar os níveis de expressão em cada genótipo e tratamento de disponibilidade
hídrica.
Os 12 genes identificados como diferencialmente expressos em condições de déficit
hídrico, em trabalhos anteriores, escolhidos para serem utilizados são os seguintes: os
fatores de transcrição, bZIP50 (Gene Bank acesso no DQ787034), C2H2 (Gene Bank
acesso no DQ055134), NAC (Gene Bank acesso no DQ028770), MyBj7 (Gene Bank acesso
no DQ902864), Syringolide (Gene Bank acesso no AB083025), EREB (Gene Bank acesso no
AF537220); RAB7, transduçao de sinal no transporte de proteínas (Gene Bank acesso no
L14930); ERD1, envolvido no transporte de glicina-betaina e prolina (Gene Bank acesso no
NM102158); MET, envolvido em respostas a estresse oxidativo causado por alta
intessidade luminosa (Gene Bank acesso no AB176559), SGR2, envolvido em transporte
através de membranas (Gene Bank acesso no AY850142); P450, envolvido em resposta a
estresse oxidativo causado por UV(Gene Bank acesso no AF135485) e CPN20, a
chaperona envolvida em repostas a estresse térmico.
Para cada gene, primeiramente será realizada uma curva de eficiência de
amplificação, conforme recomendado pela Applied Biosystems, CA, USA. Os parâmetros de
ciclagem para as reações serão 50ºC por 2 min., 95ºC por 2 min., e 45 ciclos de 95ºC por
15 seg., 55ºC por 30 seg. e 72 ºC por 30 seg., sendo os dados coletados na fase de
extensão (72°C). O gene RNAr 18S (GeneBank nº.X02623.1) será utilizado como controle
endógeno em cada tratamento para a normalização das amostras. Para o cálculo de
quantificação relativa será utilizado o método Ct calculado pela fórmula 2-
ΔΔCt
conforme
(Bustin, 2002). As análises de quantificação relativa seguirão os mesmos parâmetros de
ciclagem e coleta de dados das amostras, utilizados para gerar a curva de eficiência de
amplificação. Os resultados serão analisados pelo programa Sequence Detection (Applyed
Biosystems, CA, USA). Os primers utilizados nas reações, foram desenhados pelo
programa Primer Express (Applyed Biosystems, CA, USA), próximo à região 3´ do gene,
obtendo amplicons de aproximadamente 150 pares de base (pb). As reações de PCR serão
realizadas, em termociclador 7300 Real Time System (Applied Biosystem, Foster, CA,
USA), utilizando-se o Kit Platinum® SYBER® Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen),
conforme recomendações do fabricante.
Plano de Ação 5: Modelagem das Respostas da Cultura da Soja ao Ambiente
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O enfoque sistêmico viabilizado pelo uso de modelos de simulação de crescimento e
de desenvolvimento permite integrar os efeitos de diferentes condições edafoclimáticas
sobre o comportamento da cultura, possibilitando o estudo e a compreensão, em maior
detalhe e de uma forma mais complexa e integrada, dos processos básicos de todas as
respostas fisiológicas e agronômicas das culturas. Com base no poder de estimativa de
modelos e sistemas já consagrados, procurar-se-á desenvolver e ajustar novo padrão de
modelagem, mais moderno, simples e melhor representativo da realidade da sojicultura
nacional. Para tanto, no PA5 a Embrapa Soja, em parceria com Embrapa Informática
Agropecuária, IAPAR, USDA/ARS e Univ.of Florida, utilizarão as informações geradas nos
PA2 e PA4 para gerar coeficientes e equações de resposta das plantas ao ambiente a fim
de ajustar, calibrar e validar modelos de simulação do desenvolvimento das plantas e de
previsão de rendimentos, mais robustos, precisos e adaptados aos atuais genótipos
brasileiros. Serão organizadas e mantidas bases de dados edafoclimáticas representativas
das principias regiões brasileiras produtoras de soja e usadas modernas ferramentas de
tecnologia de informação, modelagem, geoestatística e informática. Todos os modelos
gerados serão validados com base em dados reais obtidos a campo. Tais modelos
constituem-se em ferramentas eficazes para suporte à tomada de decisões e a estudos
complementares, capazes de auxiliar na definição de atitudes operacionais e estratégicas
em todos os níveis (desde o governamental até o do produtor rural), os quais serão
empregados na atualização do zoneamento agrícola, monitoramento e previsão de safras e
em avaliações de impactos de mudanças climáticas.
