Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo ~ Departamento de Patologia
Faculdade de Medicina da USP
Departamento de Patologia
Guia de Instruções para uso do sistema de microdissecção a Laser
PALM© RoboSoftware
PALM Microlaser Technologies / Carl Zeiss Germany
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
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Este manual tem objetivo de permitir consultas rápidas às funções das diversas ferramentas do software
PalmRobo utilizado para microdissecção, além de fornecer informações básicas sobre operação do
equipamento.
Se houver alguma dúvida técnica ou algum problema que não possa ser resolvido apenas pela consulta a este
material contate IMEDIATAMENTE alguma das pessoas listadas na última página deste manual. EM
HIPÓTESE ALGUMA altere as configurações além das que estão discriminadas neste material sem autorização
prévia dos responsáveis.
Parte I – Barras de Ferramentas
A – Layout do Programa
B – Barra de Ferramentas Principais
C – Barra de Ferramentas de Dispositivos
D – Barra de Ferramenta de Processamento de Imagens
E – Barra de Ferramentas de Arquivos
F – Barra de Ferramentas de Fluorescência
G – Barra de Ferramentas de Lente
H – Barra de Ferramentas Gráficas
I – Ferramentas de Ajuste de Velocidade
J – Ferramentas de Ajudes do Microscópio
L – Ferramentas de Ajuste do Laser
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Parte II – Menus de Opções
A – Menu “File’
B – Menu “Edit”
C – Menu “View”
D – Menu “Move”
E – Menu “Laser”
F – Menu “Laser Marker”
G – Menu “Setup”
H – Menu “Devices”
I – Menu “Help”
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Parte III – Janela de Edição de Objetos
A – Layout da Janela de Edição de Objetos
B – Barra de Ferramentas da Janela de Edição de Objetos
C – Menu “File” da Janela de Edição de Objetos
D – Menu “Edit” da Janela de Edição de Objetos
E – Menu “Move” da Janela de Edição de Objetos
F – Menu “Laser” da Janela de Edição de Objetos
G – Menu “Close” da Janela de Edição de Objetos
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Parte IV – Outras Janelas
A – Janela PALM Robo Laser Settings
B – Janela Parâmetros de LPC
C – Janela Robomover
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Parte V – Funções do Laser
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Parte VI – Teclas de Atalho
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Parte VII – Instruções Passo-a-Passo
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Parte VIII – Contatos
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PARTE I
A – Layout do Programa
Abaixo o esquema mostra as principais barras de ferramentas que são abertas automaticamente
com o programa. O local das barras pode ser alterado clicando-se com o botão esquerdo na linha
vertical espessa que fica à esquerda de todas as barras e arrastando-a para o local desejado.
OBSERVAÇÃO: Se você arrastar uma barra de ferramentas para o meio da tela ela ficará
flutuante na tela.
Ferramentas do Laser
Menus
Barra de
Ferramentas
Dispositivos
Arquivo
Fluorescência
Lente
Velocidades
Microscópio
Iniciar Dissecção
Foco do Laser
Ferramentas
gráficas
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Corte
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A seguir, as principais Barras de Menu e Barras de Ferramentas que serão detalhadas nas seções
adiante.
Barra de Menu – Para selecionar as diversas ferramentas, opções de exibição e edição de objetos,
iniciar e interromper atividades do Laser e visualizar e alterar as configurações do programa e do
microscópio.
Barra de Ferramentas – Contém os principais comandos de visualização de objetos, movimentação
da base do microscópio e salvamento das configurações de objeto.
Barra de Dispositivos, Arquivos, Fluorescência e Lente – São 4 barras conjugadas que têm as
funções de movimentação dos dispositivos de captura (suporte do Eppendorf), armazenamento e
edição de imagens, configurações de abertura do obturador da fluorescência e seletor de função, além
de possuir as configurações das objetivas do microscópio sendo usado para troca automática da lente
em uso.
Barra de Elementos Gráficos – Ferramentas para desenhar e configurar objetos, além de possibilitar
medidas e ferramentas de numeração dos objetos e inserção de comentários.
Barra de Status – Mostra as atividades e coordenadas em andamento, o número de objetos em uso, o
tipo de ferramenta em uso e as coordenadas X,Y da base do microscópio.
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Barra de Ferramentas do Laser – Permite
ajustar os controles de energia e foco tanto
para corte como para catapultagem.
Barra de Ferramentas do Microscópio e
Velocidades – Permite ajustar os controles luz e foco
do microscópio, definir e recuperar posições padrão,
além de permitir ajustes nas velocidades de
movimentação, corte, catapultagem, etc. e execução do
Laser.
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PARTE I
B – Barra de Ferramentas Principais
Save Elements
Para salvar os objetos desenhados em um arquivo. O arquivo
pode ser aberto a qualquer momento com o programa. Os
arquivos são salvos em uma pasta definida no menu SETUP >
PALM robo.
First Element
Previous Element
Next Element
O microscópio centraliza na tela o objeto selecionado
Last Element
Element List
Abre a janela “Element List” – Ver a seção desta janela na
página 29
Stage
Clicando nesta ferramenta, o mouse passa a ser a ferramenta
que meche a base do microscópio. Ao andar com o mouse
pela tela, a lâmina acompanha o movimento. Para voltar ao
modo anterior, movendo a lâmina com as setas do teclado ou
com as barras verticais e horizontais basta clicar uma vez com
o botão esquerdo do mouse.
Check-Point
Point of Origin
Stop
Continue
Delete Last
Delete All
Posiciona a base do microscópio colocando no campo de
visão a tampa do eppendorf para visualizar o material já
dissecado e catapultado. Ao clicar o olho abrirá (ver abaixo)
Quando estiver visualizando o material dissecado na tampa do
eppendorf o olho fica aberto. Ao clicar nele a base do
microscópio volta ao normal com as lâminas no foco das
objetivas.
Interrompe imediatamente todas as funções do Laser (corte,
catapultagem, etc) bem como os movimentos da base do
microscópio ou do suporte do eppendorf – utilizar em caso de
emergência para interromper determinada função.
Reativa a ação em execução no momento em que a ferramente
STOP foi utilizada.
Apaga o último objeto desenhado
Apaga todos os objetos desenhados, mesmo quando estiverem
ocultos.
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Freeze
Bloqueia todos os movimentos da base do microscópio, e a
imagem fica congelada – utilizado para fotografias e “printscreen”. Importante para uso com a fluorescência (ver
instruções para fluorescência).
About
Para obter informações sobre o programa – versão e empresa
que desenvolveu o software.
PARTE I
C – Barra de Ferramentas de Dispositivos
Robo Mover
Load Position
Point of Origin
Abre a Janela Robo Mover da PALM (ver a descrição na página
seguinte. No caso do nosso microscópio ele abrirá uma
representação esquemática do suporte do Eppendorf e também o
menu de navegação pela tampa do Eppendorf.
Move a base do microscópio para fora do campo das objetivas e
destrava o suporte de lâminas. Esta ferramenta é executada
automaticamente ao desligar o microscópio, ou manualmente
quando se quer trocar as lâminas do suporte.
Move a base do microscópio de volta à posição de trabalho no
foco das objetivas. Ao clicar no botão Load Position (acima)
automaticamente ele se transforma no Point of Origin, portanto,
clicando no mesmo local a base volta à posição original.
Abre a janela do PALM Navigator que permite escanear uma ou
mais lâminas nos diversos aumentos gerando uma espécie de
miniatura, facilitando a movimentação pelas áreas de interesse.
Navigator
OBSERVAÇÃO – para este processo o microscópio e o software
precisam executar a varredura completa da lâmina(s) portanto,
quanto maior o aumento utilizado, maior será o tempo necessário
para escanear a lâmina completa.
