Universidade Federal de Goiás
Faculdade de Farmácia
RODRIGO BORGES DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES
ANTINOCICEPTIVA, ANTIINFLAMATÓRIA E
DEPRESSORA DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
DAS FOLHAS DO Synadenium umbellatum PAX.
(COLA-NOTA)
Goiânia
2007
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RODRIGO BORGES DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES
ANTINOCICEPTIVA, ANTIINFLAMATÓRIA E
DEPRESSORA DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
DAS FOLHAS DO Synadenium umbellatum PAX.
(COLA-NOTA)
Dissertação apresentada no Curso de Mestrado
em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal de Goiás,
como requisito parcial para a obtenção do
Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Área
de
concentração:
Fármacos
Medicamentos
Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos da Cunha
Co-Orientador: Prof. Dr. Elson Alves Costa
Goiânia
2007
e
Aos meus pais, Onofre e Silvia, pela
amizade,
dedicação,
incentivo,
apoio,
companheirismo,
paciência e confiança.
carinho,
amor,
compreensão,
AGRADECIMENTOS
•
Ao meu orientador, Prof. Dr. Luiz Carlos da Cunha, e ao meu co-orientador,
Prof. Dr. Elson Alves Costa, por toda ajuda e conhecimento dados a mim e
pela paciência em me atender quando precisei.
•
A todos os colegas de laboratório, tanto do NEPET (núcleo de estudos e
pesquisas tóxico-farmacológicas) quando do Laboratório de Farmacologia de
Produtos Naturais.
•
Ao aluno de iniciação científica Marcus Vinícius Mariano Nascimento, por toda
a ajuda técnica durante a realização dos experimentos.
•
A todos os colegas do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás,
pela amizade, companheirismo, apoio e incentivo recebido.
•
À Universidade Federal de Goiás, pela bolsa concedida durante a realização
deste trabalho.
•
Aos técnicos do NEPET e do Laboratório de Farmacologia de Produtos
Naturais, por toda ajuda e aprendizado técnico.
•
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás,
que de alguma forma puderam contribuir para a realização deste trabalho.
“Isto não é farmacologia. Isto é arte.”
Paul Schimmel
RESUMO
O Synadenium umbellatum Pax. (Euphorbiacea), conhecido como “cola-nota”,
“avelós”, “cancerola”, “milagrosa”, etc. é uma planta utilizada pela população
Brasileira para o tratamento da inflamação, da dor, dentre outros. O extrato etanólico
das folhas de Synadenium umbellatum (EES) e suas frações - frações hexânica
(FH), clorofórmica (FC) e metanol/água (FM) - foram testados para confirmar o seu
uso popular como analgésico e antiinflamatório e, também, baseado em
observações comportamentais, foi feito um estudo da atividade depressora do
sistema nervoso central (SNC). Para tal, vários modelos foram utilizados, dentre
eles, o de contorção abdominal induzida por ácido acético, dor induzida pela
formalina, influência do tratamento com naloxona, teste do tail flick, edema de orelha
induzido por óleo de cróton, peritonite induzido por carragenina, teste do rota-rod,
campo aberto e sono induzido por barbitúrico. O EES foi testado, pela via oral, nas
doses de 25, 50 e 100 mg/kg, enquanto que a FH foi testada na dose de 10 mg/kg, a
FC na dose de 20 mg/kg e a FM nas doses de 6, 12 e 25 mg/kg. O EES e a FM
foram capazes de inibir o número contorções abdominais induzidas por ácido
acético, mas não as frações FC e FH. O EES foi capaz de inibir ambas as fases da
dor induzida pela formalina, além de ter revertido o efeito do tratamento com a
naloxona, porém não foi capaz de prolongar o tempo de latência dos camundongos
frente a um estímulo térmico. Esses resultados mostram que o EES possui atividade
antinociceptiva e ainda sugerem que a ação do mesmo é no sistema opioidérgico
periférico, ou como um agonista ou por induzir a liberação de peptídeos opióides
periféricos. O EES e a FM possuem atividade antiinflamatória visto por suas
capacidades de reduzir o edema de orelha induzido por óleo de cróton e o número
de leucócitos totais migrados para a cavidade intraperitoneal. O EES e as frações
FH e FC, mas não a FM, apresentaram um possível efeito depressor do SNC visto
que foram capazes de aumentar o tempo parado e diminuir o número de bolos fecais
no teste do campo aberto, além de potencializarem o sono induzido por barbitúrico.
O teste do rota-rod mostrou que o EES e as frações não foram capazes de causar
incoordenação motora ou relaxamento muscular. Nossos resultados mostram que,
através do fracionamento do EES, os efeitos analgésicos e antiinflamatórios foram
separados do possível efeito depressor do SNC, visto que o primeiro foi encontrado
na FM enquanto o segundo foi encontrado nas frações FH e FC. O isolamento dos
componentes do extrato é uma etapa a ser feita no futuro, visando separar ainda
mais os efeitos e identificar os princípios ativos responsáveis pelos mesmos, além
de permitir o estudo dos mecanismos de ação envolvidos nas atividades
antinociceptiva, antiinflamatória e depressora do sistema nervoso central das folhas
do Synadenium umbellatum.
ABSTRACT
Synadenium umbellatum Pax. (Euphorbiacea), known as “cola-nota”, “avelós”,
“cancerola”, “milagrosa”, etc. is a plant used by Brazilian folks for the treatment of
inflammation, pain, among others. The ethanolic extract of the leaves of Synadenium
umbellatum (EES) and its fractions – hexane (HF), chloroformic (CF) and
methanol/water fractions (MF) – were tested due to confirm its popular use as
analgesic and antiinflammary and, also, based on behavioral observations, a study of
the depressor activity over the central nervous system (CNS) was taken. For such,
several models were used, among them, the acetic acid-induced writhing, formalininduced pain, naloxone treatment influence, tail flick test, croton oil-induced mouse
ear edema, carraginin-induced peritonits, rota-rod test, open field and barbiturateinduced sleep. The EES was tested in the oral doses of 25, 50 and 100 mg/kg, while
the HF was tested in the dose of 10 mg/kg, the CF in the dose of 20 mg/kg and the
MF in the doses of 6, 12 and 25 mg/kg. The EES and the MF were able to inhibit the
number of acetic acid-induced writhing, but not the CF and HF fractions. The EES
was able to inhibit both phases of the formalin-induced pain, besides having reverted
the naloxone treatment effect, but it wasn’t able to prolong mice latency time when
getting thermal stimuli. These results show that EES has an antinociceptive activity
and also suggests that its action is in the peripheral opioidergic system, as an agonist
or by inducing the release of peripheral opioid peptides. The EES and the MF have
demonstrated an antiinflammatory activity, due to their capacities of reducing the
croton oil-induced ear edema and the number of total leukocytes migrated into the
peritoneal cavity. The EES and the HF and CF fractions, but not the MF, have
presented a possible depressor effect over the CNS once they were able to increase
the stopped time and the number of fecal balls on the open field test, besides they
were able to potencialize the barbiturate-induced sleep. The rota-rod test showed
that the EES and the fractions weren’t able to cause motor incoordination or muscle
relaxing. Our results show that, through the EES fractionment, the antinociceptive
and antiinflammatory effects were separated from the possible depressor effect over
the CNS, once the first one was demonstrated in MF and the second one was
demonstrated in HF and CF fractions. The isolation of the compounds in the extract
is a next step to be done in the future, due to separate still more the effects and
identify the active substances responsible for them, besides allowing the study of the
action mechanisms involved in the antinociceptive, antiinflamatory and CNS
depressor activities of the leaves of Synadenium umbellatum.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Fotografia da árvore do Synadenium umbellatum Pax. (cola-nota)
no bairro Feliz, em Goiânia – GO. Foto tirada pelo Prof. Dr. Luiz
Carlos da Cunha em novembro de 2005...........................................
36
Fluxograma do procedimento geral para a extração de clorofila e
fracionamento do extrato etanólico das folhas de S.
umbellatum.........................................................................................
44
Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em
salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente
tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (grupo controle; C), com
o extrato etanólico das folhas do S. umbellatum (EES; 25, 50 ou
100 mg/kg) ou com indometacina (INDO; 10 mg/kg). As colunas e
barras verticais representam as médias ± EPM de 6 animais por
grupo experimental.............................................................................
51
Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em
salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente
tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C), com as frações
hexânica (FH, 10 mg/kg), clorofórmica (FC, 20 mg/kg) e
metanol/água (FM, 25 mg/kg) ou com indometacina (INDO; 10
mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ±
EPM de 6 animais por grupo experimental........................................
52
Porcentagem de inibição das contorções abdominais induzidas
pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina, i.p.) durante 30 minutos
em camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
EES (■) 25, 50 ou 100 mg/kg. Os símbolos e barras verticais
representam as médias ± DP de 6 animais por grupo
experimental.......................................................................................
53
Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na
pata posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 –
5 min) do teste da formalina, previamente tratados (60 min) pela
via p.o. com veículo (grupo controle, C; n = 10), com o EES (100
mg/kg, n = 10), com morfina (MOR; 10 mg/kg s.c., n = 6) ou com
indometacina (INDO; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras
verticais representam as médias ± EPM............................................
55
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na
pata posterior direita de camundongos, durante a segunda fase (15
– 30 min) do teste da formalina, previamente tratados (60 min) pela
via p.o. com veículo (grupo controle, C; n = 10), com o EES (100
mg/kg, n = 10), com morfina (MOR; 10 mg/kg s.c., n = 6) ou com
indometacina (INDO; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras
verticais representam as médias ± EPM............................................
56
Influência do tratamento prévio com o antagonista opióide não
seletivo naloxona (3 mg/kg, s.c.) sobre a atividade antinociceptiva
do EES (100 mg/kg, p.o.) e fentanil (100 µg/kg, s.c.) no modelo de
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. As colunas e
barras verticais representam a média ± EPM de 6 animais por
grupo experimental.............................................................................
57
Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do tail
flick em camundongos antes e após tratamento com o (●) veículo
p.o., com EES (■ 25, ▼50 ou ▲100 mg/kg, p.o.) ou morfina (♦ 10
mg/kg, s.c.). Nas ordenadas estão representados os tempos de
latência dos camundongos ao estímulo térmico nociceptivo, em
segundos. Os símbolos e barras verticais representam as médias ±
EPM de 6 animais por grupo experimental........................................
58
Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em
acetona) nos grupos previamente tratados pela via p.o. com
veículo (C; n = 7), com extrato etanólico de S. umbellatum (EES
25, 50 ou 100 mg/kg, n = 7) ou com dexametasona (DEXA; 2
mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam a média ±
EPM....................................................................................................
60
Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em
acetona) nos grupos previamente tratados pela via p.o. com
veículo (C; n = 7), com fração metanol/água (FM 6, 12 ou 25
mg/kg, n = 8, 8 e 7 respectivamente) ou com dexametasona
(DEXA; 2 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam
a média ± EPM...................................................................................
61
Migração de leucócitos totais no modelo de peritonite induzida por
carragenina (1% m/v) injetada na cavidade intraperitoneal de
camundongos previamente tratados pela via p.o. com veículo (C; n
= 10), com extrato etanólico de S. umbellatum (EES 25, 50 ou 100
mg/kg, n = 8, 9 e 8 respectivamente) ou dexametasona (DEXA; 2
mg/kg, n = 8). As colunas e barras verticais representam a média ±
EPM....................................................................................................
62
Figura 13
Número de quedas, no rota-rod, de camundongos previamente
tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C), com o extrato
etanólico das folhas do S. umbellatum (EES; 25, 50 ou 100 mg/kg)
ou com diazepam (DZP; 5 mg/kg). As colunas e barras verticais
representam as médias ± EPM de 7 animais por grupo
experimental.......................................................................................
65
Figura 14 - Número de quedas, no rota-rod, de camundongos previamente
tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C), com as frações
hexânica (FH, 10 mg/kg), clorofórmica (FC, 20 mg/kg),
metanol/água (FM, 25 mg/kg) ou com diazepam (DZP; 5 mg/kg).
As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 7
animais por grupo experimental.........................................................
66
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Tempo de permanência, no rota-rod, em segundos, de
camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
veículo (C), com o extrato etanólico das folhas do S. umbellatum
(EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) ou com diazepam (DZP; 5 mg/kg). As
colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 7
animais por grupo experimental.........................................................
67
Tempo de permanência, no rota-rod, em segundos, de
camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
veículo (C), com as frações hexânica (FH, 10 mg/kg), clorofórmica
(FC, 20 mg/kg), metanol/água (FM, 25 mg/kg) ou com diazepam
(DZP; 5 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as
médias ± EPM de 7 animais por grupo experimental.........................
68
Tempo parado, em segundos, no teste do campo aberto, de
camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
veículo (C), com o extrato etanólico das folhas do S. umbellatum
(EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) ou com diazepam (DZP; 5 mg/kg). As
colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 8
animais por grupo experimental.........................................................
69
Tempo parado, em segundos, no teste do campo aberto, de
camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
veículo (C), com as frações hexânica (FH, 10 mg/kg), clorofórmica
(FC, 20 mg/kg), metanol/água (FM, 25 mg/kg) ou com diazepam
(DZP; 5 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as
médias ± EPM de 8 animais por grupo experimental.........................
70
Número de bolos fecais, no teste do campo aberto, deixados por
camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
veículo (C), com o extrato etanólico das folhas do S. umbellatum
(EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) ou com diazepam (DZP; 5 mg/kg). As
colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 8
animais por grupo experimental.........................................................
71
Figura 20
Figura 21
Figura 22
Número de bolos fecais, no teste do campo aberto, deixados por
camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
veículo (C), com as frações hexânica (FH, 10 mg/kg), clorofórmica
(FC, 20 mg/kg), metanol/água (FM, 25 mg/kg) ou com diazepam
(DZP; 5 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as
médias ± EPM de 8 animais por grupo experimental.........................
72
Tempo de recuperação do reflexo postural (duração do sono), em
minutos, no teste de potenciação do sono induzido por barbitúrico,
em camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
veículo (C; n=6), com o extrato etanólico das folhas do S.
umbellatum (EES; 25, 50 ou 100 mg/kg, n=8) ou diazepam (DZP; 5
mg/kg, n=6). As colunas e barras verticais representam as médias
± EPM.................................................................................................
73
Tempo de recuperação do reflexo postural (duração do sono), em
minutos, no teste de potenciação de sono induzido por barbitúrico,
em camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
veículo (C; n = 6), com as frações hexânica (FH, 10 mg/kg, n = 8),
clorofórmica (FC, 20 mg/kg, n = 7), metanol/água (FM, 25 mg/kg, n
= 7) ou diazepam (DZP; 5 mg/kg, n = 6). As colunas e barras
verticais representam as médias ± EPM............................................
74
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em
salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente
tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (grupo controle; C), com
o extrato etanólico das folhas do S. umbellatum (EES; 25, 50 ou
100 mg/kg) (A), com as frações hexânica (FH, 10 mg/kg),
clorofórmica (FC, 20 mg/kg) e metanol/água (FM, 25 mg/kg) (B) ou
com indometacina (INDO; 10 mg/kg)................................................. 121
Tabela 2
Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na
pata posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 –
5 min) (A) e segunda fase (15 – 30 min) (B) do teste da formalina,
previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (grupo
controle, C), com o EES (100 mg/kg), com morfina (MOR; 10
mg/kg s.c.) ou com indometacina (INDO; 10 mg/kg)......................... 122
Tabela 3
Influência do tratamento prévio com o antagonista opióide não
seletivo naloxona (3 mg/kg, s.c.) sobre a atividade antinociceptiva
do EES (100 mg/kg, p.o.) e fentanil (100 µg/kg, s.c.) no modelo de
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético........................ 124
Tabela 4
Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do tail
flick em camundongos antes e após tratamento por via p.o. com o
veículo (A), com EES 25 (B), 50 (C) ou 100 (D) mg/kg, ou morfina
(E) (10 mg/kg, s.c.)............................................................................. 125
Tabela 5
Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em
acetona) nos grupos previamente tratados pela via p.o. com
veículo (C), com extrato etanólico de S. umbellatum (EES 25, 50
ou 100 mg/kg) (A), com fração metanol/água (FM 6, 12 ou 25
mg/kg) (B) ou com dexametasona (DEXA; 2 mg/kg)......................... 127
Tabela 6
Migração de leucócitos totais no modelo de peritonite induzida por
carragenina (1% m/v) injetada na cavidade intraperitoneal de
camundongos previamente tratados pela via p.o. com veículo (C),
com extrato etanólico de S. umbellatum (EES 25, 50 ou 100 mg/kg)
ou dexametasona (DEXA; 2 mg/kg)................................................... 128
Tabela 7
Número de quedas (A) e tempo de permanência (B) no rota-rod,
de camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
veículo (C), com o extrato etanólico das folhas do S. umbellatum
(EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) (1) com as frações hexânica (FH, 10
mg/kg), clorofórmica (FC, 20 mg/kg), metanol/água (FM, 25 mg/kg)
(2) ou com diazepam (DZP; 5 mg/kg)................................................ 129
Tabela 8
Número de quadrados invadidos, tempo parado (segundos),
número de levantadas, número de auto-limpeza e número de bolos
fecais no campo aberto 60 minutos após o tratamento p.o. com
veículo (C) (A), extrato etanólico de S. umbellatum (EES 25 (B), 50
(C) ou 100 mg/kg (D)), FH (10 mg/kg) (E), FC (20 mg/kg) (F), FM
(25
mg/kg)
(G)
ou
diazepam
(DZP,
5
mg/kg)
(H)...................................................................................................... 131
Tabela 9
Tempo de recuperação do reflexo postural (duração do sono), em
minutos, no teste de potenciação do sono induzido por barbitúrico,
em camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
veículo (C), com o extrato etanólico das folhas do S. umbellatum
(EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) (A), com as frações hexânica (FH, 10
mg/kg), clorofórmica (FC, 20 mg/kg), metanol/água (FM, 25 mg/kg)
(B) ou diazepam (DZP; 5 mg/kg)....................................................... 135
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-HT
5-hidroxitriptamina
5-HT1
5-hidroxitriptamina 1
5-HT2
5-hidroxitriptamina 2
5-HT3
5-hidroxitriptamina 3
5-HT4
5-hidroxitriptamina 4
5-HT7
5-hidroxitriptamina 7
5-LOX
5-Lipoxigenase
AA
Ácido araquidônico
AINE(S)
Antiinflamatório(s) não-esteroidal(is)
AMPc
3’5’-adenosina-monofosfato cíclico
ANOVA
Análise de variância
C
Controle (Veículo)
CGRP
Peptídeo relacionado ao gene de calcitocina
COX
Cicloxigenase
COX-1
Cicloxigenase-1
COX-2
Cicloxigenase-2
CRF
Fator liberador de corticotrofina
DEXA
Dexametasona
DI50
Dose inibitória mediana
DNAc
Ácido desoxirribonucléico complementar
DP
Desvio padrão
DZP
Diazepam
EES
Extrato etanólico de Synadenium umbellatum
eNOS
Óxido nítrico sintase endotelial
EPM
Erro padrão da média
FC
Fração clorofórmica
FH
Fração hexânica
FM
Fração metanol/água
g
Grama(s)
GABA
Ácido gama aminobutírico
GABAA
Ácido gama aminobutírico A
GABAB
Ácido gama aminobutírico B
GABAB
Ácido gama aminobutírico C
GMPc
Monofosfato cíclico de guanosina
GPCR
Receptor acoplado a proteína G
h
Hora(s)
HETE
Ácido hidroeicosatetraenóico
HPA
Hipotálamo-hipófise-adrenal
i.p.
Via intraperitoneal
IB4
Isolectina 4
IFN-γ
Interferon-γ
IL-1
Interleucina 1
IL-1β
Interneucina 1β
IL-8
Interleucina 8
INDO
Indometacina
iNOS
Óxido nítrico sintase induzível
IQUEGO
Indústria Química do Estado de Goiás
kg
Kilograma(s)
L
Litro(s)
LOX
Lipoxigenase
LPS
Lipopolissacarídeo
LT
Leucotrieno
LTB4
Leucotrieno B4
m/v
Massa/volume
MAO
Monoaminaoxidase
mg
Miligrama(s)
min
Minuto(s)
mL
Mililitro(s)
mm
Milímetro(s)
MOR
Morfina
NADPH
Forma
reduzida
do
fosfato
dinucleotídeo
NMDA
N-metil-d-aspartato
nNOS
Óxido nítrico sintase neuronal
NO
Óxido nítrico (nitric oxide)
de
nicotinamida
adenina
NOS
Óxido nítrico sintase
P.A.