Plano de Ação 6: Manejo da Cultura para melhor uso da água.
Os genótipos mais contrastantes identificados em trabalhos anteriores e no PA2
serão avaliados quanto à interação com sistemas de rotação de culturas em plantio direto,
em dois tipos de solo (arenoso e argiloso) e em quatro regiões: a) norte do Rio Grande do
Sul (RS) em Passo Fundo; b) Sul do RS em Pelotas; c) norte do Paraná (PR) em Londrina e
d) noroeste do PR em Jardim Olinda. Pretende-se caracterizar as respostas de cada
genótipo em termos de aumento na eficiência do uso da água através do monitoramento de
parâmetros fisiológicos, agronômicos e de solo.
Será avaliada a produtividade da soja em sistemas de rotação de culturas em plantio
direto. Os genótipos serão avaliados em sistemas de rotação de culturas em solo argiloso e
arenoso nas Regiões de Londrina, Pelotas e Passo Fundo. Em Londrina (77% de argila) e
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Jardim Olinda-PR (15% de argila) serão avaliados três sistemas de rotação de culturas:
trigo/soja contínuo; aveia/soja contínuo e Brachiaria brizantha/soja contínuo. Serão
estabelecidas, em cada uma das regiões, faixas com as culturas de inverno e no verão os
genótipos serão avaliados em blocos ao acaso com quatro repetições. As parcelas terão as
dimensões de 8 m de largura e 10 m de comprimento. A produtividade dos genótipos será
avaliada nas cinco linhas centrais da parcela, numa área útil de 5 m x 6 m.
Será monitorada continuamente a disponibilidade hídrica no solo, pois trata-se de
um dos parâmetros necessários para a determinação do balanço hídrico. Além disso
permitirá identificar diferenças entre os sistemas de rotação de culturas quanto à
capacidade de água disponível do solo. A disponibilidade hídrica será avaliado pelo método
gravimétrico, através de coletas de amostras a intervalos de 7 dias, nas camadas de solo de
0-10, 10-20 e 20-40 cm.
O desenvolvimento do sistema radicular dos genótipos será avaliado, uma vez que a
profundidade do sistema radicular interfere no cálculo da capacidade de água disponível.
Esta determinação permitirá identificar diferenças entre os sistemas de rotação de culturas
quanto a melhoria do ambiente de desenvolvimento radicular. O sistema radicular dos
genótipos de soja serão avaliados em trincheiras de 90 cm de largura por 100 cm de
profundidade. Serão avaliadas duas trincheiras por tratamento. O sistema radicular será
avaliado no sentido perpendicular à cultura, em regiões de 22,5 x 25 cm, abrangendo a área
total de 90 cm de largura por 100 cm de profundidade. Para obtenção de imagens
adequadas, o contraste das raízes com o solo será aumentado pela pintura das raízes com
tinta de cor branca. As imagens serão obtidas com câmara digital e tratadas no programa
Adobe Photoshop até obtenção de arquivos em preto e branco no formato .tif . Os arquivos
serão avaliados no programa Delta-T Scan e as raízes estimadas quanto à área e o
comprimento. A metodologia utilizada para a avaliação das raízes será a mesma
apresentada por Crestana et al. (1994), porém dispensa o uso do programa Siarcs. O
sistema radicular dos genótipos de soja será avaliado no estádio de pleno florescimento
(R3) (fevereiro). A produção de soja será avaliada em duas áreas de 5 m de largura por 5 m
de comprimento (10 linhas de 5 metros) em cada tratamento.
O balanço hídrico, diferença entre a quantidade de água recebida e a quantidade
perdida pelo sistema solo-planta-atmosfera, com o saldo correspondendo á quantidade de
água armazenada na profundidade explorada pelo sistema radicular, será estimado através
da evapotranspiração. Serão utilizados parâmetros climáticos comuns, segundo a
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metodologia descrita por Wrege et al. (1997). O balanço hídrico permitirá a identificação dos
períodos de deficiência, considerando a época de semeadura e a variação dos índices de
área foliar da cultura.
