Efeito do tempo de equilíbrio na criopreservação do sêmen sobre características de
motilidade e de integridade das membranas espermáticas de touros gir leiteiro
Leite, T.G.1; Andrade, A.F.C.2; Emerick, L.L.1; Arruda, R.P.2; Vale Filho, V.R.1; Martins, J.A.M.1;
Andrade, V.J.1; Gonçalves, P.E.M.1; Ferreira, M.B.D.3
School of Veterinary Medicine, Federal University of Minas Gerais, Brazil
Faculty of Veterinary Medicine and Zootechny, University of São Paulo, Brazil
3
EPAMIG - Uberaba, Brazil
1
2
Introdução:
Apesar dos avanços na biotecnologia de criopreservação do sêmen bovino, ainda permanecem
algumas dúvidas sobre a função e os efeitos do tempo de equilíbrio sobre as membranas do
espermatozóide, e não se tem concordância sobre a sua necessidade ou sobre qual o tempo mínimo de
equilíbrio necessário para se obter bons resultados de fertilidade (Coulter,1992; Dhami e Sahni, 1993;
Gao, Mazur e Critser, 1997). Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da
criopreservação utilizando dois diluidores e três tempos de equilíbrio diferentes sobre as
características de movimento espermático, a integridade das membranas plasmática e acrossomal,
função mitocondrial, pós-descongelamento, utilizando metodologias avançadas.
Material e métodos:
Foram coletadas amostras de sêmen de 12 touros Gir-leiteiro, por meio de eletroejaculador e avaliadas
segundo as normas do CBRA (1998). As amostras foram divididas em duas alíquotas e cada uma
delas diluída com um diluidor diferente (Bioxcell® ou TRIS) a 37ºC, com a concentração de 50 x 106
espermatozóides/mL. O sêmen diluído foi resfriado até a temperatura ambiente (25ºC) e envasado em
palhetas de 0,5 mL. Para a criopreservação utilizaram-se três aparelhos automatizados (TK-3000®),
com as mesmas curvas de resfriamento (-0,25°C / min) e de congelamento (-20°C / min) para todos os
tratamentos, variando-se apenas o tempo de equilíbrio a 5ºC: 0h (T0), 2h (T2), e 4h (T4)
estabelecendo 6 tratamentos (fatorial 2x3); após atingir a temperatura de -120ºC as palhetas foram
transferidas para o N2 líquido (-196 ºC) e armazenadas. As amostras foram posteriormente
descongeladas (37ºC /30 min) e analisadas quanto às características do movimento espermático
(avaliadas por sistema computadorizado – CASA), morfologia espermática, sobrevivência ao TTR,
integridade das membranas plasmática e acrossomal (utilizando PI/FITC-PSA), e função mitocondrial
(utilizando JC-1), as duas últimas análises realizadas através da citometria de fluxo.
Resultados:
Houve efeito de interação entre o diluidor e o tempo de equilíbrio para as características de Motilidade
Total (MT,%), Motilidade Progressiva (MotProg, %), e para a porcentagem de espermatozóides com
membranas plasmática e acrossomal intactas (AIMPI, %) e membrana acrosomal lesada (AL, %). Os
tratamentos sem tempo de equilíbrio (T0) apresentaram os menores valores (P<0,05), tanto para
parâmetros de motilidade (MT e MotProg), quanto para a integridade das membranas plasmática e
acrossomal, para ambos diluidores, e nesses tratamentos (T0) não houve diferença (P>0,05) entre os
diluidores para a MT e MotProg, e para a AIMPI e AL. O diluidor TRIS apresentou os maiores
valores de MT, MotProg, AIMPI; e os menores de AL, nos tempos de 2 e 4 h, e apresentou a menor
proporção (P<0,05) de espermatozóides com membrana plasmática lesada (MPL, %). O tempo de
equilíbrio de 4h apresentou os melhores resultados em relação aos parâmetros de motilidade, de
integridade das membranas espermáticas, e morfologia espermática. O tratamento utilizando TRIS e
4h de equilíbrio apresentou os melhores resultados (P<0,05) em relação aos parâmetros de MT,
MotProg, AIMPI, MPL, AL e de longevidade avaliada pelo TTR. Quanto à função mitocondrial, não
houve efeito (P>0,05) do diluidor e nem do tempo de equilíbrio.
Tempo de Equilíbrio T2
50
40
a
16,75
30
20
a
14,50
10
0
a
36,67
50
b
24,17
40
30
Tempo de Equilíbrio T4
Motilidade Total (%)
Motilidade Total (%)
Motilidade Total (%)
Tempo de Equilíbrio T0
20
10
Diluidor
b
28,58
40
30
20
10
0
0
BIO
a
41,00
50
TRIS
BIO
BIO
TRIS
Diluidor
Diluidor
TRIS
Gráfico 1 – Efeito do diluidor sobre a motilidade total (% de espermatozóides móveis; média ± desvio padrão)
dentro de cada tempo de equilíbrio, estimada por sistema computadorizado (CASA) em sêmen bovino
criopreservado, utilizando dois diluidores e três tempos de equlíbrio. aLetras diferentes sobre as barras indicam
diferença significativa pelo teste de Duncan (p<0,05).
Diluidor TRIS
50
40
30
20
a
28,6
a
24,2
b
16,8
Motilidade Total (%)
Motilidade Total (%)
Diluidor Bioxcell
10
a
36,7
50
40
30
a
41,0
b
14,5
20
10
0
0
T0
T2
T0
T4
Tempo
T2
Tempo
T4
Gráfico 2 – Efeito do Tempo de equilíbrio sobra a motilidade total (média ± desvio padrão) dentro de diluidor,
estimada por sistema computadorizado (CASA) em sêmen bovino criopreservado utilizando-se 2 diluidores e 3
tempos de equilíbrio. a Letras diferentes sobre as barras indicam diferença significativa pelo teste de Duncan
(p<0,05).