Padrão analítico
p.o.
Via oral
PAF
Fator de agregação plaquetária
PBS
PG
Solução salina tamponada (Phosphate Buffered Saline)
Prostaglandina
PGD2
Prostaglandina D2
PGE2
Prostaglandina E2
PGF2α
Prostaglandina F2α
PGG2
Prostaglandina G2
PGH2
Prostaglandina H2
PGI2
Prostaglandina I2
pH
Potencial hidrogeniônico
PL
Fosfolipase
PLA2
Fosfolipase A2
RIP
Proteína inativadora de ribossomos
RNAm
Ácido ribonucléico mensageiro
s
Segundo(s)
S. umbellatum
Synadenium umbellatum
s.c.
Via subcutânea
SNC
Sistema nervoso central
SP
Substância P
TNF
Fator de necrose tumoral
TNF-α
Fator de necrose tumoral α
TRPV1
Receptor vanilóide de potencial transitório 1
UFG
Universidade Federal de Goiás
UI
Unidades internacionais
v/v
Volume/volume
µg
Micrograma(s)
µL
Microlitro(s)
SUMÁRIO
RESUMO.....................................................................................................................6
ABSTRACT .................................................................................................................7
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................8
LISTA DE TABELAS .................................................................................................12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ....................................................................14
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................19
1.1. Fisiopatologia da dor.......................................................................................19
1.2. Fisiopatologia da inflamação ..........................................................................23
1.3. Fisiopatologia da depressão do sistema nervoso central ...............................30
1.4. Os produtos naturais e o Synadenium umbellatum ........................................33
2. OBJETIVOS ..........................................................................................................38
3. MATERIAIS ...........................................................................................................40
3.1. MATERIAL BOTÂNICO ..................................................................................40
3.1.1. Coleta, identificação e herborização da planta.........................................40
3.2. MATERIAL QUÍMICO .....................................................................................40
3.2.1. Extrato, frações e medicamentos .............................................................40
3.2.2. Reagentes................................................................................................40
3.3. ANIMAIS .........................................................................................................41
4. MÉTODOS ............................................................................................................43
4.1. MÉTODOS FITOQUÍMICOS ..........................................................................43
4.1.1.Preparação do extrato etanólico ...............................................................43
4.1.2. Eliminação de clorofila e fracionamento do extrato etanólico...................43
4.2. MÉTODOS FARMACOLÓGICOS...................................................................45
4.2.1. Atividade antinociceptiva..........................................................................45
4.2.1.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético .........................45
4.2.1.2. Dor induzida pela formalina ...............................................................45
4.2.1.3. Influência do tratamento com naloxona .............................................46
4.2.1.4. Teste do tail flick ................................................................................46
4.2.2. Atividade antiinflamatória .........................................................................46
4.2.2.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton ...................................46
4.2.2.2. Peritonite induzida por carragenina ...................................................47
4.2.3. Atividade no sistema nervoso central.......................................................47
4.2.3.1. Teste do rota-rod ...............................................................................47
4.2.3.2. Teste do campo aberto ......................................................................47
4.2.3.3. Potenciação do sono por barbitúrico .................................................48
4.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................48
5. RESULTADOS ......................................................................................................50
5.1. RESULTADOS FITOQUÍMICOS ....................................................................50
5.1.1.Preparação do extrato etanólico ...............................................................50
5.1.2. Eliminação de clorofila e fracionamento do extrato etanólico...................50
5.2. RESULTADOS FARMACOLÓGICOS ............................................................50
5.2.1. Atividade antinociceptiva..........................................................................50
5.2.1.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético .........................50
5.2.1.2 Dor induzida pela formalina ................................................................54
5.2.1.3. Influência do tratamento com naloxona .............................................54
5.2.1.4. Teste do tail flick ................................................................................58
5.2.2. Atividade antiinflamatória .........................................................................59
5..2.2.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton ..................................59
5.2.2.2. Peritonite induzida por carragenina ...................................................59
5.2.3. Atividade no sistema nervoso central.......................................................63
5.2.3.1. Teste do rota-rod ...............................................................................63
5.2.3.2. Teste do campo aberto ......................................................................63
5.2.3.3. Potenciação do sono induzido por barbitúrico ...................................64
6. DISCUSSÃO .........................................................................................................76
7. CONCLUSÕES .....................................................................................................94
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................96
APÊNDICE ..........................................................................................................121
Introdução
19
1. INTRODUÇÃO
1.1. Fisiopatologia da dor
A dor é uma experiência complexa que envolve não somente a transdução da
informação gerada pelo estímulo nocivo, mas também o processamento cognitivo e
emocional pelo cérebro (JULIUS e BASBAUM, 2001). A natureza altamente
subjetiva da dor é um dos fatores que dificulta a sua definição e o seu tratamento
clínico. Segundo a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP, 1994), a
dor é uma experiência sensorial e emocional associada com potenciais ou reais
lesões, tem uma conotação individual e sofre influência de experiências anteriores. A
dor pode ser classificada como neurogênica, nociceptiva, neuropática ou
psicogênica, quando associada a lesão do tecido neuronal na periferia ou em nível
central, estimulação excessiva dos nociceptores, disfunção/dano de um ou mais
nervo, e a fatores psicológicos, respectivamente (MILLAN, 1999). Woolf e Salter
(2000) já classificam a dor em fisiológica (quando há a ativação direta dos
nociceptores), neuropática (provocada por lesões de células do sistema nervoso
central) e inflamatória (provocada por danos teciduais). Em termos de duração, a dor
pode ser aguda ou crônica. A dor aguda está associada com uma lesão tecidual
recente, ativação de nociceptores e pode desaparecer até mesmo antes da cura do
dano tecidual (CARR e GOUDAS, 1999; PARK e VASKO, 2005). Por outro lado, a
dor crônica pode se perpetuar por meses ou anos, e se caracteriza em relação à
persistência e alterações adaptativas, o que muitas vezes dificulta o tratamento
(IADAROLA e CAUDLE, 1997; BESSON, 1999).
É importante a diferenciação dos termos nocicepção e dor. Nocicepção
refere-se às manifestações neurofisiológicas geradas por um estímulo nocivo,
enquanto a dor envolve a percepção de um estímulo aversivo, a qual requer a
capacidade de abstração e elaboração de impulsos sensoriais. Além disso, a dor
não é, obrigatoriamente, proporcional ao grau da lesão (ALMEIDA et al., 2004;
SNEDON, 2004). É importante salientar que sempre que qualquer tecido estiver
lesado, o organismo reage para desencadear o estímulo doloroso como um
mecanismo de proteção (CHENG et al., 2002; MILLAN, 1999, 2002; GUYTON e
HALL, 2005). Contudo, frequentemente a dor se torna crônica e debilitante em
substituição à sua função de atuar como um sistema de aviso. A transição para a
fase crônica envolve mudanças na medula espinhal e encéfalo, mas ocorre
20
modulação significativa nos locais onde as mensagens da dor são iniciadas no nível
do neurônio sensorial aferente primário (JULIUS e BASBAUM, 2001).
Os nociceptores, que são responsáveis pela percepção do estímulo nocivo,
estão amplamente distribuídos no nosso organismo. Nociceptores são terminações
periféricas de neurônios sensitivos primários cujos corpos celulares estão
localizados nos gânglios da raiz dorsal ou nos gânglios trigêmeos. São distribuídos
em três classes principais: nociceptores térmicos (ativados por temperaturas ≥ a 45
ºC ou ≤ 15 ºC), mecânicos (ativados por pressão intensa, localizados principalmente
na pele) e polimodais (ativados por estímulos mecânicos, químicos ou térmicos de
alta intensidade). Quando estimulados devidamente, os nociceptores são ativados,
gerando potenciais de ação que se propagam através das fibras nervosas aferentes.
A sensibilização dos nociceptores causa uma redução do seu limiar de ativação e,
em alguns casos, atividade espontânea. As fibras nervosas são classificadas, de
acordo com seu diâmetro, estrutura e velocidade de condução em do tipo Aα, com
maior diâmetro (12 – 22 µm), velocidade de condução rápida (70 – 120 m/s) e
fortemente mielinizadas; do tipo Aβ, também com grande diâmetro (> 10 µm),
velocidade de condução rápida (30 – 100 m/s) e fortemente mielinizadas; fibras do
tipo Aδ, com diâmetro intermediário (2 – 6 µm), velocidade de condução moderada
(12 – 30 m/s) e fracamente mielinizadas; e as do tipo C com menor diâmetro (0,4 –
1,2 µm), velocidade de condução lenta (0,5 – 2 m/s) e não mielinizadas. O potencial
de ação é conduzido por estas fibras nervosas até atingir os tratos espinotalâmicos,
espinorreticular
e
espinomesencefálico,
transmitindo
para
estas
regiões
a
informação nociceptiva. Após o processamento central da dor, estes estímulos são
retransmitidos para fibras descendentes de origem cortical ou medular (GRUBB,
1998; CARR e GOUDAS, 1999; MILLAN, 1999; ALMEIDA et al., 2004; DJOUHRI et
al., 2004).
Algumas alterações na resposta normal podem ocorrer, como, por exemplo, o
aumento da resposta a um estímulo normalmente doloroso, o qual é denominado
hiperalgesia (JULIUS e BASBAUM, 2001; BASBAUM e JESSEL, 2003). Esta
resposta exagerada normalmente é decorrente de importantes mudanças no
processo central de sensibilização da dor. Outras alterações sensoriais também
podem aparecer, entre elas, a alodinia que se refere à dor evocada por estímulo
21
inócuo (MILLAN, 1999). A hiperalgesia e a alodinia podem ter duas origens
diferentes:
responsividade
aumentada
dos
neurônios
da
medula
espinhal
responsáveis pela transmissão da dor (sensibilização central), ou diminuição do
limiar de ativação do nociceptor (sensibilização periférica). Com a sensibilização
central, a dor pode ser produzida pela ativação de fibras sensoriais primárias não
nociceptivas. Sensibilização periférica ocorre quando a terminação do nociceptor é
exposta a produtos do dano tecidual ou inflamação.
A bradicinina, a prostaglandina E2 (PGE2), o fator de crescimento nervoso e
as interleucinas pró-inflamatórias parecem exercer papel fundamental na nocicepção
periférica. A prostaglandina e a bradicinina causam alterações em receptores
valinóides de potencial transitório tipo 1 (TRPV1) acoplados a canais iônicos
dependentes de ligantes via ativação de 3’5’-adenosina-monofosfato cíclico (AMPc),
e das proteinoquinases A e C, reduzindo o tempo de pós-hiperpolarização da
membrana neural, causando, então, redução do limiar para disparo da fibra nervosa
(CHUANG et al., 2001).
O organismo humano produz moléculas que são capazes de modular a dor:
os peptídeos opióides. A primeira evidência direta de que opióides endógenos, a
exemplo de analgésicos opióides, modulam a dor em humanos foi dada pelo estudo
de Levine et al. (1978), os quais usaram um modelo de dor pós-cirúrgica dentária
para avaliar a analgesia mediada por opióides. Amplamente distribuídos no cérebro,
os mediadores opióides mais conhecidos são a β-endorfina, a metioninaencefalina, a
leucina-encefalina, a dinorfina e as endomorfinas. Os peptídeos opióides são
também produzidos por muitas células não neuronais, incluindo as glândulas
endócrinas e exócrinas e as células do sistema imune.
Os receptores opióides pertencem à superfamília de receptores acoplados a
proteínas G (GPCR), com o domínio N-terminal extracelular, sete domínios
transmembranares conectados por três alças intracelulares e três extracelulares, e o
domínio C-terminal intracelular. Têm cerca de 60% de identidade entre si, com maior
homologia nas hélices transmembranares e maior diferença nas porções N- e Cterminais bem como nas alças extracelulares. Os receptores opióides são ativados
tanto por peptídeos opióides produzidos endogenamente quanto por várias drogas
opióides naturais, semi-sintéticas ou sintéticas (WALDHOER et al., 2004). Há quatro
22
subtipos de receptores opióides, cada um com seu próprio grupo de ligantes: 1) mu,
µ ou MOP-R; 2) kappa, κ ou KOP-R; 3) delta, δ ou DOP-R; e 4) o receptor para
orfanina FQ/nociceptina ou NOP-R (FOORD, 2005). Existe um consenso de que os
opióides medeiam seus efeitos analgésicos através da ativação de receptores
específicos localizados a nível espinhal, supraespinhal e periférico.
A ativação desses receptores está relacionada primariamente a 3 eventos
básicos: redução dos níveis de AMPc pela inibição da adenilato ciclase, bloqueio de
canais de Ca+2 voltagem-dependente e aumento da corrente retificadora de K+. Com
a diminuição do AMPc e da disponibilidade de Ca+2 intracelular, a analgesia
produzida pelos opióides resulta da redução da liberação de neurotransmissores
excitatórios como o glutamato e a substância P (SP) em fibras nociceptivas
aferentes primárias (HARRISSON et al., 1998; JORDAN e DAVI, 1998; GRUBB,
1998; LAW e LOH, 1999). Estudos de co-localização têm confirmado a presença de
receptores opióides em fibras C e A (PARE et al., 2001), em fibras viscerais positivas
para TRPV1 (POONYACHOTI et al., 2002) e em neurônios que expressam isolectina
B4 (IB4), SP ou peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP) (MINAMI et al.,
1995; WENK et al., 1999; BORGLAND et al., 2001). Opióides endógenos ou
exógenos atenuam a excitabilidade de nociceptores periféricos, a propagação de
potenciais de ação, a liberação de peptídeos pró-inflamatórios (SP, CGRP) de
terminais sensoriais periféricos e a vasodilatação evocada pela estimulação de
fibras-C. Todos esses mecanismos, em conjunto, resultam em analgesia e ações
antiinflamatórias (STEIN et al., 2003).
Tradicionalmente, os agonistas opióides exercem efeitos analgésicos através
de ação no sistema nervoso central, como ocorre com a morfina (HERZ e
TESCHEMACHER, 1971; MILLAN, 1986). Por outro lado, com a utilização de
análogos quaternários dos alcalóides da morfina, como a N-metilmorfina, propõe-se
que estes agentes, por apresentarem uma mínima capacidade de transpor a barreira
hematoencefálica, exercem o efeito analgésico através da atuação em receptores
opióides
presentes
nas
terminações
nervosas
periféricas
(FERREIRA
e
NAKAMURA, 1979a,b,c; FERREIRA et al., 1982; SMITH et al., 1982; STEIN, 1993;
ANTONIJEVIC et al., 1995). Entretanto, ainda não se desenvolveu ou se isolou uma
23
droga que, administrada por via oral e com mecanismo de ação exclusivamente
periférico, apresente eficácia na terapêutica analgésica.
1.2. Fisiopatologia da inflamação
A resposta inflamatória é um mecanismo benéfico e fisiológico pelo qual o
organismo se defende contra infecções e tenta reparar danos teciduais ou perda de
função (LAWRENCE et al., 2002). Assim, o processo inflamatório agudo pode ser
definido como um conjunto de alterações bioquímicas e celulares que ocorrem em
resposta a estímulos inespecíficos, tais como infecções ou danos teciduais
(HANSSON, 2005). As reações inflamatórias locais são caracterizadas por aumento
do fluxo sangüíneo e da permeabilidade vascular, seguida de dilatação vascular e
acúmulo de células do processo inflamatório, caracterizando os quatro sinais típicos
da presença de inflamação: rubor (hiperemia), tumor (edema), calor (aumento da
temperatura local) e dor, como descritas por Cornelius Celsus, no início da era Cristã
(GILROY et al., 2004). O quinto sinal da inflamação, que é a perda da função do
tecido ou órgão lesado, associado com reações crônicas foi descrito por VIRCHOW
no século XIX (KALISCH, 1975).
Os componentes básicos de um processo inflamatório envolvem eventos
vasculares e celulares, mediadores derivados de células e da ativação plasmática,
que produzem os sinais clássicos da inflamação descritos anteriormente. As
alterações vasculares iniciam-se imediatamente e desenvolvem-se durante as
primeiras horas após o estímulo inflamatório. Elas consistem em vasodilatação,
aumento do fluxo sangüíneo, aumento da permeabilidade vascular e exsudação
plasmática (WILLIAMS et al., 1983). Em condições normais a microcirculação
apresenta baixíssima permeabilidade a macromoléculas. As proteínas plasmáticas
circulam muito lentamente entre o sangue e os tecidos e retornam ao sangue
através dos vasos linfáticos. Esta situação muda muitíssimo durante o processo
inflamatório. A microcirculação torna-se permeável a macromoléculas e fluidos
vindos do sangue, causando edema tecidual (GILROY et al., 2004).
O processo inflamatório pode ser desencadeado por inúmeros estímulos, tais
como agentes infecciosos, interação antígeno-anticorpo, traumas químicos,
mecânicos ou térmicos, isquemia, dentre outros. Os eventos celulares são marcados
pela saída das células circulantes da luz do vaso e a migração de leucócitos para o
24
sítio inflamatório. Esse fenômeno segue algumas fases como captura, rolamento dos
leucócitos pelo endotélio, adesão firme e transmigração (MUNRO, 1993;
SPRINGER, 1994; PEREIRA, 1996; WAHL et al., 1996). Todas estas etapas do
processo de migração leucocitária são dependentes da expressão pelos leucócitos e
pelas células endoteliais de moléculas denominadas moléculas de adesão e de
mediadores quimiotáticos (SPRINGER, 1994; WEBER, 2003). A mobilização
adequada dos leucócitos circulantes para o sítio inflamado é fundamental para a
defesa do organismo, uma vez que estas células podem desenvolver suas ações de
fagocitose e destruição de agentes patogênicos levando à resolução do processo.
Os leucócitos circulantes migram seletivamente e em número significativo para o
tecido inflamado no decorrer do processo. Em uma resposta inflamatória aguda, e
logo nos estágios iniciais, ocorre acúmulo predominante de neutrófilos, enquanto
que as células mononucleares são observadas mais tardiamente durante a fase
aguda, bem como nos processos crônicos. A migração de eosinófilos também pode
ocorrer em processos inflamatórios, estando principalmente associada a processos
alérgicos e infecções parasitárias. Algumas das células envolvidas já estão
presentes no tecido afetado tais como: células endoteliais, células mesoteliais,
mastócitos, eosinófilos, macrófagos e alguns linfócitos (SIBILLE e REYNOLDS,
1990; SAMPSON, 2000; BROCHE e TELLADO, 2001; BOYTON e OPENSHAW,
2002).
Diante de um agente inflamatório há a liberação de vários mediadores
químicos que influenciarão a resposta e evolução da inflamação: mediadores
gerados a partir do plasma; mediadores armazenados em células e liberados após a
ação do agente flogístico; mediadores de natureza protéica (citocinas); mediadores
lipídicos (leucotrienos – LTs –, fator de ativação plaquetária – PAF – e as
prostaglandinas - PGs); e mediadores liberados pelas células do exsudato
(PEREIRA, 1996). A vasodilatação, o aumento da permeabilidade vascular e a
ativação leucocitária estão relacionados à ação da histamina, PGs, óxido nítrico
(NO), bradicinina, LTs, C3a, C5a e PAF, sendo que esses mediadores podem ser
pré-formados e armazenados, como a histamina nos mastócitos, ou formados no
local do estímulo, como as PGs (DI VAIO e FREITAS, 2001; STEAVENS e LOWE,
2002).
25
Os principais eicosanóides envolvidos tanto na geração da inflamação como
também da dor, são os LTs e PGs. As PGs e os LTs promovem vasodilatação,
aumento da permeabilidade vascular e edema nos sítios de inflamação, enquanto
que na dor podem causar hiperalgesia a estímulos mecânico, químico ou térmico
(VANE e BOTTING, 1998). Os eicosanóides são produtos do processamento do
ácido araquidônico (AA) que normalmente é encontrado esterificado a fosfolipídios
de membrana, de onde é liberado por ação de fosfolipases (PLs), como a fosfolipase
A2 (PLA2). O AA pode sofrer metabolização pelas vias das enzimas cicloxigenase
(COX) e lipoxigenase (LOX) para produzir uma grande família de eicosanóides.
A COX é uma enzima bifuncional, com atividade de ácido graxo (catalisando a
conversão do AA em prostaglandina G2 - PGG2) e atividade de prostaglandina
hidroperoxidase (catalisando a conversão da PGG2 em prostaglandina H2 - PGH2).
