Latin American Journal of Pharmacy
(formerly Acta Farmacéutica Bonaerense)
Lat. Am. J. Pharm. 29 (6): 941-7 (2010)
Original Article
Received: December 20, 2008
Accepted: January 26, 2010
Óleo Essencial de Thymus vulgaris: Elaboração de Enxaguatório Bucal
e Avaliação do Efeito In Vitro na Formação da Placa Bacteriana
Rodolfo I. SANTOS 1, Daniel F.A. PEREIRA 1, Guilherme R. TEODORO 1,
Jose Orestes DEL CIAMPO 2, Mario S. OGASAWARA 2, Antonio C.V. CANETTIERI 1,
Sonia KHOURI 1 & Marcos J. SALVADOR 3*
Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), Laboratório de Microbiologia,
Av. Shishima Hifumi, 2911 Urbanova São José dos Campos (SP), Brasil.
2 Universidade de São Paulo (USP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto,
Departamento de Ciências Farmacêuticas, Via do Café, s/n, CEP 14040-903, Ribeirão Preto (SP), Brasil.
3 Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Instituto de Biologia, Curso de Farmácia,
Caixa Postal 6109, CEP 13083-970, Campinas (SP), Brasil.
1
RESUMO. O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro o efeito do óleo essencial de Thymus vulgaris (tomilho) puro ou incorporado em uma formulação farmacêutica de uso oral (enxaguatório bucal), frente ao
Streptococcus mutans (ATCC 25175), determinando-se sua concentração inibitória mínima e o efeito na
formação da placa bacteriana. A CIM obtida para o óleo essencial de tomilho foi de 100 μg/mL (1 %). Procedeu-se o desenvolvimento de enxaguatório bucal com efeito antiplaca contendo o óleo essencial comercial de tomilho. As análises da formação da placa bacteriana (ensaios microbiológicos, análise macroscópica de aderência e análises por MEV) confirmaram a eficácia destas novas formulações de enxaguatórios,
sem álcool, contendo óleo essencial de T. vulgaris como agentes antiplaca bacteriana com possível emprego
na odontologia preventiva. A caracterização química do óleo essencial bioativo foi realizada por CG-MS,
verificando-se a presença de carvacrol, p-cimeno e α-pineno como constituintes majoritários.
SUMMARY. “Essential Oil of Thymus vulgaris: Preparation of Pharmaceutical Mouthwash Formulation and In
Vitro Evaluation of the Bacterial Plaque-Inhibiting Properties”. The aim of this study was to evaluate the in vitro
effect of the essential oil of Thymus vulgaris (thyme) pure or incorporate in a alcohol-free pharmaceutical mouthwash formulation, against Streptococcus mutans (ATCC 25175), being determined the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and the effect in the bacterial plate formation. The MIC value obtained for the essential oil was
100 μg/mL (1 %). The mouthwash pharmaceutical formulation containing commercial essential oil of T. vulgaris
was preparated. Microbiological and macroscopic analysis as well as analyses for MEV confirmed the effectiveness of this new alcohol-free mouthwash formulation containing essential oil of T. vulgaris as agent with plaqueinhibiting properties and possible application in the preventive dentistry. The chemical characterization of the
bioactive essential oil was accomplished by CG-MS, being verified the presence of carvacrol, p-cimene and αpinene as major constituents.
INTRODUÇÃO
As substâncias naturais, produzidas pelas espécies vegetais, têm atraído pesquisadores de
diversas áreas. Os produtos que mais se destacam são aqueles derivados do chamado “metabolismo secundário” vegetal, por sua importância terapêutica ou por sua toxicidade 1-4. Nos
países industrializados, estima-se que 25 % dos
medicamentos prescritos e registrados contem
constituintes ativos derivados do reino vegetal
(extratos, substâncias puras ou modificadas) 2,5.
