Implementação e Validação de Métodos Analíticos
Alexandra Sofia Reynolds Mendes
Laboratório Regional de Controlo da Qualidade da Água
Estação da Alegria
9050-FUNCHAL
E-mail: [email protected]
Resumo
Este artigo tem como principal objectivo descrever as principais etapas
associadas à implementação e validação de um método analítico.
Apresenta-se um exemplo: implementação e validação de um método em
Absorção Atómica com Câmara de Grafite para determinação da
concentração de alumínio em aguas de consumo humano
1.
Introdução
A validação de um método analítico é um aspecto crucial da garantia da
qualidade analítica pelo tem recebido uma atenção considerável por parte
da comunidade cientifica, comités industriais e entidades reguladoras. Isso
ocorre pela necessidade de uniformizar os critérios utilizados com o fim de
demonstrar que um método de ensaio, nas condições em que é praticado
tem as características necessárias para assegurar a obtenção de resultados
com a qualidade exigida.
Um método de ensaio é um processo que envolve manipulações
susceptíveis de acumularem erros (sistemáticos e/ou aleatórios), o que, em
algumas situações, pode alterar de forma significativa o valor do resultado
final.
Implementação e Validação de Métodos Analíticos
A implementação de um método analítico pode por vezes ser entediante,
mas as consequências de não se fazer correctamente podem ser
desastrosas pois se traduzem em perda de tempo, de dinheiro e outros
recursos.
2.
Mas então o que é a validação de um método?
Segundo a Norma NP EN ISO/IEC 17025, Validação é a confirmação,
através de exame e apresentação de evidência objectiva, de que os
requisitos específicos relativos a uma dada utilização são cumpridos.
A validação de um método analítico permite demonstrar que o método é
“adequado ao uso” pretendido.
Sempre que um laboratório execute ensaios terá que instruir um processo
de validação do método durante a sua implementação, ou sempre que
ocorra uma alteração relevante do mesmo, o qual incluirá todos os registos
obtidos. A validação de um método deve ser adaptada caso a caso, sendo
progressivamente mais exigente para as seguintes situações:
•
Extensões e/ou modificações de métodos normalizados;
•
Métodos normalizados utilizados fora do âmbito de utilização
prevista;
•
Métodos Não Normalizados;
•
Métodos criados e desenvolvidos pelo próprio laboratório.
A validação inclui:
•
A especificação dos requisitos;
•
A determinação das características do método;
Metrologia e Qualidade
•
Uma verificação de que os requisitos podem ser satisfeitos
utilizando o método em causa;
•
Uma declaração de validade.
Os parâmetros de validação de um método analítico incluem:
•
A gama de linearidade;
•
Limiares analíticos (limite de detecção e limite de quantificação);
•
A repetibilidade/reprodutibilidade;
•
A exactidão;
•
A selectividade do método;
•
A robustez a influências externas;
•
A incerteza dos resultados.
A LINEARIDADE PODE SER AVALIADA POR:
Variáveis
Dependentes
Variáveis
D ep en d en tes
Representação gráfica e cálculo do coeficiente de correlação
Variáveis Independentes
r=
Variáveis Independentes
∑ {(x − x )( y − y )}
[∑ (x − x ) ][∑ ( y − y ) ]
i
i
2
i
2
i
−1 ≤ r ≤ 1
Implementação e Validação de Métodos Analíticos
Análise de residuais (ex.: razão entre os valores de y experimentais e os
Variáveis
Dependentes
valores de y estimados)
1,2
1
0,8
Variáveis Independentes
Aplicação da norma ISO 8466 “Calibração e Avaliação de Métodos
Analíticos e Estimativa das Características do Desempenho”:
•
Teste da Homogeneidade das Variâncias (comparação estatística
da variância do padrão mais concentrado S2M com a do padrão
menos concentrado S2m da curva, visto que estas normalmente
apresentam uma maior variância).
