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URI - CAMPUS DE ERECHIM
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
OBTENÇÃO DE GOMA XANTANA EM BIORREATOR UTILIZANDO
MEIO À BASE DE SORO DE QUEIJO: ESTUDO DA PRODUÇÃO E
MODELAGEM MATEMÁTICA
JAQUELINE SULKOSKI MECCA
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Mestrado
em Engenharia de Alimentos da URI-Campus de Erechim, como
requisito parcial à obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de
Alimentos, Área de Concentração: Engenharia de Alimentos, da
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões
– URI, Campus de Erechim.
ERECHIM, RS - BRASIL
FEVEREIRO 2010
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OBTENÇÃO DE GOMA XANTANA EM BIORREATOR UTILIZANDO MEIO À BASE
DE SORO DE QUEIJO: ESTUDO DA PRODUÇÃO E MODELAGEM MATEMÁTICA
JAQUELINE SULKOSKI MECCA
Dissertação de Mestrado submetida à Comissão Julgadora do Programa de Pós-Graduação em
Engenharia de Alimentos como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre
em Engenharia de Alimentos, Área de Concentração: Engenharia de Alimentos.
Comissão Julgadora:
____________________________________
Helen Treichel, D.Sc. (Orientadora)
____________________________________
Fernanda Corazza, D.Sc. (Orientadora)
____________________________________
Marcio A. Mazutti, D.Sc.
____________________________________
Gean Delise Leal Pasquali Vargas, D.Sc.
____________________________________
Rogério Cansian, D.Sc.
Erechim, Fevereiro de 2010.
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3
NESTA PÁGINA DEVERÁ SER INCLUÍDA A FICHA CATALOGRÁFICA DA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. ESTA FICHA SERÁ ELABORADA DE ACORDO COM
OS PADRÕES DEFINIDOS PELO SETOR DE PROCESSOS TÉCNICOS DA BIBLIOTECA
DA URI – CAMPUS DE ERECHIM.
4
AGRADECIMENTOS
De maneira especial, aos meus pais, Solange e Nelson, que sempre me ensinaram qual
caminho seguir e a ser uma pessoa leal. Muito obrigada por tudo, por todas as horas em que
pensei em desistir e vocês estavam aí para me apoiar. Por se preocuparem com meu futuro e,
mesmo depois de formada, darem-me essa oportunidade de continuar estudando e sentirem
muito orgulho disso.
A minha família, pelo amor e pelas palavras de incentivo. Mesmo sabendo que não seria
fácil para mim, sempre me incentivaram a fazer mestrado. Em vários momentos difíceis, vocês
me fizeram erguer a cabeça e seguir em frente. Ao meu marido, Alcione, que me recebeu em
sua casa e sempre esteve pronto para ajudar. Muito obrigada por tudo!
A Deus, que me deu força para seguir em frente quando tudo dava errado e para lutar
cada vez mais.
Aos meus orientadores Helen Treichel, Marcio Mazutti e Fernanda Corazza pelo apoio e
ensinamentos a mim dispensados. Principalmente pela total disponibilidade em ajudar, mesmo
quando não estava presente e pelas palavras de incentivo.
Às novas amizades que eu fiz durante o mestrado, principalmente à pessoa e professor
Marcio Mazutti e ao colega Giovani. Vocês foram decisivos.
A todos os colegas do mestrado, pela amizade e troca de experiências.
A todos do laboratório de biotecnologia e da vegetal, pela ajuda e amizade.
Aos colegas do Centro Tecnológico da URI - Campus de Erechim e graduandos do
Curso de Engenharia de Alimentos, os quais é difícil citar todos, e seria injusto citar apenas
alguns, mas que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho e para o
meu amadurecimento profissional e espiritual.
Muito obrigada a todos do fundo do meu coração!
Jaqueline Sulkoski Mecca
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Resumo da Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de
Alimentos como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Grau de Mestre em
Engenharia de Alimentos.
OBTENÇÃO DE GOMA XANTANA EM BIORREATOR UTILIZANDO MEIO À BASE
DE SORO DE QUEIJO: ESTUDO DA PRODUÇÃO E MODELAGEM MATEMÁTICA
JAQUELINE SULKOSKI MECCA
Fevereiro 2010
Orientadores: Marcio Mazzutti; Fernanda Castilhos Corazza; Helen Treichel
A goma xantana é um polissacarídeo produzido por Xanthomonas, importante devido à ampla
utilização na indústria de alimentos, farmacêutica e petroquímica, na recuperação de óleo,
apresentando vantagens quando comparada a utilização de outros polímeros, devido, em
especial, às suas propriedades reológicas e a não dependência do extrativismo sujeito a
sazonalidades. Assim, provavelmente a goma xantana deva continuar sendo o biopolímero mais
utilizado nos próximos anos, devido a essas suas características singulares. Diversos estudos que
visam à utilização de resíduos agroindustriais na produção de goma xantana são encontrados na
literatura, devido ao crescente mercado de aplicabilidade dos polissacarídeos de alto valor
agregado e redução de custos na produção. Desse modo, a utilização de substratos alternativos,
como o soro de queijo, representa a eliminação de possíveis problemas ambientais, além do fato
de que o Brasil poderia suprir sua própria demanda de goma xantana com maior
competitividade no preço final, visto que toda goma xantana utilizada no país é importada. Os
modelos matemáticos representam uma ferramenta tida como muito importante no aumento de
escala de um bioprocesso, controle e otimização de processo. Devido ao alto custo de uma
fermentação em escala industrial, torna-se indispensável ter um modelo que consiga descrever
quantitativamente as variáveis relevantes do processo. O modelo pode baixar custos e a
complexidade envolvida neste tipo de experimento. Neste contexto, esta dissertação apresenta
como seu principal objetivo o estudo da produção da goma xantana em biorreator utilizando
soro de queijo como substrato e a modelagem matemática da cinética deste processo. Os
resultados obtidos neste trabalho com relação aos efeitos da agitação e aeração permitem
concluir que, ambas as variáveis apresentam influência sobre a produção de goma xantana e,
com relação ao crescimento microbiano, somente a agitação apresentou influência significativa
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no processo. Além disso, as maiores produções de goma foram verificadas no período final de
fermentação (entre 72 e 96h). Esse fato ocorre devido a bactéria Xanthomonas campestris
excretar para o meio seu metabólito na sua fase de desaceleração e declínio celular, indicando
que a formação de produto é parcialmente associada ao crescimento microbiano. Com relação
ao modelo matemático proposto para representar o processo de produção de goma xantana em
biorreator batelada, pode-se verificar que o emprego de uma estrutura híbrida, combinando as
equações de balanço de massa com as redes neurais, é uma ferramenta interessante para a
estimação de parâmetros em bioprocessos.Os resultados obtidos nesse trabalho com relação a
qualidade de ajuste foram satisfatório, uma vez que o modelo foi apto para descrever o perfil
cinético do crescimento microbiano, consumo de lactose e produção de goma xantana no meio.
O modelo híbrido é uma ferramenta interessante a ser utilizada em bioprocessos, principalmente
nas situações onde o a rota metabólica não é bem conhecida ou elucidada.
Palavras Chave: Modelagem Híbrida;Goma Xantana;Soro de Queijo.
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 8
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................................ 10
2.1 POLISSACARÍDEOS MICROBIANOS.......................................................................... 10
2.1.1 Xanthomonas sp............................................................................................................ 13
2.1.2 Goma Xantana .............................................................................................................. 15
2.2 PRODUÇÃO DE BIOPOLÍMEROS POR FERMENTAÇÃO.......................................... 18
2.2.1 Substratos utilizados na produção de biopolímeros ........................................................ 21
2.2.1.1 Soro de Queijo ........................................................................................................... 23
2.3 RECUPERAÇÃO DE BIOPOLÍMEROS......................................................................... 26
2.4 TOXICIDADE E APLICAÇÕES DA GOMA XANTANA.............................................. 27
2.5 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIOPROCESSOS ................................................. 28
2.6 MODELOS CINÉTICOS DE CRESCIMENTO MICROBIANO ..................................... 30
2.7 ESTIMAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS ............................................................ 32
2.8 REDES NEURAIS........................................................................................................... 35
2.9 MODELOS HÍBRIDOS................................................................................................... 38
3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................ 40
3.1 MICRORGANISMO E MANUTENÇÃO........................................................................ 40
3.2 PRODUÇÃO DE CÉLULAS ........................................................................................... 40
3.3 CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO ............................................................... 41
3.4 SORO DE QUEIJO.......................................................................................................... 41
3.5
PRODUÇÃO DE GOMA XANTANA....................................................................... 41
3.6 RECUPERAÇÃO DO BIOPOLÍMERO .......................................................................... 43
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................ 48
4.1. ESTUDO DA PRODUÇÃO DA GOMA XANTANA..................................................... 48
4.2 MODELAGEM MATEMÁTICA DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE GOMA
XANTANA ........................................................................................................................... 54
5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ................................. 58
6. REFERÊNCIAS................................................................................................................. 59
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1. INTRODUÇÃO
Os biopolímeros são polissacarídeos de origem microbiana também conhecidos como
gomas ou exopolissacarídeos (ESP), que têm a capacidade de formar géis e soluções viscosas
em meio aquoso (MOREIRA et al., 2003).