A PGH2 é convertida, através de diferentes enzimas com especificidade celular, na
prostaglandina E2 (PGE2) prostaglandina F2α (PGF2α), prostaglandina D2 (PGD2),
prostaglandina I2 (PGI2) e no tromboxano A2, entre outras (VANE e BOTTING,
1998).
Em 1971, Vane demonstrou que o principal mecanismo de ação dos
antiinflamatórios não-esteroidais (AINES) era a propriedade de bloquear a síntese
de prostanóides através da inibição da atividade da COX. Este fato implicou
diretamente alguns eicosanóides como pró-inflamatórios. Vários anos se passaram
até a descoberta da existência de pelo menos duas isorformas de COX envolvidas
na ação não específica dos AINES, a COX-1 e a COX-2. Como a COX-2 é uma
enzima
expressa
por
células
envolvidas
em
processos
inflamatórios,
foi
correlacionada como sendo a maior responsável pela produção de prostanóides nos
processos inflamatórios e dolorosos. As LOXs originam os LTs, o ácido
hidroeicosatetraenóico
(HETE) e
as lipoxinas. Os LTs,
potentes
agentes
quimiotáticos, são produzidos, predominantemente, por células inflamatórias como
leucócitos polimorfonucleares, macrófagos e mastócitos.
Os antiinflamatórios inibidores da COX, os AINES, estão entre as drogas mais
prescritas em todo o mundo (FIORUCCI et al., 2001). Entretanto, o uso dos AINES é
limitado devido aos seus efeitos colaterais, particularmente no trato gastrintestinal
(TGI) e nos rins (FOSSLIEN, 1998). Vários anos se passaram até a descoberta da
26
existência de pelo menos duas isorformas de COX envolvidas na ação não
específica dos AINES, a COX-1 e a COX-2. Como a COX-2 é uma enzima expressa
por células envolvidas em processos inflamatórios, foi correlacionada como sendo a
maior responsável pela produção de prostanóides nos processos inflamatórios e
dolorosos (VANE et al., 1998) Os AINES podem ser comparados quanto à
capacidade variável de inibição da COX-1 e COX-2, existindo inibidores não
seletivos, como a indometacina, e inibidores seletivos para a COX-2, como o
celecoxib (WARNER e MITCHELL, 2004). Os inibidores da COX-2 têm sido
descritos
como
a
classe
de
inibidores
que
possuem
potente
atividade
antiinflamatória, sem os efeitos adversos no TGI tão comum aos AINES clássicos
(GOLDENBERG, 1999). Atualmente, porém, estudos têm mostrado que a inibição
exclusiva de COX-2 não está satisfazendo todas as necessidades da terapia
antiinflamatória por várias razões: por comprometer a função renal (BERTOLINI et
al., 2001; GAMBARO, 2002); pelo fato da COX-2 estar aumentada em pacientes
com gastrites e úlceras com o objetivo de causar uma citoproteção adaptativa, visto
que as PGs produzidas a partir de COX-2 são as responsáveis por essa citoproteção
gástrica, assim, se as COX-2 forem inibidas, o quadro do paciente com gastrite e
úlcera pode piorar devido à diminuição dessas PGs (PARENTE, 2001); por ter sido
reportado que o uso desses agentes requer vigilância no que se refere a doenças
cardiovasculares (MCADAM et al., 1999; MCGETTINGAN e HENRY, 2006). Além
disso, as PGs produzidas pela COX-1 têm mostrado contribuírem para a resolução
do processo inflamatório e hiperalgesia. Nestes casos, a eficácia antiinflamatória de
inibidores seletivos da COX-2 só foi observada em doses que inibiam a COX-1
(PARENTE E PARETTI, 2003). Assim, parece que é necessário haver um equilíbrio
entre a inibição de COX-1 e COX-2.
O LTB4, que é produzido através da conversão do AA pela 5-LOX, é também
um importante agente quimiotático para células inflamatórias tais como neutrófilos,
macrófagos e eosinófilos. Através da ativação de neutrófilos, o LTB4 acaba ativando
a sua degranulação que é associada com a liberação de enzimas e geração de
superóxido. Ele também aumenta a adesão dos neutrófilos pelo endotélio e promove
sua infiltração tecidual. Finalmente, ele parece ter um papel importante nas
respostas imunológicas por aumentar a liberação de citocinas inflamatórias por
macrófagos e linfócitos (SAMUELSSON et al., 1987). Assim, substâncias que inibem
27
a 5-LOX atuam como agentes antiinflamatórios por impedirem a formação dos LTs
(BRAIN e WILLIAMS, 1990). Além disso, substâncias que são capazes de
antagonizarem os receptores de LTs também são uma boa estratégia para a
terapêutica antiinflamatória, como por exemplo, o montelucaste e o zafirlucaste.
Considerando as propriedades pro-inflamatórias dos LTs e prostanóides,
substâncias capazes de inibir a síntese de ambos eicosanóides (inibidores duais)
deveriam não somente apresentar um perfil antiinflamatório superior como também
apresentar menos efeitos colaterais que os AINES tradicionais e os que inibem
seletivamente a COX-2 (CELOTTI e LAUFER, 2001). Assim, substâncias que são
capazes de causar inibição dual, ou seja, inibindo tanto a 5-LOX quanto a COX-2,
têm sido apontadas como moléculas promissoras na terapêutica antiinflamatória
(JULEMONT et al., 2003).
Outra via de ativação é a hidrólise do AA para formar o lisofosfolipídio. O
lisofosfolipídio pode ser acetilado formando o PAF que é um potente lipídio bioativo
que atua por ligação específica em GPCR (ISHII e SHIMIZU, 2000). O termo PAF foi
denominado pelo fato deste lipídio ser o responsável pela agregação de plaquetas
(ISHII e SHIMIZU, 2000), além de ser um dos mais potentes fatores quimiotáticos in
vitro e in vivo, principalmente para eosinófilos e neutrófilos. O PAF apresenta várias
funções patofisiológicas, sendo que alguns destes efeitos incluem ativação
plaquetária, estimulação neutrofílica, contração da musculatura lisa e aumento da
permeabilidade vascular com formação de edema (ISHII e SHIMIZU, 2000). Foi
demonstrado que tanto a injeção intraplantar de PAF em ratos (DALLOB et al., 1987;
BONNET et al., 1981) quanto a injeção intratecal em camundongos (MORITA et al.,
2004) podem causar alodinia ou hiperalgesia mecânica. Contudo, o mecanismo de
ação pelo qual o PAF exerce suas ações na dor ainda não está bem estabelecido.
As cininas representam um grupo importante de moléculas envolvidas nas
doenças inflamatórias, como na pancreatite, peritonite, artrite reumatóide, asma,
disfunções do trato genito-urinário, além de dor e hiperalgesia, e inflamação
neurogênica (CALIXTO et al., 2004). A produção de cininas, no sítio inflamatório,
resulta em vasodilatação, extravasamento plasmático e aderência de neutrófilos, em
conseqüência de uma ação direta sobre o endotélio da microvasculatura, ou ainda
indireta, através da liberação de outras substâncias pró-inflamatórias. Estes
28
peptídeos exercem seus efeitos biológicos através da ativação dos receptores B1 e
B2. Enquanto as cininas são os agonistas endógenos para o receptor B2, a des-Arg9BK e a des-Arg10-calidina são agonistas preferenciais para o B1. Ambos os
receptores
pertencem
à
superfamília
de
GPCR
com
sete
domínios
transmembranares (Gag/11 e Gai) (CALIXTO et al., 2004). O receptor B2 é
constitutivo e está presente em tecidos centrais e periféricos. Estes parecem estar
implicados na maioria das ações fisiológicas das cininas. O receptor B1 é geralmente
ausente em tecidos normais e animais saudáveis, mas pode ser induzido e superexpresso durante uma lesão tecidual ou administração de alguns mediadores
inflamatórios (SIEBECK et al., 1998).
A histamina é liberada (juntamente com a serotonina, em roedores) pelos
mastócitos em resposta a diversos estímulos inflamatórios (PARADA et al., 2001).
Ambas as aminas vasoativas exercem um papel fundamental na inflamação, sendo
capazes de causar dilatação de vênulas pós-capilares e, conseqüentemente,
aumentar o fluxo sangüíneo e a permeabilidade vascular (BARNES et al., 1988).
Além disso, elas estão implicadas nos processos de nocicepção em diversas
condições inflamatórias (BESSON, 1997), inclusive em humanos (SCIBERRAS et
al., 1987), bem como na formação de edema (KAY, 2001). A histamina e serotonina
atuam sinergicamente com a bradicinina, induzindo hiperalgesia térmica (LAVICH et
al., 2003).
Os receptores para histamina são divididos em quatro tipos: H1, H2, H3 e H4
(DE ESCH et al., 2005). A ativação de receptores histaminérgicos H1 e H2 induz a
mobilização de cálcio e acúmulo de AMPc, respectivamente. O receptor H3 está
localizado
em
neurônios
histaminérgicos
e
atua
como
um
autorreceptor
(SCHWARTZ et al., 1991). Diversos estudos demonstraram a participação dos
receptores H1 e H2 na mediação dos processos nociceptivo e inflamatório
(MALMBERG-AIELLO et al., 1998; MOBARAKEH et al., 2000; PARADA et al., 2001;
OLSEN et al., 2002), Atualmente, o receptor de histamina H4 foi descoberto a partir
de um estudo da informação da seqüência genética do receptor de histamina H3
humano. O gene que codifica o receptor de histamina H4 humano foi clonado por
Oda et al. (2000) e Nakamura et al. (2000) a partir de feto e leucócitos,
respectivamente. Sua expressão parece ser controlada por estímulos inflamatórios e
é expresso em eosinófilos, além de outras células (MORSE, 2001; O’REILLY et al.,
29
2002). É sabido que a histamina induz quimiotaxia em eosinófilos e que este efeito é
inibido por antagonistas de receptores H4, o que torna estas moléculas um
excelente alvo para o tratamento dos processos inflamatórios (O’REILLY, et al.,
2002; LING et at., 2004; DE ESCH et al. 2005).
A serotonina é estocada em plaquetas e mastócitos de roedores podendo ser
liberada sob estímulo inflamatório (HOURANI e CUSACK, 1991). Esta amina está
envolvida na nocicepção e inflamação atuando nos receptores serotoninérgicos 5HT1, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4 e 5-HT7 (SUFKA et al., 1992; DOAK e SAWYNOK, 1997,
PARADA et al., 2001, LAVICH et al., 2003). Quando a serotonina é aplicada
perifericamente, provoca dor em humanos e aumenta o comportamento de dor em
diversos modelos animais. Sua administração endógena estimula uma reação
inflamatória que consiste em formação de edema e rubor em humanos e ratos
(MALING et al., 1974; SUFKA et al., 1992).
O NO é sintetizado a partir da L-arginina e oxigênio molecular por um
processo enzimático que utiliza elétrons doados pela forma reduzida do fosfato de
nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADPH). As enzimas NO sintases (NOS)
convertem a L-arginina em NO-hidroxi-L-arginina que sofre uma oxidação formando
L-citrulina e NO. Uma das isoformas de NOS foi originalmente caracterizada em
neurônios, conhecida como NOS neuronal (nNOS ou tipo 1) enquanto a outra, foi
observada em células endoteliais, a NOS endotelial (eNOS ou tipo II) (CRANE et al.,
1997; COLEMAN, 2001). O terceiro tipo de NOS, sintetizada após a ativação celular,
foi inicialmente descrita em macrófagos de camundongos (STUEHR e MARLETTE,
1985, 1987), e é conhecida como NOS induzível (iNOS ou tipo III) (NATHAN e XIE,
1994; STUEHR e MARLETTE, 1985, 1987). A nNOS e eNOS são ativadas em
resposta a uma elevação nas concentrações de cálcio intracelular e formação do
complexo cálcio-calmodulina. Por outro lado, a iNOS liga-se à calmodulina com alta
afinidade mesmo em baixas concentrações de cálcio intracelular (MAYER e
ANDREW, 1998). A expressão da iNOS é induzida por diversos estímulos, incluindo
lipopolissacarídeos (LPS) ou citocinas como interferon- γ (IFN- γ), interleucina-1 (IL1) ou fator de necrose tumoral-α (TNF-α) (NATHAN e XIE, 1994; STUEHR e
MARLETTE, 1985, 1987).
30
Além das funções fisiológicas do NO, incluindo vasodilatação, citotoxicidade
em macrófagos e plasticidade no sistema nervoso central (SNC) (SCHUMAN e
MADISON, 1994), o NO está envolvido no processamento nociceptivo central e
periférico (MELLER e GEBHART, 1993). Muitos dos dados que sugerem a
participação do NO na nocicepção no SNC, são baseados nos efeitos
antinociceptivos de inibidores de NOS, como demonstrado em modelos em
roedores, de nocicepção térmica ou mecânica (PRZEWLOCKI et al., 1993; INOUE et
al., 1997) ou dor química persistente (HALEY et al., 1992; MOORE et al., 1991;
BABBEDGE et al., 1993; MALMBERG e YAKSH, 1993; HAO e XU, 1996;
MACHELSKA et al., 1997). Diversos trabalhos demonstraram o efeito dual do NO no
mesmo modelo de nocicepção e/ou inflamação (SOUSA et al., 2001; ROCHA et al.,
2002; PRADO et al., 2002).
1.3. Fisiopatologia da depressão do sistema nervoso central
A capacidade de integrar informações obtidas de várias fontes externas e
internas resume o papel principal do sistema nervoso central, isto é, otimizar as
necessidades do organismo nas demandas do ambiente do indivíduo. Esses
conceitos de integração transcendem os sistemas de transmissão individual, e
enfatizam os métodos através dos quais a atividade neuronal é normalmente
coordenada. Apenas com a compreensão detalhada das funções de integração, e de
suas falhas em determinadas condições fisiopatológicas, podem-se desenvolver
abordagens terapêuticas eficazes e específicas para os distúrbios neurológicos e
psiquiátricos (GOODMAN e GILMAN, 2005).
Ao
examinar
o
efeito
dos
fármacos
no
SNC,
com
relação
aos
neurotransmissores para circuitos específicos, deve-se prestar muita atenção aos
princípios gerais da organização dos neurônios. O conceito de que as sinapses
representam pontos de controle modificáveis pelos fármacos dentro das suas
estruturas
neuronais
exige
a
delineação
explícita
dos
locais
onde
os
neurotransmissores operam e o grau de especificidade com o qual estes locais são
afetados (GOODMAN e GILMAN, 2005).
Dentre os vários neurotransmissores responsáveis por alguma função no
SNC, o ácido gama aminobutírico (GABA) é o principal responsável pela depressão
central. Em 1950, o GABA foi identificado como um constituinte químico singular do
cérebro, mas sua potência como um depressor do SNC não foi imediatamente
31
reconhecida. Kravitz et al. (1963) demonstraram que o GABA era o único
aminoácido inibitório encontrado exclusivamente nos nervos inibitórios dos
crustáceos e que a potência inibitória dos extratos desses nervos era responsável
pelo seu teor de GABA. A liberação de GABA foi então relacionada à freqüência da
estimulação nervosa. Registros intracelulares do músculo indicaram que a
estimulação do nervo inibitório e a administração de GABA produziam aumentos
idênticos na condutância de Cl- no músculo. Portanto, essas observações satisfazem
completamente os critérios para identificação de um transmissor (GOODMAN e
GILMAN, 2005).
Os receptores que fazem parte do sistema GABAérgico são três: GABAA,
GABAB e GABAC. Esses receptores são dependentes de ligante e, quando o GABA
se liga ao seu sítio de ligação causa hiperpolarização do neurônio pós-sináptico. O
receptor GABAB causa hiperpolarização preferencialmente pelo influxo de K+ do que
pelo de Cl-. Com os receptores GABAA e GABAC ocorre o oposto, a hiperpolarização
é causada pelo influxo do íon Cl- (Almeida, 2006).
O receptor GABAA é o mais bem caracterizado de todos os receptores
GABAérgicos e apresenta vários subtipos. O GABAA é um receptor pertencente a
uma superfamília de canais iônicos dependentes de ligantes, responsável pela
rápida inibição da neurotransmissão. A ligação do GABA ou de seus agonistas ao
receptor GABAA causa uma mudança conformacional no canal iônico que permite o
influxo do íon Cl- para dentro da célula, causando hiperpolarização. Embora a
estrutura nativa do receptor em questão não tenha sido elucidada, acredita-se que o
receptor GABAA seja heteropentamérico, com cinco subunidades, sendo duas
cópias da subunidade α, duas da subunidade β e uma cópia da subunidade δ, γ ou ε.
O subtipo α1β2γ2 representa quase 50% do total de receptores GABAA encontrados
no cérebro. Estima-se que podem ocorrer mais de 100 subtipos diferentes de
GABAA no SNC dos mamíferos. O GABAA tem vários sítios de ligação para vários
ligantes. Os agentes terapêuticos e moduladores que se ligam a esse receptor são:
barbitúricos, benzodiazepínicos e alguns neuroesteróides, tais como os derivados da
progesterona e deoxicorticosterona. Todos esses compostos afetam a atividade do
GABA, aumentando a abertura dos canais de cloreto. O sítio de ligação dos
benzodiazepínicos se encontra entre as subunidades α e γ. Dependendo do tipo de
32
subunidade γ, o subtipo de receptor pode apresentar aumento, diminuição ou até
mesmo falta de atividade de certos benzodiazepínicos (Almeida, 2006).
O GABAB é um receptor metabotrópico constituído por uma proteína com sete
domínios transmembranares e a este receptor encontra-se acoplada uma proteína G
que, ao ser ativada pela ligação do GABA, resulta em abertura de canais de K+, Ca+2
ou na ativação da enzima adenilato ciclase. Os receptores GABAB pré-sinápticos
são primariamente unidos a canais de Ca+2 e, conseqüentemente, a redução da
liberação de vesículas, contendo o neurotransmissor, na fenda sináptica. Já os
receptores GABAB pós-sinápticos estão unidos a canais de K+ e a sua ativação
resulta em aumento da condutância de K+, causando, assim, hiperpolarização e
redução da excitabilidade neuronal (Almeida, 2006).
Ainda não se tem muito conhecimento a respeito do receptor GABAC. Até
pouco tempo atrás ele era classificado como um subtipo do receptor GABAA.
Estruturalmente, sabe-se que o receptor GABAC é ionotrópico e homoligomérico,
composto de múltiplas subunidades ρ, ou seja, não se encontram as subunidades
mais comuns de receptores GABA: δ, γ e ε (Almeida, 2006).
O SNC central também pode ser deprimido através da ação de substâncias
que se ligam aos receptores opióides, como a morfina. Como já citado
anteriormente, os receptores opióides, quando ativados, ativam a adenilato ciclase
inibitória, que diminui a quantidade de AMPc intracelular. Além disso, ocorre
ativação da corrente de K+ reguladas pelo receptor e a supressão de Ca+2 regulados
por voltagem. E são justamente essa ativação da corrente do K+ e a supressão da
corrente de Ca+2 que hiperpolarizam a membrana das células e explicam o efeito
depressor central dos opióides (HARRISSON et al., 1998; JORDAN e DAVI, 1998;
GRUBB, 1998; LAW e LOH, 1999).
Os anestésicos gerais também são capazes de levar a uma depressão do
SNC. Isso pode ocorrer tanto através da desestabilização dos lipídios de membrana,
que impedem a condução do impulso nervoso, quanto, principalmente, através da
interação desses anestésicos com proteínas localizados no SNC. Muitos agentes
anestésicos são capazes de inibirem a função de receptores excitatórios, em
concentrações alcançadas durante a anestesia como os receptores do glutamato
ionotrópico, da acetilcolina ou da 5-hidroxitriptamina (5-HT), assim como
potencializarem a função de receptores inibitórios, como o GABAA e a glicina. É
33
agora claro que os anestésicos afetam a função de muitos canais iônicos e é
provável que estes efeitos sejam responsáveis pelos seus efeitos globais sobre o
SNC (RANG et al., 2004).
De forma bem condensada, a depressão do SNC é alcançada através da
potenciação das vias inibitórias ou através da inibição das vias excitatórias
(GOODMAN e GILMAN, 2005).
1.4. Os produtos naturais e o Synadenium umbellatum
As plantas medicinais são freqüentemente utilizadas com o intuito de
substituir ou auxiliar as terapias convencionais no tratamento de várias doenças.
Entre outros fatores, a preferência na utilização das plantas medicinais decorre da
facilidade de obtenção e do baixo custo. Porém, sabe-se que as plantas medicinais
apresentam ampla diversidade de metabólitos secundários com diferentes atividades
biológicas (FARNSWORTH et al., 1985; SIMÕES, 2003), justificando a necessidade
de um aprofundamento no conhecimento das propriedades das espécies vegetais e
sua utilização na formulação de medicamentos.