O valor teste é calculado pelas equações:
VT =
sM2
sm2
para
s 〉s
2
M
2
m
e
VT =
sm2
sM2
para
s m2 〉 s M2
E é comparado com o valor tabelado na distribuição de Fisher. A decisão
estatística é a seguinte:
−
Se VT ≤ F a diferença entre as variâncias não é
significativa.
Metrologia e Qualidade
−
Se VT > F a diferença entre as variâncias é significativa e
a gama de trabalho deve ser reduzida até que esta se
deva apenas a erros aleatórios.
•
Teste da Linearidade (comparação estatística do valor teste com o
valor tabelado da distribuição de Fisher, para 1 g.l.)
O valor teste é calculado pelas equações:
DS 2 = ( N − 2 )s y2 / x (1º ) − (N − 3)s y2 / x ( 2 º )
VT =
DS 2
s y2 / x ( 2 º )
onde :
s y / x (1º )
Desvio padrão residual da curva de calibração linear.
s y / x(2 º)
Desvio padrão residual da curva de calibração não
linear.
A decisão estatística é a seguinte:
−
Se VT ≤ F, a função de calibração linear conduz a um
melhor ajuste dos pontos.
−
Se VT > F, a função de calibração linear não conduz a um
melhor ajuste dos pontos. A gama de concentrações deve
Implementação e Validação de Métodos Analíticos
ser reduzida ou então aplica-se uma função de calibração
não linear.
3.
Limiares Analíticos
Os conceitos de limite de detecção (Ld) e de quantificação (Lq) devem ser
entendidos conforme recomendado pela IUPAC, isto é:
•
o limite de detecção corresponde ao início da gama em que é
possível
distinguir
com
uma
dada
confiança
estatística
(normalmente 95 %), o sinal do branco do sinal da amostra, e
como tal indicar se o analito em questão está ausente ou presente;
a gama entre o Ld e o Lq deve ser entendida como uma zona de
detecção qualitativa, e não quantitativa, pelo que não se devem
reportar valores numéricos nesta gama;
•
o limite de quantificação corresponde ao início da gama em que o
coeficiente de variação (incerteza relativa) do sinal se reduziu a
valores razoáveis (normalmente 10 %) para se poder efectuar uma
detecção quantitativa; deste modo, na prática deve usar-se o Lq
como início da zona em que se reportam valores numéricos.
Assim, na gama baixa, o 1º padrão de calibração deve ser igual ou
ligeiramente superior ao limite de quantificação.
Podem ser usados dois métodos para o cálculo dos referidos limites:
•
a partir de uma série de ensaios com um branco representativo
(ou um padrão de baixa concentração, caso o branco não tenha
flutuação significativa), e calculando a respectiva média e desviopadrão;
recomenda-se
a
que
sejam
utilizados
brancos
Metrologia e Qualidade
independentes para obter esta estimativa (dias diferentes,
condições de rotina):
LD = x0 + 3,3s0
•
LQ = x0 + 10s0
a partir da estatística de mínimos quadrados da recta de
calibração, admitindo-se que o desvio-padrão da estimativa (Sy/x
ver ISO 8466-1) representa o desvio-padrão do branco representa
o desvio padrão do branco:
LD =
3,3s0
declive
LQ =
10 s0
declive
O LQ estimado deverá ser confirmado experimentalmente com um padrão
de concentração semelhante.
4. Repetibilidade/Reprodutibilidade
•
repetibilidade
é a aproximação entre os resultados de medições
sucessivas da mesma mensuranda, efectuadas nas mesmas condições
de medição no mais curto espaço de tempo, isto é:
•
o
mesmo laboratório;
o
mesmo analista;
o
mesmo equipamento;
o
mesmo tipo de reagentes.
reprodutibilidade é a aproximação entre resultados das medições da
mesma mensuranda efectuada com alteração de pelo menos uma das
condições de medição, ou seja:
Implementação e Validação de Métodos Analíticos
o
mesmo laboratório ou diferentes laboratórios;
o
diferentes analistas;
o
diferentes equipamentos;
o
e/ou diferentes épocas.
