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Estudo e Caracterização de Filmes Bioativos Poliméricos Fabricados
Através Da Técnica de Automontagem
Galdino1, L.F.M.D., Davi1,C.P., Oliveira Jr1,2, O.N., Zucolotto2,V., Borelli3,P., Fock3,R.A.,
Ferreira1,M.
1
Universidade Federal do ABC, CCNH, Santo André, SP - Brasil
2
Universidade de São Paulo, IFSC, São Carlos, SP - Brasil
3
Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, São Paulo, SP – Brasil
A fabricação de filmes finos bioativos poliméricos através da técnica de automontagem (LbL – layer-by-layer) é um método simples
e robusto empregado para investigar possíveis candidatos a biomateriais. A versatilidade deste método se dá pela variedade de
policátions e poliânions que vão de polímeros a proteínas e que podem ser empregados sobre diferentes substratos como quartzo ou
mica. Neste trabalho foram investigados filmes finos automontados através da técnica de automontagem utilizando-se macromoléculas
como o cloridrato de polialilamida (PAH) como policátion e proteínas purificadas extraídas do látex natural da Hevea brasiliensis como
poliânions. Para a caracterização físico-química foram utilizados métodos de espectroscopia de Uv-visível, tanto para crescimento dos
filmes e degradação, microscopia de força atômica e ângulo de contato. Para o ensaio biológico de proliferação celular foi utilizado o
ensaio de MTT. Os ensaios biológicos demonstraram que as proteínas do látex utilizadas no presente estudo apresentam pouca
atividade biológica no aspecto proliferação celular sendo que em muitos casos ficou evidente a dificuldade de adesão e proliferação
celular sobre o substrato.
Palavras-chave: layer-by-layer, proteínas do latex, cloridrato de polialilamida.
I. INTRODUÇÃO
A
engenharia de tecidos tornou-se recentemente um dos
principais campos na área da biotecnologia e desenvolvimento
de materiais. Biomateriais tridimensionalmente projetados nos
fornecem ferramentas fundamentais como guias ao
desenvolvimento de tecidos in vitro e in vivo. Um suporte
ideal ao tecido deve além de ser biocompatível, isto é, não
provocar nenhuma resposta imunitária do tecido ao implante,
também deve ao mesmo tempo ter uma superfície química que
promoverá a adesão celular funcional, ser biodegradável
deixando o tecido sadio e ter uma força mecânica necessária à
criação de um suporte macroporoso que permitirá a retenção
após o processo de implantação. Entretanto, poucos suportes
possuem estas qualificações [1,2]. O desenvolvimento de
técnicas de fabricação de filmes ultrafinos para a aplicação na
engenharia de tecidos foi impulsionado pela necessidade de se
obter estruturas organizadas, com controle de espessura e de
propriedades em escala molecular [3]. O método de
automontagem (LbL) (layer-by-layer) [4] desponta como um
dos mais promissores neste aspecto. Este método atraiu a
atenção extensiva porque possui vantagens extraordinárias
para aplicações neste campo: facilidade de preparação,
versatilidade, capacidade de incorporar diferentes tipos de
biomoléculas nos substratos, controle fino sobre a estrutura
dos materiais e manutenção da funcionalidade dos produtos
sob circunstâncias ambientais e fisiológicas [5].
Em filmes LbL, proteínas como colágeno, fibronectina (FN)
ou peptídeos têm sido usados freqüentemente para aumentar a
aderência de tipos celulares específicos sobre substratos
projetados para ambientes in vitro [6]. Outras proteínas como
as encontradas na borracha natural extraída da árvore Hevea
brasiliensis têm sido incorporadas em filmes LbL por
sua ação no processo de recuperação de úlceras causado,
por exemplo, pelo diabetes [7].
A disposição ideal das proteínas deve levar em
consideração fatores que maximizem o sítio de ligação delas
às células e minimize alterações de sua conformação interna.
Filmes finos via LbL oferecem a possibilidade de ligar
proteínas do látex a sua orientação mais favorável preservando
(e talvez estabilizando) sua conformação interna.