Os biopolímeros são interessantes do ponto de vista industrial por serem amplamente
utilizados como espessantes, geleificantes, agentes de suspensão, colóides protetores, entre
outras aplicações. Exibem uma combinação de propriedades que são essenciais para definir sua
aplicação final. Tais propriedades são determinadas por sua composição química, agrupamentos
e ligações moleculares, sua massa molar média e sua distribuição (PACE, 1991). Biopolímeros
ou polissacarídeos microbianos podem ser intracelulares, da parede celular ou extracelulares
(exopolissacarídeos ou EPS), e estes podem ser capsulares ou livres. Os de maior interesse são
os extracelulares livres, devido à sua facilidade de obtenção e menor custo para a indústria.
Quatro biopolímeros são aprovados pelo Food and Drugs Administration (FDA), nos
Estados Unidos, para uso alimentar: xantana, dextrana, curdulana e gelana (PORTILHO, 2002).
A Legislação Brasileira, através da Agência Nacional de Vigilânica Sanitária (ANVISA), prevê
o uso de xantana e da dextrana como um aditivo em alimentos, porém, curdulana e gelana ainda
não são aprovadas (ANVISA, 2007).
Segundo Anderson et al.(1986) resíduos são considerados uma fonte rica de nutrientes e
de grande aplicabilidade na indústria, nos mais diversos produtos. Neste contexto o descarte do
soro de queijo pode trazer danos à natureza. Entretanto, como o mesmo é fonte de proteínas,
lactose e demais compostos, este pode ser utilizado como meio de produção em processos
fermentativos, tornando-se muito atrativa econômica e ambientalmente a sua reutilização.
O soro de queijo é um líquido obtido da coagulação do leite na elaboração dos queijos e
após a etapa de separação da coalhada e gordura. Ele representa 80% a 90% de volume no leite
e contém em torno de 6,0% de extrato seco, 55% dos nutrientes do leite original, sendo, destes,
proteínas solúveis, lactose, vitaminas e sais minerais. O soro de leite resultante da fabricação de
queijos vem sendo estudado como alternativa promissora, em bioprocessos, para obtenção da
goma xantana (Nitschke, 2001; Gollo et al., 2009; Mesomo et al., 2009).
A goma xantana é um polissacarídeo produzido por Xanthomonas, importante devido à
ampla utilização na indústria de alimentos, farmacêutica e petroquímica, na recuperação de
óleo, apresentando vantagens quando comparada a utilização de outros polímeros, devido, em
especial, às suas propriedades reológicas e a não dependência do extrativismo sujeito a
sazonalidades (Casas, 1999). Assim, provavelmente a goma xantana deva continuar sendo o
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biopolímero mais utilizado nos próximos anos, devido a essas suas características singulares.
Diversos estudos que visam à utilização de resíduos agroindustriais na produção de goma
xantana são encontrados na literatura, devido ao crescente mercado de aplicabilidade dos
polissacarídeos de alto valor agregado e redução de custos na produção. Desse modo, a
utilização de substratos alternativos, como o soro de queijo, representa a eliminação de
possíveis problemas ambientais, além do fato de que o Brasil poderia suprir sua própria
demanda de goma xantana com maior competitividade no preço final, visto que toda goma
xantana utilizada no país é importada. (Nery et. al. 2008).
Os modelos matemáticos representam uma ferramenta tida como muito importante no
aumento de escala de um bioprocesso, controle e otimização de processo. Devido ao alto custo
de uma fermentação em escala industrial, torna-se indispensável ter um modelo que consiga
descrever quantitativamente as variáveis relevantes do processo. O modelo pode baixar custos e
a complexidade envolvida neste tipo de experimento (VOLESKY e VOTRUBA, 1991).
Neste contexto, esta dissertação apresenta como seu principal objetivo o estudo da
produção da goma xantana em biorreator utilizando soro de queijo como substrato e a
modelagem matemática da cinética deste processo.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 POLISSACARÍDEOS MICROBIANOS
Polissacarídeos microbianos são macromoléculas formadas por monossacarídeos e
derivados ácidos, podendo ser sintetizados por bactérias, fungos e leveduras (SUTHERLAND,
1982).
Polissacarídeos microbianos são biopolímeros produzidos por microrganismos, que têm a
capacidade de formar géis e soluções viscosas em meio aquoso (MOREIRA et al., 2003),
mesmo em baixas concentrações.
Muitos microrganismos produzem grandes quantidades de polissacarídeos sob as mais
variadas condições. Esses polissacarídeos têm papéis específicos como compostos de
armazenamento (glicogênio), compostos estruturais (quitina) e mediadores das interações do
microrganismo com o meio ambiente (polissacarídeos extracelulares) (PACE, 1991).
Os polissacarídeos podem ser divididos, de acordo com a sua localização morfológica, em
três grupos: intracelular, localizado no interior da célula ou como parte da membrana
citoplasmática; da parede celular formados como parte estrutural das células; e polissacarídeos
extracelulares, produzidos no interior da célula, sendo posteriormente, secretados para o exterior
da mesma (SUTHERLAND, 1982).
A biossíntese de exopolissacarídeos (EPS) está diretamente relacionada à capacidade de
sobrevivência do microrganismo em condições adversas de meio ambiente (WILKINSON, 1958
apud MOREIRA, 2002). De acordo com PACE (1991) esses EPS desempenham diferentes
papéis, que incluem: proteger o microrganismo contra desidratação; servir de barreira,
impedindo que vírus e anticorpos se liguem a sítios específicos sobre a parede celular; acoplar e
neutralizar toxinas carregadas ou íons metálicos tóxicos; atuar como fonte de carbono e energia;
converter o excesso de substrato em uma massa espumosa que é mais difícil de ser metabolizada
por outros microrganismos; interagir com células de animais ou plantas em relações específicas,
simbióticas ou patogênicas.
Os EPS são, geralmente, considerados metabólitos secundários, produzidos quando uma
fonte de carboidratos está presente em excesso (PACE e RIGHELATO, 1980). Metabólitos
secundários são compostos sintetizados pelos microrganismos quando as células crescem
lentamente ou cessam o crescimento. Seu papel no crescimento e metabolismo do
microrganismo nem sempre é bem definido.
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Os polissacarídeos capsulares são altamente hidratados, e, portanto protegem a bactéria da
dessecação, evitando que moléculas hidrofóbicas penetrem na cápsula e cheguem à membrana
celular. Os EPSs ácidos produzidos pela maioria das bactérias fitopatogênicas são altamente
aniônicos e assim, podem atuar como resinas de troca iônica, concentrando minerais e nutrientes
ao redor da célula. Outra função importante do polissacarídeo capsular, no solo ou em ambiente
aquáticos, é auxiliar na adesão da bactéria a superfícies biológicas ou inertes, nas quais existem
altas concentrações de nutrientes. As bactérias fitopatogênicas precisam crescer ou sobreviver
no solo, em folhas ou raízes de plantas para completar seu ciclo de vida, portanto a proteção
contra o meio ambiente hostil pode ser um motivo para que a bactéria produza EPS (SILVA et
al., 2001).
Os homopolissacarídeos são EPS microbianos constituídos por um único tipo de
monossacarídeo, como as gomas dextrana e curdulana. Outros EPS, como a goma xantana,
possuem estrutura
mais
complexa
podendo,
inclusive,
conter além
de
diferentes
monossacarídeos, outros compostos químicos (SUTHERLAND, 1994).
Gomas são biopolímeros hidrofílicos de alta massa molar largamente utilizadas na
indústria para controlar as propriedades funcionais de produtos alimentícios (KAYACIER et al.,
2005).