A repetibilidade e a reprodutibilidade podem exprimir-se
quantitativamente em termos das características da dispersão dos
resultados.
∑ (x − x )
2
s=
i
(n − 1)
CVxo =
s xo
× 100(%)
x
5. Exactidão
A exactidão é definida como a aproximação entre o resultado da medição e
o valor verdadeiro da mensuranda.
A exactidão de um método analítico pode ser determinada:
•
através da participação em ensaios interlaboratoriais,
•
pelo estudo de materiais de referência certificados,
•
através de ensaios fortificados,
•
por comparação com métodos de referência.
A exactidão é um parâmetro qualitativo que pode ser avaliado por testes
de significância estatística.
t = (x − µ ) n / s
Metrologia e Qualidade
6. Selectividade
A selectividade do método é a capacidade deste para identificar e
distinguir um determinado analito numa mistura complexa, sem
interferência de outros componentes. A selectividade do método deve ser
estudada usando várias amostras, desde soluções padrão a misturas de
matrizes complexas ou elementos considerados potenciais interferentes.
A selectividade do método é demonstrada como o desvio dos resultados
obtidos pela análise do analito em causa em amostras fortificadas com
todos os potenciais interferentes e os resultados obtidos com amostras não
fortificadas, isto é, contendo somente o analito. Quando se desconhecem os
interferentes, a selectividade do método pode ser investigada por
comparação dos resultados obtidos com outros métodos.
7. Robustez
A robustez do método define-se pela capacidade que um método tem para
resistir a pequenas variações durante a sua execução. Deve ser investigada
na etapa de desenvolvimento do método. Os testes de robustez avaliam
essencialmente a alteração a parâmetros identificados à partida como
críticos. Deste modo, um teste de robustez bem conduzido, evidenciará as
etapas do método em que o rigor é critico e aquelas em que há alguma
tolerância.
Para se determinar a robustez de um método pode-se utilizar o teste de
YOUDEN ou, testar o método em situações de precisão intermédia, isto é,
fazendo variar as condições operatórias dentro do próprio laboratório.
Implementação e Validação de Métodos Analíticos
8. Conclusões
A validação de um método é um processo constante e dinâmico. Um
processo de validação bem definido e documentado fornece evidência
objectiva de que o sistema e o método são adequados ao uso pretendido.
9. Bibliografia consultada
−
Validação de Métodos Analiticos: Paula Teixeira. João Seabra Barros.
INETI – DEECA. Maio 2003.
−
Vocabulário Internacional de Metrologia. Termos Fundamentais e
Gerais. 2ª Edição. Instituto Português da Qualidade (1996).
−
Guia para a Acreditação de Laboratórios em Ensaios Químicos.
Instituto Português da Qualidade (2000).
−
NP EN ISO/IEC 17025 “Requisitos Gerais de Competência para
Laboratórios de Ensaio e Calibração”. Instituto Português da
Qualidade (2000).
−
“Quantifying Uncertainty i Analytical Measurement”. Eurachem/Citac
Guide 2º Ed. (2000).
−
ISO 5725-1:1994. “Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results – Part 1. General principles and definitions”
−
ISO 5725-2:1994. “Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results – Part 2. Basic methods for the determination of
repeatability and reproductibility of a standard measurement
method.”
Metrologia e Qualidade
−
ISO 5725-3:1994. “Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results – Part 3. Intermidiate measures of the precision
of a standard measurement method.”
−
ISO 5725-4:1994. “Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results – Part 4. Basic methods for the determination of
the trueness of a standard measurement method.”
−
ISO 5725-6:1994. “Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results – Use in practice of accuracy values.”
−
Guia Relacre 13