Apesar
da
preferência
das
grandes
indústrias
farmacêuticas
pelo
desenvolvimento de medicamentos pela via sintética, nas últimas décadas observase ainda um grande interesse do mercado pelo potencial terapêutico das plantas
medicinais (CALIXTO et al., 2000; KOEHN e CARTER, 2005). Tal fato é comprovado
pela evidência de que hoje cerca de 25% das drogas prescritas no mundo são
obtidas direta ou indiretamente de plantas. Além disso, cerca de 49% das drogas
desenvolvidas entre 1981 a 2002 foram obtidas a partir de produtos naturais, ou
análogos semi-sintéticos ou ainda compostos sintéticos baseados em produtos
naturais (KOEHN e CARTER, 2005).
Ainda que os medicamentos derivados de plantas tenham uma boa aceitação
pela população e estejam presentes no mercado farmacêutico, apenas uma
pequena parcela das plantas medicinais possui dados científicos que comprovem
sua eficácia e seu espectro toxicológico, assim como garantia de qualidade do
produto. Considerando-se os diversos metabólitos secundários presentes nas
plantas, as principais categorias de medicamentos derivados de plantas são os
terpenóides, glicosídeos, alcalóides, flavonóides e outros tipos.
34
Como exemplos relevantes de medicamentos obtidos de plantas, podemos
mencionar a morfina (Papaver somniferum), a digoxina (Digitalis sp.), o taxol (Taxus
brevifolia), o quinino (casca da Chinchona sp.), a vincristina e a vinblastina
(Catharanthus roseus), dentre outros (RATES, 2001). Assim, na terapêutica
moderna, as plantas medicinais fornecem o substrato para a produção de
compostos biologicamente ativos ou compostos passíveis de modificações e
otimizações estruturais que dão origem às entidades químicas.
Neste contexto, o Brasil é um país privilegiado, pois ocupa o primeiro lugar
dentre os 17 países mais ricos do mundo em biodiversidade, detendo cerca de 23%
do total de espécies existentes no planeta (RATES, 2001). A imensa variedade de
espécies de plantas, animais e microrganismos existentes no ecossistema brasileiro,
sem dúvida apresenta um importante diferencial para o desenvolvimento de
medicamentos (KATO, 2001).
A espécie botânica Synadenium umbellatum Pax. (nome em alusão às
glândulas do ciátio concrescidas) (Fig. 1), pertence à ordem Geraniales e à Família
Euphorbiaceae. Esta família compreende cerca de 290 gêneros e aproximadamente
7500 espécies. Os maiores centros de dispersão encontram-se nos trópicos,
continentes americano e africano. São plantas de hábito variado, existindo ervas,
subarbustos, árvores e também trepadeiras, com folhas alternadas inteiras ou
partidas, em geral com estípulas, latescentes ou não. Flores sempre de sexo
separado: flores masculinas, em geral monoclamídeas, de simetria radial com
tépalas em número de 5-6; flores femininas mono ou diclamídeas, em geral
pentâmeras, ovário sempre súpero, caracteristicamente tricarpelar e trilocular (cada
lóculo contendo 1 ou 2 óvulos). O látex, quando possuem, pode ser incolor ou leitoso
com grãos de amido em forma de fêmur muito característico (JOLY, 1977).
Dentro da família Euphorbiaceae há muitas plantas com elevada toxicidade.
Em levantamento recente, no Estado de Goiás, o Centro de Informação Toxicológica
constatou que, dentre as 18 espécies botânicas relatadas como responsáveis por
ocorrências de intoxicações por plantas tóxicas no Estado, cinco delas (28%)
pertencem à família Euphorbiaceae, sendo elas a Euphorbia milii (coroa de cristo,
cristo gigante), Euphorbia tirucalli (graveto do cão, figueira do diabo, dedo do diabo),
Jatopha curcas (Pinhão de purga, pinhão paraguaio, pinhão bravo, purgão de
35
cavalo), Ricinus communis (carrapateira, rícino, mamoeira, palma de cristo,
carrapato) e Manihot utilissima (mandioca amarga, mandioca branca, mandioca
anaçunipeba).
As euforbiáceas produzem albuminóides tóxicos, sendo a ricina o mais
conhecido (QUER, 1962). A ricina é uma proteína inativadora de ribossomos (RIPs)
do tipo II, heterodimérica, com a enzima inibidora de ribossomo (~32kDa, cadeia A)
ligada por ponte dissulfeto a uma lectina galactose (~34kDa, cadeia B). Se for
quebrada a ligação entre os monômeros, as partes resultantes não são tóxicas. A
ricina inativa ribossomos impedindo a síntese protéica. Há RIPs tipo I que são
monômeros e não citotóxicos, pois não atravessam a membrana celular (BRANDT et
al., 2005).
O Synadenium umbellatum é conhecido popularmente como “cola-nota”,
“avelós”, ”milagrosa”, “cancerola”, etc., sendo o látex (obtido das folhas ou do caule;
pH ácido ± 5,0) empiricamente utilizado na forma de solução aquosa, como segue:
“Colocar 18 gotas do látex em 1 (um) litro de água e guardar na geladeira. Tomar
pela manhã, à tarde e à noite um cálice de licor ou uma xicarazinha de café. Ou
substituir a água pela solução bebendo várias vezes ao dia. Usar sempre para cura
e prevenção” (ORTÊNCIO, 1997).
No Brasil, o látex do Synadenium umbellatum tem sido utilizado popularmente
para o tratamento de várias enfermidades, tais como, alergia, câncer, doença de
Chagas, diabetes, gripe, hemorragias internas, impotência sexual, lepra, obesidade,
úlcera nervosa, cólicas menstruais e dores no corpo (ORTÊNCIO, 1997). Várias
espécies de Synadenium são conhecidas no mundo pelo seu uso como
antiinflamatório, anti-câncer e analgésico. Jager (1996) demonstrou que algumas
espécies do gênero Synadenium são potentes inibidores da síntese de PGs, como
por exemplo, a espécie Synadenium cupulare, o que justifica o uso destas plantas
como antiinflamatórios e analgésicos. Além disso, várias outras plantas pertencentes
à família euforbiácea têm apresentado atividades farmacológicas, tais como a
Euphorbia kansui, que possui atividade analgésica (DAISUKE e YOSHIMASA, 1975)
e anti-tumoral (WU et al., 1991), e diversas espécies do gênero Phyllanthus que têm
apresentado atividade antiinflamatória e analgésica (Santos, 1995).
36
Figura 1 - Fotografia da árvore do Synadenium umbellatum Pax. (cola-nota) no
bairro Feliz, em Goiânia – GO. Foto tirada pelo Prof. Dr. Luiz Carlos da Cunha em
novembro de 2005.
Objetivos
38
2. OBJETIVOS
O presente estudo teve como objetivo a obtenção de um extrato etanólico das
folhas de Synadenium umbellatum, bem como a obtenção de frações (frações
hexânica, clorofórmica e metanol/água) e a posterior avaliação das atividades
antinociceptiva, antiinflamatória e depressora do sistema nervoso central dos
mesmos visando validar o uso popular da planta no que se refere a essas
atividades.
Materiais
40
3. MATERIAIS
3.1. MATERIAL BOTÂNICO
3.1.1. Coleta, identificação e herborização da planta
Folhas de S. umbellatum foram coletadas no bairro Feliz, Goiânia-GO, Brasil,
no verão de 2005/2006. O material botânico foi identificado pelo Professor Dr. José
Realino de Paula, professor adjunto de farmacognosia da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal de Goiás (UFG). Uma exsicata foi depositada no Herbário da
UFG sob número UFG-27160. As folhas foram secas a 40 °C em estufa com
circulação de ar por 48 horas e trituradas em moinho de facas.
3.2. MATERIAL QUÍMICO
3.2.1. Extrato, frações e medicamentos
Para todos os ensaios, uma solução de extrato etanólico de S. umbellatum a
10 mg/mL foi preparada imediatamente antes dos experimentos e, a partir desta
solução, foram feitas sucessivas diluições a fim de se obter concentrações de 10, 5
e 2,5 mg/mL. Soluções das frações hexânica, clorofórmica e metanol/água também
foram preparadas imediatamente antes dos experimentos, nas concentrações de 1,
2 e 2,5 mg/mL, respectivamente, sendo que diluições sucessivas foram feitas para
se obter outras concentrações desejáveis, quando necessário. As soluções do
extrato e das frações hexânica e clorofórmica foram sempre preparadas
imediatamente antes do seu uso com salina (NaCl 0,9%) e tween-80 3%. A solução
da fração metanol/água foi preparada da mesma forma, porém não requereu a
utilização do tween-80. Outras drogas usadas foram indometacina (Prodome –
Brasil), morfina (Cristália – Brasil), dexametasona (Hipolabor – Brasil), fentanil
(Cristália – Brasil), heparina (Prodome – Brasil), naloxona (Cristália – Brasil),
diazepam (Cristália – Brasil) e pentobarbital sódico (Cristália – Brasil). Todos os
medicamentos foram solubilizados em salina, exceto a indometacina, que foi
solubilizada em NaHCO3 5%.
3.2.2. Reagentes
•
Acetona (Synth – Brasil)
•
Ácido acético glacial (Synth – Brasil)
•
Bicarbonato de sódio (Synth – Brasil)
•
Carragenina (Sigma – USA)
41
•
Celite (Synth – Brasil)
•
Clorofórmio (Synth – Brasil)
•
Cloreto de sódio (Synth – Brasil)
•
Etanol 95% P.A. (Synth – Brasil)
•
Éter etílico (Synth – Brasil)
•
Formaldeído (Synth – Brasil)
•
Fosfato de sódio dibásico (Synth – Brasil)
•
Fosfato de sódio monobásico (Synth – Brasil)
•
Metanol (Synth – Brasil)
•
n-Hexano (Synth – Brasil)
•
Óleo de cróton (Sigma – USA)
•
Solução de Türk (Sigma – USA)
•
Tween 80 (Synth – Brasil)
3.3. ANIMAIS
Os animais utilizados neste estudo foram camundongos albinos (Mus
musculus) tipo Swiss machos, pesando entre 25 e 35 g obtidos no Biotério da
Indústria Química do Estado de Goiás (IQUEGO). Os tratamentos dos animais com
o veículo (grupo controle), extrato, frações ou diferentes substâncias foram sempre
realizados em concentrações adequadas para a administração de um volume
constante de 10 mL/kg. As administrações antecediam 30 minutos (via subcutânea,
s.c.) e 60 minutos (via oral, p.o.) os testes de atividade farmacológica.
Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura e
iluminação (ciclo claro / escuro de 12 h), com água e ração ad libitum,
permanecendo no laboratório por um período de adaptação de pelo ao menos 24
horas antes dos experimentos, normalmente iniciados às 9 horas.
Todos os experimentos foram desenvolvidos seguindo normas que envolvem
cuidados com animais de laboratório (CIOMS, 1985).
Métodos
43
4. MÉTODOS
4.1. MÉTODOS FITOQUÍMICOS
4.1.1.Preparação do extrato etanólico
O extrato etanólico de S. umbellatum (EES) foi obtido por maceração em
álcool etílico 95% P.A. na proporção 1:5 (m/v), sob agitação por 5 horas, seguido por
filtração. A extração foi repetida por mais duas vezes para se garantir o esgotamento
das substâncias extraíveis pelo álcool etílico e, em seguida, os filtrados foram
misturados. O filtrado foi evaporado em rotaevaporador a 40 ºC sob pressão
reduzida a fim de se concentrar o extrato.
4.1.2. Eliminação de clorofila e fracionamento do extrato etanólico
A eliminação de clorofila e o fracionamento foram feitos de acordo com Ferri
(1996) com algumas modificações. 45 g de EES concentrado foi dissolvido em
metanol a 4 ºC e deixado em repouso a 4 ºC por 18 horas. Em seguida, a solução foi
filtrada. Ao filtrado, foi adicionada água destilada a 4 ºC até que uma solução 7:3
fosse obtida. A solução resultante foi filtrada sobre Celite e particionada em nhexano (1:1) por agitação em funil de separação por 3 vezes. A fração hexânica foi
reservada e a solução de metanol/água foi então particionada com clorofórmio (1:1)
por agitação em funil de separação por 3 vezes. A fração clorofórmica foi separada
da fração metanol/água. Em seguida, as frações hexânica (FH), clorofórmica (FC) e
metanol/água (FM) foram, individualmente, submetidas à rotaevaporação a 40 °C a
fim de se evaporar os solventes e concentrar as frações. Após a evaporação do
metanol da fração metanol/água, a solução resultante foi liofilizada (Fig. 2).
44
Extrato etanólico de S. umbellatum (45 g)
1. 1,35 L MeOH 4 °C (18 horas)
2. Filtrar
Precipitado
(subst. graxas)
MeOH
1. 0,58 L H2O 4 °C
2. Filtrar (Celite)
Pigmentos
Solução MeOH-H2O
1. Hexano (3x)
Solução MeOH-H2O
Fração hexânica
1. Clorofórmio (3x L)
Fração MeOH-H2O
Fração clorofórmica
Figura 2 – Fluxograma do procedimento geral para a extração de clorofila e
fracionamento do extrato etanólico das folhas de S. umbellatum.
45
4.2. MÉTODOS FARMACOLÓGICOS
4.2.1. Atividade antinociceptiva
4.2.1.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético
Empregando-se a metodologia de Koster (1959), foram utilizados grupos
experimentais de 6 camundongos que foram tratados pela via p.o. com veículo, EES
(25, 50 ou 100 mg/kg), FH (10 mg/kg), FC (20 mg/kg), FM (25 mg/kg) ou
indometacina (10 mg/kg). Todos os grupos receberam ácido acético 1,2% (v/v i.p.)
60 minutos após os tratamentos. O número de contorções abdominais, consideradas
como contrações da parede abdominal seguidas pela extensão de ao menos uma
das patas posteriores (TORNOS, 1999), foram contadas acumulativamente em 30
minutos de avaliação. Os resultados foram expressos como as médias ± EPM dos
números de contorções abdominais acumuladas em 30 minutos de avaliação
experimental e como a média ± DP da porcentagem de inibição das contorções,
comparativamente ao grupo controle.
4.2.1.2. Dor induzida pela formalina
Este modelo permite, após a injeção intraplantar de formalina, avaliar dois
tipos de dor: a de origem neurogênica, que ocorre pela estimulação direta de
terminações nociceptivas, e a de origem inflamatória, produzida pela liberação de
mediadores inflamatórios (HUNSKAAR et al., 1985, 1986 e 1987).
Foram utilizados grupos experimentais de até 10 camundongos tratados pela
via p.o. com veículo, EES (100 mg/kg), indometacina (10 mg/kg) ou morfina (10
mg/kg, s.c.). 60 minutos após os tratamentos, os animais foram injetados na região
intraplantar da pata posterior direita com 20 µL de formalina 3% v/v (formaldeído
1,2% v/v). Em seguida, os animais foram observados individualmente durante 30
min em caixas de acrílico com fundo especular para auxiliar a visualização. Em
seguida à aplicação da formalina, foi medida a reatividade do animal considerada
como o tempo, em segundos, que o animal permanece lambendo a pata injetada. O
efeito antinociceptivo foi avaliado nas duas fases da dor: durante os primeiros 5
minutos (dor neurogênica) e no período de 15 a 30 minutos (dor de origem
inflamatória), sendo os resultados expressos como as médias ± EPM dos tempos de
reatividade nas distintas fases, comparativamente ao grupo controle experimental.
46
4.2.1.3. Influência do tratamento com naloxona
Os animais foram pré-tratados pela via s.c. com salina ou com naloxona (3
mg/kg), um antagonista opióide não seletivo, 15 minutos antes dos tratamentos pela
via p.o. com o veículo, EES (100 mg/kg) ou com o fentanil (100 µg/kg). Decorridos
30 min (s.c.) ou 60 min. (p.o.) dos tratamentos, os animais foram injetados com ácido
acético (1,2% i.p.) e o número de contorções abdominais foi contado por 30 minutos
à semelhança do item 4.2.1.1.
4.2.1.4. Teste do tail flick
Segundo a metodologia descrita por D’Amour e Smith (1941), este ensaio
permite o estudo de drogas com atividade opióide central, mediante a avaliação do
tempo, em segundos, que o animal leva para retirar a cauda do local de incidência
de um estímulo térmico doloroso. Este estímulo nociceptivo foi produzido por
imersão do terço distal da cauda dos camundongos em banho-maria a 55,5 ± 0,5 ºC.
Grupos experimentais de 6 animais foram previamente selecionados quanto à
sua reatividade ao estímulo nociceptivo, não sendo utilizados animais cujo tempo de
resposta foi superior a 7 segundos. A reatividade foi medida a cada 30 minutos,
iniciando-se uma hora antes e prolongando-se por 2 horas depois da administração
p.o. do veículo ou do EES (25, 50 ou 100 mg/kg). Morfina (10 mg/kg), administrada
via s.c., foi utilizada como controle positivo do ensaio. O tempo máximo que se
deixaram as caudas dos animais em contato com o estímulo nociceptivo térmico foi
de 20 s para se evitar lesões.
4.2.2. Atividade antiinflamatória
4.2.2.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton
Este experimento foi realizado de acordo com Tubaro (1985). Foram
utilizados até 8 camundongos tratados pela via p.o. com o veículo, EES (25, 50 ou
100 mg/kg), FM (6, 12 ou 25 mg/kg) ou dexametasona (2 mg/kg). 60 minutos após
os tratamentos, foi administrado topicamente óleo de cróton 2,5% v/v (em solução
de acetona) na orelha direita e o mesmo volume de acetona na orelha esquerda dos
camundongos. Após 4 horas, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical, discos de 6 mm de diâmetro foram retirados de cada orelha e pesados em
balança analítica. Os resultados da diferença de peso entre os discos das duas
orelhas de cada animal foram comparados com o grupo controle experimental.
47
4.2.2.2. Peritonite induzida por carragenina
Este ensaio avalia a evolução da migração leucocitária para a cavidade
peritoneal, segundo protocolo originalmente descrito por Ferrándiz e Alcaraz (1991).
Grupos experimentais de até 10 camundongos foram tratados previamente pela via
p.o. com veículo (grupo controle), com EES (100 mg/kg) ou com dexametasona (2
mg/kg). Decorridos 60 minutos após os tratamentos, os animais foram injetados pela
via i.p. com 0,25 mL de carragenina (1% m/v em salina). Após 4 horas, os animais
foram sacrificados em câmara fechada com éter e injetados na cavidade peritoneal
com 2 mL de PBS heparinizado (10 UI/mL de heparina). Após 60 compressões leves
no abdômen, o fluído foi coletado, a amostra diluída (1:20 em Solução de Tϋrk) e a
contagem do número de leucócitos totais migrados realizada em câmera de
Newbauer. Os resultados foram expressos como as médias ± EPM dos números de
leucócitos totais por mL.
4.2.3. Atividade no sistema nervoso central
4.2.3.1. Teste do rota-rod
Este método descrito por Rosland (1990) permite avaliar a especificidade da
ação nociceptiva de drogas, verificando se estas promovem incoordenação motora
dos animais, seja por sedação e/ou por relaxamento muscular. Grupos de sete
camundongos foram colocados no rota-rod por 1 minuto, 60 minutos após os
tratamentos com veículo, EES (25, 50 ou 100 mg/kg), FH (10 mg/kg), FC (20 mg/kg),
FM (25 mg/kg) ou diazepam (5 mg/kg), sendo avaliados o número de quedas e o
tempo de permanência na barra giratória. O número máximo de quedas permitidas
foi de 3 sendo que, após a terceira, o animal não mais era reconduzido ao rota-rod.
O tempo máximo de permanência permitido no rota-rod foi de 1 minuto.
4.2.3.2. Teste do campo aberto
Este modelo foi baseado na metodologia descrita por Sielgel (1946) e
validado por Archer (1973), e permite uma avaliação da atividade estimulante ou
depressora de um dado composto podendo ainda indicar atividades mais especificas
como ação tipo ansiolítica ou ansiogênica. Foram utilizados grupos de 8
camundongos tratados previamente pela via p.o. com veículo (grupo controle), com
EES (25, 50 ou 100 mg/kg), FH (10 mg/kg), FC (20 mg/kg), FM (25 mg/kg) ou com
diazepam (5 mg/kg). 60 minutos após o tratamento, os animais foram colocados em
48
um campo-aberto confeccionado em acrílico e foram observados durante 5 minutos,
sendo avaliados a atividade exploratória dos animais (número de quadrados
invadidos), o tempo em que os animais permaneceram parados, o número de
levantadas, o número de auto-limpeza e o número de bolos fecais.
