ADIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO POLIINSATURADO AO MEIO DE INCUBAÇÃO DO
SÊMEN BOVINO CONGELADO
(ADDITION OF POLYUNSATURATED FATTY ACIDS IN INCUBATION MEDIUM
OF BOVINE FROZEN SEMEN)
Monica Yurie Machado Shiroma1, Beatriz Ramos Bertozzo1, Breno Fernandes Barreto
Sampaio2, Juliana Rosa Carrijo Mauad3, Eliane Vianna da Costa e Silva4, Carmem Estefânia
Serra Neto Zúccari5
RESUMO
A adição de ácido graxo poliinsaturado ao diluidor pode reduzir o choque térmico durante o
ciclo de congelação/descongelação seminal por proporcionar maior estabilidade às
membranas da célula. O trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da adição de ácido
oléico-linoléico (AOL) sobre a integridade das membranas plasmática e acrossomais, durante
a incubação in vitro do espermatozóide bovino pós-descongelação. Foram utilizadas doses
comerciais de sêmen de dez touros. O Grupo 1 - controle, Grupo 2 - Talp-sp acrescido de 37
µM de AOL e Grupo 3 - Talp-sp com AOL na concentração de 74 µM, sendo incubados a
37ºC/5 horas. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo
teste de Tukey. Não houve efeito dos tratamentos sobre as variáveis analisadas. Conclui-se
que o ácido oléico-linoléico, nas concentrações testadas, não foi efetivo em preservar a
integridade estrutural das membranas plasmática e acrossomais pós-descongelação, durante
incubação in vitro.
Palavras-chave: ácido oléico-linoléico, espermatozóide, touro
SUMMARY
The addition of polyunsaturated fatty acids to the extender may reduce the thermal shock
during the seminal freezing process provide greater stability to cell membranes. The study
aimed to evaluate the effect of adding oleic-linoleic acid on plasmatic an acrossomal
membranes integrity, during in vitro incubation of bovine sperm post-thaw. Semen
commercial doses from ten bulls were used. Group 1 - control, group 2 - Talp-sp plus 37 mM
of OLA and Group 3 - Talp-sp with OLA at a concentration of 74 mM, and incubated at 37°C
/ 5 hours. The data were subjected to analysis of variance and the means were compared by
Tukey test. There was no effect of treatments on the variables analyzed. We conclude that
oleic-linoleic acid in these concentrations was ineffective in preserving the structural integrity
of plasmatic and acrosomal membranes post-thaw during in vitro incubation.
Keywords: bull, oleic-linoleic acid, spermatozoa
Os ácidos graxos poliinsaturados (polyunsaturated fatty acids – PUFA) são
considerados essenciais e contribuem para a fluidez e flexibilidade da membrana. PUFAs da
série n-3 representam cerca de 30-50% do total de ácidos graxos presentes na membrana dos
espermatozóides (POULOS et al., 1973) e têm como função manter a integridade do
espermatozóide ejaculado (NEILL & MASTERS, 1972). Durante o metabolismo espermático
são produzidas substâncias reativas ao oxigênio (MARTI et al., 2008) e segundo Salomon &
1
Médico Veterinário, FAMEZ / UFMS
Mestrando em Ciência Animal, FAMEZ / UFMS
3
Professora Doutora. Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientais. Universidade Federal da Grande Dourados
4
Laboratório de Reprodução Animal, FAMEZ / UFMS
5
Laboratório de Biotecnologia da Reprodução Animal, FAMEZ / UFMS. Caixa Postal 549. Cep: 79.070-900.
Campo Grande/MS. [email protected]
2
Maxwell (1995) há elevada sensibilidade de espermatozóides criopreservados à peroxidação
de seus componentes lipídicos, em especial daqueles poliinsaturados. O trabalho teve como
objetivo avaliar o efeito da adição de ácido oléico-linoléico (AOL) sobre a integridade das
membranas plasmática e acrossomais, durante a incubação in vitro do espermatozóide bovino
pós-descongelação.
Doses de sêmen de dez touros foram descongeladas a 37ºC/30 segundos e após o
sêmen foi submetido aos seguintes tratamentos: (Grupo 1) diluição em meio Talp-sp sem
adição de albumina sérica bovina; (Grupo 2) diluição em Talp-sp acrescido de AOL na
concentração final de 37 µM (AOL-37 µM); (Grupo 3) diluição em Talp-sp acrescido de AOL
na concentração final de 74 µM (AOL-74 µM), sendo então incubados a 37ºC por 5 horas.
Alíquotas de sêmen foram submetidas às análises de motilidade/vigor, integridade da
membrana plasmática (eosina/nigrosina-EN) e status acrossomal (trypan blue/Giemsa-TBG)
nos momentos: pós-descongelação (PD) e pós-incubação (PI). Para comparar as variáveis
dependentes (motilidade, integridade da membrana plasmática e do acrossomo) foi usada a
análise de variância considerando os efeitos fixos de tratamento e momentos de avaliação. As
médias foram comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05).
