UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS INFECCIOSAS
CARACTERIZAÇAO GENÉTICA DE TRYPANOSOMA CRUZI EM
PACIENTES COM DOENÇA DE CHAGAS CRÔNICA, NO ESTADO DO
AMAZONAS, BRASIL
ROSA AMÉLIA GONÇALVES SANTANA
MANAUS
2013
i
ROSA AMÉLIA GONÇALVES SANTANA
CARACTERIZAÇAO GENÉTICA DE TRYPANOSOMA CRUZI EM
PACIENTES COM DOENÇA DE CHAGAS CRÔNICA, NO ESTADO DO
AMAZONAS, BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas em
convênio com a Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para
obtenção do titulo de Mestre em Doenças
Tropicais e Infecciosas.
Orientadora: Dra. Maria das Graças Vale Barbosa
Co-orientador: Dr. Henrique Manoel Condinho da Silveira
Manaus
2013
ii
Ficha Catalográfica
S232c
Santana, Rosa Amélia Gonçalves.
Caracterização genética de Trypanosoma cruzi em
pacientes com doença de chagas crônica, no estado do Amazonas,
Brasil. /Rosa Amélia Gonçalves Santana. -- Manaus : Universidade
do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2013.
59 f. : il.
Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas – UEA/FMT, 2013.
Orientadora: Dra. Maria das Graças Vale Barbosa
1. Trypanosoma cruzi.
4. Biologia molecular I. Título.
2. Doença de Chagas 3. Xenodiagnóstico
CDU: 614.4
iii
FOLHA DE JULGAMENTO
CARACTERIZAÇAO GENÉTICA DE TRYPANOSOMA CRUZI EM
PACIENTES COM DOENÇA DE CHAGAS CRÔNICA, NO ESTADO DO
AMAZONAS, BRASIL
ROSA AMÉLIA GONÇALVES SANTANA
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa
de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado”
Banca Julgadora:
________________________________________
Profª. Maria das Graças Vale Barbosa Guerra, Dra.
________________________________
Prof. Wuelton Marcelo Monteiro, Dr.
_________________________
Prof. Felipe Gomes Naveca, Dr.
iv
Dedicatória
Dedico
Aos meus queridos, Guilherme, Elisa
Giuliana e Elias Neto, por sempre
acreditarem e torcerem por mim.
Aos meus pais, Manoel, Wanda e
Ivanilde.
v
AGRADECIMENTOS
Início e centralizo meus agradecimentos a Deus, pela maravilhosa oportunidade de
viver, pelas bênçãos diárias, e pela sua constante e marcante presença em tudo que
faço e muito especialmente por me dar força, sabedoria e coragem para sempre
seguir em frente.
À minha amada família, meu suporte, companheiros de toda a vida e de cada dia, de
forma imensamente especial à minha mãe sempre tão amorosa e dedicada, onde
quer que esteja, continua sempre ao meu lado, incentivando e me enviando suas
bênçãos.
Aos meus pais vividos Wanda e Manoel, pelo exemplo de vida, pela paciência e
presença constante, pelo apoio psicológico e prático, pelo incentivo, por tentar aliviar
o meu cansaço, mesmo que o deles fosse ainda maior.
Ao Elias Neto, companheiro de tantos anos, pela compreensão quando abri mão de
sua companhia e momentos juntos em prol das atividades científicas.
Aos meus amores Guilherme e Giuliana... fonte de toda força para que eu pudesse
concluir esta etapa da minha vida.
Às minhas tias-primas-irmãs, Ivone, Karol, Raquel, Marcinei, Tamara, Lene e Ana
Maria pelo apoio incondicional às escolhas feitas, demonstrando que eu não poderia
ter escolhido maiores amigas.
À minha tia América, pela compreensão nas minhas ausências, por entender que
mesmo na falta de contato nunca deixei de amar. E mesmo assim ainda permanece
sempre na torcida, pelas palavras de apoio e incentivo desde sempre. Nunca
saberei como retribuir tudo o que recebi.
Aos meus cunhados Ronaldo e Racquel, e a Sra. Soraida, pelo incentivo quando
optei pela vida acadêmica, pelas preocupações, pelo acolhimento aos meus filhos,
mostrando que família também é formada nos corações.
À minha orientadora Graça Barbosa, por todos esses anos de convivência e
ensinamentos, por sempre deixar as portas de seu laboratório abertas para mim,
pelos conselhos, broncas, tempo, risadas, por sua amizade... Obrigada pela
orientação constante.
Ao professor Henrique Silveira, que me acolheu quando mal nos conhecíamos; pelo
tempo, ensinamentos, paciência e também pelos puxões de orelha, sempre
acreditando em mim. Nunca poderei agradecer igualmente.
Ao Dr. Jorge Guerra agradeço pela disposição em ajudar e sua imprescindível
contribuição na execução do projeto.
Ao Dr. Rajendranath, Dr. Felipe Naveca e MSc. George pelas dicas e sugestões
durante o sequenciamento das amostras.
vi
Aos funcionários do Laboratório de Entomologia, Íria, Flávio, Silvana, Jucielle,
Yolanda e especialmente ao senhor Nelson Fé pelos ensinamentos ao longo desses
anos.
À Laylah pelos ensinamentos e auxílio nas técnicas laboratoriais, assim como aos
amigos Laise, Clézia, Josué, Ádria, Jeremias, Rubens, Thays, Daniel pelas risadas e
companhia principalmente nos trabalhos de campo, pelas conversas nem tanto
científicas mas muito proveitosas. Agradeço imensamente pelo acolhimento dentro
do grupo em DC.
À Suzane pela abnegação do próprio tempo para me ajudar com os experimentos,
pelas dicas, pela paciência nos dias difíceis, pelos almoços e companhia durante os
finais de semana...
Ao Felipe Brito pela colaboração durante o desenvolvimento do projeto.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM pela bolsa
de estudos.
À Universidade do Estado do Amazonas por oportunizar a formação de profissionais
qualificados.
À Fundação de Medicina Tropical – HVD pelo suporte e estrutura para execução do
projeto de dissertação.
Aos professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical, pelos seus conhecimentos e experiências transmitidas. As secretárias
Conceição Tufic e Iza Freitas pela amizade e por estarem sempre dispostas a
ajudar.
Aos colegas da Turma de Mestrado - 2011, pelo apoio e convívio ao longo dessa
trajetória.
Não conseguirei ser justa ao agradecer num único momento, o muito que recebi
durante estes dois anos. Tudo que construí neste período só foi possível pela
presença de muitas pessoas essenciais e importantes na minha vida.
Obrigada!
vii
RESUMO
A doença de Chagas (DC) é um importante problema de saúde pública e seu agente
etiológico o Trypanosoma cruzi apresenta uma grande diversidade genética
evidenciada em seis linhagens denominadas DTUs, TcI-TcVI. No estado do
Amazonas, essa doença vem sendo reconhecida como uma antropozoonose
emergente, com predomínio das DTUs TcI e TcIV, relacionadas aos casos da
doença aguda, com evidencias de transmissão oral. O numero de casos crônicos
tem aumentado e as hipóteses de que a infecção chagásica ocorre em alta
prevalência em ampla dispersão como antropozoonose tem sido confirmada pelos
elementos favoráveis a expansão dessa doença como endemia humana. Entretanto
a forma de transmissão da infecção e diversidade do parasito nessa forma clinica
ainda não bem é conhecida. OBJETIVO: Detectar infecção por Trypanosoma cruzi
em pacientes com doença de chagas crônica utilizando métodos parasitológicos e
biologia molecular. MÉTODOS: Neste estudo foram examinadas amostras de
hemocultura e triatomíneos da espécie Triatoma infestans, utilizados no
xenodiagnóstico de 36 pacientes com sorologia reativa durante um inquérito
sorológico sobre a infecção chagásica em áreas periurbana e rural de Manaus. Nos
triatomíneos foram feitas observações sobre a ocorrência de formas flageladas
através de exames a fresco e investigação de DNA do parasito por biologia
molecular através da técnica de PCR citocromo-oxidase subunidade II (CoII), sendo
posteriormente sequenciados. RESULTADOS: Não foram visualizadas formas
flagelares no exame a fresco, assim como não observou-se crescimento em meio de
cultura. A investigação por biologia molecular demonstrou positividade em amostras
de 13 (36%) dos pacientes, classificado como TcI. CONCLUSAO: O isolamento e
classificação da linhagem de T. cruzi TcI em pacientes crônicos sem manifestação
de sintomas, torna evidente a ocorrência do ciclo silvestre e reitera a necessidade de
ações de vigilância através do diagnostico dessa doença através dos serviços de
saúde, informação à população sobre as medidas preventivas para a não inserção
no ciclo de transmissão, evitando assim a possibilidade de novos casos.
Palavras chaves: Trypanosoma cruzi. Doença de Chagas. Xenodiagnóstico.
