MINISTÉRIO DA SAÚDE
SECRETARIA DE ATENÇÃO À SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ATENÇÃO ESPECIALIZADA
COORDENAÇÃO GERAL DE SANGUE E HEMODERIVADOS
Noções de Imunohematologia
Ana Paula R. Diniz Zanelli – HC Ribeirão Preto
David Sebastião L. Nevoa Junior – HC MARÍLIA
Everaldo José Schörner – HEMOSC
Giovanni de Castro Borges – HEMOMINAS
Neila Simara Zanon – HEMOSC
Rodrigo Spessotto Morais – HC Ribeirão Preto
Sérgio Roberto L. Albuquerque - HEMOAM
ANTÍGENOS
Antígeno:
Os antígenos são substâncias que podem ser reconhecidas pelas
células T, células B ou ambas através de receptores
representados por anticorpo ou TCR (receptor de célula T)
particular.
• Antígeno completo ou imunógeno: é capaz de ativar uma
resposta imune.
• Antígeno incompleto: não é capaz de ativar uma resposta
imune.
• Antígenos Eritrocitários: antígenos de
sangüíneos sendo A, B e D os principais.
grupos
ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS
ANTICORPOS
São as substâncias produzidas em resposta a um estímulo
imunogênico
e
que
são
capazes
de
interagir
especificamente com o epítopo antigênico que provocou a
sua síntese.
ANTICORPOS: ESTRUTURA BÁSICA
Contém 4 cadeias polipeptídicas:

2 cadeias leves (L)

2 cadeias pesadas (H)

Carboidratos

União por pontes dissulfídricas
ANTICORPOS: SÍTIO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
Sítio de ligação ao antígeno (parátopo)
Sítios de ligação ao antígeno
Epítopo
Dobradiça

Formado pelas porções VL e VH

Determina a especificidade do anticorpo
ANTICORPOS
Imunoglobulina IgM
Representação esquemática da configuração pentamérica
da imunoglobulina IgM.
RESPOSTA IMUNE
Resposta
Primária: Resulta
na produção de
imunoglobulina
IgM depois de um
período de 1 a 2
semanas .
Resposta
Secundária:
exposição resulta
na produção de
IgG num título
elevado em um
curto espaço de
tempo (resposta
anamnéstica)
TIPOS DE ANTICORPOS
Definições:
Autoanticorpos: anticorpos do soro de indivíduos
que reagem com seus próprios antígenos.
Aloanticorpos: anticorpos que reagem com
antígenos da mesma espécie pertencentes a
indivíduos geneticamente diferentes.
TIPOS DE ANTICORPOS
• Completos ou Aglutinantes: capazes de aglutinar
em solução salina, são geralmente IgM
• Incompletos
aglutinantes:
conseguir
ou
bloqueadores
fixam-se
às
aglutiná-las
ou
não
hemácias
sem
(promovem
sensibilização). Costumam ser IgG, porém certos
IgG (anti-A, anti-B) são aglutinantes e certos IgM
não o são (anti-Jka).
GRUPOS SANGUÍNEOS HUMANOS ANTICORPOS ANTIERITROCITÁRIOS
• Anticorpos naturais (maioria da classe IgM):
– Resultam de estímulos “inaparentes”.
– Ex: anti-A; anti-B; anti-A,B
• Anticorpos imunes (maioria da classe IgG):
– Resultam de estímulos transfusionais ou gestacionais.
– Ex: anti-D; anti-K; anti-c; anti-C; anti-Fya; anti-jka
GRUPOS SANGUÍNEOS HUMANOS ANTICORPOS
COMPORTAMENTO TÉRMICO
• Anticorpos frios (maioria são IgM):
– Reagem melhor em temperaturas abaixo de 25 0C.
– Ex: anti-A; anti-B; anti-A,B; anti-M
• Anticorpos quentes (maioria são IgG):
– Reagem melhor em temperaturas próximas a 37 0C.
– Ex: anti-D; anti-K; anti-C; anti-E; anti-Fya; anti-jka
GRUPOS SANGUÍNEOS HUMANOS ANTICORPOS FIXAÇÃO DO
COMPLEMENTO
• Anticorpos que fixam o complemento:
– IgM; IgG3; IgG1; IgG2
– Ex: anti-A; anti-B; anti-A,B; anti-Jka
• Anticorpos que não fixam o complemento:
– IgG4; IgD; IgE
– Ex: anti-Lua; anti-Lub; anti-U
TIPOS DE ANTICORPOS
• Monoclonais preparados a partir de hibridomas
• Policlonais preparados a partir da imunização de
animais com proteínas humanas.
REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO CARACTERÍSTICAS DAS
INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO
 Especificidade:
 determinada pela combinação das estruturas reativas do antígeno e do anticorpo.
 Reversibilidade:
 determinada pela dissociação do complexo antígeno-anticorpo.
 Equilíbrio:
 determinado pela constante de associação K do complexo antígeno-anticorpo.
 Exotermia:
 as reações antígeno-anticorpo liberam calor.
 Afinidade:
 é a força de atração entre o antígeno e o anticorpo.
 Avidez:
 É a força de união entre o antígeno e o anticorpo.
REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO – NUVEM IÔNICA
m
D
g = eletronegatividade
m = força iônica D = constante
dielétrica
POTENCIAL ZETA
g
z
D
g = eletro-negatividade
m = força iônica
m
D = constante dielétrica
MECANISMOS DE PRODUÇÃO ARTIFICIAL DE AGLUTINAÇÃO
• - Tratamento das hemácias por enzimas
proteolíticas: a tripsina, papaína, bromelina e ficina
são enzimas capazes de retirar fragmentos
polipeptídicos da superfície das hemácias.
MECANISMOS DE PRODUÇÃO ARTIFICIAL DE AGLUTINAÇÃO
•
Adição de substâncias macromoleculares: as
substâncias (albumina, dextran, PVP, PEG) se
polarizam no campo elétrico das hemácias
diminuindo a força de repulsão pela neutralização e
aumentando a constante dielétrica do meio.
MECANISMOS DE PRODUÇÃO ARTIFICIAL DE AGLUTINAÇÃO
•
Alteração da força iônica do meio: o uso da solução
de LISS, na primeira fase da reação, provoca um
afastamento das hemácias e um aumento da
sensibilidade da reação pelo maior acesso dos
anticorpos. Na segunda fase a retirada do LISS pela
lavagem, reaproxima as hemácias já sensibilizadas.
TESTE DE ANTIGLOBULINA (COOMBS)
•
DIRETO: demonstra hemácias sensibilizadas “in
vivo” por anticorpo ou frações de complemento.
• INDIRETO: permite a execução de pesquisa e
identificação de anticorpos anti-eritrocitários, teste
de compatibilidade, fenotipagens eritrocitárias.
HEMÁCIAS CONTROLE DE COOMBS
• Deverão ser utilizadas sempre que obtiver um
resultado negativo após a adição do soro de
Coombs
• Garante que o processo de lavagem foi adequado e
que a AGH está funcionando adequadamente
GRAUS DE AGLUTINAÇÃO
• 4+ — solução límpida com um único agregado de hemácias
— ESCORE 12
• 3+ — reação forte, solução límpida sem nenhuma hemácía
livre e vários agregados grandes de hemácias — ESCORE
10
• 2+ — agregados de tamanho médio, solução clara —
ESCORE 8
• 1+ — Pequenos agregados, fundo turvo, avermelhado —
ESCORE 5
• Fraco ou pó — fraca granulação, fundo turvo, agregados
microscópicos — ESCORE 3
• Resultado negativo - ESCORE 0
GRAUS DE AGLUTINAÇÃO
SISTEMA ABO
• Primeiro sistema de grupo sanguíneo a ser
descoberto em 1900.
• Ainda hoje é o principal sistema de grupo sanguíneo
• Possui anticorpos de ocorrência “natural”
• São carboidratos adicionados a substâncias
precursoras existentes na membrana eritrocitária
ANTÍGENOS ABH
Antígeno
A
Substância
precursora
Antígeno
H
Antígeno
B
ANTÍGENOS ABH
Expressão do antígeno H no tecido hematopoiético.
Gal
GlcNAc
a12
Transferase H
Fuc
Antígeno H
R
Precursor tipo II
ANTÍGENOS ABH
Expressão do antígeno A no tecido hematopoiético.
Antígeno A
NAcGal
b13
Gal
Transferase A
GlcNAc
a12
Fuc
Antígeno H
R
ANTÍGENOS ABH
Expressão do antígeno B no tecido hematopoiético.