Óleos essenciais são misturas complexas de
substâncias voláteis de baixo peso molecular
oriundas do metabolismo secundário (monoterpenos, sesquiterpenos ou derivados dos fenilpropanóides) que apresentam odor forte e muitos óleos essenciais apresentam relato de atividade antimicrobiana contra um grande número
de microrganismos incluindo espécies resistentes a antibióticos e antifúngicos 6-8. A composição química de óleos essenciais pode depender
do clima, da estação do ano, condições geográficas, período de colheita e da técnica empregada na extração (maceração, destilação, dentre
outras). Os óleos essenciais podem apresentar
ação tanto contra bactérias Gram-positivas
PALAVRAS-CHAVE: Atividade antiplaca bacteriana, Formulação de enxaguatório bucal, Tomilho, Thymus
vulgaris.
KEY WORDS: Alcohol-free mouthwash formulation, Bacterial plaque-inhibiting properties, Thyme, Thymus vulgaris.
*
Autor a quem correpondência deve ser enviada: E-mail: [email protected], [email protected]
ISSN 0326-2383
941
SANTOS R.I., PEREIRA D.F.A., TEODORO G.R., DEL CIAMPO J.O., OGASAWARA M.S., CANETTIERI A.C.V., KHOURI S. &
SALVADOR M.J.
quanto Gram-negativas e ainda frente a leveduras e fungos filamentosos 9.
O óleo essencial de Thymus vulgaris (tomilho) tem sido usado em fitoterápicos, em cosméticos e em indústrias de alimento. Na medicina ocidental, a aplicação principal está no tratamento de queixas digestivas, de problemas respiratórios e na prevenção e no tratamento de infecções. A atividade biológica do produto de tomilho esta relacionada a seus principais constituintes, timol, carvacrol, cimeno e pineno. Além
disso, dado a presença de substâncias fenólicas,
significativa atividade antioxidante tem sido relatada para o óleo essencial de tomilho 10,11.
Martinez et al. 11 avaliaram a ação antimicrobiana de diferentes óleos essenciais, dentre os
quais o óleo essencial de T. vulgaris. Neste trabalho o óleo essencial de tomilho apresentou
ampla atividade antibacteriana sobre as cepas
estudadas com halo médio de inibição de 20
mm. Até o presente momento não se encontrou
relato da avaliação do efeito do óleo essencial
de tomilho na dinâmica da formação da placa
bacteriana, bem como o relato de enxaguatório
bucal com atividade antiplaca contendo este
óleo essencial como principal ativo em sua formulação.
Produtos oriundos de plantas utilizados na
prática odontológica têm mostrado resultados
efetivos sobre o controle da formação da placa
bacteriana, podendo interferir na síntese de polissacarídeos (dextrano), agindo nas enzimas
que produzem estas substâncias ou sobre a estrutura dentária 12. O Streptococcus mutans é o
principal organismo relacionado à formação da
placa dentária e conseqüentemente no surgimento da cárie, devido a sua capacidade de
adesão à estrutura dentária. Dependendo de fatores tais como a dieta e a remoção mecânica
regular da placa, o tipo de microbiota predominante na cavidade bucal pode variar. Todavia,
quando a remoção mecânica da placa é deficiente e a ingestão de carboidratos em geral é
freqüente, ocorre uma seleção para certos organismos patogênicos e a placa se torna mais virulenta, podendo resultar tanto em lesões de tecido duro (cáries), quanto de tecido mole (doenças periodontais) 13. Portanto, o desenvolvimento de gengivites está relacionado com a formação de placa bacteriana, sendo necessário seu
controle e prevenção na manutenção da saúde
bucal. Neste sentido, muitos agentes químicos
vêm sendo estudados, dentre eles os produtos
naturais, como componentes tanto nos géis dentifrícios como nos enxaguatórios bucais, visando
942
um possível emprego como adjuvante na terapia das doenças periodônticas e na profilaxia de
rotina 6,14-16.
Os antimicrobianos dos anti-sépticos bucais
rompem a parede celular e inibem a atividade
da célula microbiana. Adicionalmente, previnem
a agregação bacteriana e diminuem a multiplicação microbiana. Entre os compostos ativos mais
utilizados em anti-sépticos bucais temos a clorexidina, cloreto de cetilpiridinio e triclosan, além
de óleos essenciais. A clorexidina, um dos biocidas mais utilizados em formulações anti-sépticas, é uma biguanida catiônica que age principalmente sobre bactérias Gram-positivas, além
de leveduras e dermatófitos, enquanto que o
cloreto de cetilpiridinio age principalmente sobre bactérias Gram-positivas e leveduras. Entre
os compostos fenólicos, o triclosan tem sido o
mais utilizado em formulações para controle da
placa bacteriana, apresentando ação principalmente contra bactérias Gram-positivas, no entanto, este ativo tem sido utilizado em associação a copolímeros, que aumentam seu espectro
de ação sobre bactérias Gram-negativas e leveduras 16,17.