Biologia molecular
viii
ABSTRACT
Chagas disease is an important public health problem caused by Trypanosoma cruzi.
The parasite shows large genetic diversity evidenced by six DTU lineages, TcI-TcVI.
In the State of Amazonas, this disease has been recognized as an emerging
antropozoonose. TcI and TcIV are the predominante DTUs and have been
associated to acute illness, with evidence of oral transmission. The chronic cases
have increased and the hypothesis that high prevalence of Chagasic infection occurs
are widely dispersed as an antropozoonose in the amazon region has been
confirmed by the data showing the endemicity of the disease. However the chronic
form of infection, transmition characteristics and parasite diversity are still not well
known. Objective: To detect Trypanosoma cruzi infection in patients with chronic
Chagas disease using parasitological and molecular biology methods. Methods: in
this study blood culture and xenodiagnóstic using Triatoma infestans, were
performed for 36 patients with reactive serology to T. cruzi in a serological survey in
peri-urban and rural areas of Manaus. Triatoma were investigated for the presence of
flagellate forms and parasite DNA by PCR. The cytochrome oxidase subunit II was
sequenced. Results: No flagellate forms were observed nor growth in the culture
medium, but molecular biology methods demonstrated that 13 patients (36%) were
positive for T. cruzi of the TcI DTU. Conclusions: The isolation and classification of
T. cruzi of the TcI DTU in chronic asymptomatic, patients reveals the occurrence of
sylvatic cycle and stresses the need for surveillance through diagnosis of the disease
by the health services, information about prevention and interruption of transmission,
thus avoiding new cases.
Key words: Trypanosoma cruzi. Chagas disease. Xenodiagnosis. PCR.
ix
LISTA DE FIGURAS DA DISSERTAÇÃO
Figura 1 – Distribuição de T. cruzi (DTUs) da América do Sul, isolado de
humanos.................................................................................................................... 14
Figura 2 – Representação do ciclo de vida do Trypanosoma cruzi no hospedeiro
invertebrado e vertebrado.1. Ingestão de tripomastigotas 2. Epimastigotas no
intestino médio 3. Multiplicação no intestino médio 4. Tripomastigotas metacíclicas
5.
Tripomastigotas nas fezes do triatomíneo 6. Penetração das células por
tripomastigotas metacíclicas 7.
Multiplicação das amastigotas 8. Amastigotas
intracelulares transformam-se em tripomastigotas....................................................16
Figura 3 – Ciclo de vida de um barbeiro (Triatoma brasiliensis brasiliensis)...........17
x
SUMARIO
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1
1.1
A doença de Chagas .................................................................................................... 1
1.1.1
A Doença de Chagas na Amazônia.......................................................................... 2
1.1.2
Patologia da Doença de Chagas .............................................................................. 5
1.1.3
Vias de Transmissão ................................................................................................ 6
1.1.4
Diagnóstico da Doença de Chagas .......................................................................... 7
1.2
O parasito Trypanosoma cruzi .................................................................................... 10
1.3 Os vetores da doença de Chagas .................................................................................. 16
1.4
2
Reservatórios do Trypanosoma cruzi.......................................................................... 17
OBJETIVOS ................................................................................................................. 19
2.1
Geral........................................................................................................................... 19
2.2
Específicos ................................................................................................................. 19
3
MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 20
3.1
Tipo de estudo ............................................................................................................ 20
3.2
População de estudo .................................................................................................. 20
3.3
Amostra ...................................................................................................................... 20
3.4
Hemocultura de Sangue Total .................................................................................... 21
3.5
Xenodiagnóstico ......................................................................................................... 21
3.5.1 Exame a fresco ........................................................................................................... 21
3.5.2 Diagnóstico molecular ................................................................................................ 22
3.5.2.1 Extração do DNA total dos Triatomíneos ............................................................... 23
3.5.2.2 PCR – do gene Mini-exon ...................................................................................... 23
3.6
Sequenciamento ......................................................................................................... 25
3.6.1 Análise das sequências .............................................................................................. 25
3.7
Aspectos Éticos .......................................................................................................... 26
4
RESULTADO E DISCUSSÃO .............................................. Erro! Indicador não definido.
5.
CONCLUSÃO ...................................................................... Erro! Indicador não definido.
5
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS DA DISSERTAÇÃO .... Erro! Indicador não definido.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 A doença de Chagas
A doença de Chagas (DC) ou Tripanossomíase Americana é uma infecção
parasitária causada pelo Trypanosoma cruzi 1, um protozoário cujo ciclo de vida
inclui a passagem obrigatória por vários hospedeiros mamíferos, para os quais são
transmitidos pelo inseto vetor, o barbeiro. É considerada uma antropozoonose
resultante das alterações produzidas pelo ser humano no meio ambiente e das
desigualdades econômicas 2.
Nas Américas a área de abrangência dessa doença é ampla e se estende
desde o México até a Argentina, não sendo mais restrita a países endêmicos, uma
vez que nos últimos anos tem sido encontrada nos Estados Unidos, Canadá,
Europa, Japão e Austrália, principalmente devido a mobilidade da população. A
Espanha é o país europeu com maior prevalência da DC representando um desafio
em termos de saúde pública 3.
Estima-se que atualmente, no mundo, cerca de 15 a 18 milhões de pessoas
encontram-se infectadas pelo T. cruzi, e aproximadamente 90 milhões de indivíduos
estão em risco de infecção, representando uma das doenças parasitárias
negligenciadas com maior impacto social e econômico 4.
No Brasil os fatores epidemiológicos da DC vem sendo alterados, como
resultado das ações de controle, também, em função das mudanças resultantes de
transformações ambientais e de ordem econômica e social
5
. Em 2006 da
2
Organização Pan-Americana o certificado de ser livre da transmissão vetorial da
doença de Chagas pelo Triatoma infestans 6.
De acordo com o Consenso Brasileiro sobre a DC de 2005 7 no final dos anos
70, a área endêmica ou, mais precisamente, com risco de transmissão vetorial, da
doença no país, incluía 18 estados com mais de 2.200 municípios, nos quais se
comprovou a presença de triatomíneos domiciliados. Ações sistematizadas de
controle químico de populações domiciliadas do vetor foram instituídas a partir de
1975, tendo-se alcançado a total cobertura da área endêmica no ano de 1983.
Essas ações foram mantidas em caráter regular desde então, ainda que o seu
alcance em anos recentes tenha sido progressivamente menor. Isso justifica-se, em
parte, pelos resultados colhidos e, em parte, por acontecimentos alheios ao controle,
como a emergência de outras enfermidades e o reordenamento político-institucional.
Em decorrência das ações de controle cumpridas extensivamente, houve uma
significativa alteração no quadro epidemiológico da DC no país. Além disso,
mudanças ambientais, a maior concentração da população em áreas urbanas, a
melhor compreensão dos acontecimentos e o acúmulo de conhecimentos por parte
da comunidade científica, tornam necessária a revisão das estratégias e da
metodologia de vigilância epidemiológica para a DC no Brasil.
1.1.1 A Doença de Chagas na Amazônia
Considerada por muito tempo com região hipoendêmica para DC, na região
Amazônica essa doença vem sendo recentemente reconhecida como importante
3
antropozoonose negligenciada, com aumento progressivo do numero de casos
agudos e crônicos descritos nos últimos anos 8,9.
Os primeiros casos agudos da DC em humanos foram reportados na Guiana
Francesa por
agudos por
10
; em Belém no Pará, foram descritos os quatro primeiros casos
11
. Desde então mais de 60 surtos com casos agudos tem sido descritos
na região, principalmente nos estados do Pará, Amapá e Amazonas. Entre 1969 e
2008, foram notificados 761 casos da DC na região da Amazônia Brasileira, 568
desses casos foram entre 2002 e 2008 12,13.
A epidemiologia nesta região envolve uma série de determinantes biológicos e
sociais, sendo os mais importantes a migração populacional de áreas endêmicas
para a Amazônia e a intensa transformação da paisagem natural pelo
desmatamento 14.
A transmissão da DC na Amazônia apresenta peculiaridades que obrigam a
adoção de um modelo de vigilância distinto daquele proposto para a área
originalmente de risco da DC no país. Não há vetores que colonizem o domicílio e,
por conseqüência, não existe a transmissão domiciliar da infecção ao homem. Os
mecanismos de transmissão conhecidos compreendem:
I. transmissão oral;
II. transmissão vetorial extra domiciliar;
III.transmissão vetorial domiciliar ou peridomiciliar sem colonização do
vetor.
4
Os fatores biológicos estão relacionados com a presença de animais
silvestres, grande diversidade de reservatórios, principalmente Didelphis marsupialis,
com elevadas taxas de infecção pelo T. cruzi tem sido encontrada no peridomicílio e
intradomicílio dessa região resultando num intenso ciclo de transmissão silvestre
15,16
.