Antígeno B
Gal
b13
Gal
Transferase B
GlcNAc
a12
Fuc
Antígeno H
R
ANTÍGENOS ABH NAS HEMÁCIAS
NAcGal
Gal
GlcNAc
R
Gal
Antígeno A
GlcNAc
Fuc
Antígeno H
Fuc
Gal
Gal
Antígeno B
Fuc
GlcNAc
R
R
FENÓTIPO BOMBAY
SP2
SP1
hh
AA
AO
BB
BO
AB
sese
OO AA
AO
Ausência de antígenos ABH nos eritrócitos
BB
BO
AB
OO
Ausência de antígenos ABH na saliva
SISTEMA ABO
• Prova Direta  detecção de antígenos através do
uso de de anti-soros conhecidos
• Prova Reversa  detecção de anticorpos através
do uso de hemácias conhecidas
FENÓTIPOS ABO
Grupos Antígenos eritrocitários Anticorpos plasmáticos
A
A
Anti-B
B
B
Anti-A
AB
AeB
--
O
-
Anti-A; anti-B; anti-A,B
FENOTIPAGEM ABO
Grupos
A
B
AB
O
Prova direta
Prova reversa
Testar as
as hemácias
hemácias com
com os
os
Testar
anti-soros:
anti-soros:
Testar o
o plasma
plasma com
com
Testar
as hemácias:
hemácias:
as
Anti-A
Anti-B
Anti-A,B
A1
B
MÉTODOS DE TIPAGEM
Gel centrifugação
Microplacas
Tubos
COMPATIBILIDADE ABO PARA HEMÁCIAS
A
O
AB
B
COMPATIBILIDADE ABO PARA HEMOCOMPONENTES
PLASMÁTICOS
A
AB
O
B
REAGENTES UTILIZADOS NA FENOTIPAGEM ABO
•Anti-soros:
anti-A
anti-B
anti-AB, dispensável quando anti-A e anti-B
são monoclonais
REAGENTES UTILIZADOS NA FENOTIPAGEM ABO
•Hemácias
Hemácia A1
Hemácia B
Hemácias A2 e O(opcionais)
SUBGRUPOS DE A
•80% dos indivíduos do grupo A são do
subgrupo A1
•20% são classificados como A2
•Estes 2 subgrupos reagem fortemente com
anti-A
•Alguns indivíduos A2 desenvolvem anti-A1
•Existem outros subgrupos mais raros
SUBGRUPOS DE A
Fenótipos
Anti-soros
Anticorpos
Anti-A Anti-B Anti-A,B Anti-H Regulares Irregulare
Antígenos
salivares
A1
4+
0
4+
0
Anti-B
0s
A, H
A2
4+
0
4+
4+
Anti-B
Anti-A1
A, H
A3
2+
0
2+
4+
Anti-B
Anti-A1
A, H
Ax
1+
0
2+
4+
Anti-B
Anti-A1
H
Aend
1+
0
1+
4+
Anti-B
Anti-A1
H
Am
0
0
0
4+
Anti-B
0
A, H
Ay
0
0
0
4+
Anti-B
0
A, H
Ael
0
0
0
4+
Anti-B
Anti-A1
H
SUBGRUPOS DE B
•São muito mais raros que os subgrupos de
A e são determinados de maneira similar
aos subgrupos de A
SUBGRUPOS DE B
Fenótipos
Anti-soros
Anticorpos
Anti-A Anti-B Anti-A,B Anti-H Regulares Irregulare
Antígenos
salivares
B
0
4+
4+
2+
Anti-A
0s
B, H
B3
0
2+
2+
3+
Anti-A
0
B, H
Bx
0
1+
1+
3+
Anti-A
Anti-B
H
Bm
0
0
0
3+
Anti-A
0
B,H
Bel
0
0
0
3+
Anti-A
Anti-B
H
DISCREPÂNCIAS ABO
•Devem ser resolvidas antes da liberação da
bolsa.