O enxaguatório que apresenta o maior histórico de uso é composto por solução hidro-alcoólica dos óleos essenciais timol, mentol e eucaliptol. Embora sejam normalmente utilizados
como flavorizantes, os óleos essenciais podem
contribuir com a propriedade antimicrobiana do
produto devido à presença de compostos fenólicos como seus principais constituintes, os quais
agem principalmente sobre bactérias Gram-positivas e leveduras. Os produtos existentes são
formulados empregando-se misturas de ativos e
a maioria apresenta atividade biocida associada
ao efeito antiplaca bacteriana. Grande parte dos
produtos disponíveis no comercio empregam álcool como excipiente na formulação 16-18. No
Brasil, os enxaguatórios bucais são categorizados como produtos de higiene pessoal e cosméticos, sendo as formulações que apresentam indicações específicas, como anti-sépticos, antiplaca e de uso infantil, classificadas como produtos
de grau 2.
Assim, no presente estudo, buscou-se avaliar
a atividade antibacteriana do óleo essencial de
T. vulgaris e o desenvolvimento de uma formulação farmacêutica antiplaca bacteriana para uso
oral contendo óleo essencial comercial de tomilho como constituinte ativo, visando possível
aplicação tanto no tratamento como na prevenção da cárie e de doenças periodontais.
Latin American Journal of Pharmacy - 29 (6) - 2010
MATERIAL E MÉTODOS
Óleo essencial e sua caracterização
química por cromatografia gasosa
(CG-MS)
O óleo essencial de Thymus vulgaris (tomilho, TM) foi adquirido comercialmente da empresa Ferquima Indústria e Comércio Ltda., Brasil. Este óleo essencial foi submetido a caracterização química utilizando a cromatografia gasosa
com detecção por espectrometria de massas
(CG-MS), determinando-se a porcentagem dos
constituintes majoritários presentes na amostra.
Esta análise foi realizada seguindo metodologia
e condições de analise como descrito por Stefanello et al. 19.
Elaboração das formulações farmacêuticas
para uso oral
No desenvolvimento das formulações farmacêuticas para uso oral (enxaguatório bucal) contendo o óleo essencial de tomilho foram empregados os seguintes materiais: água destilada, glicerina, metilparabeno, óleo de mamona hidrogenado, cocoamidopropilbetaína, fosfato de sódio, fluoreto de sódio, corante, sacarina, polivinilpirrolidona e o óleo essencial comercial de T.
vulgaris na concentração inibitória mínima e
concentração sub-inibitória, seguindo metodologia descrita por Cordeiro et al. 20; Farmacopéia
brasileira 21, com modificações. Foram preparadas também formulações controles (Branco)
contendo todos os excipientes, exceto o óleo
essencial ativo, sendo uma formulação controle
contendo o conservante metilparabeno e outra
sem o conservante metilparabeno (0,2 %).
Microrganismo indicador
Foi utilizada como microrganismo indicador
a cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC
25175), mantida como cultura pura no Laboratório de Microbiologia da Universidade do Vale
do Paraíba (São José dos Campos - SP, Brasil).
Determinação da Concentração Mínima
Inibitória (CIM)
Para determinação da CIM utilizou-se a técnica do poço 22-24 empregando-se meios de cultura Tripsina de Soja (TSB) produzidas pela DIFCO®. Em placas de Petri de vidro com 15 cm
de diâmetro, colocou-se 1mL do inóculo (0,5 da
escala de Mc Farland, correspondendo à 3x108
UFC/mL), preparado em solução fisiológica a
0,9 % a partir de cultura fresca da cepa indicadora (24 h a 37 °C), e em seguida colocou-se o
meio ágar Tripsina de soja a cerca de 40 °C.