Além disso, a invasão dos domicílios pelos vetores (infectados por T. cruzi) e
a adaptação destes no ambiente antrópico vem sendo relatadas
17
. Mais de 25
espécies de triatomíneos silvestres já foram descritas na Amazônia, todas
consideradas potenciais vetores de T. cruzi, com o registro de pelo menos dez
destas espécies no estado do Amazonas 14,18.
Um outro fator de risco de transmissão da DC nas áreas rurais da região esta
relacionado a construção de moradias próximas aos ecótopos naturais de
triatomíneos e marsupiais, ambos frequentemente infectados por T. cruzi, afetando,
principalmente, as comunidades rurais pobres, onde as habitações precárias
favorecem
o
estabelecimento
de
populações
de
vetores
domésticos
e
peridomiciliares, mediando a fonte de novos casos da doença 19.
No estado Amazonas casos agudos da DC vem sendo registrados nos
últimos anos associados a surtos ocasionados pela transmissão oral através de
alimentos contaminados por T. cruzi. Monteiro e colaboradores
20
identificaram a
DTU TcIV, ao realizar genotipagem de amostras de humanos provenientes de surtos
ocorridos em quatro municípios do Estado do Amazonas, e demonstraram a
circulação da DTU TcI circulando em vetores e reservatórios nas mesmas regiões, o
que pode ter resultado na infecção humana.
5
O Inquérito sorológico Nacional (1975 a 1980) indicou a prevalência de 1.88%
no Amazonas; em estudo soroepidemiológico realizado em Barcelos (Rio Negro/AM)
registrou-se a positividade em 38 (25%) indivíduos
realizado por Magalhães e colaboradores
22
21
. O inquérito sorológico
em área rural de Coari, Tefé e Manaus
apresentou 15 indivíduos reativos para infecção chagásica. Alterações cardíacas da
DCA em pacientes autóctones da Amazônia, sugerem uma morbidade significativa
da doença na Amazônia 23.
Esses demonstram a prevalência da DC na região, ressaltando sobre a
possibilidade de progressão de alguns desses casos para formas crônicas
sintomáticas, chamando a atenção para a importância do diagnóstico através da
realização de inquéritos sorológicos e reforçam a hipótese de que a infecção
chagásica ocorre em alta prevalência e ampla dispersão como enzootia silvestre, e
ao mesmo tempo vem apresentando elementos favoráveis a sua expansão como
endemia humana 13.
1.1.2 Patologia da Doença de Chagas
A DC é caracterizada por um amplo espectro de resultados clínicos que vão
desde ausência de sintomas a doença grave. O curso clínico inclui as fases aguda e
crônica, separadas por um período indefinido onde os pacientes são relativamente
assintomáticos 8.
A fase aguda é na maioria dos casos subclínica e com alta parasitemia tendo
duração de 6-12 semanas. Nos casos sintomáticos apresentam sinais da inoculação
6
(chagoma de inoculação ou sinal de Romaña), febre, adenopatia generalizada,
edema, hepatoesplenomegalia, miocardites e meningoencefalites nos casos mais
severos. Na fase indeterminada da doença, os pacientes poder apresentar testes
sorológicos
e
parasitológicos
positivos,
porém,
são
assintomáticos,
sem
manifestação da infecção no eletrocardiograma e radiografias no coração, esôfago e
intestino 13.
Cerca de 30–40% dos pacientes infectados com T. cruzi que não receberam
tratamento adequado desenvolvem a fase crônica da doença e os sintomas podem
aparecer até 30 anos após a infecção. A cardiopatia chagásica, associada à
insuficiência cardíaca, arritmias, morte súbita e tromboembolismo periférico, é a
manifestação clínica mais importante desta fase devido a sua frequência e
severidade. Além da forma cardíaca, 10 -20% dos pacientes podem desenvolver a
forma digestiva (megaesôfago e megacólon), ou até mesmo uma associação das
formas digestiva e cardíaca 24.
1.1.3 Vias de Transmissão
Embora a DC seja principalmente transmitida pela exposição direta as fezes
de triatomíneos infectados pelo T. cruzi, existem outras formas de transmissão
como, transfusão de sangue, transplante de órgãos, infecção congênita e oral, esta
última tem se tornado muito recorrente em áreas não endêmicas 25.
Recentemente vários surtos da doença de Chagas tem sido reportados no
Brasil e na Venezuela após a ingestão de alimentos contaminados. Nas regiões Sul
7
e Norte do Brasil, registra-se casos agudos grave, por ingestão de alimentos
contaminados por fezes do vetor. Esta via de transmissão é geralmente associada a
uma alta concentração parasitária, resultando em uma manifestação clínica aguda
mais severa com altos índices de mortalidade 26.
No Amazonas há registro da infeção pelo T. cruzi com acometimento da
forma aguda da doença após a ingestão de suco de frutos de palmeira como o açaí
27,20.
1.1.4 Diagnóstico da Doença de Chagas
Para o diagnóstico da DC, sendo clínico epidemiológico e/ou laboratorial são
utilizados exames específicos, que podem ser parasitológicos para identificação do
T. cruzi no sangue periférico: pelo exame a fresco, gota espessa, esfregaço,
xenodiagnóstico, hemocultura; ou sorológicos, hemaglutinação indireta (HAI),
imunofluorescência (IFI), ensaio imunoenzimático (ELISA). De modo geral, os
métodos usuais para a fase aguda correspondem principalmente à presença do
parasito circulante devido a alta parasitemia, enquanto na fase crônica busca-se os
métodos de detecção de anticorpos circulantes. Todavia, no caso de amostras
inconclusivas, pode-se utilizar outras técnicas com maior especificidade como o
Western-blot (WB) 28.
Na fase crônica da doença de Chagas a parasitemia intermitente é comum e
anticorpos (IgG) contra T. cruzi são frequentemente detectados por testes
imunológicos convencionais. Durante esta fase os exames recomendados para a
8
evidenciação de parasitas viáveis no sangue periférico são hemocultura e
xenodiagnóstico, todavia a doença apresenta nesta fase, sensitividade limitada
devido ao baixo nível de parasitas circulantes no sangue
29
, porém esses métodos
indiretos são altamente específicos 30.
O Xenodiagnóstico (XD) foi introduzido por Brumpt
31
e consiste em
um
procedimento que utiliza ninfas de triatomíneos não-infectadas, criadas em
laboratório,
que sugam o sangue dos indivíduos suspeitos durante 30 minutos,
posteriormente examina-se as fezes desses insetos para verificar a presença de
formas epimastigotas e tripomastigotas
metacíclicas do T. cruzi, tal método é
considerado como um meio de cultura biológica, para a detecção da infecção pelo T.
cruzi em homem e outros mamíferos
por Torrealba
33
32
. Foi usado pela primeira vez no ser humano
que encontrou 25% de chagásicos entre os colonos de Guárico,
Shenone e colaboradores
34
obtiveram 49,3% de positividade entre pacientes
chagásicos crônicos, Coronado 35 registrou positividade entre 9% a 87,5%.
Dias, em 1989
36
foi o primeiro a estabelecer critérios para a utilização deste
método, especialmente no que diz respeito ao triatomíneo a ser utilizado. Estudos
comparativos com emprego de ninfas de espécies diferentes de triatomíneos tem
sido realizados, visando encontrar a melhor espécie a ser aplicada ao exame.
No xenodiagnóstico clássico, os triatomíneos têm contato direto com a pele
do paciente, e pode causar irritação local com surgimento de máculas ou pápulas
pruriginosas e, raramente, choque anafilático. Devido a isto, Romaña
37
introduziu,
na década de 40, o xenodiagnóstico artificial. Este método não foi usado na rotina
9
durante anos mas, ultimamente, tem-se dado grande ênfase a ele principalmente por
causa da reativação da doença de Chagas em cardiopatas transplantados, e em
imunossuprimidos, principalmente aidéticos
38
. Mesmo existindo várias técnicas
disponíveis para o diagnóstico da doença de Chagas, o xenodiagnóstico continua
sendo útil, especialmente em ensaios clínicos, na seleção e acompanhamento de
pacientes e verificação da eficácia de fármacos tripanosomicidas 39.
O Xenodiagnóstico tem sido considerado uma boa ferramenta para o
diagnóstico etiológico da doença Chagas, tanto para a seleção dos pacientes a
serem submetidos a terapia específica quanto para a avaliação da parasitemia e sua
relação com as condições clínicas da doença de Chagas. Embora existam outros
procedimentos eficientes para a detecção de T. cruzi, o xenodiagnóstico é
considerado uma eficiente método de diagnóstico para T. cruzi no fluxo sanguíneo,
particularmente útil nos casos de infecção chagásica crônica 32.
Há
uma
modificação
no
xenodiagnóstico
onde
o
material
obitdo
(fezes/intestino) pode ser semeado em meio de cultura, essa técnica denominada
xenocultura
40
permite o isolamento de cepas de T. cruzi, bem como serve de
controle de qualidade no exame do xenodiagnóstico, tal técnica pode ser empregada
para sistematizar os xenodiagnósticos negativos, mas não representa em geral,
acréscimo significativo na positividade do exame 41.