•Em
receptores,
com
necessidade
de
transfusão de urgência deverá ser utilizado
hemácias do grupo O
•Descartar sempre causas de natureza técnica
ANTICORPOS ABO
•São, geralmente IgM, podendo também ser
IgG
•A forma imune pode ser produzida por
indivíduos expostos a eritrócitos estranhos
Indivíduos do grupo O produzem anti-A,B
RAZÕES PARA REAÇÕES SEVERAS
•Anticorpos estão sempre presentes
• Anticorpos quase sempre estão em alto título
•Anticorpos são capazes de se ligar a 37°C
•Ambos IgG e IgM são capazes de fixar
complemento
•Antígenos A e B estão presentes em grandes
quantidades
TRANSFERÊNCIAS PASSIVA DE ANTICORPOS ABO
Normalmente não tem sérias conseqüências
• Razões:
 Rápida diluição do plasma infundido
 Em cada hemácia se ligam poucos anticorpos
 Anticorpos são neutralizados por substâncias
livres no plasma
SISTEMA Rh
•Descoberto em 1939
•Após o ABO, é o sistema de maior importância
clínica e o mais complexo
•Principais antígenos: D, C, E, c , e
•O antígeno Rh é uma lipoproteína e constitui parte
integrante da parede da hemácia
ANTÍGENO D
• O termo Rh positivo e Rh negativo refere à
presença ou ausência do antígeno D
• O antígeno D é o mais clinicamente significante
FENÓTIPO D FRACO
• Deve ser investigado sempre que o resultado for
negativo em centrifugação imediata
• São aqueles antígenos D que reagem menos que 2+
em qualquer uma das fases ou aqueles que reagem
somente em AGH
PROTEÍNA Rh (RhD e RhCE)
Flegel & Wagner, 2002
VARIANTES DO ANTÍGENO RhD
• D parcial
– mutações de ponto missenses no gene RHD
– rearranjos gênicos entre RHCE e RHD (alelos
híbridos)
• D fraco
– mutações de ponto missenses
Cartron et al, 1998; Wagner et
al,1999
D PARCIAL
Características:
Expressão de diferentes epítopos no antígeno D.
São definidos por anti-soros monoclonais.
ANTICORPOS Rh
• Maioria é IgG
• São imunes, estimulados por transfusão ou
gravidez
• Persistem na circulação por longos períodos
• Não fixam complemento
• Atravessam a placenta
REAGENTES
• § 2º Deve ocorrer a tipagem RhD, observando os
seguintes critérios:
• I - o antígeno RhD deve ser determinado colocando-se
as hemácias com antissoro anti-RhD (Anti-D);
• II - em paralelo, deve ser sempre efetuado um
controle da tipagem RhD, utilizando-se para isto sorocontrole compatível com o antissoro utilizado
(monoclonal ou policlonal) e do mesmo fabricante do
anti-D;
REAGENTES
III - se a reação for negativa para a presença do antígeno
RhD, deve ser efetuada a pesquisa do antígeno D -fraco,
considerando que:
a) para a realização da pesquisa de antígeno D -fraco
recomenda- se ser utilizado no mínimo dois anti-soros
anti-RhD (anti-D) contendo anticorpos da classe IgG
obtidos de linhagens celulares distintas incluindo a fase
da antiglobulina humana;
REAGENTES
d) em doadores de sangue tipados como RhD negativo,
recomenda-se a pesquisa dos antígenos C (maiúsculo) e
E (maiúsculo) e os hemocomponentes devem ser
devidamente
identificados.
A
utilização
dos
concentrados de hemácias RhD negativo C ou E positivos
deve obedecer a protocolos escritos específicos da
instituição ou seguir critérios do responsável técnico de
cada local; e
e) se a reação com o soro-controle de RhD for positiva, a
tipagem RhD é considerada inválida e o
hemocomponente só deve ser rotulado e liberado para
uso após a resolução do problema.
MÉTODOS DE TIPAGEM Rh
CR
h
AntiD
Gel centrifugação
Gel centrifugação
Tubos
Microplacas
REAÇÕES TRANSFUSIONAIS
• Hemólise extravascular
• TAD positivo
• Febre inexplicada
• Elevação da bilirrubina
• Redução da hemoglobina
TESTE DE ANTIGLOBULINA DIRETO (TAD)
Detecta sensibilização “in vivo”
Aplicações:
 Investigação de AHAI
 Investigação de hemólise induzida por droga
 Investigação de Doença Hemolítica Perinatal
 Investigação de reação transfusional
TESTE DE ANTIGLOBULINA INDIRETO
Aplicações
 Pesquisa de anticorpos Irregulares
 Identificação de Anticorpos Irregulares
 Fenotipagem
 Pesquisa de D fraco
 Teste de Auto-controle
PAI
 Anticorpos Irregulares são aloanticorpos que
reagem com antígenos eritrocitários ,exceto anti-A
e anti-B.