Após a gelificação do ágar, confeccionaram-se
poços de 5mm de diâmetro. Uma alíquota de 20
µL das soluções teste e controles foram pipetados, individualmente, nos poços. O óleo essencial foi avaliado nas concentrações de 1/1, 1/2,
1/4, 1/8 e 1/16, tendo como diluente propilenoglicol/água destilada esterilizada (5:95, v/v). Como controle positivo utilizou-se Gluconato de
Clorexidina a 0,12 % (Periogard®) e como controle negativo o diluente propilenoglicol/água
destilada esterilizada (5:95). O tempo de pré-difusão foi de aproximadamente 5 horas dentro
do fluxo laminar. Após a difusão das soluções
no meio de cultura, as placas foram incubadas a
37 °C por 24/48 h. Dado o período de incubação, a leitura dos halos formados foi realizada
em temos de diâmetro do halo de inibição em
milímetros. Procedeu-se também a determinação
da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do
óleo essencial bioativo, empregando metodologia descrita pelo NCCLS 24. Todos os experimentos foram realizados pelo menos em duplicata.
Avaliação da formação de placa bacteriana
Foram utilizados cerca de 3 mL de caldo sacarosado, juntamente com uma bengala de vidro esterilizada (superfície sólida). Neste meio
foi adicionado o inóculo da cepa padrão de S.
mutans – ATCC 25175 de acordo com a turbidez
0,5 da escala de Mac Farland (correspondendo à
3x108 UFC/mL). Em seguida foi adicionado, separadamente, cerca de 1mL das amostras (óleos
essências e formulações contendo o óleo essencial e formulações controle) e dos controles experimentais nos tubos de caldos sacarosados.
Como controle negativo foi utilizada água destilada estéril e como controle positivo Clorexidina
aquosa à 0,2 %. Sendo em seguida os tubos incubados em microaerofília a 37 ºC por 24 e 48
h. Os experimentos foram realizados, pelo menos, em duplicata. Após o período de incubação
dos caldos sacarosados, os tubos foram agitados
e cerca de 0,15 mL foram semeados em placas
de ágar Sangue e incubadas nas mesmas condições acima descritas. Para verificação da ação
bactericida ou bacteriostática, após 24 e 48 h de
incubação foi avaliada a formação ou ausência
de unidades formadoras de colônias por mL
(UFC/mL) do caldo sacarosado.
Avaliação da aderência em superfície
sólida
A avaliação da formação da placa bacteriana
foi realizada visualmente (análise macroscópica), complementando a análise pela microscopia eletrônica de varredura (MEV). De modo
que as bengalas de vidro, após período de incu943
SANTOS R.I., PEREIRA D.F.A., TEODORO G.R., DEL CIAMPO J.O., OGASAWARA M.S., CANETTIERI A.C.V., KHOURI S. &
SALVADOR M.J.
bação, foram cuidadosamente retiradas com alça
de platina e colocadas em placas descartáveis
estéreis, para avaliação qualitativa da ação antiplaca dos enxaguatórios. Procedendo a microscopia, as bengalas de vidro dos diferentes grupos foram colocadas em placa metálica para o
banho eletrolítico de ouro em vacuolizadora
DENTRON DESK II. Os corpos de prova foram
analisados e fotodocumentados em microscópio
eletrônico de varredura, JEOL modelo JSM –
5310, em aumento de 5000x. Estes experimentos
foram realizados no Laboratório Associado de
Sensores e Materiais (LAS/CTE) no Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais (INPE/São José
dos Campos - SP, Brasil).
Figura 1. Constituintes majoritários do óleo essencial
RESULTADOS
Os resultados da caracterização química do
óleo bioativo estão apresentados na Figura 1,
onde pode-se verificar a presença de carvacrol,
m-cimeno e α-pimeno como constituintes majoritários.
Empregando-se ensaios microbiológicos verificou-se que o óleo essencial de tomilho apresentou considerável atividade frente o S. mutans
(ATCC 25175) com halos de inibição que variaram de 30 a 2 mm, respectivamente, entre a
maior e menor concentração avaliado. A concentração inibitória mínima (CIM) obtida para
este óleo essencial foi de 1 % (equivalente a 100
µg/mL). Como controle negativo empregou-se
propilenoglicol/água deionizada esterilizada
(5:95) para o qual não observou-se inibição do
desenvolvimento microbiano, como controle
positivo experimental utilizou-se Periogard® a
0,12 % que apresentou um halo de inibição
frente ao S. mutans (ATCC 25175) de 22 mm.