A hemocultura consiste em semear sangue periférico coletado diretamente ao
meio de cultura com observações microscópicas m busca da visualização do
parasito;
42
obtiveram 31,8% de positividade da hemocultura utilizando o meio LIT
10
(Liver Infusio in Tryptose) a partir de então a técnica passou a ser usada no
diagnóstico da doença de Chagas.
As porcentagens de técnicas de culturas
positivas podem situar-se entre 0% a 94% 29.
Técnicas moleculares como “polymerase chain reaction” (PCR) vem sendo
utilizadas como uma alternativa complementar na detecção de T. cruzi em
pacientes, uma vez que testes parasitológicos como xenodiagnóstico e hemocultura
podem apresentar resultados falso-negativos devido a sua baixa sensitividade 43.
1.2 O parasito Trypanosoma cruzi
O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado classificado na sessão
Stercoralia, família Tripanosomatidae, que inclui o gênero Trypanosoma se
desenvolve no tubo digestivo de insetos vetores, transmitidos na forma de
tripomastigotas metacíclicos, pelo contato com as fezes do vetor 44.
O organismo monoflagelado T. cruzi possui um condrioma formado por uma
mitocôndria tubular única que percorre todo o corpo da célula e uma região
especializada em forma de disco onde se encontram altas densidades de DNA
citoplasmático k-DNA, envolto por dupla membrana mitocondrial, denominada de
cinetoplasto 45.
Ao longo do seu ciclo vital, para adaptar-se a diferentes situações
bioecológicas, assume diferentes formas evolutivas: tripomastigotas, amastigotas,
esferomastigotas e epimastigotas 46.
11
Os conhecimentos sobre a epidemiologia molecular e a genética de
população do T. cruzi têm evoluído de uma maneira rápida e continuada, pela
análise cada vez mais aprofundada da espécie. Para isto são utilizados desde os
métodos
parasitológicos
clássicos,
que
correspondem
à
caracterização
morfobiológica dos isolados, evoluindo para a caracterização isoenzimática da
estrutura clonal e para a análise molecular do DNA do cinetoplasto, do DNA nuclear
e do DNA ribossomal 47,48.
De acordo com Zingales e colaboradores
49
os subgrupos de T. cruzi
receberam ao longo dos anos diferentes classificações, biodemas (Andrade, 1974),
zimodemas
50,51
, clones
52
, linhagens I e II
53
posteriormente denominadas ‘grupos’
T. cruzi I e T. cruzi II 54. Mais recentemente, um terceiro grupo ancestral denominado
T. cruzi III, foi proposto a partir da análise de microssatélites e DNA mitocondrial 55.
Visando o entendimento de questões de biologia básica, de características
eco-epidemiológicas e de patogenicidade dos grupos foi acordado que T. cruzi fosse
dividido em seis grupos (T. cruzi I - VI), cada grupo passou a denominar-se DTU
(unidades discretas de tipagem) definida como conjunto de isolados que é
geneticamente semelhante e que pode ser identificado por marcadores moleculares
e imunológicos comuns
56
. Em 2012 Zingales e colaboradores
57
propuseram nova
nomenclatura sub-específica de T. cruzi de relevância epidemiológica conforme
abaixo:
12
T. cruzi I - (Tc I, Z1, DTU I) é a mais abundante e amplamente dispersada de
todas as DTUs nas Américas, sendo encontrada nas áreas de distribuição dos
vetores triatomíneos e podendo estar associada com os ciclos silvestre e doméstico.
A infeção humana pelo TcI é concentrada ao norte da América Central e América do
Sul, e é associada com a cardiomiopatia chagásica. Há relatos de casos da infecção
e da doença ao sul da bacia Amazônica.
• T. cruzi II - (TcII, Z2, DTU IIb) é encontrado predominantemente nas regiões
sul e central da América do Sul, porém sua extensão não esta clara. Dentro de suas
distribuições geográficas, TcII encontra-se associado com manifestações cardíacas,
síndromes do megacólon e megaesôfago. No Brasil, os hospedeiros e vetores
naturais de TcII tem sido indescritíveis e a maioria dos isolados são provenientes de
primatas e esporadicamente de outras espécies de mamíferos; ocorrendo
principalmente no ciclo doméstico.
• T. cruzi III - (Z3, Z1 ASATd, Z3-A, DTU IIc) é principalmente associada com
o ciclo silvestre no Brasil e em países adjacentes, relatos de infecção humana são
raros sendo encontrados principalmente em animais e vetores do ciclo silvestre com
nicho terrestre e ocasionalmente em cães domésticos.
• T. cruzi IV - (Z3, Z3-B, DTU IIa) apresenta padrões similares ao TcIII em
sua distribuição na América do Sul. No entanto, ao contrário de TcIII, o TcIV ocorre
frequentemente em humanos sendo causa secundária da doença de Chagas na
Venezuela. Há registros de isolados de TcIV em primatas e espécies de Rhodnius
brethesi provenientes da bacia Amazônica. Recentemente TcIV foi identificado como
13
causa primária de DC aguda em dois surtos que ocorreram no estado do Amazonas
20
.
TcV e TcVI são duas DTUs híbridas semelhantes associadas com a doença
de Chagas no América do Sul. Mais ainda que TcII, TcV e TcVI são praticamente
desconhecidos como isolados genéticos-silvestres. Por meio de genética molecular,
existem provas de que TcV e TcVI sejam híbridos de TcII e TcIII. Contudo, os
marcadores genéticos recentes, não determinam se TcV e TcVI são produtos de
hibridização independentes, ou um único evento de hibridização seguido de uma
divergência clonal, e se esses eventos são evolutivamente antigos ou recentes.
• T. cruzi V (Cepa Boliviana Z2, rDNA ½, clonet 39, DTU IId): subpopulação
associada a ciclos de transmissão doméstica, talvez com uma origem na hibridação
de subpopulações domésticas e silvestres. Presente em casos humanos e em
triatomíneos de maior abundância no cone Sul.
• T. cruzi VI (Cepa Paraguaya Z2, Zymodema B, DTU IIe): Subpopulações
associadas a casos humanos e como TcV, em triatomíneos domiciliados
frequentemente associado com o Cone Sul.
Recentemente a ocorrência de morcegos brasileiros infectados por T. cruzi
tem sido reportados da floresta Amazônica até áreas urbanas do centro-oeste,
nordeste e sudeste do Brasil
58
. Esse grupo de isolados foi provisoriamente
denominado por “Tcbat” e aguarda mais caracterizações para atribuição de uma
DTU definitiva, potencialmente como uma sétima DTU, TcVII 57.
14
Figura 1 - Distribuição de T. cruzi (DTUs) da América do Sul, isolado de
humanos.
1.2.1 Ciclo Evolutivo do T. cruzi
T. cruzi desenvolve o ciclo biológico tipo heteroxênico, em que o parasito
passa por uma fase de multiplicação intracelular no hospedeiro vertebrado, homem
e mamíferos pertencentes a ordens diferentes, e extra-celular no inseto vetor, o
triatomíneo 59.
No hospedeiro vertebrado, a infecção pelo T. cruzi ocorre pelo contato com
fezes e urina contaminadas dos triatomíneos durante o repasto sanguíneo. A forma
infectante (tripomastigota metacíclica), que se encontra nas porções distais dos
15
triatomíneos infectados, atravessa a pele ou mucosa do hospedeiro e penetra a
célula (Figura 2). Na célula, os tripomastigotas transformam-se em amastigotas, que
se multiplicam no citoplasma, e após várias gerações se diferenciam em
tripomastigotas e são liberados na corrente sanguínea para infectar células de vários
tecidos como muscular, cardíaco ou nervoso 60.
Os insetos triatomíneos são contaminados com formas tripomastigotas
sanguíneas ao se alimentar do sangue do mamífero infectado. No intestino médio do
inseto, os tripomastigotas se diferenciam em epimastigotas e, no final do tubo
digestivo, parte destas formas se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos, que
são eliminados pelas fezes quando o inseto se alimenta novamente, começando
assim um novo ciclo de infecção 61.
Fonte: CDC, 2010
Figura 2. Representação do ciclo de vida do Trypanosoma cruzi no hospedeiro
invertebrado e vertebrado.1. Ingestão de tripomastigotas 2. Epimastigotas no
intestino médio 3. Multiplicação no intestino médio 4. Tripomastigotas
metacíclicas 5. Tripomastigotas nas fezes do triatomíneo 6. Penetração das
16
células por tripomastigotas metacíclicas 7.
Multiplicação das amastigotas 8.
Amastigotas intracelulares transformam-se em tripomastigotas.
.
1.3 Os vetores da doença de Chagas
Os vetores da DC são insetos hematófagos da ordem Hemiptera, família
Reduviidae, mais conhecidos como triatomíneos, devido à denominação da
subfamília Triatominae, cujo ciclo de vida envolve uma metamorfose incompleta que
vai de ovo-ninfa-adultos (Figura 2).