Plano de Ação 7: Plataforma de Informações sobre Seca.
O portal será construído utilizando o servidor e ambiente de desenvolvimento Web
Zope (http://www.zope.org) e o sistema de gerenciamento de conteúdo (Content
Management System – CMS) Plone (http://plone.org/). O Zope e o Plone são softwares
livres e de código aberto, e são escritos em linguagem Phyton (http://www.python.org/). O
portal, construído dessa forma, permitirá que os próprios pesquisadores adicionem, editem
e gerenciem os conteúdos do portal em um ambiente Web, de forma rápida e simples, sem
a centralização num webmaster. Dessa forma, os responsáveis pela produção do conteúdo
do portal (os próprios pesquisadores envolvidos no projeto) poderão facilmente gerenciar o
conteúdo de forma colaborativa e distribuída.
O portal deverá conter todas informações técnicas básicas e aplicadas sobre as
estratégias para redução de riscos contra seca, com os resultados desse e de outros
projetos relacionados, assim como de outras fontes. Essas informações estarão
organizadas para fácil acesso pelos produtores, técnicos e cientistas, dando suporte aos
trabalhos de zoneamento de risco climático, monitoramento e previsão de safras.
O portal também contará com módulos de monitoramento e previsão de safras em
acordo com as normas da Embrapa e do Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento, e também através de consulta aos dados e informações disponibilizados e
autorizados pela CONAB.
Estratégia de Ação
Em várias atividades, a presente proposta complementa trabalhos já concluídos ou
em andamento, mas em sua maior parte a proposta apresenta novas iniciativas de pesquisa
para solução/mitigação de problemas com seca. Pesquisadores da Embrapa e instituições
parceiras participam do projeto. O PA1 (Gestão do Projeto) integrará as ações de pesquisa,
através da troca de informações por meios eletrônicos e reuniões semestrais entre os
responsáveis pelos PAs. Ao final de cada ano do projeto pretende-se, também, reunir os
responsáveis por todas as atividades para apresentação, discussão e compatibilização dos
resultados. No PA2 (Caracterização Fisiológica/Agronômica) as unidades da Embrapa
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Soja/Trigo/Clima Temperado, JIRCAS, UEL, IAPAR, e ESALQ, realizarão avaliações
fisiológicas/agronômicas utilizando novos parâmetros e parâmetros já consagrados em
trabalhos
anteriores
das
equipes
(e.g.
discriminação
de
carbono,
eficiência
fotossintética)(Fig.2) na análise das novas variedades da Embrapa e de outros genótipos.
Pretende-se utilizar as informações sobre os mecanismos de tolerância conhecidos
classificando os genótipos para fins de informação à assistência técnica, produtores,
melhoristas e cientistas. As PGM desenvolvidas pela Embrapa no projeto 03.02.5.13.00
(Fig.1) e as linhagens a serem obtidas no PA3 também serão caracterizadas quanto à
tolerância dentro desse PA, à medida que forem sendo disponibilizadas. No PA3
(Desenvolvimento de Linhagens) melhoristas da Embrapa Soja e Embrapa Trigo, utilizarão
os genótipos caracterizados como tolerantes neste projeto e em trabalhos anteriores
(Casagrande et al, 2001; Oya et al, 2004; Stolf, 2005), para o desenvolvimento de linhagens
mais tolerantes e com bom potencial produtivo. O desenvolvimento de uma variedade leva
de 7 a 10 anos, portanto, não se pretende, nesse PA3, o desenvolvimento de variedades
tolerantes, mas sim iniciar o desenvolvimento de linhagens que serão futuramente utilizadas
no desenvolvimento de variedades. No PA4 (Caracterização Molecular) as instituições