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PARTE I
D – Barra de Ferramentas de Processamento de Imagem
Inicia automaticamente o programa de análise de
imagem acoplado – no caso o Image J.
Image Processing Software
PARTE I
E – Barra de Ferramentas de Arquivo
New Image Folder
Save Image
Seleciona ou Cria uma nova pasta para salvar as imagens.
Salva a imagem da tela com um número como nome em uma
pasta padrão definida no menu SETUP > PALM robo. O
número com o qual a imagem é salva aumenta
automaticamente como em qualquer programa de análise e
processamento de imagens.
OBSERVAÇÃO – As imagens podem ser salvas com ou sem
os objetos desenhados.
Imaging
Inicia automaticamente o programa de processamento de
imagem (no caso o Adobe Photoshop) para exibir as imagens
salvas e/ou editá-las.
PALM Picture
Exibe e permite a organização das pastas e imagens salvas nas
mesmas.
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PARTE I
F – Barra de Ferramentas de Fluorescência
Timer
Permite a determinação de um tempo para fechamento
automático do obturador da lâmpada de fluorescência.
Indicador de Status do Obturador da lâmpada de
fluorescência. Esta é a aparência do obturador fechado. Ao
clicar ele será aberto e a porção azul central do botão
ficará maior, diminuindo a porção cinza.
Fluorescence Shutter
OBSERVAÇÃO – no nosso microscópio o feixe de Laser
passa pelo mesmo orifício de entrada da fluorescência,
portanto tanto para a utilização do laser ou da disseção é
necessário que o Obturador esteja ABERTO!
Esta janela é habilitada quando o obturador está aberto e
pode-se selecionar o que será utilizado através do mesmo.
Aparecem normalmente quatro opções sendo uma delas o
Laser e as outras três filtros de fluorescência (DAPI, FITC
e Texas Red).
Fluorescence List
OBSERVAÇÃO – No nosso microscópio não é possível
visualizar a imagem com filtro de fluorescência e dissecar
ao mesmo tempo. É necessário desenhar na imagem da
fluorescência (Ver seção de instruções de Dissecção),
depois mudar esta lista para Laser e então iniciar a
dissecção!
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PARTE I
G – Barra Ferramentas de Lente
Microscope
Lens List
Abre a janela de controles do microscópio para ajuste de
direção, intensidade de luz e foco a partir do computador.
Para selecionar a objetiva a ser utilizada pelo microscópio.
O nosso microscópio tem as seguintes opções: 5x, 10x,
20x, 40x e 63x.
OBSERVAÇÃO: JAMAIS gire manualmente o canhão de
objetivas. Isto pode danificar o sistema motorizado!
PARTE I
H – Barra de Ferramentas Gráficas
Graphic on/off
Para mostrar ou ocultar objetos desenhados.
Number on/off
Para mostrar ou ocultar o número de cada objeto.
Element areas
Mostra a área do objeto desenhado em µm² mantendoa hachurada ao fundo.
Ruler
Ferramenta de medida. Basta segurar o botão esquerdo
do mouse clicado e desenhar a distância desejada. O
resultado é apresentado em µm.
OBSERVAÇÃO – Ferramenta utilizada para medidas
lineares.
Clique neste botão e depois na área da tela em que
deseja inserir um COMENTÁRIO. No local clicado
aparecerá uma bandeira e você poderá digitar o texto
desejado.
Flag (Comentário)
Se precisar alterar um comentário já redigido, vá para
o menu View > Element List e mude-o diretamente na
lista de objetos (ver sessão de Lista de Objetos).
Os comentário também podem ser adicionados a um
objeto através da Lista de Objetos.
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Reference Point
Para selecionar um ponto de referência
Para desenhar objetos à mão livre utilizando o mouse.
Para desenhar mantenha o botão esquerdo pressionado
e mova o cursor.
Freehand
Para reiniciar a desenhar em uma imagem
parcialmente completa ou para mudar uma imagem
clique em um ponto da linha, mantenha o clique e
pressione ao mesmo tempo a tecla “CTRL”. Neste
momento você verá sobre o ponto em que está
clicando um quadrado grande com a mesma cor da
linha. Mantenha o “CTRL” pressionado e continue o
desenho. Após um ou dois segundo solte o “CTRL” e
continue mantendo o botão esquerdo do mouse
pressionado e continue desenhando normalmente.
Para conectar dois objetos, pressione “CTRL” e
desenhe uma linha entre o ponto de término de um
objeto e o ponto de término do outro objeto. Ao soltar
o mouse os elementos estarão conectados.
Line
Para desenhar linhas retas. Inicie com um clique com o
botão esquerdo (e solte). Com um clique adicional
você poderá mudar a direção da linha. Vá para o ponto
até onde você quer a linha e dê novamente um clique
duas vezes com o botão esquerdo e a linha será
finalizada.
Se o atributo “Quadrático” estiver aceso
(selecionado) as linhas serão sempre exatamente
verticais ou horizontais.
Para desenhar retângulos / quadrados
Se o atributo “Quadrático” estiver aceso
(selecionado) os objetos serão sempre quadrados
perfeitos.
Rectangle
Se o atributo “Centrifugo” estiver aceso
(selecionado) os objetos serão sempre quadrados
perfeitos desenhados a partir do centro. Utilize esta
função a partir do ponto central da imagem que você
deseja incluir no objeto.
Para desenhar elipses e círculos
Círculo
Se o atributo “Quadrático” estiver aceso
(selecionado) os objetos serão sempre círculos
perfeitos.
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Se o atributo “Centrifugo” estiver aceso
(selecionado) os objetos serão sempre círculos
perfeitos desenhados a partir do centro. Utilize esta
função a partir do ponto central da imagem que você
deseja incluir no objeto.
Ponto
Desenha pontos, marcando células individuais para
catapultagem, ou então um ponto de aderência que não
foi adequadamente cortado pelo laser. Estes são os
pontos utilizados pela função LPC (ver adiante – Laser
Pressure Catapulting)
AutoCircle
Marca áreas de tamanhos pré-definidos (ver adiante
seção de personalização para definir o tamanho do
círculo) para corte e subseqüente catapultagem. Estes
objetos também são utilizados pela função laser
AutoCircle.
Para selecionar objetos que podem ser alterados. Com
um clique no botão direito do mouse escolha a opção
Change. Podem também ser movidos (mantendo o
botão esquerdo clicado e arrastando-o) ou apagados
(clique com o botão direito e escolha a opção delete).
Para selecionar um objeto, clique no número do objeto
para selecioná-lo (diretamente ou a partir da lista de
objetos).
Pointer
Para selecionar mais de um objeto clique com o botão
esquerdo e arraste-o formando um retângulo que
inclua todos os objetos desejados ou parte deles ou
então, clique no primeiro objeto, pressione “SHIFT” e
clique em outro objeto a ser selecionado.
Para seleção de um objeto que está sobreposto por
outros, clique no primeiro, pressione “CTRL” e clique
novamente. Perceba que o objeto selecionado mudou
de número – na verdade a seleção mudou para um
objeto que estava sobreposto pelo anteriormente
selecionado. Repita o procedimento até o objeto
desejado ser selecionado.
Lines
Determina a espessura das linhas e pontos e o tamanho
da régua. A espessura dos objetos selecionados
também será alterada por esta função.
Colors
Para determinar a cor de base para cada objeto. A cor
dos objetos já desenhados não mudará.
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Color Palete On-Off
Para exibir ou ocultar a palheta de cores. Com a
palheta de cores você pode selecionar a cor do
próximo objeto a ser desenhado. A cor selecionada é
salva com a cor padrão para todos os objetos do
mesmo tipo dali em diante. Mas isso pode ser alterado
quantas vezes forem necessárias para desenhar
diferentes grupos de tecidos ou células por exemplo
com cores diferentes.