São popularmente chamados de “barbeiros” ou “chupanças” pelo hábito de
picarem a face descoberta de pessoas adormecidas. Entretanto, o motivo mais
relevante para a transmissão da DC é o comportamento que estes triatomíneos têm
de defecar durante ou logo após a hematofagia, sendo comum a deposição de suas
fezes contaminadas com o T. cruzi sobre a região facial incluindo os olhos, nariz e
boca. Neste momento, as formas infectantes do parasita são transferidas para a
circulação do hospedeiro 62.
Fotos: Rodrigo Méxas, IOC/Fiocruz
17
Figura 3 - Ciclo de vida de um barbeiro (Triatoma brasiliensis brasiliensis).
Os triatomíneos são insetos de hematofagismo restrito, com ecletismo
alimentar que permite sua sobrevivência com qualquer tipo de sangue. Possuem
hábitos noturnos, fotofobia, termotropismo positivo, presença de substâncias
anticoagulantes e anestésicas na saliva. Esses insetos evoluem e procriam
realizando hematofagia desde sua primeira fase de vida até adulto. Tal hábito
permite um estreito relacionamento com animais reservatórios silvestres e
domésticos 63.
Pelo menos 18 espécies de triatomíneos silvestres têm sido encontradas na
Região Amazônica, das quais 10 com registro de infecção por flagelados do tipo
Trypanosoma cruzi
64
. As espécies Rhodnius pictipes, Rhodnius robustus e
Panstrongylus geniculatus foram anteriormente registradas no município de Manaus.
Estas espécies são frequentemente encontradas com altas taxas de infecção natural
pelo T. cruzi em diversos ecótopos naturais na Amazônia Brasileira, onde
esporadicamente invadem as residências 65,66.
1.4 Reservatórios do Trypanosoma cruzi
O papel dos reservatórios como vias alternativas de transmissão do T. cruzi,
tem sido discutido, uma vez que os mamíferos como os gambás, podem atuar como
reservatórios e vetores de uma só vez, a partir da ruptura de ninhos de amastigotas
de T. cruzi em tecidos de glândulas anais, que facilitariam a transmissão por
contaminação de fluidos, a outros mamíferos ou mesmo de seres humanos, quando
18
estes entram em contato com ambientes enzootico contaminando os seus membros
e extremidades (mãos), mucosa utensílios e alimentos 67.
Na Amazônia brasileira a presença do T. cruzi em animais silvestres entre
eles marsupiais, quirópteros, roedores, edentados e primatas foi relatada por Deane
68
. Em áreas rurais de Manaus e Coari, Magalhães e colaboradores
16
também
encontrou marsupiais muito próximo de residências, infectados por T. cruzi. De
acordo com
69
, pelo menos 180 espécies de mamíferos pertencentes as ordens:
Didelphimorphia, Lagomorpha, Chiroptera, Rodentia, Pilosa, Cingulata, Carnivora,
Primata, Perisodactyla, já foram encontrados naturalmente infectados por T. cruzi, e
têm um papel importante na manutenção e interação de ciclos domésticos,
peridoméstico e silvestre da doença de Chagas, incluindo-se o homem que adoece e
atua como reservatório.
19
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Detectar infecção por Trypanosoma cruzi em pacientes com doença de
chagas crônica não tratados utilizando métodos parasitológicos e biologia molecular
2.2 Específicos
- Detectar positividade por Trypanosoma cruzi em triatomíneos utilizados no
xenodiagnóstico durante o seguimento clínico de pacientes com sorologia positiva
para doença de chagas
- Classificar os tipos de linhagens de T. cruzi encontrado nos triatomíneos
utilizados no xenodiagnóstico durante o seguimento clínico de pacientes com
sorologia positiva para doença de chagas
20
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Tipo de estudo
Estudo do tipo descritivo experimental para detecção de T. cruzi em amostras
de material de hemocultura e triatomíneos utilizados no xenodiagnóstico de casos
crônicos da doença de Chagas.
3.2 População de estudo
Os pacientes incluídos neste estudo são provenientes de um inquérito
sorológico realizado no período entre outubro de 2010 a julho de 2012 em área rural
e periurbana da zona oeste de Manaus, Amazonas. Na área rural o estudo foi
conduzido no Assentamento Tarumã Mirim, popularmente conhecido como Ramal
do Pau Rosa, localizado no Km 21 da Rodovia Federal BR 174, e na área
periurbana no bairro Tarumã, como parte do projeto sob título: “Estudo ecoepidemiológico da infecção chagásica: soroprevalência, vetores, reservatórios e
caracterização de cepas de Trypanosoma cruzi em áreas periurbana e rural de
Manaus” coordenado pela Dra. Maria das Graças Vale Barbosa. Após as coletas o
trabalho foi realizado no Centro de Entomologia da Fundação de Medicina Tropical
Dr. Heitor Vieira Dourado.
3.3 Amostra
No âmbito deste projeto foram realizados os ensaios sorológicos ELISA, IFI e
Western Blot usando a metodologia descrita por Magalhães e colaboradores (2011).
Um total de 36 pacientes com sorologia reativa para doença de Chagas em pelo
21
menos dois dos três testes realizados forma incluídos no presente estudos. Nestes
pacientes foi realizado xenodiagnostico e coletado sangue venoso para realização
de hemocultura.
3.4 Hemocultura de Sangue Total
A hemocultura foi realizada semeando-se 100µl de sangue de cada paciente em
três tubos de ensaio utilizando o meio de cultivo NNN 70,71. A presença de formas
flagelares foi pesquisada nas culturas por um período de 120 dias.
3.5 Xenodiagnóstico
Para o xenodiagnóstico (XD) foram utilizados triatomíneos da espécie Triatoma
infestans, criados na colônia de Hemiptera do Centro de Entomologia da Fundação
de Medicina Tropical HVD. A escolha desta espécie deve-se a disponibilidade de
exemplares para uso no xenodiagnóstico dos 36 pacientes que tiveram sorologia
positiva para doença de Chagas em pelo menos dois testes sorológicos, critério para
classificação de Doença de Chagas crónico de acordo com o Consenso Brasileiros
em doença de Chagas ( 2005)7.
Foram utilizadas 40 ninfas de III e IV estádios de T. infestans, colocadas em
dois frascos de plásticos adaptados sendo 20 ninfas em cada. A detecção de T.
cruzi foi realizada utilizando exame a fresco e diagnóstico molecular.
3.5.1 Exame a fresco
22
As observações foram feitas após cinco dias da realização do XD, com
leituras a cada 30 dias até completar 180 dias, examinado por meio de microscópica
óptica.
O material obtido por compressão abdominal (fezes e/ou macerado do tubo
digestivo) dos triatomíneos, foi colocado em uma placa de Petri pequena e estéril,
contendo 2 ml de solução salina (NaCl 0,85%) e observado entre lâmina e lamínula.
A cada 30 dias foi realizado cultivo do material observado no exame a fresco
transferindo-se 0,5 ml para um tubo contendo meio de cultura tipo NNN (Novy e
MacNeal, 1904; Nicolle, 1908), suplementado com 30% de soro fetal bovino para
identificação e caracterização da cepa infectante e circulante.
Todos os exemplares de triatomíneos mortos bem como a parte do intestino
dissecado durante as observações microscópicas em exame a fresco foram
armazenados a uma temperatura de -30ºC para posterior investigação por biologia
molecular.
3.5.2 Diagnóstico molecular
Com a finalidade de realizar a tipagem das linhagens de T. cruzi dos
pacientes foram utilizadas duas técnicas de biologia molecular: 1) PCR multiplex
para o espaçador não transcrito do mini-exon; e 2) sequenciamento do gene que
codifica a subunidade II da Citocromo oxidase (COII).
23
3.5.2.1
Extração do DNA total dos Triatomíneos
A técnica de extração de DNA descrita por Zulantay e colaboradores
72
foi
utilizada nas amostras de fezes de barbeiro. Após a análise microscópica as fezes
foram depositadas em microtubos 1,5ml acrescidos com 500ul de PBS pH 7.2 e
incubados em banho maria por 15 minutos a 98° C. Posteriormente as amostras
foram centrifugadas por 3 minutos a 3500 rpm. Um total de 200ul do sobrenadante
foi pipetado e estocado a -20°C.
3.5.2.2
PCR – do gene Mini-exon
Parte do espaçador não transcrito do gene miniexon foi amplificado pela
técnica descrita por Fernandes e colaboradores
73
. Na reação de PCR utilizou-se os
primers:
5’ - TTGCTCGCACACTCGGCTGCAT-3’ (TC1 - específico para o grupo I);
5’ - ACACTTTCTGTGGCGCTGATCG-3’ (TC2 - específico para o grupo II);
5’ - CCGCGWACAACCCCTMATAAAAATG-3’ (TC3 - específico para Z3);
5’ - CCTATTGTGATCCCCATCTTCG-3’ (TR - específico para Trypanosoma rangeli)
e 5’ -TACCAATATAGTACAGAAACTG-3’ (Miniexon - comum a todos os grupos).