Embrapa Soja, Cenargen, JIRCAS, UEL e UNESP, utilizarão os genótipos e linhagens
segregantes
para
tolerância
à
seca,
caracterizados/desenvolvidos
nos
PA2/PA3,
respectivamente, para analisar a expressão de genes diferencialmente expressos
identificados em projetos anteriores (PRODETAB 140-01/02, PADCT 62.0524/98-7,
01.02.105.03) e por outros grupos de pesquisa (Maruyama et al, 2004; Oono et al., 2003;
Pellegrineschi et al, 2002; Shinozaki et al., 2003), como genes chave envolvidos em
respostas de defesa contra a desidratação. O nível de expressão será avaliado por PCR em
Tempo Real, Northern Blots e Ribonuclease Protection Assays (RPA) utilizando-se
genótipos submetidos a diferentes combinações de déficit hídrico na Embrapa Soja, onde
há instalações para controle preciso de irrigação e de precipitação pluviométrica. Visualizase, nesse PA4, a possibilidade de utilizar a expressão de determinados genes como marcas
moleculares em programas de seleção assistida. A participação das universidade se dará
principalmente através dos alunos de pós-graduação envolvidos no projeto. No PA5
(Modelagem da cultura da soja) as instituições Embrapa Soja, Embrapa Informática
Agropecuária, USDA/ARS e Univ.of Flórida utilizarão as informações geradas no PA2 e PA4
para ajuste de modelos de simulação e previsão de desenvolvimento/rendimentos mais
robustos, precisos e adaptados aos atuais genótipos brasileiros, os quais serão
empregados na atualização do zoneamento agrícola, monitoramento e previsão de safras e
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em avaliações de cenários de mudanças climáticas. As variedades mais contrastantes
identificadas em trabalhos anteriores e no PA2 serão utilizados no PA6 (Manejo da cultura
para melhor uso da água), coordenado pela Embrapa Soja. No PA6 as variedades
selecionadas serão avaliados quando à interação com sistemas de rotação de culturas em
plantio direto, em dois tipos de solo (arenoso e argiloso) e em três regiões (Passo FundoRS, Pelotas-RS e Londrina-PR). Pretende-se caracterizar as respostas e interações de
cada genótipo em termos de aumento na eficiência do uso da água e da conservação de
água no solo através do monitoramento de parâmetros fisiológicos e agronômicos.
Finalmente, no PA7 (Plataforma de Informações sobre Seca), sob liderança da Embrapa
Informática Agropecuária, as informações obtidas nos PAs serão integradas através de
plataforma informatizada, onde as informações, resultados e recomendações geradas a
partir do projeto e disponíveis em outras fontes serão disponibilizadas na internet. Pretendese criar um portal onde o máximo de informações sobre estratégias de combate à seca
esteja disponível, desde o enfoque de pesquisa básica/avançada ao da pesquisa aplicada.
Informações com potencial para proteção intelectual somente serão disponibilizadas após
aprovação da gerência de propriedade intelectual da Embrapa e consulta aos parceiros
envolvidos. A tecnologia DREB, usada nas PGM, está patenteada pelo JIRCAS sob as Pat.
no P3183458 e P3178672, assim como o processo de transformação de soja pela Embrapa
Pat. no WO09918223A1. Em dezembro de 2003, Embrapa e JIRCAS assinaram acordo
para desenvolvimento de PGM com as construções AtDREB. Os documentos detalham que
os resultados científicos obtidos serão publicados em conjunto e que Royalties obtidos de
variedades comerciais geradas a partir deste trabalho serão divididos em até 50%,
dependendo dos gastos que serão feitos por cada parte nas fases posteriores, como
programa de melhoramento, análises de biossegurança e desregulamentação junto às
agências federais e internacionais competentes.