Tempo de Equilíbrio T0
Tempo de Equilíbrio T2
50
a
13,83
30
20
a
10,75
10
40
b
19,83
30
50
a
26,58
MotProg. (%)
40
MotProg. (%)
MotProg.(%)
50
Tempo de Equilíbrio T4
20
10
0
Diluidor
TRIS
a
30,75
b
22,92
30
20
10
0
BIO
40
0
BIO
Diluidor
BIO Diluidor TRIS
TRIS
Gráfico 3 – Efeito do diluidor sobre a motilidade progressiva (média ± desvio padrão) dentro de cada tempo de
equilíbrio, estimada por sistema computadorizado (CASA) em sêmen bovino criopreservado. aLetras diferentes
sobre as barras indicam diferença significativa pelo teste de Duncan (p<0,05).
Diluidor TRIS
50
40
30
b
13,83
20
a
19,83
a
22,92
10
0
Motilidade Progressiva (%)
Motilidade Progressiva (%)
Diluidor Bioxcell
50
a
26,58
40
30
20
a
30,75
b
10,75
10
0
T0
T2
Tempo
T4
T0
T2
Tempo
T4
Gráfico 4 – Efeito do Tempo de equilíbrio sobra a motilidade progressiva (média ± desvio padrão) dentro de
diluidor, estimada por sistema computadorizado (CASA) em sêmen bovino criopreservado utilizando-se 3
tempos de equilíbrio. a Letras diferentes sobre as barras indicam diferença significativa pelo teste de Duncan
(p<0,05).
Tempo de Equilíbrio T2
Tempo de Equilíbrio T0
35
a
8,75
a
6,91
15
10
30
25
b
15,20
20
15
35
30
a
20,89
15
10
10
5
0
5
5
0
0
BIO
Diluidor
a
26,81
b
18,27
25
20
AIMPI (%)
25
20
AIMPI (%)
AIMPI (%)
35
30
Tempo de Equilíbrio T4
BIO
TRIS
TRIS
Diluidor
BIO
Diluidor
TRIS
Gráfico 5 - Efeito do diluidor sobre a Integridade das membranas plasmática e acrossomal (AIMPI, %) em
sêmen bovino criopreservado (média ± desvio padrão) dentro de cada tempo de equilíbrio, avaliada por
citometria de fluxo. aLetras diferentes sobre as barras indicam diferença significativa pelo teste de Duncan
(p<0,05).
Diluidor TRIS
Diluidor Bioxcell
a
18,27
a
15,20
AIMPI (%)
30
25
20
b
6,91
15
10
35
30
AIMPI (%)
35
25
20
15
10
a
26,81
b
20,89
c
8,75
5
5
0
0
T0
T2
T0
T4
Tempo
T2
T4
Tempo
Gráfico 6 - Efeito do Tempo de equilíbrio sobre a Integridade das membranas plasmática e acrossomal (AIMPI,
%) em sêmen bovino criopreservado utilizando-se 3 tempos de equilíbrio (média ± desvio padrão) dentro de
diluidor, avaliada por citometria de fluxo. a Letras diferentes sobre as barras indicam diferença significativa pelo
teste de Duncan (p<0,05).
Efeito do tempo sobre a porcentagem de
espermatozóide com Membrana Plasmática
Lesada
Efeito do diluidor sobre a porcentagem de
espermatozóide com Membrana Plasmática
Lesada
MPL (%)
80
b
85,83
a
72,22
60
40
20
c
86,48
100
MPL (%)
100
80
b
78,03
a
72,57
60
40
20
0
0
BIO
TRIS
Diluidor
T0
T2
T4
Tempo
Gráfico 7 – Efeitos isolados de tempo de equilíbrio e de diluidor sobre a percentagem de espermatozóides com
membrana plasmática lesada (MPL, %) em sêmen bovino criopreservado utilizando-se 3 tempos de equilíbrio e
dois diluidores (média ± desvio padrão), avaliados por citometria de fluxo. a Letras diferentes sobre as barras
indicam diferença significativa pelo teste de Duncan (p<0,05).
Conclusão:
Conclui-se que o tempo de equilíbrio é necessário para preservar a motilidade total, a motilidade
progressiva, a integridade das membranas plasmática e acrossomal, e a longevidade espermática, além
de atuar preservando a morfologia espermática. Pode-se concluir também que a utilização de no
mínimo 4 h de equilíbrio garante uma melhor sobrevivência espermática. Assim, o melhor método de
criopreservação foi aquele que utilizou o diluidor TRIS com 4 h de equilíbrio (TRIST4).
Palavras chave: sêmen, criopreservação, tempo de equilíbrio, sondas fluorescentes, citometria
de fluxo, CASA.
Referências Bibliográficas
CBRA. Procedimentos para exame andrológico e avaliação do sêmen animal. Belo Horizonte: CBRA,
1998. 49f.
COULTER, G.H. Bovine spermatozoa in vitro: A review of storage and manipulation.
Theriogenology, v. 38, n. 2, p.197-207, 1992.
DHAMI, A. J.; SAHNI, K. L. Evaluation of different cooling rates, equilibration periods and diluents
for effects on deep-freezing, enzyme leakage and fertility of taurine bull spermatozoa.
Theriogenology, v. 40, p.1269-1280, 1993.
GAO, D.; MAZUR, P.; CRITSER J. Fundamental cryobiology of mammalian spermatozoa. In:
KAROW, A.M., CRITSER J.K. (ed.), Reproductive Tissue Banking. Academic Press, London, 1997,
p. 263–328