A mistura de reação contendo primers a 0,5pmol/µl cada (TC1, TC2, TC3, TR,
Miniexon), 1,5µM de MgCl2, 0,6mM de dNTPs, 1U Taq DNA polimerase (Invitrogen),
5µl de DNA e Tampão diluído a 1X, com volume final de 50µl. Em cada reação foi
incluído um controle negativo, para certificação de não contaminação da PCR.
24
O processo de amplificação foi realizado por um ciclo de desnaturação inicial
de 95ºC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos, incluindo desnaturação a 94ºC por 30
segundos, anelamento a 55ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 30 segundos,
com uma extensão final de 10 minutos a 72ºC.
O produto da reação de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose
a 2% em TBE (Tampão tris ácido bórico- EDTA) 1X, corado com brometo de etídio.
As amplificações foram visualizadas sob luz ultra violeta, fotografadas e comparadas
com os fragmentos do marcador de peso molecular. Os fragmentos obtidos estavam
de acordo com os tamanhos previstos: TcII 250 pb, TcI 200 pb, Z3150 pb, Tr 100 pb.
O controle positivo para cepas de T. cruzi utilizado foi obtido a partir de culturas
existentes no Centro de Entomologia da FMT-HVD.
3.5.2.3
Análise do polimorfismo do gene que codifica a subunidade II do
citocromo oxidase (CoII)
Todas as amostras foram submetidas a tipagem genética mitocondrial através
da análise do polimorfismo do gene que codifica a subunidade II da citocromo
oxidase 55. As reações de PCR foram realizadas utilizando os primers:
TcMit 31 (5’ – TAAATAATATATATTGTACATGAG- 3’) e
TcMit 40 (5’ – CTRCATTGYCCATATATTGT- 3’).
Para cada reação de PCR foram utilizados 2ul de DNA, e as seguintes condições de
amplificação: um ciclo de desnaturação inicial de 94 ºC por 5 minutos seguido de 35
ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, 48ºC por 2 minutos para o
anelamento dos primers e 72ºC por 2 minutos para a extensão, finalizando com um
ciclo a 72ºC por 5 minutos para extensão final.
25
3.6 Sequenciamento
Os produtos amplificados na PCR foram purificados utilizando o kit Wizard SV
Gel and PCR clean-up-system (Promega) e sequenciados em ambas as direções
utilizando os iniciadores TcMit31 e TcMit40. As reações de sequenciamento foram
realizadas utilizando 1-3 ul de produto de PCR, 0,33 pmol do iniciador; 2,0 ul do
tampão 5x; 1,0 ul de Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems) e água para completar o volume final de 10µL. As reações foram
realizadas em termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf). Os produtos da
PCR foram purificados utilizando o kit Wizard SV Gel and PCR clean-up-system
(Promega), de acordo com as recomendações do fabricante. O sequenciamento do
DNA foi realizado no DNA Analyzer ABI 3130XL (Applied Biosystems).
3.6.1 Análise das sequências
A validação da qualidade das sequências foi realizada e uma sequência consenso
das fitas sense e anti-sense foi montada e alinhada com as sequências padrões
obtidas no GenBank (http.//www.ncbi.nlm.nih.gov). Foram utilizadas as seguintes
cepas padrão: TcI (Silvio X10 cl4), TcII (Esmeraldo cl3), TcIII (M6241 cl6), TcIV
(CANIII cl1), TcV (Mn cl2) e TcVI (CL Brener), com os respetivos número de acesso
do GenBank: EU302222.1; AF359035.1; AF359032.1; AF359030.1; DQ343718.1;
DQ343645.1. A edição das sequências nucleotídicas foi feita utilizando o programa
informático BioEdit version 7.0.5.2 74.
26
As arvores filogenéticas foram construídas utilizando o método de NeighbourJoining implementado no programa informático MEGA 5.2
75
. A análise de bootstrap
foi inferida com base em 1500 réplicas.
3.7 Aspectos Éticos
Esse projeto contempla dados incluídos no projeto já aprovado pelo comitê de
ética da FMT-HVD sob número Nº 1986 e os aspectos éticos da pesquisa serão
considerados de acordo com a Resolução nº 196 de 10/10/96 da Comissão Nacional
de Ética em Pesquisa do Ministério da Saúde, que estipula normas éticas
regulamentadoras de pesquisas envolvendo seres humanos, garantido o sigilo dos
dados coletados dos inquéritos sorológicos já realizados. Este estudo faz parte de
um projeto maior sob título: “Estudo eco-epidemiológico da infecção chagásica:
soroprevalência, vetores, reservatórios e caracterização de cepas de Trypanosoma
cruzi em áreas periurbana e rural de Manaus” aprovado no Edital PPSUS 007/2009,
Pesquisa para o SUS: Gestão Compartilhada em Saúde.
27
4 RESULTADO E DISCUSSÃO
Apresentado no formato de artigo científico.
28
Trypanosoma cruzi strain TcI is associated with
chronic Chagas disease in the Brazilian Amazon
Rosa Amélia Gonçalves Santana1
Email: [email protected]
Laylah Kelre Costa Magalhães1
Email: [email protected]
Laise Kelman Costa Magalhães1
Email: [email protected]
Suzane Ribeiro Prestes1
Email: [email protected]
Marcel Gonçalves Maciel1
Email: [email protected]
George Allan Villarouco da Silva4
Email: [email protected]
Wuelton Marcelo Monteiro1,2
Email: [email protected]
Felipe Rocha de Brito2
Email: [email protected]
Leila Inês Aguiar Raposo Câmara de Coelho3
Email: [email protected]
João Marcos Barbosa Benfica Ferreira1,5
Email: [email protected]
Jorge Augusto Oliveira Guerra2
Email: [email protected]
Henrique Silveira6*
*
Corresponding author
Email: [email protected]
Maria Graças Vale das Barbosa1,2
Email: [email protected]
1
University of the State of Amazonas (Universidade do Estado do Amazonas), Manaus,
Brazil
2
Heitor Vieira Dourado Tropical Medicine Foundation (Fundação de Medicina Tropical
Heitor Vieira Dourado), Manaus, Brazil
29
3
Federal University of Amazonas (Universidade Federal do Amazonas), Manaus, Brazil
4
Leônidas and Maria Deane Institute, Fiocruz of Amazon, Manaus, Brazil
5
Francisca Mendes Hospital, Manaus, Brazil
6
Institute of Hygiene and Tropical Medicine (Instituto de Higiene e Medicina Tropical), New
University of Lisbon (Universidade Nova de Lisboa), Lisbon, Portugal
Abstract
Background
Chagas disease in the Amazon region is considered an emerging anthropozoonosis with a
predominance of the discrete typing units (DTUs) TcI and TcIV. These DTUs are responsible
for cases of acute disease associated with oral transmission. Chronic disease cases have been
detected through serological surveys. However, the mode of transmission could not be
determined, or any association of chronic disease with a specific T. cruzi DTU’s. The aim of
this study was to characterize Trypanosoma cruzi in patients with chronic Chagas disease in
the State of Amazonas, Brazil.
Methods
Blood culture and xenodiagnosis were performed in 36 patients with positive serology for
Chagas disease who participated in a serological survey performed in urban and rural areas of
Manaus, Amazonas. DNA samples were extracted from the feces of triatomines used for
xenodiagnosis, and the nontranscribed spacer of the mini-exon gene and the mitochondrial
gene cytochrome oxidase subunit II (COII) were amplified by PCR and sequenced.
Results
Blood culture and xenodiagnosis were negative in 100% of samples; however, molecular
techniques revealed that in 13 out of 36 (36%) fecal samples from xenodiagnosis, T. cruzi was
characterized as the DTU TcI, and different haplotypes were identified within the same DTU.
Conclusion
The DTU TcI, which is mainly associated with acute cases of Chagas disease in the Amazon
region, is also responsible for chronic infection in patients from a region in the State of
Amazonas.
Background
Chagas disease (CD) is a complex zoonosis found in South and Central America and is
considered to be one of the most important neglected diseases. It is estimated that between 8
and 11 million people are infected and that over 25 million are at risk of developing the
disease [1]. In Brazil, the epidemiological patterns of the disease have changed as a result of
control activities and environmental, economic, and social changes. In the Amazon region,
infection with Trypanosoma cruzi was previously thought to be an enzootic disease of wild
30
animals [2]. However, in recent years, it has been recognized as an important emerging
anthropozoonosis, with reports of acute and chronic [3-7] cases and unclear mechanisms of
transmission.