Cut Tools
Para selecionar o tipo de função do UV-Laser para o
próximo comando de execução do Laser. O número à
esquerda indica o número de vezes que o processo será
repetido para cada objeto (em caso por exemplo de
cortes espessos onde é necessário realizar o mesmo
corte mais de uma vez para evitar energia excessiva do
laser. Ver a seção de Ferramentas do Laser.
Start Laser
Para ativar o Laser e executar o processo indicado pelo
“Cut Tools”
Laser Status
Mostra o status de atividade do Laser. Quando o
mesmo é ativado, a esfera fica azul:
ou
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PARTE I
I – Ferramentas de Ajuste de Velocidade
Para mostrar e alterar os padrões de velocidade para os 6 parâmetros disponíveis. Primeiro selecione o
parâmetro. A unidade também pode ser selecionada através do menu Setup > PALM Robo entre
µm/seg ou passos/seg
Padrão de
relação entre
o movimento
do mouse e o
movimento
da base.
Clique com o
mouse
arrastando o
seletor
vertical para
diminuir ou
aumentar a
velocidade.
Padrão de
velocidade para
o movimento
da base do
microscópio
com as setas do
teclado.
Padrão de
velocidade para
movimentação
com o cursor e
barras de
rolagem
verticais e
horizontais.
Padrão de
velocidade para
a
movimentação
de elemento
para elemento,
para checkpoint ou para a
posição de
referência.
Outra opção
para
diminuir a
velocidade é
clicar na
caixa Slow.
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Padrão de
velocidade para
o movimento
da base do
microscópio
durante o corte.
Lembrar que
quanto mais
lento for feito o
corte, mais
eficiente ele
será pelo maior
tempo de
contato do laser
com a
superfície.
Padrão de
velocidade
para o
movimento
da base do
microscópio
durante a
Catapultagem
(LPC)
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PARTE I
J – Ferramentas de Ajuste do Microscópio
Ao clicar na caixa ao lado de “AF active” o auto-foco ficará
sempre ativado. Se quiser utilizar o auto-foco apenas uma vez
clique no botão imediatamente abaixo.
Clicar neste botão define o momento atual como a definição de
trabalho para foco da objetiva em uso.
Os botões de posição da objetiva determinam o posicionamento
do canhão de objetivas e de uma objetiva em especial.
O primeiro botão, com a objetiva à direita, rebaixa o canhão para
remover a base do microscópio. Este rebaixamento é executado
automaticamente quando se clica no botão Load Position na
Barra de Ferramentas.
O botão do meio é a posição de trabalho. Toda vez que for
clicado voltará para a posição definida pelo último clique no
botão “Set Workposition” descrito acima.
O botão à direita eleva o canhão de objetivas para observar o
material dissecado na tampa do Eppendorf. Este comando
também é executado automaticamente ao se clicar no botão
“Check-point” na barra de ferramentas.
Liga ou desliga a luz do microscópio.
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Ajuste de Foco Ajuste de Luz
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PARTE I
L – Ferramentas de Ajuste do Laser
Para selecionar a função desejada para ajustar os parâmetros de energia e foco, clique na seta para
baixo à direita e escolha LPC ou Cut. Ao selecionar uma das ferramentas, os valores padrão de foco e
energia aparecerão automaticamente nos indicadores abaixo da janela.
Os valores de energia e foco podem ser mudados antes de cada operação utilizando o laser, permitindo
assim aperfeiçoar cada operação de acordo com a espessura ou tipo de tecido para obter um corte mais
preciso e um processo mais eficiente de catapultagem.
Para ajuste fino, os valores podem ser ajustados enquanto a operação de corte ou catapultagem estiver
em andamento.
OBSERVAÇÃO: Um corte perfeito depende fundamentalmente de três parâmetros: Energia, Foco e
Velocidade. Quando mais correto estiver o foco, menos energia será necessária, portanto, comece
ajustando o sistema pelo foco. A seguir ajuste a energia necessária. Lembre-se de que talvez seja
necessário diminuir um pouco a velocidade de corte especialmente em cortes mais espessos ou com
muita parafina. Em alguns casos pode ser necessário repetir o procedimento. Basta selecionar
novamente o mesmo objeto e reiniciar a função de laser.
Padrões de energia e foco para a função “Cut” Padrões de energia e foco para a função “LPC”
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PARTE II
A – Menu “File”
Prepara o Software para desenhar novos objetos. Os objetos
existentes até o momento deverão ser salvos anteriormente se
quiser guardá-los.
Para abrir objetos salvos em um arquivo. Coloque a lâmina
exatamente na mesma posição que ela foi usada para desenhar os
objetos e então utilize a ferramenta “open elements”.
Para salvar os objetos desenhados em um arquivo. O arquivo
pode ser aberto novamente no momento ou em outra seção de
uso do PALM Robo Software.
Os arquivos são salvos numa pasta padrão definida previamente
no menu Setup > PALM Robo) – ver detalhes adiante.
Inicia automaticamente o programa de análise de imagem
acoplado – no caso o Image J
Seleciona ou Cria uma nova pasta para salvar as imagens.
Salva a imagem da tela com um número como nome em uma
pasta padrão definida no menu SETUP > PALM robo. O número
com o qual a imagem é salva aumenta automaticamente como
em qualquer programa de análise e processamento de imagens.
OBSERVAÇÃO – As imagens podem ser salvas com ou sem os
objetos desenhados.
Inicia automaticamente o programa de processamento de
imagem (no caso o Adobe Photoshop) para exibir as imagens
salvas e/ou editá-las.
Exibe e permite a organização das pastas e imagens salvas nas
mesmas.
Para importar as propriedades dos objetos da lista de objetos
(cor, número, tipo, etc.) e as coordenadas dos pontos de
ancoramento dos objetos. A importação é feita através de um
arquivo de texto no formato TXT.
Para exportar as propriedades dos objetos mostrados na lista de
objetos (cor, número, tipo, etc.) e as coordenadas dos pontos de
ancoramento dos objetos. As propriedades são salvas como um
arquivo de texto no formato TXT.
O arquivo de texto pode ser aberto com o software PALM Robo
ou com qualquer editor de textos que reconheça a extensão TXT,
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como por exemplo o Word, Bloco de Notas, etc.
Para imprimir as propriedades dos objetos para um arquivo do
Excel ou para um arquivo de texto.
Você pode escolher quais objetos e quais propriedades destes
objetos serão impressas.
Para abrir um dos últimos quatro arquivos utilizados cujos
objetos foram salvos.
Para sair do programa PALM Robo
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PARTE II
B – Menu “Edit”
Para desfazer o comando anterior.
Para selecionar todos os objetos visualizados na tela.
Para apagar a seleção de todos os objetos visualizados na
tela.
Para mostrar ou alterar as propriedades dos objetos
selecionados.
Se mais de um objeto estiver selecionados, as
propriedades do objeto com menor número (desenhado
antes) será mostrado.
Para restaurar à condição anterior um objeto selecionado
que foi editado previamente. Se mais de um objeto
estiver selecionado, todos os objetos selecionados serão
restaurados.
Para renumerar os objetos restantes. Utilizar esta
ferramenta quando você apagar alguns objetos, porque os
números dos objetos apagados ficam vagos até que você
execute este comando e os objetos remanescentes sejam
renumerados novamente em ordem crescente.
Para copiar os objetos selecionados para a Área de
Transferência.
Para colar os objetos armazenados na Área de
Transferência.
Para apagar os objetos selecionados.
Para apagar o último objeto desenhado.
Para apagar todos os objetos, incluindo os objetos
ocultos.
Para criar um grupo de objetos a partir dos objetos
selecionados.
Para adicionar um ou mais objetos selecionados para um
grupo já existente.