Neste trabalho foram investigados filmes finos
automontados através da técnica de automontagem utilizandose macromoléculas como o cloridrato de polialilamida (PAH)
como policátion, proteínas purificadas extraídas do látex
natural da Hevea brasiliensis e a fibronectina como
poliânions.
II. MATERIAIS E MÉTODOS
Na confecção dos filmes LbL foram utilizadas as soluções a
seguir descritas e os tempos de deposição respeitados confome
tabela 1:
Cloridrato
de
Polialilamina
PAH
–
[CH2CH(CH2NH2.HCl) - MM 56.000 g.mol-1 – adquirido da
empresa Alfa Aesar) solução em concentração de 0,5 mg.mL-1
em pH 6,0;
Proteína purificada do látex [doado por Ricardo Mendonça
e Joaquim Coutinho Netto da FMRP-USP - 14 a 50 kDa,
ponto isoelétrico 4.7] solução em concentração de 1 mg.mL-1
em tampão tris(hidroximetil) aminoetano 10 mM em pH 3,0;
7,4 e 9,0;
2
Tabela 1: Tempos respectivos para policátions e poliânions
Filmes LbL
Tempo de deposição em
minutos
PAH/proteína pH 3
3e5
PAH/proteína des pH 7,4
3e3
PAH/proteína in pH 7,4
3e3
PAH/proteína pH 9
3e3
II. RESULTADOS E DISCUSSÃO
III.1 Filmes LbL de proteína do látex
Sobre substrato de quartzo foram confeccionados filmes
LbL de PAH/proteínas do látex até a décima quarta bicamada,
conforme gráfico 1:
Gráfico 1: Filme LbL de PAH/Proteínas do látex em diferentes
pHs
O filme de PAH/proteína em pH 7,4 foi selecionado como o
sistema mais favorável segundo os dados de crescimento
apresentado no gráfico 1, pela melhor linearidade de
crescimento.
III.2 Filmes LbL de proteína do látex
Sobre substrato de quartzo foram confeccionados filmes
LbL de PAH/proteínas do látex até a décima quarta bicamada,
conforme gráfico 2:
Gráfico 2: Filme LbL de PAH/Proteínas do látex in natura e
desnaturada em pH 7,4
Este ensaio foi realizado para verificar se a proteína do
látex, mesmo desnaturada, ainda permite a automontagem de
filmes LbL e se ela possue algum fator de influencia sobre
testes biológicos. Os resultados obtidos demonstram que é
possível confeccionar filmes com as proteínas do látex
desnaturadas R²=0,9677 e in natura R²=0,9592 mantendo o
regime de crescimento linear, similares aos observados nos
filmes com proteína in natura.
III.3 Degradação de filmes de proteínas do látex
Os filmes automontados de PAH/proteínas do látex foram
automontados sobre substratos de quartzo e imersos em 1,5
mL de solução PBS por 21 dias, conforme gráfico 3:
Gráfico 3: Filme LbL de PAH/Proteínas do látex in natura em
meio de degradação
Observou-se que o filme analisado não alcançou o valor
inicial de absorbância (0,24 u.a) ao final de 21 dias indicando
que o filme de proteína do látex não se degrada totalmente
durante o período avaliado. O PBS pode ter contribuído para o
aumento da absorbância do filme já que o substrato de PBS
apresentou pequeno aumento de absorbância durante 10 dias
III.4 Microscopia de Força Atômica
Os ensaios de microscopia de força atômica foram feitos em
amostras com 5 e 15 bicamadas dos sistemas PAH/ proteína
do látex in natura em diferentes pHs, conforme figura 1:
Figura 1: Imagens de AFM de filmes PAH/proteína do látex in
natura em pH 3,0; 7,4 e 9,0 com 5 e 15 bicamadas. Escala de
4µm.
3
Pela figura 1 temos: filme PAH/proteína em pH 3,0 com
rugosidade média (Rms) de 3,7 e 5,0 nm para 5bc e 15bc,
filme em pH 7,4 apresenta topografias com baixa rugosidade,
com Rms de 5,3 e 8,7 nm para 5bc e filmes em pH 9,0 cujos
índices de Rms se elevaram de 4,3 nm em 5bc para 7,2 nm em
15bc. Pela figura 1 percebe-se a tendência dos filmes de PAH/
proteínas do látex in natura tornarem-se mais rugosos com o
aumento do número de bicamadas.