As gomas podem ser provenientes de plantas terrestres, subdividindo-se em estruturais
(amido, celulose, pectina, etc.), exudatos (goma arábica) e oriundos das sementes (goma guar e
locusta); de plantas aquáticas (ágar, carragena); e de microrganismos (dextrana, gelana, xantana,
etc.), que recebem a denominação de biopolímeros microbianos (BOBBIO e BOBBIO, 1992).
Microrganismos são mais apropriados que macroalgas ou plantas superiores, uma vez que
eles exibem alta taxa de crescimento e são mais acessíveis na manipulação das condições para
aumentar o crescimento e/ou a produção de exopolissacarídeo (PARIKH e MADAMWAR,
2006).
As gomas microbianas não dependem de condições climáticas, e não estão sujeitas à
contaminação marinha ou falha na colheita, que prejudicam a oferta das gomas tradicionais.
Além disso, são menos suscetíveis à variabilidade em sua qualidade, pois sua produção pode ser
controlada cuidadosamente. Os polissacarídeos obtidos de microrganismos possuem
propriedades específicas, sendo uma alternativa válida para o desenvolvimento de novos
produtos, pois possuem propriedades similares aos de origem vegetal e animal. Essas gomas
têm como principal desvantagem o seu elevado custo, o que se deve aos processos de produção
que são intensivos em capital e energia (PACE, 1991; MAUGERI, 2001).
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As propriedades dos biopolímeros são determinadas por sua composição química,
agrupamentos e ligações moleculares, sua massa molar e sua distribuição. A principal
característica dos polímeros é sua capacidade de modificar a reologia de soluções, além de
serem, em sua maioria, multifuncionais, isto é, exibem uma combinação de propriedades que
são essenciais para definir sua aplicação final. Os EPS microbianos podem ser polímeros de
monossacarídeos aniônicos, neutros e catiônicos ou derivados destes e, freqüentemente, contêm
grupos laterais como acetato, piruvato, succinato, componentes lipídicos, nitrogênio orgânico ou
íons inorgânicos. O grau de substituição destes grupos laterais tem um importante efeito sobre
as propriedades dos polímeros (PACE, 1991).
As propriedades mais importantes de uma solução de goma são água ligada, viscosidade
em termos de gelatinização e capacidade espessante. Em adição a estas funções, elas são
também usadas em formulações de alimentos para estabilização de emulsões, prevenção de
recristalização do gelo e atributos sensoriais (KAYACIER et al., 2005).
Vários biopolímeros têm sido produzidos e utilizados comercialmente, entre eles:
dextrana (Leuconostoc e Streptococcus), xantana (Xanthomonas), curdulana (Alcaligenes
faecalis var. mixogenes e Agrobacterium radiobacter), alginato bacteriano (Azotobacter,
principalmente Azotobacter vinelandii, e Pseudomonas), zanflo (Erwinia tahitica), gelana
(Sphingomonas paucimobilis, anteriormente classificada como Pseudomonas elodea), welana
(Alcaligenes), escleroglucana (Sclerotium), pululana (Aureobasidium pullulans), celulose
bacteriana (Acetobacter xilinum) (SUTHERLAND, 1992; MARTINS e SÁ-CORREIA, 1993;
GIAVASIS et al., 2000; MAUGERI, 2001; GIAVASIS et al., 2003; KALOGIANNIS et al.,
2003; CAMPBELL et al., 2003).
A dextrana e a xantana são os polissacarídeos microbianos comercializados em maior
escala, dividindo fatias importantes do mercado de gomas. A goma gelana e curdulana também
são produzidas comercialmente por biossíntese microbiana e aprovadas pelo Food and Drugs
Administration (FDA), para uso em alimentos. A xantana foi o segundo polissacarídeo
microbiano usado na indústria de alimentos como espessante, emulsificante, estabilizante e
agente de suspensão, aprovado pelo FDA em 1969. No Brasil, a adição de xantana em alimentos
é permitida desde 1965.
A goma xantana foi descoberta da década de 1950 e comercializada a partir da década de
1960, sendo um polissacarídeo natural e um importante biopolímero industrial (GARCÍAOCHOA et al., 2000). É um heteropolissacarídeo produzido por cultivo aeróbio de culturas de
Xanthomonas campestris, normalmente pelo pv campestris (GARCÍA-OCHOA et al., 2000;
MAUGERI, 2001).
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A instabilidade das linhagens de Xanthomonas campestris podem ocasionar uma variação
de massa molar do polissacarídeo, e do grau de piruvatação e acetilação. Segundo MAUGERI
(2001), através de manipulações genéticas é possível alterar o grau de acetilação, aumentar o
grau de piruvatação em 45% e aumentar o rendimento da goma em 20%.
A aplicação da goma xantana em inúmeros segmentos industriais entre eles alimentos,
fármacos, químico, petroquímico deve-se, principalmente, às suas propriedades reológicas que
permitem a formação de soluções viscosas em baixas concentrações (0,05-1%) e ampla faixa de
estabilidade a pH e temperatura, características conferidas devido à sua estrutura ramificada e
sua alta massa molar (GARCÍA-OCHOA et al., 2000; SUTHERLAND, 2002). Quando em
conjunto com galactomananas (goma guar, goma de algaroba e goma locuste) a goma xantana
apresenta aumento sinérgico de viscosidade, formando géis termorreversíveis (GARCÍAOCHOA et al., 2000; MAUGERI, 2001; WANG et al., 2002a; WANG et al., 2002b;
PARADOSSI et al., 2002; SUTHERLAND, 2002).
A importância e potencialidade do uso de biopolímeros nos mais diversos segmentos
industriais como agentes espessantes, estabilizantes, gelificantes e emulsionantes em alimentos,
fármacos, tintas, defensivos agrícolas e outros, é um consenso na literatura. Observa-se nesses
setores uma contínua substituição dos polissacarídeos convencionais por produtos de origem
microbiana, por várias razões, como possibilidade de modificação de suas características
reológicas através do controle de parâmetros de fermentação, independência climática, controle
de qualidade dos lotes (BOZA, 2002).
Um alto potencial de aplicação nos mais diversos segmentos industriais tem surgido para
biopolímeros, destacando-se a indústria alimentícia devido principalmente à propriedade de
formar soluções viscosas e géis hidrossolúveis. Para DRUZIAN (2000), a pesquisa visando à
aplicação industrial está concentrada nos polissacarídeos extracelulares (EPS), pois resultam em
processos de extração e purificação mais simples e produtividade mais elevada.
2.1.1 Xanthomonas sp
A bactéria Xanthomonas campestris, capaz de elevar a viscosidade do meio onde se
desenvolve, foi isolada por Vers em 1940. A viscosidade é produzida pela secreção no meio de
um heteropolissacarídeo aniônico, denominado goma xantana, produzido em escala industrial
por fermentação aeróbica pela X. campestris (MAURY e ROQUE, 1986).
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As bactérias Xanthomonas pertencem à família Pseudomonaceae. Microrganismos deste
gênero são bactérias fitopatogênicas relativamente comuns responsáveis por causar “black root”
em crucíferas, resultando em grandes perdas econômicas (ESGALHADO et al., 1995;
CROSMAN et al., 2004).
As Xanthomonas são bactérias Gram-negativas, com formato de bastonetes (0,4-0,7µm de
largura e 0,7-1,8µm de comprimento), móveis por flagelo único (1,7-3µm de comprimento),
com exceção a X. maltophilia que possui vários flagelos. As colônias de Xanthomonas sp são
normalmente amarelas, lisas e viscosas. Os pigmentos amarelos, xantomonadinas, estão
presentes em todas as espécies de Xanthomonas, porém, podem estar ausentes quando acontece
alguma degradação (GARCÍA-OCHOA, 2000). São essencialmente fitopatogênicas, com
exceção da X. maltophilia que é um patógeno humano (HOLT et al., 1994).
Estes microrganismos são quimiorganotróficos, capazes de usar uma variedade de
carboidratos, sais e ácidos orgânicos como fonte de carbono, estritamente aeróbios, com um tipo
de metabolismo respiratório que requer oxigênio como o aceptor de elétrons terminal,
resistentes à estreptomicina. A bactéria não desnitrifica, é catalase-positiva e oxidase-negativa.
A Xanthomonas sp pode oxidar a glicose e o caminho de Entner-Doudoroff é
predominantemente usado para o catabolismo da glicose (o caminho da pentose fosfato também
acontece, mas usa só 8-16% da glicose total consumida); o ácido tricarboxílico e os ciclos de
glioxilato estão presentes (GARCÍA-OCHOA, 2000).