Para remover um ou mais objetos selecionados de um
grupo.
Para definir até três figuras de referência para um
determinado grupo (tipo de figura – círculo, quadrado,
etc.).
Para excluir um tipo de figura de referência definida para
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um determinado grupo (tipo de figura – círculo,
quadrado, etc.).
Para transferir objetos de uma lâmina para cortes
subseqüentes automaticamente – Utilizado para
marcação em uma lâmina corada e dissecção de uma
lâmina não corada.
OBSERVAÇÃO – A utilização desta ferramenta requer o
estabelecimento de pontos de referência pelo software e
portanto as lâminas devem estar montadas com posição
mais próxima possível uma da outra para permitir o
reconhecimento da área determinada.
Para transferir objetos de uma lâmina para cortes
subseqüentes manualmente – Utilizado para marcação
em uma lâmina corada e dissecção de uma lâmina não
corada.
Para atualizar a apresentação dos objetos na tela. Se
houver objetos selecionados, estes serão atualizados. Se
nenhum estiver selecionado todos serão atualizados.
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PARTE II
C– Menu “View
Para visualizar as barras de ferramentas disponíveis para exibição.
As que estiverem marcadas serão exibidas na tela principal do
software. Para ocultar alguma barra basta clicar em cima e o “tique”
será apagado e a barra ocultada. Para exibir barras ocultas faça o
procedimento contrário, clicando em uma barra que não estiver
selecionada. Com isso ela será selecionada neste menu e aparecerá
já na tela principal do programa.
.
Abre a janela do PALM Navigator que permite escanear uma ou
mais lâminas nos diversos aumentos gerando uma espécie de
miniatura, facilitando a movimentação pelas áreas de interesse.
OBSERVAÇÃO – para este processo o microscópio e o software
precisam executar a varredura completa da lâmina(s) portanto,
quanto maior o aumento utilizado, maior será o tempo necessário
para escanear a lâmina completa.
Abre a janela “Element List” – Ver a seção desta janela na página
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Abre a janela de controles do microscópio para ajuste de direção,
intensidade de luz e foco a partir do computador.
Para mostrar ou ocultar objetos desenhados. Novos objetos
desenhados não serão mostrados a partir do momento em que esta
opção for desligada.
Para mostrar ou ocultar o número de cada objeto.
Para mostrar ou ocultar pontos de ancoramento dos
Para mostrar ou ocultar a máscara do retângulo durante o desenho.
Para mostrar ou ocultar a marca indicativa do centro do objeto
desenhado.
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PARTE II
D – Menu “Move”
Interrompe imediatamente todas as funções do Laser (corte,
catapultagem, etc) bem como os movimentos da base do
microscópio ou do suporte do eppendorf – utilizar em caso de
emergência para interromper determinada função.
Reativa a ação em execução no momento em que a ferramente
STOP foi utilizada.
Clicando nesta ferramenta, o mouse passa a ser a ferramenta que
meche a base do microscópio. Ao andar com o mouse pela tela, a
lâmina acompanha o movimento. Para voltar ao modo anterior,
movendo a lâmina com as setas do teclado ou com as barras
verticais e horizontais basta clicar uma vez com o botão esquerdo
do mouse.
Com esta função ativada, o movimento da base do microscópio
segue no sentido oposto do movimento do mouse (mais parecido
com o Charriot).
Bloqueia todos os movimentos da base do microscópio, e a imagem
fica congelada – utilizado para fotografias e “print-screen”.
Importante para uso com a fluorescência (ver instruções para
fluorescência).
Para determinar as configurações de velocidade da base do
microscópio, das setas, de corte, LPC, posicionamento e
deslocamento.
Para alterar a velocidade atual de movimento – diminuir ou
aumentar.
OBSERVAÇÃO: O aumento ou diminuição será feito para a função
em uso: movimentação, corte, LPC, etc. As demais velocidades não
serão alteradas.
O microscópio centraliza na tela o objeto selecionado de acordo
com a opção.
Posiciona a base do microscópio colocando no campo de visão a
tampa do eppendorf para visualizar o material já dissecado e
catapultado. Ao clicar o olho abrirá (ver abaixo)
Move a base do microscópio para fora do campo das objetivas e
destrava o suporte de lâminas. Esta ferramenta é executada
automaticamente ao desligar o microscópio, ou manualmente
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quando se quer trocar as lâminas do suporte.
Para mover a base do microscópio para os objetos previamente
definidos como Referência 1, 2 e 3 dentro de cada grupo, com a
ferramenta “Define Group Reference Figure” no Menu Edit.
Para mover a base do microscópio para a última coordenada x,y.
Esta posição é definida como o ponto zero (0) para a coordenada
dos objetos. Após a fixação a base volta novamente para a posição
inicial.
A base é automaticamente referenciada a cada vez que o programa
é iniciado, assim, esta opção só deve ser utilizada em caso de erro
de referenciamento de objetos.
PARTE II
E – Menu “Laser”
Para determinar os parâmetros de dissecção e
catapultagem para cada objetiva selecionada. Ver adiante
sessão com a janela específica na página 38.
Para determinar as configurações de energia e foco do
UV-Laser para cada objetiva selecionada. Ver adiante
sessão com a janela específica na página 37.
Para ativar o Laser e executar o processo indicado pelo
“Cut Tools” ou selecionado do próximo item.
Seletor da função do Laser para a próxima execução do
Laser.
Ver adiante para especificação de cada uma das funções
na página 40.
Para alterar os valores de energia e foco para a opção em
atividade. Diferente da opção “Energy & Focus (UVLaser)...” que permite alterar as configurações
específicas para cada objetiva, estas opções alteram
apenas a ação em andamento.
Durante a execução do laser estes parâmetros também
podem ser alterados através do teclado ou da barra de
ferramentas do laser à esquerda.
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24
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PARTE II
F – Menu “Laser Marker”
Para alinhar a posição da Marca do Laser (triângulo
verde no centro da tela) com a posição atual das
ferramentas do laser.
Com esta ferramenta, a cor, tamanho, tipo e estilo da
Marca do Laser (triângulo verde no centro da tela)
podem ser alterados.
Com esta ferramenta a Marca do Laser (triângulo verde
no centro da tela) pode ser ocultada ou exibida.
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25
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PARTE II
G – Menu “Setup”
Ferramentas gerais de configuração, salvamento,
padrões, salvamento de objetos e imagens, funções do
laser e auto-foco no microscópio motorizado. Nesta
seção é possível alterar as pastas de destino das imagens,
configurações de padrões gerais para objetos e para o
microscópio.
Para a definição de nomes significativos para os filtros
de fluorescência instalados, permitindo a visualização
dos nomes além dos números que representam a
seqüência ocupada no canhão de fluorescência.
Ferramenta também utilizada para selecionar o filtro de
fluorescência e para obter informações sobre os filtros
instalados.
Para abrir e fechar o obturador da fluorescência
(conforme descrito para os botões da barra de
ferramentas de fluorescência).
Além disso permite a obtenção de informações sobre o
tipo de obturador instalado.
OBSERVAÇÃO – Lembre-se que em nosso
microscópio, para a utilização do Laser é fundamental
que o obturador esteja aberto então, mantenha sempre a
lâmpada de fluorescência desligada quando ela não for
utilizada porque ela tem meia-vida determinada pelo
tempo de uso.
Para obter informações acerca do tipo de refletor,
calibrá-lo e definir nomes significativos para as cores do
refletor.
Ferramenta também utilizada para selecionar um dos
tipos de refletor disponíveis.
Para criar ou alterar os padrões de fluorescência
existentes. Os padrões de fluorescência definidos podem
também ser ativados através da barra de ferramentas de
fluorescência já descrita.