III.5 Ângulo de Contato
Sobre substrato de quartzo foram confeccionados filmes
LbL de PAH/proteínas do látex até a décima camada,
conforme gráfico 4:
das soluções dos
polieletrólitos não apresentaram boa
proliferação celular ao longo de 21 dias quando comparados
ao controle sobre a placa de poliestireno.
Um teste complementar chamado de direto, onde células de
fibroblastos humanos normais foram semeadas sobre
monocamadas de proteínas do látex em diferentes
concentrações, conforme gráfico 5, revelou que quanto menor
for a concentração das proteínas, maior foi a atividade
proliferativa.
Gráfico 5: Proliferação celular de fibroblastos humanos
normais para monocamadas de diferentes concentrações de
proteína do látex
Gráfico 4: Ângulo de contato medidos camada a camada
para o sistema PAH/proteína do Látex
Para o sistema PAH/proteínas do látex in natura é notória a
influência da rugosidade da superfície nos ângulos de contato.
Um fator que explicaria este fenômeno seria a presença de ar
que pode ficar preso nas irregularidades da superfície
ocasionando um molhamento heterogêneo da superfície [8,9].
III.6 Ensaio de MTT
Este ensaio foi realizado para verificar a influência da
atividade biológica do filme de PAH/proteínas do látex sobre a
proliferação celular de fibroblastos normais humanos,
conforme gráfico 4:
Gráfico 4: Proliferação celular de fibroblastos humanos
normais para o sistema PAH/proteína do látex
Verificou-se que tanto os filmes de PAH/ proteínas do látex
in natura e desnaturada assim como castings (monocamadas
III. CONCLUSÕES
Através da técnica de LbL foi possível automontar filmes de
PAH/proteínas do látex em diferentes pH´s. O aumento no
número de bicamadas deste sistema implica em um aumento
na rugosidade média e na elevação do ângulo de contato. Os
filmes não se degradaram completamente ao final de 21 dias
de experimento. Através do ensaio de proliferação celular
verificou-se que as proteínas usadas no presente estudo casos
dificultaram a adesão e proliferação celular sobre o filme.
IV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] Sittinger, M.; Perka, C.; Schultz, O.; Haupl, T.; Burmester, G. R. Z
Rheumatol. 1999, 58(3), 130-135.
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J. Biomech. Eng. 1991, 113 (2), 143-151.
[3] Paterno, L. Go; Mattoso, Capparelli, L. H, Oliveira Jr , O. N. de., Quim.
Nova, Vol. 24, No. 2, 228-235, 2001.
[4] Decher, G, J., Hong D., Schmitt, J., Thin Solid Films 1992, 210, 831.
[5] Z.Tang; Y. Wang; P. Podsialdo; N.A.Kotov. Biomedical applications of
Layer-by-Layer Assembly: From Biomimetics to Tissue Engineering. Adv.
Mater, 2006, 18, 3203-3224.
[6]Li, M, Mills, D. K., Cui, T., McShane, M. J. ,IEEE Transactions on
nanobioscience, Vol. 4, No. 2, June 2005
[7] Frade, M.A.C., Valverde, R. V., Assis, R.V.C. de, Coutinho-Netto, J., and
N.T. Foss, Cronic phlepoppathic cutaneous ulcer: a therapeutic proposal. Int.
J. Dermatol., 40(3): 238-240, (2001).
[8] Hikita, M. et al. Super-liquid-repellent surfaces prepared by colloidal silica
nanoparticles covered with fluoroalkyl groups. Langmuir [S.I.], v. 21, n. 16, p.
7299-7302, 2005.
[9] Marmur, A. The lotus effect: Superhydrophobicity and metastability.
Langmuir [S.I.], v. 20, n. 9, p. 3517-3519, 2004.
AGRADECIMENTOS
UFABC, FAPESP, CNPq, CAPES e todos os professores e amigos
envolvidos neste trabalho.