Grande parte dos patovares de X. campestris, e outras espécies de Xanthomonas
produzem EPS. Por serem bactérias essencialmente fitopatogênicas, a produção de EPS está
relacionada com sua sobrevivência, enquanto na superfície do vegetal hospedeiro, pois este é
um ambiente inóspito à bactéria. Causam uma variedade de doenças e sintomas, incluindo
necrose, gomose e/ou doenças vasculares ou parenquimatosas em folhas, ramos ou frutos de
muitas plantas (HAYWARD, 1993). A espécie X. campestris, a mais numerosa e abundante,
diferencia-se em aproximadamente 125 patovares, que infectam e causam doenças em vários
hospedeiros (BRADBURY, 1984).
As bactérias colonizam a superfície dos vegetais pela adesão a certas estruturas. Após
invadirem os espaços intercelulares, desenvolvem microcolônias rodeadas de material fibrilar,
provavelmente o EPS xantana. Passadas 24 horas encontram-se abundantemente rodeadas por
EPS, que preenche os espaços intercelulares. Como o muco secretado pela bactéria apresenta
alta capacidade de retenção de água, os espaços tornam-se congestionados; este fenômeno é
conhecido como water soaking. O tecido é continuamente desintegrado e é o primeiro sintoma
da infecção e pré-requisito para a efetiva colonização bacteriana (RUDOLPH, 1993). Como a
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congestão é progressiva, os danos vão agravando-se. A planta vai murchando devido à redução
da fotossíntese e aumento da permeabilidade da membrana celular. A bactéria utiliza como
substrato o tecido necrosado, uma vez que é capaz de secretar diversas enzimas que degradam
os polissacarídeos estruturais como a celulose e pectinas (SUTHERLAND, 1993).
Fatores de crescimento geralmente requeridos incluem metionina, ácido glutâmico, ácido
nítrico ou a combinação desses. A temperatura ótima de crescimento fica entre 25 a 30ºC, e
possuem máxima tolerância ao NaCl de 2,0-5,0%. Capaz de fazer proteólise no leite para obter
fontes de nitrogênio (HOLT et al., 1994).
As linhagens utilizadas para a produção de goma xantana são selecionadas e cultivadas
por muitos métodos convencionais. A modificação genética pode levar a melhorias nas
propriedades requeridas para aplicações de recuperação da cepa ou suplementação do meio, ou
ainda aumentar a produção, reduzindo o tempo de fermentação e simplificando a recuperação e
purificação do produto no processo (ROSALAM e ENGLAND, 2006).
2.1.2 Goma Xantana
A Goma Xantana é um polissacarídeo sintetizado por bactérias do gênero Xanthomonas, e
um importante biopolímero industrial. A descoberta da goma xantana foi resultado de um
programa sistemático de busca ou screening iniciada pelo Departamento de Agricultura dos
EUA. O resultado deste programa foi a descoberta da xantana na década de 1950 nos
Laboratórios de Pesquisa Regionais do Norte (NRRL) no Departamento de Agricultura dos
Estados Unidos (MORRIS, 1984). A xantana é completamente atóxica, tendo sido aprovada
pelo Food and Drug Administration (FDA) dos EUA desde 1969, como aditivo em alimentos.
No Brasil, a adição de xantana em alimentos é permitida desde 1965, pelo Decreto Lei nº
55.871, da Legislação Brasileira de Alimentos (LIMA et al., 2001).
A Xantana é um heteropolissacarídeo, cuja unidade básica repetidora é um
pentassacarídeo, formado por duas unidades de glicose, duas unidades de manose e uma
unidade de ácido glucorônico na proporção molar de 2,8:2,0:2,0 e grupos piruvato e acetil. Sua
cadeia principal consiste em unidades de β-D-glucose com ligações nas posições 1 e 4. O
trissacarídeo da cadeia lateral contém uma unidade de ácido D-glucurônico entre duas unidades
de D-manose ligadas na posição O-3 de resíduos de glicose da cadeia principal.
Aproximadamente metade dos resíduos D-manose terminais contém um ácido pirúvico ligado,
com distribuição indeterminada. A unidade D-manose ligada à cadeia principal contém um
16
grupo acetil na posição O-6. A presença dos ácidos acético e pirúvico produz um polissacarídeo
do tipo aniônico (SUTHERLAND et al., 1992; GARCÍA-OCHOA et al., 2000; PORTILHO,
2002). A estrutura molecular da goma xantana pode ser observada na Figura 1.
Figura 1. Estrutura da goma xantana (GARCÍA-OCHOA et al., 2000).
A massa molar da goma xantana varia de 2 x 106 a 20 x 106 Da (Daltons). Esta
distribuição da massa molar depende da associação entre cadeias, dando forma a agregados de
diversas cadeias individuais. As variações nas condições de fermentação são fatores que
influenciam a massa molar da xantana (GARCÍA-OCHOA et al., 2000, LIMA et al., 2001).
A xantana foi o segundo biopolímero bacteriano a ser comercializado e o primeiro
utilizado na indústria de alimentos, tendo sido produzida comercialmente em 1961 (MORRIS,
1996). O interesse deve-se às suas propriedades físico-químicas que superam todos os outros
polissacarídeos disponíveis no mercado. Dentre estas propriedades destaca-se a sua elevada
viscosidade em baixas concentrações (0,05-1%), devido à sua estrutura ramificada e sua alta
massa molar, bem como estabilidade em ampla faixa de temperatura e pH (VENDRUSCOLO,
1995; GARCÍA-OCHOA et al., 2000).
Existem muitos tipos de gomas as quais podem ser originadas de plantas, algas,
microrganismos ou sinteticamente (KAYACIER et al., 2005). Goma xantana é um
polissacarídeo extracelular bem conhecido, usado como espessante em indústrias farmacêuticas,
cosméticos e de alimentos (KIM et al., 2005).
17
A principal característica da xantana é sua capacidade de modificar a reologia ou o
comportamento de escoamento das soluções (MARGARITIS e PACE, 1985). Suas propriedades
são determinadas por sua composição química, arranjos e ligações moleculares (PACE, 1980).
As soluções de xantana mostram um comportamento pseudoplástico, ou seja, a
viscosidade diminui com o aumento da deformação do fluido. A viscosidade das soluções
praticamente não se alteram com a temperatura entre 4º e 93ºC, com pH entre 1 e 13 e com
forças iônicas equivalentes a concentrações de cloreto de sódio entre 0,05% e 1%. Há
compatibilidade plena com uma grande diversidade de insumos usados industrialmente, como
metais, ácidos, sais, agentes redutores, outros texturizantes, solventes, enzimas, surfactantes e
conservantes. Em conjunto com galactomananas (goma guar e goma de algaroba) apresenta um
aumento sinérgico de viscosidade e formam géis termorreversíveis (LIMA et al., 2001).
A goma xantana com alto grau de acetilação e especialmente baixo grau de piruvatação,
aumenta a viscosidade de suas soluções porque associações intermoleculares são favorecidas.
Um problema importante relacionado com a produção de goma xantana deve-se à instabilidade
das linhagens de X. campestris, resultando em uma variação de massa molar do polissacarídeo,
e do grau de piruvatação e acetilação. Com a identificação dos genes responsáveis pela síntese
do polissacarídeo é possível, através de manipulações genéticas, alterar o grau de acetilação,
aumentar o grau de piruvatação e aumentar o rendimento da goma (LIMA et al., 2001;
MAUGERI, 2001).
A demanda por goma xantana produzida por X. campestris sp. aumenta constantemente
todos os anos e uma taxa anual de crescimento de 5-10% é estimada (ROSALAM e
ENGLAND, 2006).
Em 1992 a capacidade mundial de produção de biopolímeros (principalmente xantana)
excedia 30.000 toneladas anuais correspondendo a 408 milhões de dólares (KALOGIANNIS et
al., 2003). O Brasil segue a tendência mundial de incremento no consumo de xantana, mesmo
sendo esta totalmente importada, demonstrando a relevância de se investir em uma produção
nacional competitiva, já que o Brasil mostra-se com um grande potencial para a fabricação deste
polímero em escala industrial, pois dispõe de matéria-prima básica para a produção: açúcar, e
álcool para a recuperação do polímero (MOREIRA, 2002).
No Brasil o substrato representa um baixo custo de produção, entretanto em outros países
o custo do meio de fermentação representa um fator crítico sob o aspecto comercial na produção
do polissacarídeo. Por esse motivo, vem aumentando muito o interesse por substratos
alternativos como, por exemplo, resíduos industriais que podem ser utilizados como uma
18
alternativa para produção de polissacarídeos diminuindo custos de produção e minimizando
problemas ambientais causados pelo seu descarte (ROTTAVA, 2005).