Para salvar ou abrir configurações pré-definidas de
velocidade para a base do microscópio, setas do teclado,
corte, LPC, posicionamento e movimentação.
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Também utilizado para salvar ou abrir configurações
pré-definidas de laser para energia, foco, valores de
objetivas, distâncias de LPC e alterações automáticas.
Restabelece todas as configurações de fábrica
OBSERVAÇÃO:
SOMENTE
AS
PESSOAS
RESPONSÁVEIS PELO MICROSCÓPIO PODEM
UTILIZAR ESTA FUNÇÃO!! (ver última página).
.
Para calibrar o software em relação às configurações do
microscópio. Esta calibração é fundamental para os
cortes e medidas, caso contrário, a Marca do Laser no
software pode não corresponder à do microscópio e os
cortes não serão coincidentes com os objetos
desenhados. Também é fundamental para as medidas
para que haja correspondência entre a distância real em
µm e o número de pixels da imagem.
A calibração é armazenada de acordo com a objetiva
indicada.
Para abrir as configurações padrão de fábrica para a
calibração.
.
.
.
.
.
OBSERVAÇÃO:
SOMENTE
AS
PESSOAS
RESPONSÁVEIS PELO MICROSCÓPIO PODEM
UTILIZAR ESTA FUNÇÃO!! (ver última página).
Para compensar o desvio da objetiva do microscópio
(aberração cromatográfica)
Para abrir as configurações padrão de fábrica para o
desvio de objetiva.
OBSERVAÇÃO:
SOMENTE
AS
PESSOAS
RESPONSÁVEIS PELO MICROSCÓPIO PODEM
UTILIZAR ESTA FUNÇÃO!! (ver última página).
Para compensar o desvio gerado pelo refletor do
microscópio.
Para abrir as configurações padrão de fábrica para o
desvio de refletor.
OBSERVAÇÃO:
SOMENTE
AS
PESSOAS
RESPONSÁVEIS PELO MICROSCÓPIO PODEM
UTILIZAR ESTA FUNÇÃO!! (ver última página).
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27
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PARTE II
H – Menu “Devices”
Abre a Janela Robo Mover da PALM (ver a descrição na página
seguinte. No caso do nosso microscópio ele abrirá uma representação
esquemática do suporte do Eppendorf e também o menu de
navegação pela tampa do Eppendorf.
PARTE II
I – Menu “Help”
Manual de Ajuda tutorial para diversos aspectos relacionados
ao software PALM Robo.
Lista os tópicos de ajuda.
Para mostrar as informações do sistema.
Para obter informações sobre o programa – número de versão,
ano e produção.
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PARTE III
A – Layout da Janela de Edição de Objetos
A lista de objetos mostra as principais informações sobre os objetos desenhados e permite realizar
operações básicas com eles.
As colunas na porção superior da tabela mostram as informações de cada objeto descritas a seguir:
Cor do objeto e seleção – caixas com um tique ao lado da
Primeira Coluna
cor é sinal de que o objeto está visível. Ao tirar o tique o
objeto será ocultado.
Nome do Objeto – pode ser acrescentado clicando sobre
Name:
o espaço branco.
Número do Objeto – ascendente e seqüencial. Note que
se alguns objetos forem apagados os números não são
restabelecidos automaticamente e os objetos continuam
com os seus números anterior (veja que faltam os objetos
Nr:
1 a 11 que foram apagados). Para restabelecer a
numeração utilize o botão da barra de ferramentas desta
caixa ou do programa.
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
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Grp:
Type:
Cut,shot:
Área:
H x W:
Comment:
Position:
Para elementos agrupados, mostra o número do grupo.
Tipo de Objeto, classificado de acordo com a ferramenta
utilizada para desenhá-lo.
Número de cortes e catapultagens realizado em cada
objeto. Note que os pontos (dot) não são cortados, apenas
catapultados direto por isso aparecem como -,1.
Área de cada objeto em µm²
Dá a altura e largura dos objetos desenhados.
Texto adicional para breve descrição ou indicação a
respeito do objeto em questão. Pode ser feito também
através do botão “Flag” na barra de ferramentas gráficas.
Coordenadas (X,Y) relativas ao ponto de referência da
base do microscópio.
Ao clicar uma vez em qualquer objeto ele será selecionado. Para selecionar múltiplos objetos utilize a
tecla “SHIFT”. Clicando duas vezes sobre o objeto será aberta uma nova janela com as propriedades do
objeto descritas acima onde podem ser mudados alguns atributos como nome, cor e comentários.
Abaixo da primeira tabela, há uma segunda, com um resumo dos tipos e cores que mostra:
Mostra as cores que foram utilizadas para todos os tipos
de objetos. Também tem caixas para ticar quando quiser
Primeira Coluna:
que os objetos sejam exibidos ou retirar o tique para
ocultá-los.
Elements:
Número total de objetos para cada cor e tipo.
Áreas:
Área total de todos os objetos por cor (em µm²)
Mostra os diferentes tipos de objetos para visualização.
Clicando na seta à direita é possível selecionar apenas
um tipo de objeto para visualização.
Barra inferior mostrando o total de objetos e a área total
em µm² de todos os objetos listados.
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30
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PARTE III
B – Barra de Ferramentas da Janela de Edição de Objetos
Stop
Import Elements
Export Elements
Desenha pontos, marcando células individuais para
catapultagem, ou então um ponto de aderência que
não foi adequadamente cortado pelo laser. Estes são
os pontos utilizados pela função LPC (ver adiante –
Laser Pressure Catapulting)
Para importar as propriedades dos objetos da lista de
objetos (cor, número, tipo, etc.) e as coordenadas dos
pontos de ancoramento dos objetos. A importação é
feita através de um arquivo de texto no formato
TXT.
Para exportar as propriedades dos objetos mostrados
na lista de objetos (cor, número, tipo, etc.) e as
coordenadas dos pontos de ancoramento dos objetos.
As propriedades são salvas como um arquivo de
texto no formato TXT.
O arquivo de texto pode ser aberto com o software
PALM Robo ou com qualquer editor de textos que
reconheça a extensão TXT, como por exemplo o
Word, Bloco de Notas, etc.
Para imprimir as propriedades dos objetos para um
arquivo do Excel ou para um arquivo de texto.
Print Elements
Go To
Change
Delete Selected
Delete All
Renumber All
Você pode escolher quais objetos e quais
propriedades destes objetos serão impressas.
Centraliza o objeto selecionado na lista. Basta clicar
no objeto na tabela (ele ficará azul) então clique
neste botão para que o objeto selecionado seja
mostrado no centro da tela.
Para mostrar ou alterar as propriedades dos objetos
selecionados.
Se mais de um objeto estiver selecionados, as
propriedades do objeto com menor número
(desenhado antes) será mostrado.
Para apagar o(s) objeto(s) selecionado(s) na lista
(marcados em azul).
Para apagar todos os objetos da lista.
Para renumerar os objetos restantes. Utilizar esta
ferramenta quando você apagar alguns objetos,
porque os números dos objetos apagados ficam
vagos até que você execute este comando e os
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
31
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Cut Options
Start Laser
objetos
remanescentes
sejam
renumerados
novamente em ordem crescente.
Para selecionar o tipo de função do UV-Laser para o
próximo comando de execução do Laser. O número
à esquerda indica o número de vezes que o processo
será repetido para cada objeto (em caso por exemplo
de cortes espessos onde é necessário realizar o
mesmo corte mais de uma vez para evitar energia
excessiva do laser. Ver a seção de Ferramentas do
Laser.
Para ativar o Laser e executar o processo indicado
pelo “Cut Tools”
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
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PARTE III
C – Menu “File” da Janela Edição de Objetos
Prepara o Software para desenhar novos objetos. Os objetos
existentes até o momento deverão ser salvos anteriormente se
quiser guardá-los.