4.2.3.3. Potenciação do sono por barbitúrico
Foram utilizados grupos de até 8 camundongos tratados previamente pela via
p.o. com veículo, com EES (25, 50 ou 100 mg/kg), FH (10 mg/kg), FC (20 mg/kg),
FM (25 mg/kg) ou com diazepam (5 mg/kg). 60 minutos após os tratamentos, os
animais
foram
injetados
com
pentobarbital
sódico
50
mg/kg
i.p.
Foram
cronometrados o tempo de recuperação do reflexo postural. Os resultados foram
expressos como o tempo de recuperação (minutos) do sono de cada grupo
experimental comparativamente ao grupo controle experimental (GONZALESTRUJANO et. al., 1998).
4.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram dados como médias ± erro padrão das médias (EPM) ou
desvio padrão (DP). As diferenças estatísticas entre os grupos experimentais foram
detectadas pela análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey.
Considerou-se como valores significantes aqueles cujo P < 0,05. Para a análise dos
dados foi utilizado o software GraphPad Prism 4.0.
Resultados
50
5. RESULTADOS
5.1. RESULTADOS FITOQUÍMICOS
5.1.1.Preparação do extrato etanólico
Foram coletados 17 kg de folhas de S. umbellatum. Após secagem, o peso
das folhas foi de 1,3 kg, o que gerou 90 g de extrato, cuja coloração era verde
intenso. Isso corresponde a um rendimento de 6,9%.
5.1.2. Eliminação de clorofila e fracionamento do extrato etanólico
O EES (45 g) forneceu três frações: uma fração hexânica (FH), uma fração
clorofórmica (FC) e uma fração metanol/água (FM). As frações FH e FC
apresentaram coloração marrom escura e tiveram rendimentos de 4% e 11,5%,
respectivamente em relação ao EES. A fração FM apresentou coloração castanha
escura e teve um rendimento de 12,3% em relação ao EES.
5.2. RESULTADOS FARMACOLÓGICOS
5.2.1. Atividade antinociceptiva
5.2.1.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético
O EES exibiu significante supressão do número de contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético em uma relação dose-resposta em camundongos se
comparados ao grupo controle. No grupo controle, previamente tratado com veículo
(60 minutos antes), a injeção de ácido acético (1,2 % i.p.) induziu 77,3 ± 2,1
contorções em 30 min. O pré-tratamento com EES (25, 50 ou 100 mg/kg) reduziu as
contorções abdominais em 24,7% (58,2 ± 1,0), 39,5% (46,8 ± 0,9) e 55,0% (34,8 ±
1,5), respectivamente (Fig. 3). O pré-tratamento com FH (10 mg/kg) e FC (20 mg/kg)
não alteraram o número de contorções (78,2 ± 2,9 e 75,8 ± 3,4 respectivamente)
enquanto que a FM (25 mg/kg) reduziu as contorções abdominais em 59,2% (31,5 ±
1,6) (Fig. 4). O pré-tratamento com indometacina (10 mg/kg) reduziu as contorções
em 39,6% (46,7 ± 0,7). A dose efetiva necessária para reduzir em 50% o efeito
(DE50), determinada por interpolação gráfica da relação dose do extrato /
porcentagem de inibição foi de 80,7 mg/kg (Fig. 5).
Número de Contorções
51
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
*
*
C ____________________
25
50
100 INDO
EES
Figura 3 - Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina,
i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (60 min) pela via
p.o. com veículo (grupo controle; C), com o extrato etanólico das folhas do S.
umbellatum (EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) ou com indometacina (INDO; 10 mg/kg). As
colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 6 animais por grupo
experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Os grupos tratados com as diferentes doses de EES são significativamente
diferentes entre si (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Número de Contorções
52
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
C
FH
10
FC
20
FM
25
INDO
Figura 4 - Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina,
i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (60 min) pela via
p.o. com veículo (C), com as frações hexânica (FH, 10 mg/kg), clorofórmica (FC, 20
mg/kg) e metanol/água (FM, 25 mg/kg) ou com indometacina (INDO; 10 mg/kg). As
colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 6 animais por grupo
experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
53
% d e in ib ição
100
75
50
25
0
1.0
1.5
2.0
Log dose (mg/kg)
Figura 5 - Porcentagem de inibição das contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético (1,2 % v/v em salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente
tratados (60 min) pela via p.o. com EES (■) 25, 50 ou 100 mg/kg. Os símbolos e
barras verticais representam as médias ± DP de 6 animais por grupo experimental.
R2 = 0,9306
54
5.2.1.2 Dor induzida pela formalina
A aplicação intraplantar de formalina 3% na pata posterior direita de
camundongos produziu intensa nocicepção em duas fase distintas: a primeira de 0 a
5 minutos (dor neurogênica) (Fig. 6) e a segunda de 15 a 30 minutos (dor
inflamatória) (Fig. 7). Nos animais previamente tratados (60 min) pela via p.o. com
veículo, a reatividade na primeira fase de nocicepção foi de 119,4 ± 12,2 s (n = 10) e
na segunda fase foi de 271,5 ± 24,9 s (n = 10). O pré-tratamento com EES (100
mg/kg, p.o.) reduziu ambas as fases de nocicepção, sendo que tal redução, na
primeira fase, foi de 48,7% (61,3 ± 5,4 s, n = 10) enquanto, na segunda fase, a
redução foi de 73,1% (73,0 ± 12,4 s, n = 10). O grupo tratado com morfina (5 mg/kg
s.c.) teve ambas as fases reduzidas, sendo que a primeira fase foi reduzida em 72,1
% (33,3 ± 15,8 s, n = 6) e a segunda fase em 84,0 % (42,7 ± 20,2 s, n = 6). O grupo
tratado com indometacina (10 mg/kg, p.o.) não teve a primeira fase reduzida (106,3
± 10,4 s, n = 6), porém teve a segunda fase reduzida em 50,9 % (133,4 ± 15,0 s, n =
6).
5.2.1.3. Influência do tratamento com naloxona
A pré-administração do antagonista opióide naloxona (3 mg/kg. s.c.) no grupo
tratado com veículo (p.o.) não modificou o número de contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético (1,2%, i.p.) em 30 min (67,7 ± 3,0) comparativamente
ao grupo pré-administrado com salina s.c. (70,1 ± 2,6). O tratamento com o agonista
opióide fentanil (100 µg/kg, s.c.) reduziu o número de contorções para 6,3 ± 1,0. No
entanto, a administração de naloxona 15 min antes da injeção do fentanil, bloqueou
o efeito antinociceptivo do agonista opióide nas contorções induzidas pelo ácido
acético (66,7 ± 2,2). Resultado semelhante foi evidenciado com o EES (100 mg/kg,
p.o.) cujo efeito (43,5 ± 1,7) foi inibido com o tratamento prévio com naloxona (68,8 ±
2,2) (Fig. 8).
55
1ª Fase (0 – 5 minutos)
Tempo de reação (s)
140
120
100
80
*
60
*
40
20
0
C
EES 100
MOR
INDO
Figura 6 - Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata
posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 – 5 min) do teste da
formalina, previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (grupo controle,
C; n = 10), com o EES (100 mg/kg, n = 10), com morfina (MOR; 10 mg/kg s.c., n = 6)
ou com indometacina (INDO; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais
representam as médias ± EPM.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
56
2ª Fase (15 – 30 minutos)
Tempo de reação (s)
300
250
200
*
150
100
*
50
0
C
EES 100
*
MOR
INDO
Figura 7 - Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata
posterior direita de camundongos, durante a segunda fase (15 – 30 min) do teste da
formalina, previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (grupo controle,
C; n = 10), com o EES (100 mg/kg, n = 10), com morfina (MOR; 10 mg/kg s.c., n = 6)
ou com indometacina (INDO; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais
representam as médias ± EPM.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
57
Número de contorções
Salina
Naloxona
75
#
50
##
*
25
*
0
Veículo
EES
100 mg/kg
Fentanil
100 µg/kg
Figura 8 - Influência do tratamento prévio com o antagonista opióide não seletivo
naloxona (3 mg/kg, s.c.) sobre a atividade antinociceptiva do EES (100 mg/kg, p.o.)
e fentanil (100 µg/kg, s.c.) no modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM de 6 animais por
grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
# Estatisticamente diferente do grupo tratado com EES 100 mg/kg e pré-tratado com
salina (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
## Estatisticamente diferente do grupo tratado com fentanil 100 µg/kg e pré-tratado
com salina (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
58
5.2.1.4. Teste do tail flick
Os tempos de latência ao estímulo térmico nociceptivo no tempo zero para o
grupo controle foi de 2,29 ± 0,35 s. O tratamento prévio com o EES (25, 50 ou 100
mg/kg) não modificou a reatividade dos animais ao estímulo doloroso durante 2
horas após a administração. Em condições semelhantes, o tratamento com morfina
(10 mg/kg) ampliou o tempo de latência ao estímulo térmico em 295 % (20,0 ± 0,0)
30 minutos após a sua administração e continuou causando antinocicepção durante
todo o tempo avaliado (Fig. 9).
23
*
Tempo de Latência (s)
20
*
*
*
60
90
120
18
15
13
10
8
5
3
0
-60
-30
0
30
Tempo (min)
Administração
dos Tratamentos
Figura 9 - Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do tail flick em
camundongos antes e após tratamento com o (●) veículo p.o., com EES (■ 25, ▼50
ou ▲100 mg/kg, p.o.) ou morfina (♦ 10 mg/kg, s.c.). Nas ordenadas estão
representados os tempos de latência dos camundongos ao estímulo térmico
nociceptivo, em segundos. Os símbolos e barras verticais representam as médias ±
EPM de 6 animais por grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
59
5.2.2. Atividade antiinflamatória
5..2.2.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton
O EES e a FM reduziram o edema de orelha induzido pelo óleo de cróton
de maneira dose-dependente. No grupo controle, previamente tratado (60 min antes)
com o veículo (p.o.), a administração de óleo de cróton (2,5% v/v em solução de
acetona) na orelha direita e o mesmo volume de acetona na orelha esquerda dos
camundongos, gerou um edema de 21,7 ± 1,8 mg (n = 7) em 4 horas. O prétratamento com EES (25, 50 ou 100 mg/kg; p.o.) reduziu o edema em 30,0% (15,3 ±
0,4 mg, n = 7), 43,8% (12,2 ± 0,4 mg, n = 7) e 59,4% (8,8 ± 0,2 mg, n = 7),
respectivamente (Fig. 10). O pré-tratamento com FM (6, 12 ou 25 mg/kg; p.o.)
reduziu o edema em 19,8% (17,4 ± 0,6, n = 8), 41,0% (12,9 ± 0,9 mg, n = 8) e 61,9%
(8,3 ± 0,9 mg, n = 7), respectivamente (Fig. 11). O pré-tratamento com
dexametasona (2 mg/kg; p.o.) reduziu o edema em 83,9% (3,5 ± 0,9 mg, n = 6).
5.2.2.2. Peritonite induzida por carragenina
O EES exibiu significante inibição da migração de leucócitos totais no
modelo de peritonite induzida por carragenina de maneira dose-dependente (Fig.
12). O grupo controle, 4 horas após a administração de carragenina 1% (m/v i.p.)
induziu a migração de 11,4 ± 0,3 x 106 leucócitos / mL (n = 10) para a cavidade
peritoneal. O pré-tratamento com EES (25, 50 ou 100 mg/kg) reduziu a migração
leucocitária em 21,9% (8,9 ± 0,5 x 106 leucócitos / mL, n = 8), 36,0% (7,3 ± 0,2 x 106
leucócitos / mL, n = 9) e 53,5% (5,3 ± 0,6 x 106 leucócitos / mL, n = 8). O prétratamento com dexametasona (2 mg/kg, n = 8) reduziu a migração leucocitária em
66,7% (3,8 ± 0,4 x 106 leucócitos / mL) respectivamente.
60
Edema (mg)
25
20
*
15
*
10
*
*
5
0
C
25
50
100 DEXA
____________________
EES
Figura 10 - Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em
acetona) nos grupos previamente tratados pela via p.o. com veículo (C; n = 7), com
extrato etanólico de S. umbellatum (EES 25, 50 ou 100 mg/kg, n = 7) ou com
dexametasona (DEXA; 2 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam a
média ± EPM.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Os grupos tratados com as diferentes doses de EES são significativamente
diferentes entre si (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
61
Edema (mg)
25
20
*
15
*
*
10
*
5
0
C ____________________
6
12
25 DEXA
FM
Figura 11 - Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em
acetona) nos grupos previamente tratados pela via p.o. com veículo (C; n = 7), com
fração metanol/água (FM 6, 12 ou 25 mg/kg, n = 8, 8 e 7 respectivamente) ou com
dexametasona (DEXA; 2 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam a
média ± EPM.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Os grupos tratados com as diferentes doses da FM são significativamente diferentes
entre si (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
62
Núm ero de Leucócitos
Totais / m L (x 10 6 )
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
*
*
*
*
C
25
50
100
______________
DEXA
EES
Figura 12 - Migração de leucócitos totais no modelo de peritonite induzida por
carragenina (1% m/v) injetada na cavidade intraperitoneal de camundongos
previamente tratados pela via p.o. com veículo (C; n = 10), com extrato etanólico de
S. umbellatum (EES 25, 50 ou 100 mg/kg, n = 8, 9 e 8 respectivamente) ou
dexametasona (DEXA; 2 mg/kg, n = 8). As colunas e barras verticais representam a
média ± EPM.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Os grupos tratados com as diferentes doses de EES são significativamente
diferentes entre si (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
63
5.2.3. Atividade no sistema nervoso central
5.2.3.1. Teste do rota-rod
O EES e as frações FH, FC e FM não alteraram a atividade motora dos
camundongos enquanto os animais tratados com diazepam (5 mg/kg) apresentaram
diminuição da mesma. Camundongos (n = 7) tratados pela via oral (60 min antes)
com veículo (p.o.), ao serem colocados na barra giratória por 1 minuto, tiveram 0,1 ±
0,1 quedas por minuto e se equilibraram por 60 ± 0,0 s no rota-rod. Os animais prétratados com EES (25, 50 ou 100 mg/kg) tiveram 0,6 ± 0,2, 0,6 ± 0,3 e 0,7 ± 0,2
quedas respectivamente, (Fig. 13) e se equilibraram por 60 ± 0,0, 60 ± 0,0 e 60 ± 0,0
s respectivamente (Fig. 15) no rota-rod. Os animais pré-tratados com FH (10 mg/kg),
FC (20 mg/kg) e FM (25 mg/kg) tiveram 0,4 ± 0,2, 0,3 ± 0,2 e 0,3 ± 0,3 quedas
respectivamente (Fig. 14), e se equilibraram por 60 ± 0,0, 60 ± 0,0 e 60 ± 0,0 s
respectivamente (Fig. 16) no rota-rod. Os animais tratados com diazepam (5 mg/kg)
apresentaram 2,0 ± 0,4 quedas e se equilibraram por 39,9 ± 9,5 s no rota-rod.
5.2.3.2. Teste do campo aberto
O EES e as frações não alteraram a movimentação espontânea dos
camundongos. Este efeito foi demonstrado pelo número de quadrados invadidos em
5 minutos no campo aberto. O EES e a FC, porém, da mesma maneira que o
diazepam, aumentaram o tempo parado, enquanto o EES e a FH, assim como o
diazepam, diminuíram o número de bolos fecais. O teste também mostrou que o
EES e as frações FH, FC e FM, nas concentrações utilizadas, não alteraram o
número de levantadas nem o número de auto-limpeza. O grupo diazepam (5mg/kg),
porém, teve o número de levantadas diminuído, mas não apresentou alterações no
número de auto-limpeza. Os resultados do tempo parado e do número de bolos
fecais tanto do EES quanto das frações FH, FC e FM estão representados nas
figuras 17-20.
64
5.2.3.3. Potenciação do sono induzido por barbitúrico
O EES e as frações FH e FC apresentaram um possível efeito depressor
do SNC em camundongos de acordo com o teste de potenciação do sono induzido
por barbitúrico. Os camundongos tratados com veículo (p.o. n = 6) tiveram um tempo
de recuperação do sono de 25,5 ± 3 min. Os animais tratados com EES (25, 50 ou
100 mg/kg, p.o, n = 8), tiveram os tempos de recuperação do sono aumentados em
97,6% (50,4 ± 2 min), 143,1% (62 ± 5 min) e 150,6% (63,9 ± 6 min) respectivamente
(Fig. 21). Os animais tratados pela via p.o. com FH (10 mg/kg, n = 8) e FC (20
mg/kg, n = 7) tiveram os tempos de recuperação do sono aumentados em 118,0%
(55,6 ± 8 min) e 89,4% (48,3 ± 3 min) respectivamente, enquanto os tratados com
FM (25 mg/kg, n = 7) não tiveram o tempo de recuperação do sono aumentado (23,3
± 3 min) (Fig. 22). Os animais tratados com diazepam (5 mg/kg, n = 6) tiveram um
tempo de sono aumentado em 270,6% (94,5 ± 9 min).
65
Número de Quedas
3
*
2
1
0
C
50
100
DZP
25
_____________________
EES
Figura 13 - Número de quedas, no rota-rod, de camundongos previamente tratados
(60 min) pela via p.o. com veículo (C), com o extrato etanólico das folhas do S.
umbellatum (EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) ou com diazepam (DZP; 5 mg/kg). As
colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 7 animais por grupo
experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
66
Número de Quedas
3
*
2
1
0
C
FH
10
FC
20
FM
25
DZP
Figura 14 - Número de quedas, no rota-rod, de camundongos previamente tratados
(60 min) pela via p.o. com veículo (C), com as frações hexânica (FH, 10 mg/kg),
clorofórmica (FC, 20 mg/kg), metanol/água (FM, 25 mg/kg) ou com diazepam (DZP;
5 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 7 animais
por grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Tempo de permanência (s)
67
60
*
50
40
30
20
10
0
C
25
50
100
DZP
_____________________
EES
Figura 15 - Tempo de permanência, no rota-rod, em segundos, de camundongos
previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C), com o extrato etanólico
das folhas do S. umbellatum (EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) ou com diazepam (DZP; 5
mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 7 animais
por grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Tempo de permanência (s)
68
60
*
50
40
30
20
10
0
C
FH
10
FC
20
FM
25
DZP
Figura 16 - Tempo de permanência, no rota-rod, em segundos, de camundongos
previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C), com as frações
hexânica (FH, 10 mg/kg), clorofórmica (FC, 20 mg/kg), metanol/água (FM, 25 mg/kg)
ou com diazepam (DZP; 5 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as
médias ± EPM de 7 animais por grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Tempo parado (s)
69
200
175
150
125
100
75
50
25
0
*
*
*
*
C
25
50
100
DZP
____________________
EES
Figura 17 - Tempo parado, em segundos, no teste do campo aberto, de
camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C), com o
extrato etanólico das folhas do S. umbellatum (EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) ou com
diazepam (DZP; 5 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ±
EPM de 8 animais por grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Os grupos tratados com EES 25 mg/kg é significativamente diferente dos grupos
tratados com 50 mg/kg e 100 mg/kg (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
70
*
Tem po parado (s)
200
175
150
125
100
75
50
25
0
*
C
FH
10
FC
20
FM
25
DZP
Figura 18 - Tempo parado, em segundos, no teste do campo aberto, de
camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C), com as
frações hexânica (FH, 10 mg/kg), clorofórmica (FC, 20 mg/kg), metanol/água (FM, 25
mg/kg) ou com diazepam (DZP; 5 mg/kg). As colunas e barras verticais representam
as médias ± EPM de 8 animais por grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Número de bolos fecais
71
4
3
2
*
1
0
C
*
*
*
25
50
100 DZP
____________________
EES
Figura 19 - Número de bolos fecais, no teste do campo aberto, deixados por
camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C), com o
extrato etanólico das folhas do S. umbellatum (EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) ou com
diazepam (DZP; 5 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ±
EPM de 8 animais por grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Número de bolos fecais
72
4
3
2
*
1
0
C
FH
10
FC
20
FM
25
*
DZP
Figura 20 - Número de bolos fecais, no teste do campo aberto, deixados por
camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C), com as
frações hexânica (FH, 10 mg/kg), clorofórmica (FC, 20 mg/kg), metanol/água (FM, 25
mg/kg) ou com diazepam (DZP; 5 mg/kg). As colunas e barras verticais representam
as médias ± EPM de 8 animais por grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
73
Tempo de
recuperação (min)
125
*
100
75
50
*
*
*
25
0
C __________________
25
50
100 DZP
EES
Figura 21 - Tempo de recuperação do reflexo postural (duração do sono), em
minutos, no teste de potenciação do sono induzido por barbitúrico, em camundongos
previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C; n=6), com o extrato
etanólico das folhas do S. umbellatum (EES; 25, 50 ou 100 mg/kg, n=8) ou diazepam
(DZP; 5 mg/kg, n=6). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
74
Tempo de
recuperação (min)
125
*
100
75
*
50
*
25
0
C
FH
10
FC
20
FM
25
DZP
Figura 22 - Tempo de recuperação do reflexo postural (duração do sono), em
minutos, no teste de potenciação de sono induzido por barbitúrico, em camundongos
previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C; n = 6), com as frações
hexânica (FH, 10 mg/kg, n = 8), clorofórmica (FC, 20 mg/kg, n = 7), metanol/água
(FM, 25 mg/kg, n = 7) ou diazepam (DZP; 5 mg/kg, n = 6). As colunas e barras
verticais representam as médias ± EPM.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Discussão
76
6. DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo demonstram que o EES possui efeito
antinociceptivo e antiinflamatório analisados em vários modelos de nocicepção e
inflamação em camundongos. Além do mais, o estudo também demonstrou, através
da realização de vários modelos comportamentais, um possível efeito depressor do
sistema nervoso central.