2.2 PRODUÇÃO DE BIOPOLÍMEROS POR FERMENTAÇÃO
A produção de biopolímero depende da composição do meio, da linhagem e das
condições de fermentação utilizadas, tais como: temperatura, velocidade de agitação,
concentração inicial de nitrogênio. Obtendo-se deste modo uma variação nos rendimentos e na
qualidade do polímero, pois influenciam na estrutura molecular e nas propriedades da goma
xantana produzida (CASAS et al., 2000; GARCIA-OCHOA et al., 2000).
O meio de cultura consiste geralmente de 2-4% glicose ou sacarose como fonte de
carbono, 0,05-0,1% de nitrogênio (extrato de levedura, peptona, nitrato de amônio ou uréia),
fósforo e traços de outros minerais. O pH deve ser mantido próximo ao da neutralidade
(MAUGERI, 2001). O polímero é sintetizado, principalmente ao cessar o crescimento
microbiano. Geralmente, a concentração final atinge 20 a 30 g.L-1, com rendimento de 50 a 70%
e produtividade típica de 0,5g.L-1.h-1 (LIMA et al., 2001; PORTILHO, 2002).
Segundo GARCÍA-OCHOA et al. (2000) o meio de produção ótimo para xantana inclui:
sacarose (40 gL-1), ácido cítrico (2,1 g.L-1), sais de amônia, potássio, magnésio, sódio, zinco,
ferro e cálcio, ácido bórico e ácido clorídrico concentrado, sendo o pH ajustado para 7,0.
Nitrogênio pode ser fornecido nas formas orgânica ou inorgânica, sendo que a razão C:N usada
no meio de produção deve ser menor que a usada durante o crescimento. Glutamato é a melhor
fonte de nitrogênio, usada em concentrações de 15 mM. Pequenas quantidades de ácidos
orgânicos adicionados ao meio, melhoram a produção (GARCÍA-OCHOA et al., 2000).
A relação carbono:nitrogênio no meio de cultura influencia grandemente a produção de
goma xantana. Uma elevada concentração de nitrogênio é necessária para um rápido
crescimento celular, entretanto, quando a concentração de nitrogênio no meio de cultura for
muito elevada, a goma xantana produzida possui propriedades reológicas inadequadas
(NITSCHKE et al., 2001).
Para NITSCHKE et al. (2001) meios contendo elevado teor de fonte de carbono e baixo
teor de nitrogênio favorece o acúmulo de polímero. A goma xantana é produzida como
metabólito secundário em processo com duas fases distintas: a fase de crescimento, onde maior
concentração de nitrogênio é requerida para o crescimento celular e a fase de produção, onde
maior concentração de carbono é necessária, visando o acúmulo de produto.
19
GARCÍA-OCHOA et al. (2000) verificou que nitrogênio, fósforo e magnésio influenciam
o crescimento, enquanto nitrogênio, fósforo e enxofre influenciam a produção de goma xantana.
CASAS et al. (2000) observou, porém, que a concentração de nitrogênio influencia o
aumento de biomassa, primeiramente aumentando conforme aumenta a concentração de
nitrogênio, chegando a um máximo quando 1,144g.L-1 de NH4NO3 são utilizadas, a partir disso
ocorre uma diminuição da biomassa com aumento da concentração do nitrogênio. Sobre a
produção de goma xantana nenhum efeito foi verificado.
Ácidos orgânicos como succinato, piruvato e α-cetoglutarato tiveram efeito estimulante
no crescimento e produção de goma xantana, porém concentrações maiores que 0,3% de
piruvato, 0,6% de succinato e 0,4% de α-cetoglutarato mostraram efeitos inibitórios (SOUW e
DEMAIN, 1979).
SOUW e DEMAIN (1979) utilizaram fosfato de potássio no meio de fermentação
alcançando um máximo de produção (25 g/Kg de meio) e de viscosidade na concentração de 50
mM, sendo que acima disso ocorreram decréscimos na produção e viscosidade da goma
xantana.
As temperaturas empregadas para a produção de xantana variam de 25 a 34ºC. GARCÍAOCHOA et al., (2000) concluíram que a temperatura ótima para a produção de xantana depende
do meio de produção utilizado, sendo esta de 28ºC para o meio otimizado por eles. Em
temperaturas mais baixas entre 25º e 28ºC obtém-se maior conteúdo de acetato do que em
temperaturas mais altas compreendidas entre 31º e 34ºC. Com aumento da temperatura ocorre
também um decréscimo na massa molar média da goma produzida (CASAS et al., 2000).
O pH neutro é apontado pela maioria dos pesquisadores como ótimo para o crescimento
da Xanthomonas campestris, sendo que este decresce para 5,0 durante a produção de goma
xantana, devido aos grupos ácidos presentes no polímero (GARCIA-OCHOA et al., 2000;
PAPAGIANNI et al., 2001).
PAPAGIANNI et al. (2001), verificaram que o pH do meio de cultura aumentou durante
as fermentações, usando fermentador, quando foi variada a velocidade de agitação, alcançando
um máximo de 9,5 quando foi utilizado 600 rpm.
Aeração é requerida para se obter produção de goma em processos fermentativos,
aumentos nos níveis de agitação resultam em níveis de produção mais altos, o que ocorre
também para o crescimento celular. Em baixas velocidades ocorrem limitações de oxigênio
resultando em baixas produções e gomas com baixa massa molar. Os efeitos benéficos do
aumento da agitação são atribuídos ao aumento da transferência de nutrientes e oxigênio
necessários para a formação de goma xantana (PAPAGIANNI et al., 2001).
20
A faixa de oxigenação recomendável para a produção de xantana é de 1,5-3,5 mM
O2/minuto, e um bom nível de aeração é requerido para se obter uma boa produção de goma em
processos fermentativos, uma vez que ocorre grande aumento da viscosidade do meio ao longo
da fermentação (WOICIECHOWSKI, 2001). O tempo de fermentação é de 48 a 96 horas
(LIMA et al., 2001).
Na condução de uma fermentação, o preparo do inóculo e a fermentação propriamente
dita são as principais fases do processo. Na primeira, multiplica-se o microrganismo em
quantidade suficiente e em condições adequadas para assegurar seu desenvolvimento na etapa
seguinte (CADMUS et al., 1978; GARCÍA-OCHOA et al., 2000).
Durante o desenvolvimento do inóculo o objetivo é aumentar a concentração celular
minimizando a produção de goma xantana, pois a goma ao redor das células impede o transporte
de nutrientes e estende a fase lag de crescimento (GARCÍA-OCHOA et al., 2000).
A produção de biopolímeros por microrganismos pode ser em meio líquido contendo
fonte de carbono e sais minerais, como visto, ou por via enzimática, utilizando enzimas
purificadas, sem adição do microrganismo (RODRIGUES, 1989 apud PADILHA, 1997). A
fermentação em cultivo submerso é a mais comumente utilizada para obtenção de goma xantana
por ser de fácil controle, possibilitando a variação do meio de cultivo, fácil esterilização do
meio, aeração estéril menos dispendiosa e a superfície bacteriana fica inteiramente exposta ao
meio facilitando as trocas metabólicas (REGULY, 2000 apud PINTO, 2005).
O processo de fermentação pode ser efetuado de maneira descontínua ou contínua. No
procedimento descontínuo ou em batelada, o cultivo das bactérias é adicionado ao um meio
contendo os substratos necessários ao desenvolvimento do microrganismo e são fornecidas as
condições ideais para que as reações ocorram. No momento em que a concentração do produto
atingir o valor máximo o processo é finalizado. Em escala laboratorial este método pode ser
realizado em agitadores orbitais ou em bioreatores. Nos agitadores orbitais apenas pode-se
controlar a temperatura, o tempo e a agitação do processo fermentativo, enquanto que em
bioreatores o controle é mais rigoroso sendo possível monitorar outros parâmetros como pH e a
concentração de oxigênio dissolvido (TAIT et al., 1986).
Dos poucos resultados publicados visando otimização em biorreator em batelada, o tempo
final de fermentação foi normalmente fixado. O objetivo foi maximizar o valor de algumas
variáveis de estado avaliadas no tempo final de fermentação, e as variáveis controladas foram
temperatura e pH do caldo de fermentação (CACIK et al., 2001).