Para abrir objetos salvos em um arquivo. Coloque a lâmina
exatamente na mesma posição que ela foi usada para desenhar os
objetos e então utilize a ferramenta “open elements”.
Para salvar os objetos desenhados em um arquivo. O arquivo
pode ser aberto novamente no momento ou em outra seção de
uso do PALM Robo Software.
Os arquivos são salvos numa pasta padrão definida previamente
no menu Setup > PALM Robo) – ver detalhes adiante.
Para importar as propriedades dos objetos da lista de objetos
(cor, número, tipo, etc.) e as coordenadas dos pontos de
ancoramento dos objetos. A importação é feita através de um
arquivo de texto no formato TXT.
Para exportar as propriedades dos objetos mostrados na lista de
objetos (cor, número, tipo, etc.) e as coordenadas dos pontos de
ancoramento dos objetos. As propriedades são salvas como um
arquivo de texto no formato TXT.
O arquivo de texto pode ser aberto com o software PALM Robo
ou com qualquer editor de textos que reconheça a extensão TXT,
como por exemplo o Word, Bloco de Notas, etc.
Para imprimir as propriedades dos objetos para um arquivo do
Excel ou para um arquivo de texto.
Você pode escolher quais objetos e quais propriedades destes
objetos serão impressas.
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
33
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PARTE III
D – Menu “Edit” da Janela Edição de Objetos
Para selecionar todos os objetos visualizados na tela.
Para apagar a seleção de todos os objetos visualizados na
tela.
Para mostrar ou alterar as propriedades dos objetos
selecionados.
Se mais de um objeto estiver selecionados, as
propriedades do objeto com menor número (desenhado
antes) será mostrado.
Para renumerar os objetos restantes. Utilizar esta
ferramenta quando você apagar alguns objetos, porque os
números dos objetos apagados ficam vagos até que você
execute este comando e os objetos remanescentes sejam
renumerados novamente em ordem crescente.
Para copiar os objetos selecionados para a Área de
Transferência.
Para colar os objetos armazenados na Área de
Transferência.
Para apagar os objetos selecionados.
Para apagar todos os objetos, incluindo os objetos
ocultos.
Para criar um grupo de objetos a partir dos objetos
selecionados.
Para adicionar um ou mais objetos selecionados para um
grupo já existente.
Para remover um ou mais objetos selecionados de um
grupo.
Para definir até três figuras de referência para um
determinado grupo (tipo de figura – círculo, quadrado,
etc.).
Para excluir um tipo de figura de referência definida para
um determinado grupo (tipo de figura – círculo,
quadrado, etc.).
Para transferir objetos de uma lâmina para cortes
subseqüentes automaticamente – Utilizado para
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
34
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marcação em uma lâmina corada e dissecção de uma
lâmina não corada.
OBSERVAÇÃO – A utilização desta ferramenta requer o
estabelecimento de pontos de referência pelo software e
portanto as lâminas devem estar montadas com posição
mais próxima possível uma da outra para permitir o
reconhecimento da área determinada.
Para transferir objetos de uma lâmina para cortes
subseqüentes manualmente – Utilizado para marcação
em uma lâmina corada e dissecção de uma lâmina não
corada.
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
35
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PARTE III
E – Menu “Move” da Janela Edição de Objetos
O microscópio centraliza na tela o objeto selecionado de acordo
com a opção.
PARTE III
F – Menu “Laser” da Janela Edição de Objetos
Para ativar o Laser e executar o processo indicado pelo
“Cut Tools” ou selecionado do próximo item.
Seletor da função do Laser para a próxima execução do
Laser.
Ver adiante para especificação de cada uma das funções
na página 40.
PARTE III
G – Menu “Close” da Janela Edição de Objetos
Salva e fecha a lista de objetos
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
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PARTE IV
A – Janela Palm Robo Laser Settings
Para as configurações de diferenças entre energia de corte e energia de LPC. Esta diferença é
importante porque em geral, é necessária uma energia maior para catapultar do que para cortar o tecido.
Normalmente, há uma diferença pré-estabelecida para cada objetiva. As barras laterais controlam as
energias de corte e LPC respectivamente. Ao centro, há a demarcação da diferença e a caixa “AutoChange” quando selecionada, controla automaticamente a diferença ideal. Em geral, deve-se deixar a
caixa “Auto-Change” selecionada. Alterações deste delta deverá ser comunicada aos responsáveis. O
Controle de foco segue o mesmo padrão. Para alterar para controle de foco clique na lingüeta “Focus”
Objetiva
Alterna controle de energia e foco
Controle de energia de LPC
Auto-Change – mantém diferença préprogramada entre energia de corte e
LPC
Diferença de energia entre corte e LPC
Controle de energia de Corte
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PARTE IV
B – Janela Parâmetros de LPC
Contém os principais controles de configuração para catapultagem, incluindo a distância deixada antes
do término do corte, a direção da catapultagem, a distância de catapultagem a partir da linha e o raio da
Ferramenta Auto-Circle – descrita na seção de ferramentas gráficas.
Objetiva
Distância entre os pontos de catapultagem
– utilizado para múltiplos pontos em
lâminas de vidro sem membrana.
Distância do ponto de catapultagem mais
próximo da linha – para lâminas de vidro
Posição do ponto de catapultagem. Pode
ser na periferia ou no centro. Utilizar o
centro para células isoladas
Raio da Ferramenta auto-circle para selecionar
uma área redonda e catapultar a partir do centro.
Distância deixada sem cortar na função
LPC para evitar que o corte se mova antes
da catapultagem. Quando mais espesso o
tecido menor a distância necessária.
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
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PARTE IV
C – Janela Robomover
Contém um esquema do suporte do Eppendorf. Também tem uma barra de ferramentas simples com
botões já descritos em seções anteriores. Esta janela aparece quando vai-se ao Check-point.
Para colocar o suporte em posição de
inserção ou retirada de Eppendorf.
Tampa do Eppendorf – clique aqui para visualizar o
material dissecado. O quadrado vermelho significa a
região em que você está.
Vidro branco para melhor visualização das lâminas.
Pode ser substituído pela tampa do Eppendorf, quando
esta tiver também o material esbranquiçado em seu
interior.
Ponto de Navegação pela tampa do Eppendorf. Clique neste ponto e
arraste-o para navegar pela tampa do Eppendof.
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
39
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PARTE V
Cut
Para cortar ao longo de uma linha previamente desenhada.
Usado para todos os tipos de preparação.
O laser corta exatamente de acordo com a linha desenhada
criando um espaço entre o que estiver de um lado e outro da
linha. Esta opção permite o isolamento das áreas desejada.
JointCut
Fecha a linha, mas deixa uma pequena porção sem cortar,
mantendo o tecido conectado. Utilizado para lâminas com
membrana e células vivas.
Esta é uma função de corte que, deixando um pequeno
fragmento sem cortar, evita que o fragmento se desloque
dificultando a catapultagem. Toda a área pode ser
catapultada a seguir com um simples tiro do laser. Esta
função é utilizada para corte de figuras geométricas para
evitar os movimentos não intencionais do material sobre a
membrana.
Close & Cut
Mesma função do Cut só que, após deixar uma parte do
material unida, um novo corte é realizado para terminar o
corte. Esta função faz conectar automaticamente o fim da
linha com o início da mesma. Utilizado para lâminas de
vidro, lâminas com membrana, células vivas e a maioria das
preparações teciduais.
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
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LPC (Laser Pressure Catapulting)
É a Catapultagem a Laser. Através de um tiro de laser onde o
ponto for desenhado, aí é aplicada uma pressão e o tecido ou
célula é catapultado. O ponto de catapultagem pode ser
indicado manualmente, para c[elulas ou tecidos após o corte.