Procedeu-se o desenvolvimento de formulações de enxaguatório bucal contendo óleo de
tomilho a 0,25 % (TM 0,25 %) e 1 % (TM 1 %) e
formulações controle sem o óleo de tomilho,
com e sem conservante, as quais foram submetidas à atividade antiplaca e antibacteriana (Tabela 1).
No estudo para verificação da formação de
placa constatou-se que na presença das duas
de tomilho empregando a cromatografia gasosa
(CG/MS).
Avaliação Macroscópica
da formação de placa
(aderência)
Avaliação Microscópica
da formação de placa
por MEV (aderência)
Contagem
de UFC/mL
Interpretação
frente ao
microrganismo
Formulação com conservante
+ óleo essencial TM 0,25%
-
+
> 105
Viável
Formulação com conservante
+ óleo essencial TM 1%
-
-
0
Bactericida
-
+
132
Bacteriostático
-
+
> 105
Viável
+
+
> 105
Viável
-
-
0
Bactericida
Produtos
Formulação Controle
Branco com conservante
Formulação Controle
Branco sem conservante
Controle negativo
Água destilada esterilizada
Controle positivo
Clorexidina 0,05%
Tabela 1. Avaliação do efeito na formação de placa bacteriana e da atividade antibacteriana da formulação de
enxaguatório bucal contendo óleo essencial de Thymus vulgaris. -: ausência de aderência bacteriana; +: presença de aderência bacteriana.
944
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Figura 2. Avaliação, macroscópica, do efeito na formação de placa bacteriana da formulação contendo
óleo essencial de Thymus vulgaris (tomilho). A =
controle negativo (água destilada esterilizada); B =
controle positivo (Clorexidina aquosa a 0,2 %); C =
Formulação do enxaguatório bucal Controle-Branco
sem conservante; D = Formulação do enxaguatório
bucal Controle-Branco com conservante; E = Formulação do enxaguatório bucal com óleo essencial de
tomilho TM 0,25 %; F = Formulação do enxaguatório
bucal com óleo essencial de tomilho TM 1 %.
formulações contendo óleo de tomilho (TM 0,25
% e TM 1 %), não se observou macroscopicamente aderência de bactérias as bengalas de vidro, exceto para o controle negativo (Fig. 2, Tabela 1). Já na analise microscópica por microscopia eletrônica de varredura (MEV) a formulação com conservante + óleo essencial de tomilho a 1 % e o controle positivo clorexidina 0,05
% não foi possível verificar aderência de microrganismo na superfície sólida. As demais amostras analisadas já apresentaram aderência nas
análises por MEV (Fig. 3, Tabela 1),
DISCUSSÃO
O interesse por agentes antibacterianos de
origem natural tem aumentado com o propósito
de combater doenças infecciosas mostrando que
Figura 3. Avaliação, microscópica (MEV), do efeito na
formação de placa bacteriana da formulação contendo
óleo essencial de Thymus vulgaris (tomilho) por
MEV. A = controle negativo (água destilada esterilizada); B = controle positivo (Clorexidina aquosa a 0,2
%); C = Formulação do enxaguatório bucal ControleBranco sem conservante; D = Formulação do enxaguatório bucal Controle-Branco com conservante; E =
Formulação do enxaguatório bucal com óleo essencial
de tomilho TM 0,25 %; F = Formulação do enxaguatório bucal com óleo essencial de tomilho TM 1 %.
possuem espectro de ação com eficácia frente a
diferentes agentes microbianos 11,19.
O óleo essencial de T. vulgaris (tomilho) tem
sido usado em fitoterápicos, em cosméticos e
em indústrias de alimento. Martinez et al. 11,
avaliaram a ação antimicrobiana do óleo essencial de T. vulgaris, verificando promissora atividade antibacteriana e tendo como constituintes
majoritários no óleo bioativo os terpenos timol
(39,7 %), cimeno (30 %) e limoneno (1,7 %).