O grande interesse de produção de goma xantana no país despertou o interesse no
desenvolvimento de pesquisas que melhorassem geneticamente as linhagens produtoras de
21
goma xantana, visando aumentar a sua produção e qualidade. Estudos dos genes responsáveis
pela síntese de goma xantana vêm sendo realizados há muitos anos, sempre tendo como enfoque
o processo de biossíntese da goma e os fatores que a relacionam com a virulência quando
infectam as plantas (PADILHA, 2003).
O conhecimento das vias biossintéticas, bem como de seus mecanismos de controle é
importante para aumentar a eficiência de conversão e a produtividade da fermentação, assim
como para alterar a massa molar e a composição molecular do polímero (PACE, 1991). A goma
xantana é o único biopolímero do qual se conhece a via metabólica e a enzima indutora do
processo, sendo que para os demais, esta via tem sido apenas sugerida (RODRIGUES, 1989
apud PADILHA, 1997; GIAVASIS et al., 2000; SÁ-CORREIA et al., 2002).
O caminho de biosíntese da xantana envolve três estágios: (i) conversão do açúcar
simples para derivados de nucleotídeos precursores, (ii) união de subunidades de
pentassacarídeos ligado à membrana interna portadora de fosfato poliprenol, com adição de
grupos acetil e piruvato, e (iii) polimerização das unidades repetidas de pentassacarídeos e
secreção do polímero (IELPI et al., 1993 apud SILVA et al., 2001).
Uma qualidade interessante na produção industrial de goma xantana é a versatilidade
nutricional da X. campestris, a qual pode utilizar diferentes substratos, porém com o
inconveniente da variação da massa molar da goma sintetizada, interferindo nas qualidades
reológicas e na qualidade do biopolímero sintetizado nestes meios (SUTHERLAND, 1993).
A industrialização e comercialização extensiva da xantana tiveram início a partir de
1964. Atualmente, os maiores produtores de goma são Merck, Kelko e Pfizer nos Estados
Unidos, Rhône-Poulenc, Mero-Rousselot-Satia e Sanofi-Elf, na França e Jungbunzlauer na
Áustria (GARCÍA-OCHOA, 2000; LIMA et al., 2001).
2.2.1 Substratos utilizados na produção de biopolímeros
A glicose e a sacarose são citadas na literatura como fontes preferenciais de carbono para
a produção de biopolímeros (SUTHERLAND, 2002), porém, algumas fontes alternativas têm
sido sugeridas, tais como melaço, resíduo da indústria de soja, soro de leite, casca de café e
bagaço de mandioca, água residual de moinho de azeitona, entre outros (LOPEZ et al., 2001;
NITSCHKE et al., 2001; WOICIECHOWSKI, 2001; KALOGIANNIS et al., 2003).
Utilizando meios alternativos em processos fermentativos, tais como resíduos
agroindustriais, é possível reduzir os custos de produção, além de minimizar problemas
22
ambientais, pois auxilia na destinação desses resíduos. Diversos trabalhos referentes à produção
de biopolímeros utilizam resíduos da agroindústria.
A produção de goma xantana em meios alternativos vem sendo estudada visando
melhorias no rendimento e na qualidade da goma produzida com diminuições expressivas nos
custos de produção. NITSCHKE et al. (2001) estudaram diferentes formulações de meio de
cultura a base de soro de queijo (integral, filtrado e hidrolisado) para a produção de goma
xantana pelo isolado X. campestris C7L e verificaram que essa linhagem demonstrou capacidade
de produzir goma com alta viscosidade em soro de queijo. Em um sistema combinando soro
integral e soro filtrado obtiveram um rendimento geral do processo de 55%.
O soro de queijo, resultante da fabricação de queijos vem sendo estudado como uma fonte
alternativa para a produção de goma xantana. A produção diária de soro de leite atinge
quantidades muito elevadas e seu descarte representa um sério problema ambiental. Possui alto
teor de lactose além de proteínas e sais minerais, constituindo um meio de cultura rico e de fácil
obtenção (STAUFFER e LEEDER, 1978 apud NITSCHKE et al., 2001).
ANTUNES et al. (2000a) estudaram a relação entre viscosidade e composição química
da goma xantana sintetizada por X. campestris pv pruni cepa 06 em meios convencionais MPI,
composto por 1,5 g.L-1 NH4H2PO4; 2,5 g.L-1 K2HPO4; 0,6 g.L-1 MgSO4.7H2O; 2,0 g.L-1 ácido
cítrico; 5,0 g.L-1 KH2PO4; 0,006 g.L-1 Bo3; 2,0 g.L-1 (NH4)2SO4; 0,0024 g.L-1 FeCl3; 0,002 g.L-1
ZnSO4 e 50 g.L-1 de sacarose, e MPII composto por 1,5 g.L-1 NH4H2PO4; 2,5 g.L-1 K2HPO4; 0,2
g.L-1 MgSO4.7H2O e 50 g.L-1 de sacarose, e em meios alternativos como soro de queijo
adicionado de sacarose , soro de queijo adicionado de sacarose e sais e farelo de arroz e soro de
queijo adicionado de sais, sacarose e farelo de trigo. Esses autores verificaram que em meios
convencionais a goma xantana produzida possui qualidade superior à goma sintetizada em meio
de soro de queijo em relação à viscosidade.
A produção de goma xantana a partir de um meio otimizado composto de 175 g.L-1 de
melaço, 4 g.L-1 de K2HPO4 e um pH inicial neutro foi estudada por KALOGIANNIS et al.
(2003). Seus resultados indicaram que o K2HPO4 serve como um agente tamponante e também
como um nutriente para o crescimento da X. campestris e ainda, que o melaço de açúcar de
beterraba parece ser um substrato industrial adequado para fermentações desta goma.
Segundo WOICIECHOWSKI (2001) hidrolisados de casca de café pré-tratados ou não,
bem como hidrolisados de bagaço de mandioca suplementados com várias fontes de nitrogênio,
são substratos viáveis para a produção de goma xantana por fermentação com X. campestris. A
melhor produção de xantana foi obtida com o uso de nitrato de potássio como fonte de
nitrogênio, com um fator de conversão de substrato em produto da ordem de 75%.
23
Resíduo de grão de soja, um subproduto da indústria de molho de soja, quando utilizado
como fonte de nitrogênio e glicose como fonte de carbono, na produção de goma gelana,
apresentou uma produção maior de goma (7,5 gL-1) do que em meio convencional que continha
peptona e nitrato de amônio como fontes de nitrogênio. A caracterização deste resíduo mostra
valores de 17,2% de carboidratos e 33,4% de proteína (JIN et al. 2003).
BAE e SHODA (2004) pesquisaram a produção de celulose bacteriana por Acetobacter
xylinum BPR 2001, usando melaço como fonte de carbono, em processos em batelada e batelada
alimentada. Para melhorar a produção de celulose bacteriana, utilizaram o melaço pré-tratado
com calor e ácido sulfúrico, obtendo um aumento na concentração de polímero de 76% quando
comparado com a produção obtida com melaço que não passou por pré-tratamento.
O maior rendimento de pululana produzido por levedura, 5,9% em 60 horas, 28ºC, 180
rpm, foi obtido por CHI e ZHAO (2003), utilizando glicose (8% p/v), hidrolisado de torta de
soja (2% p/v), além de sais de potássio, magnésio, sódio e amônio, pH 7,0.
Sabe-se que os meios industriais utilizados para a produção de polissacarídeos são
bastante complexos e alguns de seus componentes podem ser responsáveis pela inibição da
produção destes, ou ainda, dificultar sua posterior recuperação e purificação (TREICHEL,
2004). Entretanto, contaminantes como metais pesados e inibidores específicos são removidos
parcialmente com pré-tratamentos (STOPPOCK e BUCCHOLZ, 1996 apud KALOGIANNIS et
al., 2003). Estes pré-tratamentos clarificam o meio sem provocar prejuízos na fermentação,
garantindo maior facilidade na extração e purificação de bioprodutos, como mostrado nos
trabalhos de TREICHEL (2004) e BAE e SHODA (2004).
2.2.1.1 Soro de Queijo
O soro de queijo é um líquido opaco, amarelo-esverdeado, resultante da precipitação de
gorduras e caseína do leite durante a fabricação de queijos. Contém cerca de 55% dos sólidos
existentes no leite integral original e representa cerca de 80% a 90% do volume de leite
utilizado na fabricação de queijo (ANDRADE e MARTINS, 2002). É o maior subproduto da
indústria leiteira e é caracterizado por elevados valores de DBO (Demanda Bioquímica de
Oxigênio), na faixa de 30-60kg/m3. Seu descarte diretamente em rios ou esgotos públicos
atualmente não é permitido, mas em média, cada tonelada de soro não tratado despejado por dia
24
no sistema de tratamento de esgoto equivale à poluição diária de cerca de 470 pessoas
(HATZINIKOLAOU et al., 2005).