Esta função é especialmente útil para citocentrifugados e
para células isoladas em preparações histológicas.
Auto LPC
Catapultagem automática de múltiplos pontos para grandes
áreas utilizadas SOMENTE para lâminas de vidro, sem
membrana.
Com lâminas de vidro, apenas uma pequena quantidade de
células ou tecidos pode ser catapultado com um tiro simples
(quando há membrana ela serve como uma base de apoio o
que não ocorre com o vidro). Assim, áreas grandes devem
ser catapultadas com múltiplos tiros. Deve-se desenhar a área
de catapultagem e definir o número de tiros nas opções de
configurações (Setup)
Close & Cut + Auto LPC
Catapultagem automática de múltiplos pontos para grandes
áreas utilizadas SOMENTE para lâminas de vidro, sem
membrana.
É uma mistura das duas funções, primeiro há o corte com
uma área de contato mantida. Depois automaticamente o
corte é completado e então o tecido delimitado é catapultado
através de múltiplos tiros do Laser
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
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Robo LPC
Corte e catapultagem em um único passo. Esta é a ferramenta
mais usada para tecidos em lâminas com membrana.
A linha marcada é cortada, deixando uma pequena área de
conecção a partir da qual toda a área é imediatamente
catapultada com um tiro de laser. O tamanho da porção de
conexão pode ser pré-selecionado nas configurações de laser
(Menu Setup) e mostrada junto com o ponto de catapultagem
(linha e ponto verdes).
Auto Circle
Ferramenta utilizada em lâminas com membrana e para
porções pequenas, também em lâminas de vidro.
Através de um círculo de raio pré-definido que pode ser
alterado no menu Setup, um círculo é desenhado, recortado e
catapultado a partir do centro.
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
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PARTE VI
Help
F1
Help > PalmRobo Help
Abre o arquivo de ajuda do software
File
F2
F3
Alt + F4
File > Open Imaging
Abre o programa de processamento de imagem (Photoshop)
File > Open PalmPicture
Abre a janela para visualizar e organizar imagens e pastas salvas
File > Exit PalmRobo
Sai do Programa
Edit
Ctrl + A
Ctrl + C
Ctrl + V
Backspace
Alt + Backspace
Ctrl + Y
Del
Alt + Enter
Edit > Select all / Edit > Deselect all
Seleciona todos os objetos ou apaga a seleção se estiverem selecionados
Edit > Copy
Copia um objeto ou configurações do mesmo
Edit > Paste
Copia um objeto ou configurações do mesmo
Edit > Delete Last
Apaga o último objeto desenhado
Edit > Undelete
Retorna à ação anterior de apagar
Edit > Delete All
Apaga todos os objetos desenhados
Edit > Delete Selected
Apaga os objetos selecionados
Edit > Change
Altera as características de configuração dos objetos
Move
Alt + F
Ctrl + F
Ctrl + S
Ctrl + K
F7
F8
Esc
Move > Freeze mode
Congela a imagem e o movimento do microscópio
Move > Speed faster
Aumenta a velocidade da função em uso / selecionada no menu velocidade
Move > Speed slower
Diminui a velocidade da função em uso / selecionada no menu velocidade
Move > Goto Check-Point
Coloca a tampa do Eppendorf no ponto de visualização
Move > Stage mode
Habilita a movimentação da base do microscópio diretamente com o mouse
Move > Setup Speed
Abre as janelas de configuração de velocidades
Move > Stop
Pára imediatamente as funções de laser em execução
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
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View
Ctrl + L
Ctrl + P
F4
F5
F6
Ctrl + U
Ctrl + E
Ctrl + G
View > Menus > Laser Tools
Habilita a visualização da barra de ferramentas do laser
View > Menus > Color Palette
Habilita a visualização da paleta de cores.
View > Navigator Window
Abre a janela de visualização das miniaturas das lâminas na base
View > Element List
Abre a janela de lista de objetos com suas características
View > Microscope Window
Abre a janela de controle das ferramentas do microscópio
View > Menus > Cut Tools
Habilita a visualização da barra de opções e ferramentas de corte
View > Menus > Speed Tools
Habilita a visualização da barra de ferramentas de controle de velocidade
View > Menus > Graphic Tools
Habilita a visualização da barra de ferramentas gráficas
Laser
Page Up
Page Down
Home
End
F9
F11
Laser > Energy/Power more
Aumenta a energia de corte do laser
Laser > Energy/Power less
Diminui a energia de corte do laser
Laser > Focus Up
Aproxima as objetivas da lâmina alterando o foco
Laser > Focus Down
Distancia as objetivas da lâmina alterando o foco
Laser > Energy & Focus (UV-Laser)...
Abre a barra de ferramentas de controle de energia e foco do laser
Laser > Start Laser function
Ativa o laser para executar a função determinada na opção Cut Tools
Outras
Alt + P
Alterna entre a ponteira de seta normal e entre a ponteira de grupo de
referência (quadrado)
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PARTE VII
LIGANDO O SISTEMA
1 – Ligue o estabilizador
2 – Ligue o centro de controle elétrico do microscópio (com várias luzes)
3 – Ligue o computador
4 – Clique no ícone do PALM Robo
COLOCANDO OU RETIRANDO A LÂMINA
1 – Clique no botão “Load Position”
. A Base do microscópio será afastada.
2 – Retire o suporte de lâminas – ele tem 3 espaçoes
3 – Coloque as lâminas nos espaços determinados começando pela parte de cima e ajustando a
pequena porção móvel na parte de baixo para ajustar e fixar a lâmina – pode-se colocar até três
lâminas.
4 – Coloque novamente o suporte de lâminas na posição – Note que só há uma posição correta com
um ângulo reto no canto superior direito
5 – Após encaixar o suporte clique no botão “Point of Origin” (no mesmo local do Load Position com
posição da seta invertida
6 – A Base voltará à posição de visualização e o suporte será automaticamente travado.
COLOCANDO OU RETIRANDO O EPPENDORF
Nota: Se você estiver iniciando o uso do microscópio, ao colocar a lâmina, o microscópio já desloca
automaticamente o suporte do Eppendorf e você pode pular as etapas 1 e 2 a seguir.
1 – Clique no botão Palm Robo Mover –
– isso abrirá a Janela mostrada na página 39
2 – Clique no botão “Load Collector”. O suporte do Eppendorf será movido para o lado
3 – Abra o Eppendorf e encaixe a parte lateral da tampa entre os ganchos do clipe.
4 – Encaixe o corpo do Eppendorf no suporte à direita do clipe – tome cuidado para que o corpo do
eppendorf sempre fique acima da tampa para evitar que ele fique raspando na lâmina o que pode, além
de danificar o tecido, alterar o foco do laser durante o corte.
5 – Aparecerá um aviso na tela do computador, selecione a opção “Use the same collector type”
6 – Selecione a tampa do Eppendorf na Janela da página 39
7 – Clique novamente no botão “Load Collector”. O suporte voltará para a posição de dissecção.
CALIBRANDO A ENERGIA E FOCO DO LASER
Nota: É importante realizar este procedimento a cada vez que você for usar um tecido diferente ou
secções preparadas de alguma outra forma para padronizar a melhor forma de corte.
1 – Após colocar a lâmina e o Eppendorf selecione a lâmina clicando no botão Navigator
2 – Na janela aberta escolha a lâmina clicando em um ponto dela duas vezes – o microscópio se
deslocará para lá
3 – Ajuste o foco nos botões macro e micrométrico à direita do microscópio ou na opção focus nas
ferramentas de controle do microscópio à direita da tela – Nota – procure o foco em aumentos menores
para depois passar para os maiores.