Atualmente,
várias
doenças
ainda
permanecem
com
sua
etiologia
desconhecida ou apresentam múltiplos fatores que contribuem para a permanência
da doença no organismo. Algumas dessas doenças podem apresentar um caráter
inflamatório e/ou doloroso persistente, sendo tratadas com a utilização de alguns
medicamentos classicamente utilizados na inflamação e/ou dor como os AINES,
glicocorticóides, opióides, e derivados, na tentativa de melhorar a sintomatologia
geral do paciente (GUPTA e DUBOIS, 2001). Assim, a descoberta de novas
substâncias com atividade analgésica e/ou antiinflamatória é ainda um aspecto
altamente desejável e de enorme importância para a utilização clínica. Várias
evidências demonstram que um grande número de medicamentos utilizados na
terapêutica é derivado direta ou indiretamente de produtos naturais, especialmente
de plantas superiores, sendo uma fonte inesgotável de possibilidades para a
descoberta de novos fármacos (KOEHN e CARTER, 2005). Entretanto, várias
dificuldades são encontradas por aqueles que desejam estudar as ações das plantas
medicinais em sistema biológico, como por exemplo, a escolha de modelos
experimentais, a obtenção de extratos padronizados e a dificuldade de obtenção,
isolamento e identificação das substâncias ativas. Além disso, muitas doenças estão
associadas a múltiplos fatores, dificultando a escolha de um alvo específico para o
estudo (COOKSON, 2004).
A fim de se estudar a atividade antinociceptiva e antiinflamatória do EES e de
suas frações, escolhemos como um dos modelos experimentais, o modelo das
contorções abdominais em camundongos. Este modelo baseia-se na contagem das
contrações da parede abdominal seguidas de torção do tronco e extensão de ao
menos um dos membros posteriores (writhing) como respostas reflexas à irritação
peritoneal e à peritonite produzidas pela injeção intraperitoneal de ácidos fracos ou
outros agentes inflamatórios. Introduzido por Siegmund et al. (1957a) utilizando-se a
77
fenilquinona, o teste foi posteriormente padronizado com outros agentes.
Acetilcolina, ácidos acético ou clorídrico diluídos (ECKHARDT et al., 1958; KOSTER
et al., 1959; NIEMEGEERS et al., 1975), bradicinina (EMELE e SHANAMAN, 1963),
adrenalina (MATSUMOTO e NICKANDER, 1967), trifosfato de adenosina, triptamina
(COLLIER et al., 1968), e ocitocina (MURRAY e MILLER, 1960) têm sido usados.
Modificações têm sido feitas na concentração, temperatura e volume da solução
injetada, e condições e maneiras de monitorar as condições comportamentais, de
modo a simplificar o teste e aumentar a sua sensibilidade (LINÉE e GOURET, 1972;
HARADA et al., 1979). O modelo também é usado em macacos (PEARL et al.,
1969).
O ácido acético atua indiretamente causando a liberação de mediadores
endógenos envolvidos na modulação da nocicepção, incluindo a bradicinina,
serotonina, histamina, PGs, entre outros, que causariam a estimulação dos
neurônios nociceptivos e, consequentemente, a indução da dor (WHITTLE, 1964;
BERKENKOPF e WEICHMAN, 1988; CHAU, 1989). Além disso, recentemente,
Ribeiro et al. (2000) mostraram que a nocicepção induzida pelo ácido acético
depende da liberação de citocinas, como a IL-1β, TNF-α e IL-8, a partir de
macrófagos e basófilos residentes na cavidade abdominal, e que em conjunto com
outros mediadores podem induzir a nocicepção característica observada neste
modelo.
O modelo das contorções abdominais induzidas por ácido acético é um
modelo relativamente simples e com pouca especificidade, mas de fácil observação,
rápido e com boa sensibilidade a várias drogas analgésicas, antiinflamatórias
esteroidais e não-esteroidais, bem como a drogas semelhantes à morfina e outros
analgésicos que atuam centralmente ou mesmo perifericamente. Além disso, os
resultados obtidos com as várias classes de analgésicos neste modelo mostram boa
correlação com a ação analgésica encontrada em outros modelos pré-clínicos, bem
como em estudos clínicos (KOSTER et al., 1959; TABER, 1964; BLUMBERG et al.,
1965; BLANE, 1967; SIEGMUND, 1957a,b; CHAU, 1989). Entretanto, devido à baixa
especificidade da resposta antinociceptiva neste modelo, ensaios complementares
são necessários para a interpretação dos resultados, pois uma variada gama de
compostos
essencialmente
não
analgésicos
como
anti-histamínicos,
parassimpaticomiméticos, estimulantes do sistema nervoso central, inibidores da
78
monoaminaoxidase (MAO), antagonistas serotoninérgicos, relaxantes musculares, e
neurolépticos podem também inibir o writhing (HENDERSHOT e FORSAITH, 1959;
CHERNOV et al., 1967; PEARL et al., 1968; LOUX et al., 1978; RATES e BARROS,
1994).
Os resultados do presente estudo demonstraram que, no modelo das
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, o EES nas doses aqui
utilizadas (25, 50 e 100 mg/kg) e a fração FM (25 mg/kg) obtidos das folhas do S.
umbellatum apresentaram atividade antinociceptiva quando administrados pela via
oral. As frações FH e FC não apresentaram redução no número de contorções
abdominais, indicando que os princípios ativos responsáveis pelas atividades
antinociceptiva e antiinflamatória foram arrastados pelos solventes de maior
polaridade utilizados no fracionamento: uma mistura metanol/água 7:3. Além disso, o
EES foi efetivo de maneira dose-dependente. Como controle positivo do ensaio foi
utilizado indometacina, um antiinflamatório não-esteroidal, também conhecido como
um dos mais potentes inibidores da COX in vitro (VANE, 1971). Como esperado, ele
foi capaz de inibir o número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético.
A
analgesia
moderada
produzida
pelo
ácido
acetilsalicílico
e
pela
indometacina é explicada pela inibição da atividade da COX e redução da síntese de
PGs (VANE, 1971). Entretanto, nos testes padrões em animais nos quais se induz
uma reação inflamatória, tem sido difícil a separação entre a influência da atividade
antiinflamatória
desses
compostos
e
entre
um
efeito analgésico
singular
(HUNSKAAR et al., 1986).
Com o objetivo de melhor caracterizar a atividade antinociceptiva do EES,
utilizamos o teste da formalina em camundongos, um modelo químico de
nocicepção, que fornece uma resposta específica comparativamente ao modelo do
ácido acético (SHIBATA et al., 1989; TJØLSEN et al., 1992), além de ser
considerado o modelo que mais se aproxima da dor clínica (TJØSEN e HOLE,
1997). Descrita originalmente em gatos e ratos por Dubuisson e Dennis (1977), o
teste da formalina foi posteriormente adaptado para camundongos (HUNSKAAR et
al., 1985). A grande maioria dos estudos realizados com esse modelo utiliza
roedores (TJØLSEN et al., 1992), porém, ocasionalmente, outras espécies de
animais podem ser utilizadas, tais como, primatas (ALREJA et al., 1984), coelhos
79
(CARLI et al., 1981), cobaias (TAKAHASHI et al., 1984), crocodilos (KANUI et al.,
1990) e aves (HUGHES e SUFKA, 1991). O ensaio consiste na injeção intraplantar
de formaldeído na pata posterior do animal, a qual desencadeia intensa nocicepção
por estimulação direta dos nociceptores. A nocicepção causada pela formalina é
caracterizada por vigorosas lambidas, mordidas e batidas na pata injetada com o
irritante. A aplicação do agente irritante na pata posterior torna a resposta
nociceptiva mais específica, pois o animal, durante o grooming, utiliza mais
frequentemente as patas anteriores (TJØLSEN et al., 1992). Seguindo as
recomendações de Hunskaar et al. (1985) e Murray et al. (1988) somente as
lambidas (licking) foram contatas em nossos experimentos visto que as mordidas e
batidas são difíceis de serem contadas em camundongos devido ao tamanho
pequeno do animal e seus rápidos movimentos.
O teste da formalina possui uma característica importante em roedores, que é
a apresentação de duas fases distintas de nocicepção, que parecem envolver
diferentes mediadores (DUBUISSON e DENNIS, 1977; HUNSKAAR et al., 1985;
HUNSKAAR e HOLE, 1987; ROSLAND, 1991; CORRÊA e CALIXTO, 1993; SEGUIN
et al., 1995; SANTOS E CALIXTO, 1997). A primeira fase da nocicepção inicia-se
imediatamente após a injeção de formalina, estendendo-se pelos primeiros 5
minutos, o que se acredita ser devido à estimulação química direta dos nociceptores
(DEBUISSON e DENNIS, 1977; HUNSKAAR et al., 1985), predominantemente das
fibras aferentes do tipo C e, em parte, as do tipo Aδ (HEAPY et al., 1987). A segunda
fase desse modelo ocorre entre 15-30 minutos após a injeção de formalina e está
relacionada com a liberação de vários mediadores pró-inflamatórios (HUNSKAAR e
HOLE, 1987).
As pesquisas indicam que vários mediadores químicos como a SP, NO,
bradicinina e aminoácidos excitatórios, como o glutamato, estão envolvidos com a
primeira fase visto que são esses mediadores que fazem a estimulação direta de
nociceptores periféricos que integram as fibras aferentes primárias do tipo C e parte
das do tipo Aδ (DUBUISSON e DENNIS, 1977). A ativação desses nociceptores,
bem como de fibroblastos, mastócitos, neutrófilos e plaquetas, promove a liberação
de muitos mediadores inflamatórios, como histamina, serotonina, taquicininas (SP,
neurocinina A, neurocinina B) e glutamato (FUJIMAKI et al., 1992; SANTOS e
80
CALIXTO, 1997; CAO et al., 1998; OMOTE et al., 1998; BEIRITH et al., 2002) que,
agindo de forma conjunta e/ou sinérgica, sensibilizam as vias nervosas periféricas e
centrais de condução do sinal doloroso, dando origem à segunda fase (ou fase
inflamatória, mais tardia e duradoura) da resposta nociceptiva à formalina
(HUNSKAAR e HOLE, 1987). Entre as duas fases, há uma interfase, na qual o
comportamento nociceptivo não é observado, ou seja, há um período de quiescência
da resposta nociceptiva. A duração da interfase é determinada pela ativação dos
sistemas monoaminérgicos descendentes inibitório e excitatório, que modulam os
sinais nociceptivos ao nível do corno dorsal da medula (HENRY et al., 1999).
A primeira fase do teste da formalina é inibida por agonistas opióides de ação
central, como a morfina e o fentanil, e por antagonistas de receptores de bradicinina
B1 e B2, além de antagonistas de receptores NMDA e de receptores valinóides.
Agonistas opióides de ação exclusivamente periférica e antiinflamatórios esteroidais
e não esteroidais não são capazes de inibir a primeira fase da formalina, porém,
junto ainda com os agonistas opióides de ação central, são capazes de inibir a
segunda fase (HUNSKAAR e HOLE, 1987; SHIBATA et al., 1989; OLUYOMI, 1992;
CORRÊA e CALIXTO, 1993; STEIN, 1993).
O pré-tratamento pela via oral com o EES na dose que produziu efeito
máximo no modelo das contorções abdominais (100 mg/kg) inibiu fortemente tanto a
primeira quanto a segunda fase da formalina. Como esperado, a indometacina, um
AINE, inibiu somente a segunda fase, enquanto a morfina, um agonista opióide de
ação central e periférica, inibiu ambas as fases da formalina. Desta forma, estes
resultados reforçam a hipótese de que esta planta é dotada de importante atividade
antinociceptiva e/ou antiinflamatória.
Através do teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético para
o estudo do mecanismo da atividade antinociceptiva do EES foi verificado que o prétratamento com naloxona, um antagonista opióide não seletivo, inibiu a atividade
antinociceptiva do EES. Esses resultados indicam que os princípios ativos presentes
nas folhas do S. umbellatum interagem com o sistema opioidérgico.
A fim de diferenciar entre uma ação opióide central ou periférica, foi realizado
o teste do tail flick. Este modelo algesiométrico térmico foi introduzido por D’Amour e
81
Smith (1941) e, à semelhança do teste da placa quente (WOOLFE e MACDONALD,
1944), mede o tempo de latência do animal a um estímulo térmico. Estes ensaios
são sensíveis a drogas opióides tipo morfina (JANSSEN et al., 1963), cuja atividade
analgésica é mediada por receptores µ, κ e δ distribuídos no sistema nervoso central
(BESSON e CHAOUCH, 1987; STEIN e SHIPPENBERG, 1989).
O tratamento dos animais com EES, nas mesmas doses utilizadas no teste
das contorções abdominais induzidas por ácido acético, não alterou a latência dos
camundongos ao estímulo térmico doloroso, embora a morfina, um analgésico
opióide utilizado como controle positivo do ensaio, tenha aumentado o tempo de
latência. Esses resultados excluem um mecanismo de antinocicepção dependente
de atividade opióide no sistema nervoso central, e nos leva a sugerir que os
princípios ativos presentes nas folhas do S. umbellatum possivelmente atuam como
agonistas opióides periféricos ou por induzirem a liberação de peptídeos opióides
endógenos perifericamente. O fato do EES não ter modificado o tempo de latência
no teste de tail flick pode ser explicado pelo fato deste modelo ser sensível somente
a drogas de atividade supraespinhal (YAKSH e RUDY, 1977; SMITH et al., 1982,
1985).
Tradicionalmente, o efeito analgésico dos agonistas opióides é explicado por
ação no sistema nervoso central, como ocorre com a morfina e o fentanil (HERZ e
TESCHEMACHER, 1971; MILLAN, 1986). Entretanto, mecanismos periféricos na
atividade analgésica da morfina passaram a ser evidenciados e caracterizados
através da aplicação tópica desses agentes (KAYSER et al., 1990) ou com a
utilização de análogos quaternários de agonistas ou antagonistas opióides, por
exemplo, os alcalóides N-metilmorfina e N-metilnalorfina. Estes agentes, com
mínima capacidade de atravessarem a barreira hematoencefálica, parecem exercer
o efeito analgésico através da interação com receptores opióides presentes nas
terminações nociceptivas periféricas (FERREIRA e NAKAMURA, 1979a,b,c;
FERREIRA et al., 1981; SMITH et al., 1982). Pelo fato dos agonistas opióides
periféricos terem mínimo acesso ao SNC, eles podem ser muito úteis na prática
clínica uma vez que eles são desprovidos de efeitos colaterais centrais típicos, como
os causados por opióides semelhantes à morfina (como depressão respiratória e uso
abusivo). Similarmente, o risco de efeitos adversos poderia ser reduzido com a
82
combinação
de
opióides
periféricos
e
opióides
semelhantes
à
morfina
(SEVOSTIANOVA et al., 2005).
Bentley et al. (1981) utilizando o modelo das contorções abdominais em
camundongos, determinaram que a ação analgésica da morfina e de encefalinas
dependiam, parcialmente, da atuação nas terminações de nervos sensoriais do
peritônio. Estudos com a N-metilmorfina no mesmo modelo de nocicepção (writhing)
ou na hiperalgesia produzida pela injeção intraplantar de PGE2 em ratos mostram
que o efeito analgésico deste alcalóide opióide quaternário era revertido pelo prétratamento com naloxona ou com N-metilnalorfina (LORENZETTI e FERREIRA,
1982; MAGNAN et al., 1982; SMITH et al., 1982).
A utilização de modelos de inflamação ocorre na quase totalidade dos
estudos que caracterizam a atividade antinociceptiva opióide periférica (STEIN,
1993). Aparentemente, a ruptura do perineuro durante o processo inflamatório, além
de induzir hiperalgesia, favorece o acesso e o efeito do opióide no terminal nervoso
sensitivo (OLSSON, 1990, ANTONIJEVIC et al., 1995). Outros autores mostraram
que, na inflamação, o número de receptores opióides está aumentado (supraregulação) nos terminais aferentes periféricos (HASSAN et al., 1993; SCHÄFER et
al., 1995). Por outro lado, a diminuição do pH no local inflamatório aumenta a
eficácia do agonista opióide em inibir a adenilato ciclase (SELLEY et al., 1993).
Estudos in vitro e in vivo demostraram que receptores opióides modulam o
eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e a liberação do fator liberador de
corticotrofina (CRF) na porção endócrina do hipotálamo (PFEIFFER e PFEIFFER,
1984; NIKOLARAKIS et al., 1987). Por outro lado, a glândula adrenal armazena
opióides endógenos, predominantemente encefalinas, que são liberadas junto com
as catecolaminas durante o estímulo de estresse (NORTH e EGAN, 1983). Ferreira
et al. (1995) mostraram que drogas com mecanismo farmacológico semelhante aos
opióides periféricos podem agir através da liberação de opióides das glândulas
adrenais.
Além da possibilidade das adrenais liberarem peptídeos opióides, células do
sistema imunológico também são capazes de fazê-lo. Durante a inflamação,
leucócitos secretam peptídeos opióides que se ligam a receptores em neurônios
83
sensoriais periféricos e medeiam a antinocicepção. Esta secreção pode ser induzida
por estresse ou injeção local de CRF (MOUSA et al., 2003). Em humanos, peptídeos
opióides liberados localmente diminuem a intensidade da dor e o consumo voluntário
de medicamentos analgésicos em condições de estresse pós-cirúrgico (STEIN et al.,
1993). O mecanismo pelos quais os opióides induzem analgesia periférica envolve a
participação dos receptores µ, κ e δ (FERREIRA e NAKAMURA, 1979a,b;
FERREIRA et al., 1984; STEIN et al., 1988, 1989, 1990; KAYSER et al., 1991).
Estudos sugerem que a analgesia promovida por ativação destes receptores possa
ser mediada pela geração de NO a partir da L-arginina e ativação de guanilato
ciclase, uma vez que os receptores opióides periféricos são acoplados a proteína G
e acoplados à via da L-arginina-NO-GMPc (FERREIRA et al., 1991a,b, 1995;
DUARTE et al., 1992; GRANADOS-SOTO et al., 1997; NOZAKI-TAGUCHI e
YAMAMOTO, 1998). A morfina demonstrou exercer sua ação nociceptiva periférica
através da ativação de canais de K+ sensíveis a ATP (RODRIGUES e DUARTE,
2000). Foi demonstrado que a ação antinociceptiva periférica do doador de óxido
nítrico nitroprussiato de sódio e dibutiril GMPc está associada com canais de
potássio sensíveis a ATP, estabelecendo, assim, uma ligação entre a participação
da via do óxido nítrico/GMPc na analgesia induzida por certas drogas e a ativação
de canais de potássio sensíveis a ATP (SOARES et al., 2000, 2001).