Por se tratar de um produto com alta percentagem de água inviabiliza economicamente
sua desidratação, e o fato de ser perecível agrava o problema, impossibilitando seu
armazenamento prolongado, direcionando as pesquisas a seu aproveitamento na produção de
biogás, etanol, proteínas concentradas, além de produção de fermento de panificação e
antibióticos (ALMEIDA, et al., 2001).
As aplicações do soro são inúmeras, englobando as indústrias de lácteos, carnes, misturas
secas (para condimentar), panificação, chocolate, aperitivos, bebidas, entre outras. Nos Estados
Unidos 90% do soro, quando transformado em pó, é destinado à alimentação humana, o que em
2001 representou mais de 500.000 toneladas (CNPGL/EMBRAPA, 2002).
Ainda assim,
aproximadamente 50% do soro mundialmente produzido já se encontra industrializado. Uma
parcela é comercializada como fonte energética e nutritiva sob a forma de pó, pois o mesmo
retém aproximadamente 75% dos nutrientes do leite, além de ser responsável por uma parcela
que varia entre 80 a 90% de sua composição total (ALMEIDA et al., 2001).
No Brasil o soro de queijo ainda é considerado um produto de qualidade inferior e de
pouca importância sob o ponto de vista nutritivo. O RIISPOA (Regulamento de Inspeção
Industrial e Sanitária dos Produtos de Origem Animal – Decreto 30.691/52) considera o soro de
queijo como um produto para alimentação animal (CNPGL/EMBRAPA, 2002).
O Brasil é o sexto maior produtor mundial de leite bovino, com uma taxa anual de
aumento da produção na faixa de 4%. Cerca de 35% da produção é destinada à fabricação de
queijos, onde as maiores produções são de queijo mussarela, prato e minas frescal (FARRO e
VIOTTO, 2003).
A Tabela 1 apresenta a composição centesimal média do soro de queijo, subproduto
utilizado como substrato no presente estudo.
O principal problema encontrado na produção de goma xantana a partir de soro de queijo
é a baixa capacidade de utilização da lactose pela X. campestris, fato esse que se deve pouca
expressão da enzima β-galactosidase da bactéria (NITSCHKE et al., 2001).
As β-galactosidases, popularmente conhecidas como lactases e classificadas como
hidrolases, são responsáveis por catalisar o resíduo terminal β-galactopiranosil da lactose para
formar glicose e galactose, obtendo assim, alimentos com baixos teores de lactose. As βgalactosidases podem ser encontradas na natureza, distribuídas entre vegetais, em órgãos
animais e também são produzidas por grande quantidade de microrganismos, tais como fungos
25
filamentosos, bactérias e leveduras, sendo as leveduras e fungos as fontes preferidas destas
enzimas para aplicações comerciais (SANTIAGO et al., 2004).
Em decorrência de a X. campestris ser um microrganismo lactose negativo, ANTUNES et
al. (2000a) acrescentou outra fonte de carbono ao meio de soro de queijo, que foi a adição de
farelo de arroz e trigo que visou elevar a quantidade de carbono e micronutrientes. NITSCHKE
et al. (2001) utilizaram glicose e galactose concomitantemente e verificaram que não houve
preferência do microrganismo por um destes açúcares, já a lactose residual foi consumida mais
lentamente.
Tabela 1. Composição centesimal média do soro de queijo.
Componentes
Quantidade
Água (%)
93,39 ± 0,44
Gordura (%)
0,43 ± 0,19
Proteína (%)
0,78 ± 0,25
Lactose (%)
4,90 ± 0,11
Minerais (%)
1,59 ± 0,02
Sódio (%)
0,13
Potássio (%)
0,14
Cálcio (%)
0,12
Fósforo (%)
0,10
Nitrato (ppm)
45
Ferro (ppm)
1
Fonte: Franco (1982); Farro e Viotto (2003)
Ao adicionar glicose ao meio contendo soro de queijo, SCHAWARTZ e BODIE (1986)
verificaram que a lactose deixava de ser utilizada pela bactéria X. campestris.
Devido às características nutricionais do soro de queijo e sua abundância no Brasil,
pesquisas que visem à utilização desse subproduto são de fundamental importância.
Pesquisas mostram a utilização de soro de queijo como meio básico para vários processos
fermentativos, como produção de etanol, metano e goma xantana (FU et al., apud
HATZINIKOLAOU et al., 2005).
GOLLO (2006) trabalhou com meio à base de soro de queijo mussarela avaliando a
influencia da adição de sais ao meio na produção de goma xantana. Bons resultados foram
26
encontrados, demonstrando que a bactéria tem a capacidade de utilizar a lactose presente no
meio.
2.3 RECUPERAÇÃO DE BIOPOLÍMEROS
As etapas de recuperação da goma xantana envolvem remoção de células microbianas,
precipitação do biopolímero, secagem e moagem. O método específico de purificação a ser
utilizado é determinado pelo uso final do polissacarídeo (GALINDO, 1994).
O caldo pode ser esterilizado, após a fermentação, para eliminação das células e para
melhorar as características da goma em solução. Uma vez as células eliminadas, a precipitação
da goma xantana é feita com álcool ou sais quaternários de amônio ou separada por
ultrafiltração (MAUGERI, 2001; LIMA et al., 2001).
O processo de recuperação de goma xantana apresentado por GARCÍA-OCHOA et al.
(2000) envolve etapas de: desativação ou lise das células, através de processos químicos,
mecânicos ou térmicos; remoção das células por filtração; recuperação do polímero por
precipitação com solventes orgânicos (etanol, álcool isopropílico, misturas de sais e álcool);
separação do precipitado e do solvente, sendo o precipitado lavado várias vezes com o solvente
que é evaporado posteriormente; secagem do biopolímero em secadores contínuos ou em
batelada, a vácuo ou com circulação forçada de gás inerte.
As células podem ser eliminadas fisicamente através de centrifugação (GIAVASIS et al.,
2000; MOREIRA et al., 2003; CHI e ZHAO, 2003; NAMPOOTHIRI et al., 2003; BOZA et al.,
2004) ou filtração (KANG et al., 1982; GIAVASIS et al., 2000). Métodos químicos ou
enzimáticos podem ser usados como alternativa, complementados com operações posteriores de
purificação/ concentração (PACE, 1991; GARCÍA-OCHOA et al., 2000).
Os polímeros são recuperados por centrifugação e precipitados preferencialmente com
solventes orgânicos solúveis em água como álcool ou acetona (KANG et al., 1982; MARTINS e
SÁ-CORREIA, 1993; GIAVASIS et al., 2000; NAMPOOTHIRI et al., 2003; MOREIRA et al.,
2003; CHI e ZHAO, 2003; BOZA et al., 2004). A quantidade de solvente necessário para a
completa precipitação depende da força iônica e da composição do polímero apesar de não
depender de sua concentração. A precipitação com solventes também resulta em purificação
parcial do polímero por eliminação dos componentes solúveis no solvente (PACE, 1991).
27
Como métodos alternativos de recuperação primária do polímero, a literatura cita a
precipitação seletiva com detergentes catiônicos e ainda a produção de uma forma insolúvel de
polímero por adição de certos sais ou por ajuste de pH (PACE, 1991; GARCÍA-OCHOA et al.,
2000; DRUZIAN, 2000).
Os polímeros precipitados são purificados e secos em estufa, a baixas temperaturas
(MOREIRA et al., 2003) ou liofilizados (GIAVASIS et al., 2000) e, então armazenados ou
preparados para as análises subseqüentes de determinação da estrutura e reologia. A purificação
dos EPS pode ser feita por sucessivas diálises contra água deionizada (CHI e ZHAO, 2003), ou
com detergentes catiônicos, pelo uso de métodos cromatográficos ou ainda com agentes
químicos ou enzimas que interagem de forma específica com certos grupos (DRUZIAN, 2000).
Segundo PACE (1991) a secagem rápida a altas temperaturas pode resultar em um
produto com baixa solubilidade ou com reologia pobre em solução. Porém, o aquecimento
controlado da goma xantana pode resultar em um produto com melhor reologia em solução.