Guia de Utilização do Microscópio e Software para Microdissecção Zeiss / PALM
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4 – Ao encontrar o foco vá para o aumento em que deseja fazer a dissecção – escolha a objetiva no
canto superior direito da tela ao lado do botão do microscópio.
5 – Ajuste o foco da melhor forma possível
6 – Clique no botão “Set Workposition” –
7 – Escolha a ferramenta gráfica “Line”
reta ou não.
8 – Selecione nas opções de corte
– para marcar esta posição.
ou “Freehand”
na barra inferior e desenhe uma linha
a opção “Cut”
9 – Inicie o Laser clicando em
ou
e observe o corte. Pode ter acontecido o seguinte:
A – O corte ficou ideal – não há necessidade de alterar parâmetros
B – O laser passou mas não cortou ou ficou falhado – neste caso há necessidade de otimizar o
corte (ver 10)
C – O laser cortou muito grosso e em algumas áreas destruiu o tecido adjacente, pareceu
estourar – neste caso há necessidade de otimizar o corte (ver 10).
10 – Para otimizar o corte pode-se alterar três parâmetros – Energia, Foco e Velocidade
11 – Na barra de ferramentas do laser escolha na caixa de seleção de cima “Cut” (A outra opção é
LPC) e na barra de ferramentas de controle de velocidade escolha a opção “Cut” (Há várias outras
opções que não devem ser selecionadas neste momento.
12 – Experimente alterar a energia (quanto maior a energia melhor o corte), alterar o foco, ou então
alterar a velocidade de corte (mudando a posição das barras verticais ou o número abaixo delas).
DICA – Para verificar como estão as alterações desenhe outra linha grande, execute o laser novamente
e vá alterando os parâmetros enquanto o laser corta. Pare quando o corte ficar ideal.
13 – Com o corte ideal, é preciso salvar estas configurações. Na barra de Menus vá em Setup
14 – Escolha Save Settings
15 – Salve o arquivo com o nome desejado para as suas configurações de corte.
OBSERVAÇÃO 1 – Ao alterar os parâmetros de energia, foco e velocidade, dê preferência à seguinte
ordem: 1º - ajuste o foco ao mais próximo do ideal (sem foco não há energia que corte!); 2º - ajuste a
velocidade, às vezes uma pequena diminuição da velocidade compensa ao invés de aumentar a energia
e obter artefatos na periferia; 3º - por fim aumenta a energia. Esta ordem de execução não se deve ao
fato de o laser ser gasto pelo excesso de energia, muito pelo contrário, mas pela qualidade da amostra
e do material dissecado evitando artefatos periféricos
OBSERVAÇÃO 2 – o mesmo procedimento de configuração pode ser feito para a catapultagem,
apenas escolhendo as opções LPC no menu de ferramentas do laser (à esquerda) ou de velocidade (à
direita) e a opção RoboLPC nas opções de corte (ver passo 8) para que além do corte ele faça a
catapultagem. Embora às vezes isso seja necessário, geralmente as configurações de corte afetam mais
o processo, em geral a energia pré-determinada para catapultagem já é suficiente, raramente
precisando ser alterada.
DISSECANDO E CATAPULTANDO
1 – Após colocar a lâmina e o Eppendorf selecione a lâmina clicando no botão Navigator
2 – Na janela aberta escolha a lâmina clicando em um ponto dela duas vezes – o microscópio se
deslocará para lá
3 – Ajuste o foco nos botões macro e micrométrico à direita do microscópio ou na opção focus nas
ferramentas de controle do microscópio à direita da tela – Nota – procure o foco em aumentos menores
para depois passar para os maiores.
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4 – Ao encontrar o foco vá para o aumento em que deseja fazer a dissecção – escolha a objetiva no
canto superior direito da tela ao lado do botão do microscópio.
5 – Ajuste o foco da melhor forma possível
6 – Clique no botão “Set Workposition” –
– para marcar esta posição.
7 – Procure a área desejada, utilizando as setas do teclado, as barras de rolagem vertical e horizontal
ou a opção “Stage”
para mover com o mouse a base do microscópio – se escolher o “Stage”, ao
clicar na tela o controle voltará a ser dado somente pelas setas e barras de rolagem.
8 – Escolha a ferramenta gráfica “Line”
, “Freehand”
ou outra de sua preferência para a
tarefa desejada na barra inferior e desenhe os objetos a serem dissecados e catapultados
9 – Selecione nas opções de corte
a opção que melhor se adapta “RoboLPC”
por exemplo – Nesta opção note que seu objeto ficou com uma área de descontinuidade, completada
com outra cor e um ponto (que será o ponto de catapultagem) para detalhes, veja a Parte V deste
manual). Cheque se a janela de fluorescência está aberta e com o Laser definido como ferramenta.
10 – Inicie o Laser clicando em
ou
.
11 – Se você desenhou vários objetos e não quer dissecar todos, pode ir até a lista de objetos
12 – Na lista, clique sobre o objeto que deseja dissecar e repita os passos 9 e 10 a partir da própria
janela da lista de objetos que tem estas opções (ver página 29).
13 – Se o corte não ficou bom, você pode repetir a operação clicando nos botões
ou
14 – No caso da catapultagem não ter sido perfeita ou de ter restado algum ponto de ligação do tecido
dissecado, na barra de ferramentas gráficas escolha o ponto
e desenhe um ponto sobre o local de
união. Então nas opções de corte (ver passo 9) escolha LPC e inicie o Laser (ver passo 10). Você pode
fazer isso também a partir da lista de objetos, selecionando o ponto desenhado e a opção LPC e então
iniciar o Laser.
15 – No caso de o tecido ter sido totalmente cortado mas não catapultado, coloque o tecido dissecado
no foco (por vezes diferente do tecido original, especialmente se ele tiver se deslocado para cima de
outra parte da lâmina), repita o passo 14 com o corte dissecado no foco.
VISUALIZANDO O MATERIAL DISSECADO
1 – Após a dissecção clique no botão “Check-point”
e a base do microscópio será deslocada,
colocando a tampa do eppendorf no campo de visualização. Ao mesmo tempo aparecerá uma janela
mostrada na página 39.
2 – Selecione a tampa do Eppendorf
3 – Selecione a objetiva de 5x
4 – Coloque a imagem no foco
5 – Aumente a objetiva para o tamanho desejado. Para navegar pela tampa do Eppendorf use o botão
de navegação da janela da página 39.
6 – Para voltar clique no botão “Check-point”novamente
DETALHES SOBRE A FLUORESCÊNCIA
Nota: Os passos são semelhantes, vamos destacar aqui apenas as diferenças.
1 – Como a lâmpada de fluorescência tem meia-vida determinada pelo uso, deve-se ligá-la
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separadamente.
2 – Como o feixe de laser passa pelo mesmo ponto do filtro de fluorescência, não é possível utilizar os
dois ao mesmo tempo, portanto, selecione na janela de fluorescência. Se ela estiver fechada clique no
botão
para abrir e nas opções
escolha o filtro.
3 – Escolha o campo desejado e clique no botão “Freeze”
. A seguir, desenhe a área desejada e
mude na opção de fluorescência para Laser
, clique novamente no “Freeze” e proceda a
dissecção normalmente.
DESLIGANDO O SISTEMA
1 – Feche o Software PALM Robo
2 – Deslique o Computador
3 – Desligue o centro de controle elétrico do microscópio (com várias luzes)
4 – Deigue o estabilizador
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PARTE VIII
Em caso de dúvidas, problemas ou parainformações avançadas, contate:
Prof. Dr. Chin Jia Lin
Fone:
E-mail:
Dr. Luiz Fernando Ferraz da Silva
Fone: (11) 9989-8575
E-mail: [email protected]
Profa. Dra. Thais Mauad
Fone: (11) 3066-7173
E-mail: [email protected]
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