 São encontrados em 0,3-38% da população
dependendo do grupo estudado.
 A imunização para antígenos eritrocitários resultam
de transfusão, gestação, transplante ou injeção de
material imunogênico.
PAI
 Aloanticorpos
antieritrocitários
podem
ser
detectados no soro ou no plasma de pacientes
quando colocados em contato com hemácias que
contenham o antígeno.
 Uma vez detectados os aloanticorpos devem ser
identificados.
 As técnicas para pesquisa e identificação de
anticorpos são as mesmas.
PESQUISA DE Ac IRREGULARES
Soro Do Paciente

2 ou 3 Hc Fenotipadas
SE +
IDENTIFICAÇÃO
REAGENTES UTILIZADOS PARA A REALIZAÇÃO DO PAI
• Conjuntos de 2 ou 3 hemácias do grupo O fenotipadas
para os principais antígenos de grupo sanguineo
• As hemácias devem homozigotas para que seja
detectado anticorpos com efeito de dose.
ANTICORPOS CLINICAMENTE SIGNIFICANTES
 São anticorpos que reduzem a sobrevida das
hemácias transfundidas ou que podem estar
associados à doença hemolítica perinatal.
 Alguns
anticorpos
destroem
hemácias
incompatíveis dentro de horas ou até minutos,
outros diminuem a sobrevida em alguns dias e
outros, ainda, não causam destruição.
ANTICORPOS DE SIGNIFICÂNCIA CLÍNICA
RH
KELL
DUFFY
KIDD
Ss
Ac QUE DEVEM
SER
RESPEITADOS
IDENTIFICAÇÃO DE Ac IRREGULARES
 Se o paciente já tiver
sido sensibilizado
previamente, porém, não
apresentar triagem
positiva, o Ac
anteriormente identificado
deverá ser respeitado.
CAUSAS D RESULTADOS FALSO-NEGATIVO
• Neutralização do reagente
►lavagem inadequada
►aumento no volume de soro utilizado
►contaminação do reagente AGH
▪ Interrupção no teste
►dissociação do IgG ligado
CAUSAS DE RESULTADO FALSO-NEGATIVO
▪ Estocagem Imprópria do reagente
►perda de reatividade da AGH por
congelamento ou calor
►reagente de hemácias pode perder
antígenos na estocagem
▪ Procedimento impróprio
►excesso ou falta de centrifugação
► esquecimento de algum reagente
►suspensão de hemácias muito pesada
►proporção soro/célula incoreta
CAUSAS DE RESULTADO FALSO-NEGATIVO
• Complemento
• Salina
►pH 7.0 a 7.2
►temperatura adequada
CAUSAS DE RESULTADO FALSO-POSITIVO
• Células aglutinadas ante da lavagem
• Partículas ou contaminantes
►poeira ou sujeira no tubo
▪ Procedimentos inadequados
►excesso de centrifugação
►centrifugação com PEG
CAUSAS DE RESULTADO FALSO-POSITIVO
• TAD
• complemento
►componentes do complemento podem se
ligar durante a estocagem
►complemento pode se ligar em amostras
coletadas na mesma linha de infusão
usada
para
administrar
soluções
contendo dextrose.
MINISTÉRIO DA SAÚDE
SECRETARIA DE ATENÇÃO À SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ATENÇÃO ESPECIALIZADA
COORDENAÇÃO GERAL DE SANGUE E HEMODERIVADOS
SAF/Sul, Trecho 02, Ed. Premium, Torre 02, ala B, 2ª andar sala 202
Brasília-DF-Brasil
Tel.: (61) 3315-6159
[email protected]
Coordenador Geral de Sangue e Hemoderivados: Guilherme Genovez
Responsável pela Área Técnica de Hemoterapia: Helder Melo
Área Técnica de Hemoterapia: Giselle Barban, Jacqueline Vianna; Jakeline Nunes;
Lydia França; Priscila Murador; Reyjane Teixeira e Vânia Melo