The etiologic agent of CD is the flagellate protozoan T. cruzi, which is primarily transmitted
through the feces of infected triatomines, may also be transmitted by blood transfusion,
transplacental route, organ transplantation, laboratory accidents and orally through
contaminated food [8]. This parasite presents high genetic variability and is divided in 6
specific discrete typing units (DTUs), termed TcI to TcVI [9,10]. Understanding the genetics
and diversity of the parasite will provide information about its evolution, biological behavior,
and epidemiological patterns; the natural history of infection; and issues related to the
diagnosis and treatment of the disease [10,11].
In the Brazilian Amazon, Venezuela, Colombia, Central America, and North America, TcI is
the prevailing DTU and is responsible for most cases of acute and chronic cardiac CD,
whereas TcIV causes sporadic cases of acute CD in the Amazon [6]. In recent years, the
number of chronic CD cases detected at the Tropical Medicine Foundation (Fundação de
Medicina Tropical) outpatient clinics has increased [4,5,12].
Previous serological surveys revealed that prevalence of T. cruzi chronic infection in the
municipalities of Coari and Tefé and also in Manaus rural areas is 0.5%, 1.9% and 1.2%,
respectively [13]. Furthermore, [14] registered a 13% prevalence in the Rio Negro
microregion. Comparing the range of prevalence in both studies, our study area can be
considered of low endemicity.
Understanding the emergence and expansion of CD in the Amazon requires knowledge of the
diversity of T. cruzi circulating in the region. Thus, the aim of this study was to characterize
T. cruzi DTUs in patients with chronic infection in the State of Amazonas, Brazil.
Methods
Ethical issues
This project was approved by the ethics committee on human research of the Dr. Heitor
Vieira Dourado Tropical Medicine Foundation (Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor
Vieira Dourado) (Approval No. 1986). Patients diagnosed with CD were referred for clinical
follow-up as recommended by the Brazilian Ministry of Health. All participants involved in
the study voluntarily signed an informed consent form.
Study area
The study was performed in rural and urban areas in the west side of the city of Manaus, State
of Amazonas (AM), Brazil, where autochthonous acute and chronic cases of CD [13] and the
presence of infected vectors and reservoirs of T. cruzi [15] were reported. The area as the
whole Amazon state is considered a low endemicity area for Chagas disease [3,13]. In the
rural area, data collection was performed in the Tarumã Mirim settlement, which is located on
federal highway BR 174. In the urban area, the study was performed in the Tarumã
neighbourhood, which is partly located within an area of environmental protection and partly
31
within an area of real estate expansion, which has caused environmental degradation (Figure
1).
Figure 1 Map of Manaus highlighting the study areas (A: urban area, B: rural area) and
the location of participants (red dots).
Study population
Patients included in this study were identified during a serological survey performed from
October 2010 to July 2012. Of the 1837 participants evaluated during the survey, 44 were
positive by at least two of the three serological tests performed: enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) (Wama® and Bioeasy®), indirect immunofluorescence (IIF)
(Wama), and Western Blot (BioMérieux®). Of these 44 patients, 36 underwent clinical
follow-up at the Dr. Heitor Viera Dourado Tropical Medicine Foundation, and whole blood
culture, xenodiagnosis, and molecular techniques for the detection of T. cruzi in the feces of
triatomine bugs used for xenodiagnosis were performed.
Whole blood culture
Eight ml of blood were collected in heparinized tubes from patients who agreed to participate,
for each patient, 100ul whole blood was distributed into 2,5 ml of NNN culture media
containing rabbit blood and 40 mg/ml of gentamycin sulphate. Triplicates were made for each
patient. The search for flagellate forms was performed for a period of 120 days by inverted
optical microscopy [16,17].
Xenodiagnosis
Xenodiagnosis was carried out using two cages each containing 20 III- and IV-stage nymphs
of Triatoma infestans reared in the laboratory, that were put in contact with the patient’s arm
for 30–40 min [18,19]. After the blood meal, triatomines were maintained at 27 °C and after
30, 60, 90, 120, and 180 days of incubation, the feces of each insect were analyzed
microscopically and harvested for molecular characterization. Feces of the 40 nymphs used
32
for each patient were collected in pools of 10 nymphs, at each of the five time points after the
blood meal, totaling 1440 pools. Although Triatominae species susceptibility for different
strains of T. cruzi, on xenodiagnosis, may differ [20], T. infestans had a better performance on
natural xenodiagnosis and is normally refractory to T. cruzi [21,22].
DNA extraction
For DNA extraction, the technique described by Zulantay and colleagues [23] was used.
There were a total of 1440 nymphs (40 nymphs from each of 36 patients). Feces of
triatomines in pools of 10 triatomines of the same patient and time of collection were placed
in 1.5-ml microtubes with 500 μl of phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.2 and incubated in
a water bath for 15 minutes at 98 °C. Next, the samples were centrifuged for 3 minutes at
3500 rpm. A total of 200 μl of the supernatant was removed and stored at −20 °C; this sample
was used for PCR.
DNA amplification of the mini-exon gene
The DNA target of the non-transcribed spacer of the mini-exon gene was amplified according
to the multiplex protocol previously described by Fernandes and colleagues [24]. The
amplification process was performed with an initial denaturation cycle of 95 °C for 5 minutes;
35 cycles of: denaturation at 94 °C for 30 seconds, annealing at 55 °C for 30 seconds, and
extension at 72 °C for 30 seconds; and a final 10 minute extension at 72 °C. The amplified
products were analyzed by electrophoresis on a 2% agarose gel stained with ethidium
bromide. The 150 bp product is characteristic of T. cruzi zymodeme (Z3) of DTUs TcIII or
TcIV, 100 bp is characteristic of T. rangeli, 200 bp corresponds to T. cruzi TcI, and 250 bp is
characteristic of T. cruzi TcII.
Analysis of polymorphisms of the gene encoding cytochrome oxidase subunit
II (COII)
All samples were subjected to mitochondrial DNA typing by analyzing polymorphisms in the
COII gene. Amplifications were performed with the primers TcMit 31 and TcMit 40, which
were designed to amplify a product of approximately 400 bp [25]. For each PCR reaction, 2
μl of the sample was used under the following amplification conditions: an initial denaturation
cycle at 94 °C for 5 min, followed by 35 cycles of 30 seconds at 94 °C, 2 minutes at 48 °C,
and 2 minutes at 72 °C, with a final extension at 72 °C for 5 minutes. Positive and negative
controls were included in each reaction. PCR products were visualized on a 1.5% agarose gel
stained with ethidium bromide.
The amplified PCR products were purified using the Wizard SV Gel and PCR Clean-up
System kit (Promega) and sequenced in both directions using the primers TcMit31 and
TcMit40. The sequencing reactions were performed using 1–3 μl of the PCR product, 0.33
pmol of primer, 2.0 μl of 5× buffer, 1.0 μl of Big Dye Terminator v.3.1 CycleSequencing Kit
(Applied Biosystems), and water to make a final volume of 10 μL. The reactions were
performed in a Mastercycler Gradient thermocycler (Eppendorf). PCR products were purified
using the Wizard SV Gel and PCR Clean-up System kit (Promega) according to the
manufacturer’s recommendations. DNA sequencing was performed on a DNA Analyzer ABI
3130XL (Applied Biosystems). Nucleotide sequences were edited with the program BioEdit
version 7.0.5.2.[26].
33
Validation of sequence quality was performed, and the consensus sequence of the sense and
antisense strands was mounted and aligned with standard sequences obtained from GenBank
(http.//www.ncbi.nlm.nih.gov). Generated sequences were deposited at Genbank [Genbank:
KJ636060 to Genbank:KJ636072]. The following standard strains were used: TcI (Silvio ×10
cl4), TcII (Esmeraldo cl3), TcIII (M6241 cl6), TcIV (CANIII cl1), TcV (Mn cl2), and TcVI
(CL Brener), with the respective accession numbers [GenBank: EU302222.1, AF359035.1,
AF359032.1, AF359030.1, DQ343718.1, and DQ343645.1].
Phylogenetic trees were constructed using the neighbor-joining method included in the
program MEGA 5.2 [27]. The bootstrap analysis was inferred based on 1500 replicates.
Results
Thirty-six patients were included in the study: 21 (58%) were from a rural area while 15 were
from a periurban area; 28 (78%) were originally from the State of Amazonas; 18 (50%) were
male and 18 (50%) worked in agriculture. Patient age ranged between 8 and 73 years, with the
highest percentage (36%) of patients aged more than 50 years (Table 1). Out of the 36
patients, 26 (72%) were reactive by ELISA + IIF, two (6%) by ELISA + Western Blot, and 8
(22%) by the three tests (ELISA + IIF + Western Blot; Table 2).