Impactos Potenciais
A caracterização fisiológica, agronômica e molecular de genótipos de soja auxiliará
no desenvolvimento de estratégias de melhoramento genético visando o desenvolvimento
de materiais mais tolerantes à seca. Posteriormente, poderão ser incorporadas a programas
de melhoramento e gerar variedades comerciais. A caracterização dos genótipos com
potencial para tolerância à seca permitirá ainda a indicação de materiais mais adaptados a
condições edafoclimáticas hoje adversas. As informações geradas na caracterização
fisiologica, agronômica e molecular dos genótipos identificados como mais tolerantes a
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déficits hídricos servirão de base a outros projetos envolvendo prospecção de genes de
tolerância à seca, como por exemplo, os projetos PRODETAB 140/01-02 e Macroprograma
2 02.05.202.00 agregando conhecimento ao banco de genes já disponível com mais de
10.000
EST
(Expressed
Sequence
Tags)
na
Embrapa
Soja
(http://bioinfo.cnpso.embrapa.br/), ou a projetos como o que busca identificar sequências
promotoras de interesse à agricultura, aprovado no Macroprograma 2
(Projeto:
02.05.103.00) e onde membros desta proposta participam. Os resultados da caracterização
de linhagens de soja geneticamente modificadas em condições de campo são cruciais para
confirmar se a estratégia molecular utilizada reduz as perdas durantes eventos de seca em
condições reais. Caso positivo, as linhagens consideradas elite, tanto em termos
moleculares (locus único de inserção, segregação mendeliana, inserção em região
genômica de alta expressão, etc) como em termos agronômicos (produtividade, tolerância à
seca, etc), poderão ser incluídas em ações de melhoramento e de biossegurança da
Embrapa, visando uma possível liberação comercial. Os modelos ajustados a partir das
respostas e caracterização dos genótipos constituem-se na principal ferramenta para
atualização do zoneamento agrícola e aos estudos dos impactos de mudanças climáticas e
definição de ações estratégicas futuras, cada vez mais considerados pela comunidade
científica e exigidos pela sociedade (Fig.2). Compreender como genótipos mais tolerantes
ao déficit hídrico respondem quando submetidos a diferentes condições de manejo da
cultura permitirá melhor poder de decisão a técnicos de extensão e produtores (Fig.3).
Finalmente todas essas informações estarão disponíveis de forma interativa, via internet,
permitindo acesso e troca de informações através de um portal sobre seca na cultura da
soja entre vários segmentos, desde o científico até os setores ligados diretamente ao setor
produtivo.
Questões Relacionadas à Propriedade Intelectual e Apropriação de Resultados
Informações com potencial para proteção intelectual somente serão disponibilizadas
após aprovação da gerência de propriedade intelectual da Embrapa e consulta aos
parceiros envolvidos.
A tecnologia DREB esta patenteada pelo JIRCAS sob as Pat. no P3183458 e
P3178672, assim como, o processo de transformação de soja pela EMBRAPA Pat. no
WO09918223A1. Em dezembro de 2003, EMBRAPA e JIRCAS assinaram Memorando de
Entendimento (MOU) e Acordo de Transferência de Material (MTA) para trabalhos conjuntos
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de transformação genética de soja com construções AtDREB. Em resumo, o MOU e o ATM
detalham que os resultados científicos obtidos através desse acordo serão publicados em
conjunto. Royalties obtidos de variedades comerciais geradas a partir deste trabalho serão
divididos em até 50%, dependendo dos gastos que serão feitos por cada parte nas fases
posteriores
como
programa
de
melhoramento,
análises
de
biossegurança
e
desregulamentação junto às agências federais e internacionais competentes.
Os módulos de monitoramento e previsão de safras do portal sobre seca somente
entrará no ar na Internet após cumprir as normas da Embrapa e do Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento.
Envolvimento do Setor Privado
a)
No momento não se vislumbra a participação direta do setor privado no projeto.
Entretanto, informalmente a empresa BASF já foi consultada e tem interesse no
desenvolvimento comercial de variedades de soja tolerantes à seca com genes DREB e
contendo o gene ahas (que confere resistência aos herbicidas da classe das
imidazolinonas). A soja Cultivance®, resistente a herbicidas, sendo desenvolvida em
parceria entre a Embrapa e a BASF contém o gene ahas. Portanto, há o interesse em unir
as duas tecnologias numa mesma variedade.
b)
No caso de ser possível o desenvolvimento de linhagens GM tolerantes à seca, que
venham a ser incorporados nos programas de melhoramento da Embrapa, as fundações, já
parceiras da Embrapa em desenvolvimento de cultivares, serão consultadas para participar
do desenvolvimento tanto técnica, quanto financeiramente.
Riscos e Dificuldades
- Problemas climáticos, ou no avanço de gerações no PA3 poderão atrasar o
desenvolvimentos de linhagens a serem testadas no campo.
- Os experimentos de campo com linhagens GM não serão instalados caso não seja
possível obter junto a CTNBio autorização para Liberação Planejada no Meio Ambiente.
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- Nos experimentos de Pelotas-RS e Passo Fundo-RS, caso não ocorram secas, a
diferenciação entre os materiais poderá ficar prejudicada, uma vez que nessas localidades
não há as coberturas móveis para evitar chuva nos períodos reprodutivos. O fator de
diferenciação quanto ao déficit, nesses casos, será a irrigação nos tratamentos sem déficit.