A maioria dos leucócitos que contêm peptídeos opióides na fase inicial da
inflamação é do tipo polimorfonuclear (PMN), enquanto que os monócitos
predominam durante a fase mais tardia (RITTNER et al., 2001). Tanto esses
leucócitos circulantes quanto o endotélio vascular expressam moléculas de adesão,
que promovem a migração de leucócitos para o local da inflamação. No entanto,
este importante passo na resolução do processo inflamatório pode ser bloqueado
por anticorpos anti-moléculas de adesão, prejudicando assim a antinocicepção
mediada por opióides (STEIN et al., 2003; MACHELSKA et al., 1998, 2002, 2004).
Por outro lado, o recrutamento de leucócitos polimorfonucleares mediado por
quimiocinas intensifica os processos de rolamento, diapedese e extravasamento de
células, através do aumento da expressão das moléculas de adesão (ZHANG et al.,
2001).
84
Muitos estudos em animais têm demonstrado efeitos antinociceptivos
proeminentes dos opióides em modelos de dor persistente com componentes de
inflamação tecidual (JORIS et al., 1987). Além disso, tem sido mostrado que esses
efeitos antiinflamatórios são devidos, principalmente, à ativação de receptores
opióides periféricos (STEIN et al., 1989), os quais, como dito anteriormente, sofrem
supra-regulação durante a inflamação e são ativados por peptídeos opióides
endógenos produzidos por células do sistema imunológico que migram para o tecido
inflamado (STEIN et al., 1989; PRZEWLOCKI et al., 1992).
O fato de o EES atuar no sistema opioidérgico periférico explica a inibição da
segunda fase da formalina, porém não explica a inibição da primeira. A inibição da
primeira fase da formalina poderia ser justificada, dentre muitas possibilidades, pela
ação dos aminoácidos excitatórios (glutamato e aspartato) ou SP no sistema
nervoso periférico Essas substâncias apresentam papel importante no processo de
sensibilização do corno dorsal da medula espinhal, uma vez que a estimulação das
fibras aferentes primárias induzindo a liberação desses transmissores no local
(MILLAN, 1999, 2002). Outros estudos mostram que os aminoácidos excitatórios,
quando injetados pela via intraplantar ou intratecal, promovem um comportamento
nociceptivo (AANONSEN e WILSON, 1987; BEIRITH et al., 2002).
O glutamato é o neurotransmissor encontrado em maior concentração nas
sinapses excitatórias nos cérebros de mamíferos e possui um papel fisiológico
(memória e aprendizado) e patológico (doenças neurodegenerativas e na dor aguda
e crônica). Entretanto, apresenta uma importância mais relevante nas condições
crônicas que envolvem a patogênese da dor neuropática (GAVIRAGHI, 2000). O
glutamato atua em receptores localizados no sistema nervoso periférico através da
interação com receptores NMDA e não NMDA por um mecanismo que depende da
ativação da via L-arginina-óxido nítrico, causando, portanto, dor (BEIRITH, 2002).
Assim, a administração espinhal de antagonista de SP e/ou glutamato é capaz de
bloquear a facilitação do processo nociceptivo produzido pela estimulação direta ou
prolongada das fibras C (DICKENSON e SULLIVAN, 1987a,b; CODERRE e
MELZACK, 1991; MALMBERG e YAKSH, 1992; MAO et al., 1992; REN et al., 1992;
YAMAMOTO e YAKSH, 1992).
85
Antagonistas de bradicinina (B1 e B2) também têm mostrado capazes de
inibir a primeira fase da formalina (HUNKAAR e HOLE, 1987). A SP, neurocininas A
e B podem estimular diferentes tipos de receptores taquicinérgicos (MAGGI et al.,
1987; LAVIELLE et al., 1988; QUIRION e DAM, 1988). Quaisquer moléculas que
antagonizam esses receptores são capazes de inibir a primeira fase da formalina.
A segunda fase da formalina pode ser inibida também por agentes
antiinflamatórios. Assim, a investigação dessa atividade também foi realizada
através de um modelo que mede a atividade antiedematogênica e um outro que
quantifica a inibição da migração de leucócitos para o foco inflamatório.
O tecido conjuntivo possui uma população transitória e uma residente, as
quais são influenciadas por processos inflamatórios e infecciosos e está intimamente
associado a todos os tecidos do corpo, refletindo suas condições fisiológicas (BRITO
et al., 1998; GAHMBERG et al., 1999; CUMMINGS, 1999; GARTNER e HIATT,
1999; BORINI e GUIMARÃES, 1999; CATÃO-DIAS e SINHORINI, 1999). Assim,
uma agressão a um tecido adjacente ao tecido conjuntivo desencadeia a liberação
de mediadores que atraem, para o local lesado, células da população transitória que,
em cooperação com as células residentes, buscam inibir o processo inflamatório
(VELO et al., 1973; KUHNS et al., 1992; FAITLWICZ, 1993; DOWNEY et al., 1995;
MARINHO et al., 1997; BRITO et al., 1998; FAIÇAL e UEHARA, 1998; GAHMBERG
et al., 1999; CUMMINGS, 1999; GARTNER e HIATT, 1999).
A migração celular até o tecido injuriado ocorre por um complexo ciclo de
eventos, ainda não totalmente esclarecidos, mas estudados há muitos anos, que
permite às células se locomoverem do espaço vascular para o extravascular e
dentro do espaço intersticial, exercendo suas funções de defesa em um padrão
comportamental conhecido (DRUBIN e NETSONT, 1996; LAUFFENBURGER e
HORWITZ, 1996; MITCHISON e CRAMER, 1996; ASSOIAN, 1997; BRITO et al.,
1998; CATÃO-DIAS e SINHORINI, 1999; CUMMINGS, 1999; GAHMBERG et al.,
1999; HYNES et al., 1999; BOROJEVIC, 1999; SMILENOV et al., 1999; SERVANT,
2000; JIN, 2000).
Para a verificação da atividade antiedematogênica do EES e da fração FM foi
utilizado o teste do edema de orelha induzido por óleo de cróton. Neste ensaio, a
86
intensidade do edema, induzida pela aplicação tópica de um agente irritante na
cavidade auricular externa, é avaliada como parâmetro de atividade antiinflamatória
de substâncias administradas anteriormente ao agente irritante. O óleo de cróton é
um irritante que provoca a migração de leucócitos causando edemas intervasculares
(SWINGLE et al., 1981). Ele possui na sua composição o acetato de tetradecanoilforbol que é um dos responsáveis por sua ação irritante e formação de edema e está
relacionado ao aumento da permeabilidade vascular e exsudação plasmática
(PUIGNERO et al., 1998; LAPA et al., 2003). Assim, devem-se considerar, ao
interpretar os resultados deste ensaio, fatores que influenciam a formação do
edema, tais como a perfusão vascular do tecido, pressão sanguínea sistêmica e
nível de glicocorticóides, pois a intensidade do edema é o parâmetro observado
quanto à ação antiinflamatória analisada (RATES e BARROS, 1994; SOUCCAR e
LAPA, 1997).
Na avaliação pelo teste de edema de orelha induzido pelo óleo de cróton, o
tratamento prévio dos camundongos com EES e com a FM, em diferentes doses,
bem como a dexametasona, controle positivo do teste, foram capazes de reduzir a
formação do edema de maneira dose-dependente. A FM foi a fração escolhida para
ser avaliada quanto à atividade antiinflamatória visto que ela foi a única das frações
capaz de inibir o número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético.
Contudo, os resultados obtidos não dão suporte para se afirmar em qual das fases
do processo inflamatório se deu a intervenção do EES e da FM, pois um processo
inflamatório caracteriza-se por três fases distintas (FREIRE, 1992), coexistentes a
partir de um dado momento: uma fase aguda, onde ocorre vasodilatação, aumento
da permeabilidade vascular e extravasamento líquido, tendo como principais
mediadores a histamina, a serotonina, as cininas e os produtos do AA; uma fase
tardia, onde ocorre quimiotaxia e migração celular; e uma fase crônica, caracterizada
por degeneração e fibrose.
Assim, não ficou evidente o mecanismo de ação do efeito antiedematogênico
gerado pelo EES e pela FM, o qual pode ter várias explicações, dentre elas, uma
ação inespecífica gerando vasoconstricção, feedback negativo por ligação a
receptores autacóides, inibição da liberação de enzimas lisossômicas e estabilização
das membranas celulares; ou por mecanismos de inibição da migração celular, se foi
por uma ação direta sobre a cascata do AA, seja inibindo a COX e acil-hidrolases,
87
seja inibindo a fosforilação do complexo PLA2/anexina 1 em PLA2 ativada; ou se foi
por ligação a receptores citoplasmáticos que enviam um sinal
para o núcleo e
promovem um mecanismo de ação gênica, ou mesmo através de outros
mecanismos antiinflamatórios pouco estudados ou desconhecidos (FAIÇAL e
UEHARA, 1998). A presença de alguns mecanismos de ação gênica, bem como da
degeneração e fibrose estão descartados para tratamentos agudos, como os
realizados por nós, entretanto não se pode desconsiderar a sua presença em
tratamentos crônicos e, portanto, esta possibilidade deverá ser investigada
futuramente.
A redução da quimiotaxia é uma importante resposta observada em
tratamentos nos quais se utilizam antiinflamatórios. A migração leucocitária está
relacionada à ação do AA produzido através da ação da LOX sobre o mesmo
previamente liberado pela PLA2 (BRAIN e WILLIANS, 1990; YOKOMIZO et al.,
1995; BRITO et al., 1998; FAIÇAL e UEHARA, 1998; BORINI e GUIMARÃES, 1999;
GAHMBERG et al., 1999; WAGNER e ROTH, 2000). A composição celular da
inflamação está relacionada ao tipo de estímulo inflamatório e ao ambiente em que
ela se desenvolve, estando os neutrófilos, por exemplo, associados a respostas
rápidas a infecções e danos tissulares, e os eosinófilos a inflamações alérgicas,
enquanto monócitos e linfócitos são normalmente recrutados na inflamação crônica
(ADAMS e LLOYD, 1997). Os neutrófilos são as primeiras células leucocitárias a
migrarem através do endotélio para o sítio inflamatório (WITKO-SARSAT et al.,
2000). A inibição da COX pode resultar em migração leucocitária devido à
conseqüente inibição da liberação de diversas interleucinas (ILs) e TNF, porém é
mais provável que uma inibição de LOX ou de PLA2 resulte em uma redução na
migração leucocitária, visto que um dos agentes quimiotáticos, como por exemplo, o
leucotrieno B4 (LTB4), teria a sua produção diminuída.
O aumento da quantidade de leucócitos no sítio inflamatório pode ser
interpretado como uma ação pró-inflamatória, resultando em altas concentrações de
enzimas lisossômicas e aumento no dano tissular (HIGGS et al., 1980). Mikami e
Miyasaka (1983) demonstraram que, na pleurisia induzida por carragenina em ratos,
o efeito antiexsudativo dos antiinflamatórios não esteroidais estaria associado
principalmente à redução de PGE2 e, parcialmente, à redução da atividade de
88
enzimas lisossomais, enquanto a atividade antiinflamatória dos antiinflamatórios
esteroidais seria explicada pela redução da migração leucocitária.
A ação dos glicocorticóides pode estar relacionada à regulação da expressão
de genes envolvidos na resposta inflamatória, havendo uma interação dos
glicocorticóides com receptores específicos, formando dímeros que migram para o
núcleo e se ligam a elementos de resposta aos esteróides, exercendo efeitos
repressores ou indutores (BIOLA e PALLARDY, 2000; HANG et al., 2004; NORMAN
et al., 2004). Podem, por exemplo, interagir com os genes responsáveis pela
produção de diversas enzimas responsáveis pela formação de PGs, inibindo a
transcrição do RNA mensageiro (RNAm) destas enzimas (NEWTON et. al., 1998),
com o gene da anexina 1, induzindo sua expressão (WALLNER et al., 1986), além
de interferirem na síntese e liberação de ILs e TNF (UTSUNOMIYA et al., 1994).
A anexina 1 possui atividade inibidora da PLA2 intra e extracelular podendo
ser
considerada
como
segundo
mensageiro
responsável
pela
ação
dos
glicocorticóides no processo inflamatório (FAROOQUI et al., 1999). As ações da
anexina 1 estão relacionadas à uma inibição direta da PL assim como uma inibição
de sua ativação, além da inibição de outras enzimas relacionadas à inflamação,
como a óxido nítrico sintase (NOS) e COX-2 (PARENTE e SOLITO, 2004).
Para avaliar a atividade do EES na migração de leucócitos totais para o local
da inflamação, utilizamos o teste de peritonite induzido por carragenina. A
carragenina, um polissacarídeo sulfatado, desencadeia uma inflamação aguda
envolvendo
liberação
seqüencial
de
vários
mediadores
pró-inflamatórios,
principalmente a histamina, a serotonina, as cininas, as PGs e os tromboxanos (DI
ROSA et al., 1971; DAMAS et al., 1990). Este modelo de inflamação aguda permite
a quantificação de leucócitos que migram para a cavidade peritoneal sob a ação de
agentes quimiotáticos, principalmente LTs e ILs, sendo sensível à ação de
antiinflamatórios esteroidais (VINEGAR et al., 1973; HIGGS et al., 1980; MIKAMI e
MIYASAKA, 1983; BROOKS e DAY, 1991).
A administração oral de EES nas mesmas doses utilizadas no modelo das
contorções abdominais reduziu de forma dose-dependente o número de leucócitos
que migraram para a cavidade peritoneal, seguindo o perfil da dexametasona,
89
controle positivo do teste. Esse resultado, somado ao resultado positivo no teste de
edema de orelha induzido por óleo de cróton sugere fortemente que o EES possui
uma ação antiinflamatória, assim como a FM, de acordo com o modelo
antiedematogênico. Essa ação antiinflamatória é capaz de reduzir a migração de
leucócitos para o foco inflamatório, mostrando a possível interferência do EES nos
mecanismos quimiotáticos.
Durante
os
nossos
experimentos,
verificamos
uma
mudança
no
comportamento dos animais após a administração do EES, o que nos levou a
estudar uma possível atividade depressora no SNC. Além disso, considerando que
os modelos utilizados para a avaliação da atividade antinociceptiva sempre exigem
respostas motoras dos animais, resultados falso positivos poderiam ser obtidos caso
ocorresse incoordenação motora por sedação e/ou relaxamento muscular.
O efeito do EES e das frações FH, FC e FM foi estudado no teste do rota-rod.
Neste teste, o pré-tratamento dos animais com o EES e com as frações FH, FC e
FM nas doses utilizadas no modelo das contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético não modificou o número de quedas, nem o tempo de permanência dos
camundongos no rota-rod, excluindo as influências motoras. Este resultado indica
também que o efeito antinociceptivo do EES e da FM não parece ser acompanhado
de sedação ou relaxamento muscular.
No teste do campo aberto, cinco parâmetros foram avaliados: o número de
quadrados invadidos, o tempo parado, o número de levantadas, o número de autolimpeza e o número de bolos fecais. O EES, nas doses utilizadas, não alterou o
número de quadrados invadidos, o que confirma a não influência do EES na
atividade locomotora dos animais. O tempo parado, porém, foi diminuído, o que é
sugestivo de uma atividade depressora do SNC, sendo que este efeito pode vir a ser
um efeito ansiolítico, que ainda deve ser melhor investigado. O número de bolos
fecais diminuído pode também indicar um efeito depressor do SNC, como também
pode ter sido provocado por uma atividade anticolinérgica ou até mesmo por uma
diminuição do peristaltismo provocada por agonistas opióides. Não houve alteração
no número de levantadas e no número de auto-limpeza.
90
O teste do campo aberto também foi realizado com as frações FH, FC e FM.
Nenhuma das frações foi capaz de alterar o número de quadrados invadidos, nem o
número de levantadas, nem o número de auto-limpeza. Esse resultado é condizente
ao observado com o EES, e também mostrou que as frações não alteraram a
atividade locomotora dos animais. O tempo parado só foi aumentado pela FC,
enquanto o número de bolos fecais só foi diminuído pela FH. Estes resultados
condizem com o observado no mesmo experimento realizado com o EES, visto que
os únicos parâmetros alterados, tanto para o EES como para as frações, foram o
tempo parado e o número de bolos fecais.
Ainda para verificar a atividade depressora do SNC, utilizou-se o modelo da
potenciação do sono induzido por barbitúrico. Neste modelo, substâncias que
deprimem o SNC, em geral, aumentam a duração do sono produzido pelo
pentobarbital, ligante de sítios localizados nos receptores GABAérgicos do tipo A
(CHWEH et al., 1987, LANCEL, 1999). Os benzodiazepínicos apresentam esse
efeito, evidenciado principalmente pelo prolongamento da duração do sono induzido
por agentes hipnóticos, o que foi bem observado nos resultados obtidos, quando o
diazepam promoveu aumento do tempo de sono induzido por barbitúrico.
Os nossos experimentos mostraram que o EES (25, 50 e 100 mg/kg) e as
frações FH e FC, mas não a fração FM, foram capazes de potencializar o sono
induzido por barbitúrico, sugerindo um efeito depressor do SNC do EES e das
frações FH e FC. Esse efeito depressor do SNC observado no EES e nas frações
FH e FC ainda foram confirmados pelos dados obtidos através do teste do campo
aberto. A dose das frações administradas foi o equivalente a aproximadamente o
dobro da maior dose utilizada com o EES (100 mg/kg), entretanto, em termos
percentuais, o EES na dose de 100 mg/kg foi capaz de potencializar a ação do
pentobarbital mais do que as frações FH e FC isoladamente, sugerindo que o efeito
das frações FH e FC sejam aditivos.
Os efeitos depressores do SNC das frações FH e FC condizem com as
características químicas das substâncias nelas presentes, visto que o n-hexano
arrasta substâncias de baixa polaridade e o clorofórmio arrasta substâncias de
polaridade intermediária.
Assim, como é sabido, para uma ação no SNC, as
substâncias têm que penetrar a barreira hematoencefálica e, geralmente, somente
91
moléculas de baixa polaridade tendem a atravessá-la, como o que parece ter
acontecido com as frações FH e FC. Além disso, a fração FM, que possui moléculas
de alta polaridade, não apresentou efeito depressor do SNC.
Uma possibilidade que não pode ser descartada é a de que a potenciação do
sono induzido pelo EES e pelas frações FH e FC pode ter ocorrido devido a uma
interferência de ordem farmacocinética, o que pode levar a um resultado falso
positivo na avaliação do efeito depressor do SNC nesse modelo utilizado (VIEIRA,
2001). As enzimas hepáticas, envolvidas no processo de metabolização de diversos
compostos, são importantes para a metabolização dos barbitúricos no organismo
animal (PACIFICI, 1995), sendo também usadas na metabolização de outros
xenobióticos como os constituintes de plantas ditas medicinais.
A este respeito, há alguns trabalhos mostrando a interação farmacocinética
entre espécies de plantas, como Smilax sp, Eucalyptus globulus, Blupeurum
falcatum, Piper methysticum, Stachytarpheta cayennensis, entre outras, com
fármacos tais como diazepam, álcool etílico e barbitúricos (BLUMENTHAL, 2000;
BLUMENTHAL et al., 1998; CUPP, 1999; HU et al., 2005; VIEIRA, 2001). Assim, a
potenciação do sono induzido por barbitúrico poderia ser resultado de uma
interferência, competição ou inibição do sistema microssomal hepático, o qual
metaboliza o pentobarbital sódico. A administração de Hypericum perforatum, por
exemplo, afeta o sistema micromossomal hepático P450, aumentando a atividade da
isoenzima CYP3A4, o que reduz, possivelmente, a atividade de fármacos que são
substratos para essa enzima e que são administrados simultaneamente com a
mesma, incluindo anti-histamínicos não-sedativos, contraceptivos orais, alguns
antiretrovirais, antiepilépticos, bloqueadores de canais de cálcio, ciclosporina, alguns
quimioterápicos, antibióticos macrolídeos, e antifúngicos (ROBY et al., 2000). Alguns
compostos presentes no EES e nas frações FH e FC poderiam estar contribuindo
para esse efeito potencializador do sono induzido por barbitúrico.
A possibilidade de interferência farmacocinética do EES e das frações FH e
FC sobre as enzimas hepáticas deve ser melhor investigada para se compreender
seus efeitos farmacológicos, mas principalmente pela questão de segurança
farmacológica, já que o uso concomitante com muitos outros fármacos é muito
comum, e pode interferir com seus efeitos terapêuticos. Uma maneira possível para
92
descartar essa possível interferência farmacocinética seria a realização do teste de
potenciação do sono induzido por éter, visto que essa substância não sofre
metabolização do sistema enzimático P450.