Table 1 Number of patients included in the study by gender according to area of
residence, age, and origin
Variables
Female
Male
Total
Rural
10 (28%)
11 (19%)
21 (58%)
Periurban
8 (22%)
7 (19%)
15 (42%)
18 (50%)
10 (28%)
28 (78%)
Pará
2 (6%)
2 (6%)
Ceará
3 (8%)
3 (8%)
Maranhão
1 (3%)
1 (3%)
Piauí
1 (3%)
1 (3%)
Minas Gerais
1 (3%)
1 (3%)
Area
Origin (by state)
Amazonas
Age group
8 to 20
2 (6%)
2 (6%)
4 (11%)
21 to 30
4 (11%)
0
4 (11%)
31 to 40
4 (11%)
5 (14%)
9 (25%)
41 to 50
4 (11%)
2 (6%)
6 (17%)
34
> 50
4 (11%)
9 (25%)
13 (36%)
Table 2 Results of PCR of samples from reactive patients for CD serology
Serological Tests
No. of positive patients
Mini-exon PCR
PCR (COII)
ELISA + IIF
26 (72%)
1
9
ELISA + WB
2 (6%)
0
0
ELISA + IIF + WB
8 (22%)
2
4
36 (100%)
3
13
Total
Blood culture and xenodiagnosis
There was no growth of T. cruzi in blood cultures, which may be a consequence of standard
protocol used in the laboratory that uses a low amount of patient’s blood to start
hemocultures, while other protocols use higher amounts of patient’s blood [20]. No
flagellated forms were observed in the fresh triatomine stools.
DNA amplification of the mini-exon gene
T. cruzi positivity was observed in PCR of the mini-exon gene of triatomine samples after 180
days of xenodiagnosis of three (8.3%) patients, with the profile of amplified products
compatible with TcI (Table 2).
Analysis of the mitochondrial gene COII
PCR of the gene encoding COII showed a band of 420 bp amplified in 13 (36%) samples
corresponding to the 13 patients already detected by Mini-exon gene amplification (Table 2).
Sequencing and phylogenetic analysis of the gene encoding the COII reference strain Silvio
10× showed that chronic infection of these patients was caused by the T. cruzi DTU TcI
(Figure 2).
35
Figure 2 Phylogenetic tree showing the distribution of Trypanosoma cruzi isolates in
rural and periurban areas of Manaus, State of Amazonas, Brazil, based on the
sequencing of the gene encoding cytochrome oxidase subunit II. The following standard
strains obtained from GenBank (DTU (strain name – access number)) were used: TcI (Silvio
×10 cl4 – EU302222.1), TcII (Esmeraldo cl3 – AF359035.1), TcIII (M6241 cl6 –
AF359032.1), TcIV (CANIII cl1 – AF359030.1), TcV (Mn cl2 – DQ343718.1), and TcVI
(CL Brener – DQ343645.1). TcCOII1, haplotype described in (6).
Haplotypes
The analysis revealed the presence of four different haplotypes in the samples. Based on these
sequences, haplotype TcI COII 1[6] was the most frequent, occurring in samples of 9 patients
(HUM01,02,03,05,06,07,09,10,12). The remaining sequences from the samples of four
patients (HUM04 and HUM08, HUM11, and HUM13) were not previously described (Figure
3).
Figure 3 Representation of Trypanosoma cruzi haplotypes identified as DTU TcI
identified by sequencing of the cytochrome oxidase subunit II gene. Standard strains
obtained from GenBank [DTU (strain name – access number)]: TcI (Silvio ×10 cl4EU302222.1), TcII (Esmeraldo cl3 -AF359035.1), TcIII (M6241 cl6- AF359032.1), TcIV
(CANIII cl1 -AF359030.1), TcV (Mn cl2- DQ343718.1), and TcVI (CL BrenerDQ343645.1). TcCOII1, haplotype described in (6).
Of the 13 patients positive for TcI, 8 were male, their age ranged from 9 to 73 years, 9 were
originally from Amazonas and live in a rural area with eating habits including the
consumption of wild animal meat and palm tree fruit juice, 3 had never heard of the disease.
Electrocardiogram and echocardiogram of seropositive patients show mild left ventricular
diastolic dysfunction in only 2 patients. No digestive system complaints were reported.
Discussion
This study revealed that the DTU TcI causes chronic CD in an asymptomatic group of
patients in the Amazon region. This study is the first in the region to characterize TcI in
36
patients with chronic infection, showing the insertion of man into the sylvatic cycle of T. cruzi
and reinforcing the idea that the Amazon is an emerging area for CD [14].
TcI has a wide distribution from North America to South America. In countries of Northern
South America such as Venezuela and Colombia, TcI has been reported as the predominant
lineage and, association with Chagas disease pathology has been reported [28-30]. TcI has
also been sporadically reported from chagasic patients throughout the southern cone.
Research performed in the State of Amazonas, especially in the microregion of Rio Negro,
show a disproportionate relationship between the numbers of individuals with positive anti-T.
cruzi serology and overt clinical cases of CD, with a prevalent profile of low morbidity and
mortality [3,18,31]. In this region, there are reports of seropositive patients exhibiting cardiac
abnormalities with no record of digestive disorders [32].
Comparisons of the pathogenicity of the different DTUs reveal that TcI shows lower
parasitemia compared with the DTUs TcV and TcVI [33]. Considering that the biological
characteristics of the different DTUs play an important role in the prevalence of latent chronic
Chagas infection and the low immune power of circulating T. cruzi, it has been hypothesized
that the T. cruzi strains circulating in the State of Amazonas have low virulence and
pathogenicity [34].
Nine out of the 13 patients characterized as DTU TcI had a common haplotype, which was
also the most frequent in outbreaks reported in the Amazon by Monteiro and colleagues [6].
Eleven out of 13 had never left the Amazon region, and 4 were originally from northeastern
and midwestern regions of Brasil. The T. cruzi haplotypes isolated from these four patients
fall into the most prevalent haplotype in the region present in the study, suggesting that they
acquired the infection locally, progressing to the chronic phase.
An important biological factor in the natural history and epidemiology of CD is the high
diversity of vectors and wild animal reservoirs of T. cruzi, resulting in an intense and complex
sylvatic transmission cycle. This factor may be related to parasite genetic diversity. The same
study by Monteiro et al. [6] revealed four haplotypes of DTUs TcI and TcIV causing
infections; however, no correlation between haplotype and clinical and epidemiological
factors of CD or the interaction of the parasite with the vector were observed [6]. Genetic
variability within TcI has been highlighted by other studies and associated with severe forms
of CD in Colombia and Argentina [30,35,36]. In Venezuela, as well as other Northern South
Americas, there are a number of reports showing genetically homogeneous TcI strains from
humans, when compared with sylvatic TcI strains, from the same areas [30,37,38].
Although the present study did not find any association between haplotype and symptoms
suggestive of CD, it is unclear whether the different clinical forms of CD may be associated
with a specific T. cruzi DTU, clone, transmission mode or host genetics [6]. Gaining
knowledge about the biological properties of the TcI lineage, which certainly plays an
important role in the CD pathogenesis and response to the specific chemotherapy in the
Amazon region, represents a challenge for future research [39-41].
Intensive programs of vector control and transfusion surveillance in long-established endemic
areas of Brazil have been successful; however, CD has been rising in the Amazon region in
the form of outbreaks associated with oral transmission. CD is thus considered as neglected
and emerging, as evidenced by the occurrence of acute and chronic cases that indicate a new
epidemiological profile of the disease. Thus, the importance of performing serological surveys
37
in the region needs to be emphasized due to the cases diagnosed in the present study.
Moreover, in addition to the planning and implementation of disease control measures,
complementary PCR as a tool for DTU classification should also be highlighted, due to
limited data on the relationship between the specific DTU genotypes/haplotypes types and
clinic-epidemiological features of CD.
Conclusions
In this study, T. cruzi infection was confirmed in 36 patients with reactive serology for
chronic CD, parasites were detected using molecular parasitological techniques and
genotyped in 13 of these patients. Furthermore, T. cruzi DNA was found in triatomines used
for xenodiagnosis of patients with positive serology for chronic CD, being DTU TcI the
detected strain.
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
Authors Contributions
Serological tests: LIARCC and LKCM (Laise). Parasitological tests: RAGS, MGVB, LKCM (Laylah), SRP,
and FRB. Patient follow-up: JAOG, JMBBF. Molecular techniques: HS, RAGS, LKCM (Laylah), GVS and
SRP. Data analysis: RAGS, MGVB, HS, MGM and WMM. Wrote the paper: RAGS, HS, and MGVB. All
authors read and approved the final version of the MS
Acknowledgments
We would like to thank the people who performed the serological survey and patient follow-up. HS is
a recipient of a PVE Grant from the Program Science without borders, CAPES at the Fundação
Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado, Manaus, Brazil. This project was funded by the Amazonas
Research Foundation (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas – FAPEAM) (PPSUS
grant call for proposals no. 007/2009), by the National Council for Scientific and Technological
Development (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq), and by the
Department of Science and Technology of the Ministry of Health of Brazil (Departamento de Ciência e
Tecnologia do Ministério da Saúde do Brasil - DECIT/MS).
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