- As diferenças nos níveis de expressão, dos 12 genes escolhidos para avaliar a
possibilidade de seu uso como marcadores na seleção de genótipos mais tolerantes,
poderá ser pequena, inviabilizando o uso como ferramenta de seleção.
Medidas de Segurança Ambiental, Biológica e Pessoal
A Embrapa Soja e a Embrapa Trigo possuem Certificado de Qualidade em
Biossegurança (CQB) Nos 02/97 e 58/98, respectivamente, para trabalhos com Organismos
GM do grupo de risco I (situação deste projeto) conforme Resoluções Normativas da
CTNBio nos 1 e 2, e atende todas as determinações de descarte e redução de risco
estipuladas pela CTNBio e CIBio da Embrapa Soja. Também possuem pessoal qualificado e
treinado em segurança do trabalho que acompanha as atividades no laboratório, casa-devegetação e campo. Qualquer alteração no projeto, dificuldade de execução ou acidente
com OGMs serão comunicados imediatamente a CIBio da Embrapa Soja. Os relatórios
quadrimestrais do projeto serão também encaminhados a CIBio da Embrapa Soja para que
possam compor o Relatório Anual de CQB da unidade a ser encaminhado anualmente a
CTNBio.
Outros Projetos e Financiamentos
A geração dos eventos de soja contendo a construção rd29A:DREB1A foi financiada
por projeto no Macroprograma 3 sob o título “Introdução de genes por biobalística em soja
visando tolerância à seca”, do Edital 5/02, projeto que foi encerrado em 2006. Também
ocorre aporte de recursos do JIRCAS através do pagamento de duas bolsas de mestrado
no valor de R$750,00/mês (R$ 36.000,00 em dois anos), uma de doutorado (Fellowship) no
valor de R$2.400,00/mês (R$57.600,00 em dois anos) e da compra já efetivada de
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equipamento de PCR em Tempo Real (ABI 7300, Applied Biosystems) no valor de U$
40,000 (~R$ 84.000). Equipamento já instalado e funcionando tendo já sido utilizado no
estudo preliminar de um dos eventos.
O desenvolvimento de linhagens/progênies tolerantes à seca NÃO faz parte do
programa de melhoramento de soja da Embrapa.
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Informações adicionais
Figura 1. PGM de soja com a construção rd29:DREB1A que confere tolerância à seca,
desenvolvidas em pareceria pela Embrapa e JIRCAS. Figura mostra resposta da linhagem
P58 de soja em duas condições de água no vaso, 5% e 2.5% de Umidade Gravimétrica
(UG). As linhagens identificadas como possíveis “eventos elite” no projeto 03.06.5.02.00
serão caracterizadas fisiológica e agronomicamente em condições de campo com controle
da irrigação e da precipitação pluviométrica. Todos os experimentos seguirão as normas de
biossegurança estabelecidas pela CTNBio.
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Figura 2. Dados obtidos com a caracterização fisiológica e agronômica de variedades de
soja em condições de campo na Embrapa (C) têm alimentado modelos matemáticos
utilizados no zoneamento agrícola da cultura no Brasil (A e B). A constante atualização
dessas informações permite produtores, extensionistas e agentes financeiros públicos e
privados a definir estratégias para redução de riscos na produção de soja devido a fatores
climáticos como à seca. Constantemente novos genótipos, inclusive genótipos obtidos por
engenharia genética, são disponibilizados e juntos com novas práticas de manejo devem
ser testados utilizando ferramentas de diversas áreas técnicas da Agronomia como a
agrometeorologia, biotecnologia, melhoramento genético, fisiologia vegetal (D e E) e manejo
da cultura.
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Figura 3. A) Aspecto e produtividade da soja em sistemas de manejo do solo na safra 05/06
em Londrina, PR. B) Diferença de rendimento entre os sistemas de plantio direto e
convencional em experimento de manejo do solo durante vinte anos. O projeto propõe,
definir variedades melhores adaptadas a diferentes condições edafoclimáticas, dentro de
cada sistema de produção. Esta definição depende de uma ampla caracterização fisiológica
e agronômica dos genótipos disponíveis.