Faz-se necessário, portanto, investigar de modo mais profundo a possível
atividade depressora do SNC do EES e das frações FH e FC e tentar comprovar ou
descartar uma possível atividade ansiolítica e uma possível capacidade de inibição
enzimática. Além disso, uma maior purificação das frações se faz necessária, a fim
de se tentar isolar e identificar os princípios ativos responsáveis pelas ações
farmacológicas encontradas neste estudo.
Conclusões
94
7. CONCLUSÕES
1. O EES possui atividade antinociceptiva e antiinflamatória, além de uma
possível atividade depressora do SNC.
2. A atividade antinociceptiva do EES envolve a ação do sistema opióide
periférico, sendo essa ação através de atividade agonista opióide periférica ou
através da indução da liberação de peptídeos opióides periféricos.
3. A atividade antiinflamatória do EES envolve mecanismos capazes de reduzir
a formação de edemas e o número de leucócitos totais que migram para o
foco inflamatório.
4. A
FM
é
a
fração
responsável
pelas
atividades
antinociceptiva
e
antiinflamatória.
5. As frações FH e FC são as frações responsáveis pelo possível efeito
depressor do SNC.
6. Este estudo respalda o uso popular do Synadenium umbellatum como
analgésico e antiinflamatório.
Referências
Bibliográficas
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96
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Apêndice
121
APÊNDICE A – Tabelas de dados
Tabela 1 – Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em
salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (60 min) pela
via p.o. com veículo (grupo controle; C), com o extrato etanólico das folhas do S.
umbellatum (EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) (A), com as frações hexânica (FH, 10
mg/kg), clorofórmica (FC, 20 mg/kg) e metanol/água (FM, 25 mg/kg) (B) ou com
indometacina (INDO; 10 mg/kg).
A (EES)
Animal
C
EES 25
EES 50
EES 100
INDO
1
80
57
47
36
45
2
78
55
49
39
48
3
80
57
50
32
47
4
83
62
45
38
46
5
74
60
46
35
45
6
69
58
44
29
49
Média ± EPM
77,3 ± 2,1
58,2 ± 1,0*
46,8 ± 0,9*
34,8 ± 1,5*
46,7 ± 0,7*
B (Frações)
Animal
C
FH 10
FC 20
FM 25
INDO
1
80
69
72
28
45
2
78
74
76
30
48
3
80
81
63
28
47
4
83
81
82
38
46
5
74
75
73
31
45
6
69
89
89
34
49
Média ± EPM
77,3 ± 2,1
78,2 ± 2,9
75,8 ± 3,4
31,5 ± 1,6*
46,7 ± 0,7*
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Os grupos tratados com as diferentes doses de EES são significativamente
diferentes entre si (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
122
Tabela 2 – Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata
posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 – 5 min) (A) e segunda
fase (15 – 30 min) (B) do teste da formalina, previamente tratados (60 min) pela via
p.o. com veículo (grupo controle, C), com o EES (100 mg/kg), com morfina (MOR; 10
mg/kg s.c.) ou com indometacina (INDO; 10 mg/kg).
A (Primeira fase)
Animal
C
EES 100
MOR
INDO
1
95
67
4
119
2
116
48
0
122
3
162
48
20
93
4
165
73
97
102
5
115
55
15
137
6
78
26
64
65
7
93
78
8
91
68
9
189
84
10
90
66
Média ± EPM
119,4 ± 12,2
61,3 ± 5,4*
33,3 ± 15,8*
106,3 ± 10,4
123
B (Segunda fase)
Animal
C
EES 100
MOR
INDO
1
250
78
13
61
2
405
113
0
149
3
360
31
50
162
4
233
87
136
145
5
121
22
15
150
6
326
3
42
133
7
252
96
8
226
97
9
269
105
10
273
98
Média ± EPM
271,5 ± 24,9
73,0 ± 12,4*
42,7 ± 20,2*
133,3 ± 15,0*
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
124
Tabela 3 – Influência do tratamento prévio com o antagonista opióide não seletivo
naloxona (3 mg/kg, s.c.) sobre a atividade antinociceptiva do EES (100 mg/kg, p.o.)
e fentanil (100 µg/kg, s.c.) no modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético.
Salina
Naloxona
Salina
Naloxona
Salina
Naloxona
Animal
Veículo
Veículo
EES
100 mg/kg
EES
100 mg/kg
Fentanil
100 µg/kg
Fentanil
100 µg/kg
1
68
57
42
68
3
62
2
74
71
37
59
4
72
3
59
64
47
70
7
63
4
76
68
41
72
10
68
5
69
67
46
69
7
74
6
75
79
48
75
7
61
Média ± EPM
70,1 ± 2,6
67,7 ± 3,0
43,5 ± 1,7*
68,8 ± 2,2
#
6,3 ± 1,0*
##
66,7 ± 2,2
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
# Estatisticamente diferente do grupo tratado com EES 100 mg/kg e pré-tratado com
salina (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
## Estatisticamente diferente do grupo tratado com fentanil 100 µg/kg e pré-tratado
com salina (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
125
Tabela 4 – Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do tail flick em
camundongos antes e após tratamento por via p.o. com o veículo (A), com EES 25
(B), 50 (C) ou 100 (D) mg/kg, ou morfina (E) (10 mg/kg, s.c.).
A (Controle)
Imersão das
caudas (min)
Animal
-60
-30
0
1
3,66
2,20
3,14
2
2,20
4,27
3,10
3
1,25
2,94
4
3,86
5
6
Média ± EPM
30
60
90
120
2,53
3,14
2,28
3,53
1,68
3,60
3,75
6,38
1,59
1,62
2,46
3,28
3,96
2,60
1,86
4,85
2,57
3,72
3,21
3,23
1,77
1,16
2,18
3,88
5,27
5,78
3,16
2,47
2,88
3,73
2,64
1,25
2,97
2,89 ± 0,40
2,71 ± 0,36
2,29 ± 0,35
2,79 ± 0,31
3,58 ± 0,66
3,40 ± 0,39
3,61 ± 0,69
60
90
120
Tempo (s)
B (EES 25 mg/kg)
Imersão das
caudas (min)
Animal
-60
-30
0
30
1
3,08
2,45
2,16
4,09
3,45
3,74
3,73
2
1,07
1,57
1,15
1,67
3,52
4,41
4,37
3
3,49
2,25
2,01
3,00
2,33
1,43
4,00
4
1,70
1,50
3,03
4,28
3,62
3,18
3,45
5
2,02
2,02
2,87
2,29
1,26
1,56
2,45
6
0,90
1,48
1,32
4,41
3,07
3,65
1,25
Média ± EPM
2,04 ± 0,43
1,88 ± 0,17
2,09 ± 0,31
3,37 ± 0,35
3,26 ± 0,50
3,01 ± 0,44
2,73 ± 0,50
60
90
120
Tempo (s)
C (EES 50 mg/kg)
Imersão das
caudas (min)
Animal
-60
-30
0
30
Tempo (s)
1
1,89
3,63
3,22
5,39
4,48
2,41
1,98
2
2,26
3,54
2,07
2,78
3,77
5,70
3,14
3
1,37
1,11
2,29
2,39
3,14
4,33
3,97
4
1,22
2,74
0,78
6,88
1,87
1,74
1,32
5
1,53
2,77
2,37
3,29
2,91
2,39
4,48
6
1,63
1,41
1,13
4,44
0,94
4,31
1,26
Média ± EPM
1,65 ± 0,15
2,53 ± 0,43
1,98 ± 0,36
3,47 ± 0,54
3,78 ± 0,48
3,00 ± 0,83
2,97 ± 0,67
126
D (EES 100 mg/kg)
Imersão das
caudas (min)
Animal
-60
-30
0
1
2,97
2,56
2,65
2
2,48
3,16
3,44
3
1,35
2,73
4
3,92
3,06
5
0,99
6
Média ± EPM
30
60
90
120
5,71
4,85
2,49
3,14
2,88
3,49
3,87
5,86
3,54
2,67
3,32
2,05
2,80
1,26
1,37
5,02
1,95
3,46
3,74
3,86
1,55
2,43
4,46
4,59
1,20
1,43
3,48
1,86
3,00
1,62
1,36
2,15 ± 0,48
2,78 ± 0,32
3,04 ± 0,39
3,76 ± 0,51
3,43 ± 0,55
2,63 ± 0,57
2,82 ± 0,59
60
90
120
Tempo (s)
E (Morfina 10 mg/kg)
Imersão das
caudas (min)
Animal
-60
-30
0
1
3,58
2,96
2,42
20,00
13,78
13,21
9,65
2
1,28
2,52
4,10
20,00
20,00
20,00
20,00
3
1,18
1,84
0,91
20,00
13,65
14,95
19,03
4
2,44
3,50
4,64
20,00
20,00
20,00
20,00
5
2,14
1,62
2,70
20,00
20,00
18,90
13,54
6
4,34
2,49
±
0,51
2,42
2,48
±
0,28
2,69
2,91
±
0,54
20,00
20,00
±
0,00*
20,00
17,91
±
1,32*
20,00
17,84
±
1,22*
20,00
17,04
±
1,80*
Média ± EPM
30
Tempo (s)
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
127
Tabela 5 – Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em
acetona) nos grupos previamente tratados pela via p.o. com veículo (C), com extrato
etanólico de S. umbellatum (EES 25, 50 ou 100 mg/kg) (A), com fração
metanol/água (FM 6, 12 ou 25 mg/kg) (B) ou com dexametasona (DEXA; 2 mg/kg).
A (EES)
Animal
C
EES 25
EES 50
EES 100
DEXA
1
30,0
14,6
11,2
9,1
5,9
2
22,1
15,4
11,6
8,7
6,3
3
23,6
15,3
12,5
8,0
1,9
4
14,3
14,9
11,3
8,3
2,8
5
23,3
14,3
13,8
8,7
3,2
6
18,7
14,9
13,7
9,7
0,8
7
19,9
17,5
11,3
9,0
Média ± EPM
21,7 ± 1,8
15.3 ± 0,4*
12,2 ± 0,4*
8,8 ± 0,2*
3,5 ± 0,9*
B (Frações)
Animal
C
FM 6
FM 12
FM 25
DEXA
1
30,0
16,2
13,8
4,5
5,9
2
22,1
15,3
17,3
6,7
6,3
3
23,6
17,5
10,0
9,4
1,9
4
14,3
16,7
10,1
8,9
2,8
5
23,3
16,3
12,9
7,9
3,2
6
18,7
20,0
13,4
7,9
0,8
7
19,9
18,0
10,8
12,5
19,8
14,8
17,4 ± 0,6*
12,9 ± 0,9*
8
Média ± EPM
21,7 ± 1,8
8,3 ± 0,9*
3,5 ± 0,9*
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Os grupos tratados com as diferentes doses de EES ou FM são significativamente
diferentes entre si (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
128
Tabela 6 – Migração de leucócitos totais (x 106) no modelo de peritonite induzida por
carragenina (1% m/v) injetada na cavidade intraperitoneal de camundongos
previamente tratados pela via p.o. com veículo (C), com extrato etanólico de S.
umbellatum (EES 25, 50 ou 100 mg/kg) ou dexametasona (DEXA; 2 mg/kg).
Animal
C
EES 25
EES 50
EES 100
DEXA
1
12,0
8,8
6,9
6,4
4,0
2
11,3
7,2
8,8
3,6
3,4
3
10,8
9,5
6,8
5,5
6,5
4
10,4
10,5
7,3
4,4
4,1
5
13,7
7,4
7,9
3,8
3,1
6
10,6
8,9
6,6
7,4
2,9
7
11,3
8,2
6,8
7,5
3,3
8
11,3
10,8
7,2
3,9
3,3
9
11,8
10
11,1
Média ± EPM
11,4 ± 0,3
5,3 ± 0,6*
3,8 ± 0,4*
7,0
8,9 ± 0,5*
7,3 ± 0,2*
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
Os grupos tratados com as diferentes doses de EES são significativamente
diferentes entre si (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
129
Tabela 7 – Número de quedas (A) e tempo de permanência (B) no rota-rod, de
camundongos previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C), com o
extrato etanólico das folhas do S. umbellatum (EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) (1) com
as frações hexânica (FH, 10 mg/kg), clorofórmica (FC, 20 mg/kg), metanol/água (FM,
25 mg/kg) (2) ou com diazepam (DZP; 5 mg/kg).
A1 (Número de quedas - EES)
Animal
C
EES 25
EES 50
EES 100
DZP
1
0
1
0
1
3
2
0
0
2
1
2
3
0
0
0
1
1
4
1
1
1
1
1
5
0
0
0
0
3
6
0
1
1
1
1
7
0
1
0
0
3
Média ± EPM
0,1 ± 0,1
0,6 ± 0,2
0,6 ± 0,3
0,7 ± 0,2
2,0 ± 0,4*
A2 (Número de quedas - Frações)
Animal
C
FH 10
FC 20
FM 25
DZP
1
0
0
0
0
3
2
0
1
1
2
2
3
0
0
1
0
1
4
1
1
0
0
1
5
0
0
0
0
3
6
0
0
0
0
1
7
0
1
0
0
3
Média ± EPM
0,1 ± 0,1
0,4 ± 0,2
0,3 ± 0,2
0,3 ± 0,3
2,0 ± 0,4*
130
B1 (Tempo de permanência - EES)
Animal
C
EES 25
EES 50
EES 100
DZP
1
60
60
60
60
14
2
60
60
60
60
60
3
60
60
60
60
60
4
60
60
60
60
60
5
60
60
60
60
14
6
60
60
60
60
60
7
60
60
60
60
11
Média ± EPM
60 ± 0,0
60 ± 0,0
60 ± 0,0
60 ± 0,0
39,9 ± 9,5*
B2 (Tempo de permanência - Frações)
Animal
C
FH 10
FC 20
FM 25
DZP
1
60
60
60
60
14
2
60
60
60
60
60
3
60
60
60
60
60
4
60
60
60
60
60
5
60
60
60
60
14
6
60
60
60
60
60
7
60
60
60
60
11
Média ± EPM
60 ± 0,0
60 ± 0,0
60 ± 0,0
60 ± 0,0
39,9 ± 9,5*
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
131
Tabela 8 - Número de quadrados invadidos, tempo parado (segundos), número de
levantadas, número de auto-limpeza e número de bolos fecais no campo aberto 60
minutos após o tratamento p.o. com veículo (C) (A), extrato etanólico de S.
umbellatum (EES 25 (B), 50 (C) ou 100 mg/kg (D)), FH (10 mg/kg) (E), FC (20
mg/kg) (F), FM (25 mg/kg) (G) ou diazepam (DZP, 5 mg/kg) (H).
A (Controle)
Animal
Número de
quadrados
invadidos
Tempo parado
(segundos)
Número de
levantadas
Número de
auto-limpeza
Número de
bolos fecais
1
34
26
11
51
2
2
42
42
11
15
6
3
31
29
13
65
1
4
54
23
20
73
1
5
49
45
24
46
2
6
40
16
10
23
2
7
41
22
20
58
6
8
59
26
14
53
5
Média ± EPM
43,8 ± 3,4
28,6 ± 3,5
15,4 ± 1,9
48,0 ± 7,0
3,1 ± 0,8
B (EES 25 mg/kg)
Animal
Número de
quadrados
invadidos
Tempo parado
(segundos)
Número de
levantadas
Número de
auto-limpeza
Número de
bolos fecais
1
53
66
17
26
2
2
58
59
19
83
2
3
49
109
19
42
1
4
52
48
18
73
1
5
48
88
15
35
0
6
67
48
10
74
2
7
51
55
5
93
0
8
34
65
14
46
1
Média ± EPM
51,5 ± 3,3
67,2 ± 7,5*
14,6 ± 1,7
59,9 ± 8,7
1,1 ± 0,3*
132
C (EES 50 mg/kg)
Animal
Número de
quadrados
invadidos
Tempo parado
(segundos)
Número de
levantadas
Número de
auto-limpeza
Número de
bolos fecais
1
62
74
11
35
2
2
18
173
4
23
2
3
33
136
1
21
0
4
56
125
6
0
0
5
43
69
12
71
0
6
54
106
18
20
1
7
51
152
20
58
1
8
45
127
15
36
1
Média ± EPM
45,2 ± 5,0
120,3 ± 12,7*
10,9 ± 2,4
33,0 ± 8,0
0,9 ± 0,3*
D (EES 100 mg/kg)
Animal
Número de
quadrados
invadidos
Tempo parado
(segundos)
Número de
levantadas
Número de
auto-limpeza
Número de
bolos fecais
1
19
179
2
60
0
2
63
30
19
84
0
3
55
123
19
46
2
4
85
93
3
40
0
5
48
105
11
73
1
6
25
52
12
32
2
7
59
103
32
45
2
8
30
145
18
43
2
Média ± EPM
48,0 ± 7,9
103,8 ± 16,9*
14,5 ± 3,5
52,9 ± 6,3
1,1 ± 0,4*
133
E (FH 10 mg/kg)
Animal
Número de
quadrados
invadidos
Tempo parado
(segundos)
Número de
levantadas
Número de
auto-limpeza
Número de
bolos fecais
1
61
113
16
50
2
2
30
21
20
75
0
3
54
5
19
37
0
4
37
10
15
37
2
5
22
15
3
112
1
6
36
5
13
62
2
7
62
10
17
0
0
8
57
5
13
75
0
Média ± EPM
44,9 ± 5,5
23,0 ± 13,1
14,5 ± 1,9
56,0 ± 11,8
1,1 ± 0,4*
F (FC 20 mg/kg)
Animal
Número de
quadrados
invadidos
Tempo parado
(segundos)
Número de
levantadas
Número de
auto-limpeza
Número de
bolos fecais
1
28
77
5
62
4
2
6
134
1
25
0
3
38
31
10
37
2
4
39
159
16
50
0
5
55
26
15
12
2
6
41
211
8
37
4
7
36
77
12
25
3
8
52
101
15
12
5
Média ± EPM
36,9 ± 5,4
102,0 ± 22,4*
10,2 ± 1,9
32,5 ± 6,2
2,5 ± 0,7
134
G (FM 25 mg/kg)
Animal
Número de
quadrados
invadidos
Tempo parado
(segundos)
Número de
levantadas
Número de
auto-limpeza
Número de
bolos fecais
1
38
26
16
25
0
2
15
0
2
75
3
3
52
108
26
50
3
4
16
10
2
62
4
5
44
31
10
62
3
6
11
15
3
50
1
7
62
41
17
25
2
8
0
139
14
12
1
Média ± EPM
29,8 ± 7,8
46,2 ± 17,7
11,25 ± 3,1
45,1 ± 7,8
2,1 ± 0,5
H (Diazepam 10 mg/kg)
Animal
Número de
quadrados
invadidos
Tempo parado
(segundos)
Número de
levantadas
Número de
auto-limpeza
Número de
bolos fecais
1
53
163
4
44
0
2
2
229
6
0
0
3
27
176
1
14
0
4
42
169
9
30
0
5
73
152
10
32
0
6
34
213
4
22
0
7
30
187
10
38
0
8
58
180
2
43
0
Média ± EPM
39,0 ± 7,7
183,6 ± 9,1*
5,8 ± 1,3*
27,8 ± 5,4
0,00 ± 0,00*
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
135
Tabela 9 – Tempo de recuperação do reflexo postural (duração do sono), em
minutos, no teste de potenciação do sono induzido por barbitúrico, em camundongos
previamente tratados (60 min) pela via p.o. com veículo (C), com o extrato etanólico
das folhas do S. umbellatum (EES; 25, 50 ou 100 mg/kg) (A), com as frações
hexânica (FH, 10 mg/kg), clorofórmica (FC, 20 mg/kg), metanol/água (FM, 25 mg/kg)
(B) ou diazepam (DZP; 5 mg/kg).
A (EES)
Animal
C
EES 25
EES 50
EES 100
DZP
1
32
52
49
51
110
2
25
46
60
59
95
3
26
53
55
55
60
4
18
43
50
50
114
5
17
45
54
58
108
6
35
55
74
57
80
7
60
67
96
8
49
87
85
50,4 ± 2*
62,0 ± 5*
63,9 ± 6*
94,5 ± 9*
Média ± EPM
25,5 ± 3
B (Frações)
Animal
C
FH 10
FC 20
FM 25
DZP
1
32
40
53
16
110
2
25
81
42
15
95
3
26
45
49
25
60
4
18
36
44
23
114
5
17
49
40
35
108
6
35
40
49
16
80
7
53
61
33
8
101
48,3 ± 3*
23,3 ± 3
Média ± EPM
25,5 ± 3
55,6 ± 8*
94,5 ± 9*
* Estatisticamente diferente do grupo controle (P < 0,05) – ANOVA, teste de Tukey.
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