O menor percentual de motilidade foi observado após o período de incubação,
havendo diferença significativa entre os momentos para todas as características seminais,
exceto para a categoria de mortos, pela técnica do trypan blue/Giemsa. Os valores médios das
variáveis espermáticas avaliadas nos diferentes momentos são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Valores de motilidade, vigor e integridade das membranas plasmática e acrossomal,
durante incubação in vitro a 37ºC / 5 horas, do sêmen congelado de touros (n=10)
Momentos
*
Variáveis
PósPós-incubação (37°C / 5 h)
(%)
descongelação
Controle
AOL** 37 µM AOL 74 µM
Motilidade
60,0 ± 14,1a***
43,0 ± 12,5ab
40,0 ± 14,9b
45,0 ± 13,5ab
a
a
a
Vigor (0-5)
3,0 ± 0,0
2,6 ± 0,5
2,7 ± 0,7
2,7 ± 0,5a
30,5 ± 10,1b
34,4 ± 11,8b
32,0 ± 10,4b
EM- vivos
61,3 ± 14,2a
b
a
a
EM-mortos
38,7 ± 14,2
69,5 ± 10,1
65,6 ± 11,8
68,0 ± 10,4a
TBG-vivos
59,1 ± 15,9a
19,3 ± 8,8b
19,6 ± 7,8b
17,9 ± 8,0b
a
a
a
TBG-mortos
23,7 ± 7,8
35,6 ± 12,7
33,2 ± 7,9
32,6 ± 9,6a
TBG-RAV
1,0 ± 1,1b
2,4 ± 1,2ab
3,1 ± 1,1a
3,1 ± 1,5a
b
a
a
TBG-RAF
16,2 ± 16,3
42,6 ± 11,6
44,1 ± 8,3
46,4 ± 6,0a
* EN = eosina/nigrosina; TBG = trypan blue/Giemsa; RAV = reação acrossomo
verdadeira; RAF = reação acrossomo falsa; ** AOL = ácido oléico-linoléico; *** letras
diferentes na mesma linha indicam diferença significativa entre médias pelo teste de Tukey
(p<0,05)
O alto conteúdo de PUFAs na membrana plasmática do espermatozóide o torna muito
vulnerável às mudanças peroxidativas, pois ácidos graxos contendo duas ou mais duplas
ligações são prontamente atacados pelos radicais oxigênio. A geração de espécies reativas ao
oxigênio e a peroxidação lipídica da membrana podem causar efeitos negativos sobre a
motilidade, produzir alterações na peça intermediária e na fusão espermatozóide-ovócito
(KIM & PARTHASARATHY, 1998). No entanto, não foi observado efeito da adição de AOL
nas concentrações testadas no presente trabalho, pois os valores observados para as variáveis
espermáticas analisadas durante o período de incubação não diferiram do grupo controle.
Por outro lado, Marti et al. (2008) demonstraram que a distribuição das enzimas
antioxidantes na superfície espermática é claramente afetada pela criopreservação. A inclusão
de AOL resultou em aumento de 39% da atividade da superóxido dismutase. Já, no caso da
2
glutationa peroxidase a associação de proteínas do plasma seminal e ácido oléico-linoléico
produziu um aumento na atividade enzimática de 240% em relação ao grupo controle e de
30% para o sêmen resfriado e congelado. Pérez-Pé et al. (2001) observaram, para o sêmen
ovino submetido ao choque frio que, a adição de 37 µM de ácido oléico-linoléico (18:1 n-9 e
18:2 n-6, respectivamente) resultou em maior percentual médio de espermatozóides com
membrana plasmática íntegra após diluição, quando comparado ao controle, após 1 hora de
incubação a 37ºC. Houve interação positiva quando feita a associação com proteínas do
plasma seminal. Os autores concluíram que, possivelmente, houve boa preservação da fluidez
das membranas e/ou estabilização dos elementos protéicos na matriz lipídica da bicamada.
A adição de AOL pós-descongelação foi feita supondo que, se incorporado à
membrana plasmática preservaria a viabilidade (PÉREZ-PÉ et al., 2001) e reduziria os danos
da peroxidação lipídica (MARTI et al., 2008), aumentando assim a longevidade dos gametas.
Com isso se poderia elevar o potencial fecundante das doses de sêmen de baixa qualidade
pertencentes a touros muito valiosos já mortos, viabilizando o transporte no trato genital
feminino e a formação do reservatório espermático no istmo. Contudo, diante dos resultados
obtidos no presente trabalho pode-se supor que após a descongelação o nível de
desorganização da estrutura bidimensional da membrana tenha sido tão elevado que a
incorporação de PUFAs não ocorreu, portanto não lhe conferindo maior resistência estrutural.
Conclui-se que o ácido oléico-linoléico, nas concentrações testadas, não foi efetivo em
preservar a integridade estrutural das membranas plasmática e acrossomais pósdescongelação, durante incubação in vitro do sêmen de touros.
REFERÊNCIAS
KIM, J.G.; PARTHASARATHY, S. Oxidation and the spermatozoa. Semin. Reprod.
Endocrinol., v.16, p.235-239, 1998.
MARTI, E.; MARTI, J.I.; MUIÑO-BLANCO et al. Effect of the cryopreservation process on
the activity and immunolocalization of antioxidant enzymes in ram spermatozoa. Journal of
Andrology, v.29, n.4, p.459-467, 2008.
NEILL, A.R.; MASTERS, C.J. Metabolism of fatty acids by bovine spermatozoa. Biochem.
J., v.127, p.375-385, 1972.
PÉREZ-PÉ, R.; CEBRIÁN-PÉREZ, J.A.; MUIÑO-BLANCO, T. Semen plasma proteins
prevent cold-shock membrane damage to ram spermatozoa. Theriogenology, v.56, p.425-434,
2001.
POULOS, A.; DARIN-BENNETT, A.; WHITE, I.G. The phospholipids-bound fatty acids
and aldehydes of mammalian spermatozoa. Comp. Biochem. Physiol. v.46B, p.541-549,
1973.
SALOMON, S.; MAXWELL, W.M.C. Frozen storage of ram semen I. Processing, freezing,
thawing and fertility after cervical insemination. Animal Reproduction Science, v.37, p.185249, 1995.
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