Nenhum relato de avaliação da atividade antiplaca bacteriana foi encontrado na literatura.
Entretanto, os resultados experimentais obtidos
nesta investigação indicam que a formulação do
enxaguatório bucal sem álcool contendo óleo
essencial de T. vulgaris (TM 0,25 % e TM 1 %)
apresentou efeito antiplaca in vitro, com atua-
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SANTOS R.I., PEREIRA D.F.A., TEODORO G.R., DEL CIAMPO J.O., OGASAWARA M.S., CANETTIERI A.C.V., KHOURI S. &
SALVADOR M.J.
ção na dinâmica da formação da placa bacteriana de S. mutans (ATCC 25175) no modelo experimental utilizado. Tanto no ensaio de cultivo
em meio de cultura apropriado como na microscopia observou-se que a formulação evitou a
formação da placa bacteriana comparando com
os controles positivo (Clorexidina 0,2 %) e negativo (ensaio somente com água destilada; formulação base sem o óleo essencial e sem conservante e formulação base sem o óleo essencial
e com conservante). Inicialmente verificou-se
que o óleo de tomilho exerceu considerável atividade antibacteriana, apresentando CIM de 100
µg/mL para a indicadora S. mutans (ATCC
25175). Nas formulações de enxaguatório preparadas com TM 0,25 % observou-se que macroscopicamente não houve aderência a superfície
sólida e no plaqueamento do caldo verificou-se
que os microrganismos estavam íntegros, porém
na formulação TM 1% também não houve aderência a superfície sólida, mas verificamos que o
não houve crescimento dos microrganismos no
plaqueamento do caldo, o que indica que nesta
concentração o produto é bactericida. Já para as
formulações controle (Branco) indicam que o
conservante pode estar agindo como coadjuvante frente à cepa indicadora estudada, pois mesmo na ausência do óleo essencial de tomilho
(principio ativo) o produto com conservante reduziu as colônias passando de 100 mil (formulação controle sem conservante) para 132 colônias (formulação controle com conservante). Estes resultados foram confirmados pela analise
por MEV da superfície sólida da bengala de vidro. Assim, os resultados mostraram atividade
antiplaca bacteriana para as formulações de enxaguatório bucal contendo óleo essencial de T.
vulgaris (tomilho) frente a S. mutans (ATCC
25175) que é uma indicadora que se apresenta
como agente importante de doenças da cavidade oral 15. Enxaguatórios bucais, contendo outros óleos essências, tem- se demonstrado tam-
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mais de uma planta em associação na formulação. O enxaguatório bucal desenvolvido no presente estudo não contem álcool na sua formulação, foi formulado contendo somente óleo essencial de T. vulgaris e apresentou resultados
antiplaca bacteriana promissores. Entretanto, estudos mais detalhados in vitro e in vivo com este produto, bem como estudos de estabilidade e
avaliação de toxicidade devem ser realizados visando uma possível aplicação profilática e/ou
terapêutica.
CONCLUSÃO
Neste estudo verificou-se que o óleo essencial de T. vulgaris (tomilho) apresenta efeito antibacteriano frente a S. mutans (ATCC 25175)
com CIM de 100 µg/mL. Os constituíntes químicos majoritários detectados por CG-MS no óleo
bioativo foram carvacrol, p-cimeno e α-pineno.
Procedeu-se a elaboração de formulação farmacêutica para uso oral contendo óleo essencial
de T. vulgaris e os resultados obtidos indicam
ação antiplaca in vitro do enxaguatório bucal
contendo óleo essencial de tomilho a 1 % frente
ao S. mutans (ATCC 25175) com atuação na dinâmica da formação da placa bacteriana. Verificou-se também que o conservante utilizado nas
formulações pode agir como um coadjuvante,
visto que a formulação controle (branco, sem o
óleo essencial de tomilho) e com conservante
inibiu macroscópicamente a aderência de bactérias a superfície sólida e apresentou efeito bacteriostático.
Agradecimentos. À FAPESP, FAEPEX-UNICAMP e a
Faculdade de Ciências da Saúde-UNIVAP pelo apoio
financeiro. À pesquisadora Maria Lúcia B. de MattosLAS/CTE- INPE/SJC.
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