O polímero depois de seco pode ser moído, algumas gomas comerciais são diferenciadas
por tamanho de partículas. Deve-se ter em conta que na moagem o calor gerado não degrade ou
possa descolorir o produto (GARCÍA-OCHOA et al., 2000).
2.4 TOXICIDADE E APLICAÇÕES DA GOMA XANTANA
Os aspectos toxicológicos e de segurança da goma xantana foram investigadas
intensamente para determinar sua aplicação em alimentos e fármacos. A goma xantana é um
produto atóxico, não provoca sensibilização nem irritação na pele ou nos olhos (GARCÍAOCHOA et al., 2000).
Os biopolímeros bacterianos, em razão de sua origem, para serem utilizados em produtos
para consumo humano devem, além de ter a aprovação prévia dos órgãos competentes, passar
por rigoroso controle de qualidade (MOREIRA et al., 1998). A Food and Drug Administration
(FDA) dos EUA aprovou em 1969 o uso da goma xantana como aditivo em alimentos. Em 1980
a xantana foi agregada à lista de emulsificantes/estabilizantes alimentícios permitidos pela
comunidade econômica européia (MORRIS, 1984).
O uso de hidrocolóides em muitas áreas industriais tem aumentado significativamente. A
xantana é o polímero de maior importância econômica e sujeito de numerosos estudos
(MOREIRA et al., 2001).
28
A goma xantana tem sido empregada numa variedade de produtos alimentícios devido às
suas características, incluindo a estabilização de emulsões, estabilidade térmica, compatibilidade
com ingredientes alimentícios e suas propriedades reológicas (GARCÍA-OCHOA et al., 2000).
Ela encontra aplicações em molhos prontos (French dressings), alimentos congelados, suco de
frutas e coquetéis, sobremesas instantâneas, produtos cárneos, etc. Fora da indústria de
alimentos incluem-se aplicações como agente de suspensão e espessante em pasta de dentes,
desodorantes em forma de géis, impressão em tecidos, suspensão de compostos químicos de uso
agrícola e aumento na recuperação de petróleo (LIMA et al., 2001; MAUGERI, 2001).
Gomas e estabilizantes são incorporados na formulação de diversos alimentos. Em
particular, eles são usados para oferecer resistência a um processo físico indesejado como
cristalização, sedimentação gravitacional e desagregação mecânica que podem ocorrer durante a
distribuição ou estocagem (MARCOTTE et al., 2001).
Resistência e estabilidade ao congelamento-descongelamento, capacidade espessante,
facilidade de cozimento, aderência proveitosa, aumento na penetração de calor e outros efeitos
positivos, são reconhecidos quando certos polissacarídeos são misturados e aplicados.
Diferentes combinações de polissacarídeos estão sendo aplicadas em pastas de amido, géis,
produtos processados de amido, bebidas, produtos lácteos, emulsificados e cremosos, carnes e
outros produtos (SOKORA et al., 2006).
A obtenção de biopolímeros para o consumo humano é uma tarefa mais complexa do
que para a utilização em outros produtos, uma vez que devem ser considerados seguros do ponto
de vista alimentar e, portanto, satisfazer os severos códigos e legislações alimentares,
atualmente em vigor. Uma amostra disso é que, apesar da pesquisa em polímeros produzidos
por microrganismos ter sido iniciada há mais de três décadas, poucos biopolímeros foram
aprovados para uso alimentar nos EUA (PORTILHO, 2002).
2.5 MODELAGEM MATEMÁTICA DE BIOPROCESSOS
O objetivo da engenharia bioquímica é o desenvolvimento de métodos para melhorar a
capacidade metabólica de microorganismos industrialmente relevantes. Para alcançar este
objetivo é necessário fazer uso de processos de manipulação genética do metabolismo celular e
melhorar as condições de operação do processo. Dentro de uma perspectiva de engenharia, o
desenvolvimento de modelos matemáticos é uma das mais poderosas ferramentas científicas
disponíveis para estas tarefas (WIECHERT et al., 2002).
29
Com o desenvolvimento científico e industrial de modernos bioprocessos, melhores
métodos de medidas, monitoramento e modelagem tornam-se necessários, com o objetivo de
gerar informações mais detalhadas sobre o processo, melhorando o controle e o entendimento
do mesmo (MANDENIUS et al., 2004). Nos processos biológicos ao menos duas características
são bem distinguíveis: o meio de cultivo e a biomassa. As propriedades das células individuais
são determinadas pelos mecanismos de transporte da membrana extracelular, a qual separa o
meio extracelular do interior das células, e pelos mecanismos de transportes das membranas
intracelulares, as quais são responsáveis pelo metabolismo celular. O metabolismo intracelular é
caracterizado por um grande número de etapas de reações reguladas por enzimas intracelulares
(HAAG et al., 2005).
Em contraste com a alta complexidade do metabolismo celular, modelos matemáticos
simples têm sido desenvolvidos, baseados, principalmente, em observações experimentais
descrevendo os fenômenos, tais como: limitação, ativação, inibição, saturação, consumo de
múltiplos substratos, gargalos do processo, múltiplos estados estacionários. Estes modelos são
geralmente válidos para uma limitada, mas freqüentemente ampla faixa de condições
operacionais. O nível de complexidade da descrição matemática do sistema depende da
aplicação. Se a proposta de controle do sistema é manter o mesmo com pequenas perturbações
em torno de um valor constante, geralmente o uso de um modelo linear é suficiente. Porém,
mudanças nesse valor de referência necessitariam a derivação de um novo modelo. Em outras
aplicações, como no controle de um processo dinâmico, onde há um grande número de
condições operacionais, é necessária a formulação de um modelo não linear mais abrangente.
Muito freqüentemente, as propriedades do sistema, tais como constantes de Michaelis ou
taxas de reações, não são conhecidas quantitativamente nem qualitativamente. Nesses casos,
uma abordagem matemática flexível e sistemática é requerida para encontrar as características
do processo. Por outro lado, o modelo deve ser suficientemente geral, com um conjunto de
parâmetros capaz de representar bem o fenômeno observado. No entanto, o modelo não deve ter
um número excessivo de parâmetros, o que facilita o ajuste aos dados experimentais, porém não
confere ao mesmo uma característica geral (HAAG et. al, 2005). Um modelo deve ser sempre o
mais simples possível e tão complexo quanto o necessário. A complexidade de um modelo
crescerá se a abrangência e a eficiência são estendidas. Assim, a complexidade do modelo
sempre estará relacionada com o problema a ser resolvido (WIECHERT, 2002).
Segundo VOLESKY e VOTRUBA (1991) a análise do sistema é um método básico para
a descrição de fenômenos complexos e interações entre variáveis observadas do processo sob
30
estudo. Na prática, para um sistema fermentativo, a análise do processo é representada pelas
seguintes etapas:
•
Especificação matemática do problema para dadas condições físico-químicas,
bioquímicas e fisiológicas;
•
Desenvolvimento de estratégias detalhadas resultando na obtenção de adequados
modelos matemáticos representando o processo;
•
Síntese dos resultados e projeto das estratégias de otimização para o controle do
processo.
No desenvolvimento de modelos matemáticos de bioprocessos devem-se especificar
alguns itens que necessitam serem identificados para melhorar a precisão e qualidade dos
modelos, tais como (WIECHERT, 2002):
•
Compreensão estrutural: Modelos matemáticos devem fornecer todas as informações
para que se possa conhecer o comportamento do processo, principalmente, partes
essenciais do sistema;
•
Simulação: A maior aplicação dos modelos é a exploração do possível comportamento
do sistema. A simulação do processo pode levar ao correto entendimento do
comportamento do processo, eliminando hipóteses que possam reproduzir resultados
ruins;
•
Análise do sistema: Baseado num dado modelo matemático é possível obter informações
da estrutura do sistema e seu comportamento qualitativo;
•
Predição e Projeto: Baseado num modelo validado, experimentos futuros podem ser
previstos sem a realização dos mesmos. O objetivo desta ferramenta é fornecer
embasamento para um projeto racional e eficiente do bioprocesso;
•
Otimização: Uma vez que os modelos são preditivos e estão disponíveis, o último
objetivo da engenharia bioquímica é o cálculo de um projeto metabólico ótimo.
2.6 MODELOS CINÉTICOS DE CRESCIMENTO MICROBIANO
O desenvolvimento de um modelo matemático de um processo fermentativo
normalmente inicia a partir de um simplificado esquema de reações advindas do conhecimento
das rotas metabólicas envolvidas. Cada etapa da reação metabólica é caracterizada pela reação
estequiométrica ou pelo fluxo, representada pela velocidade de reação ou pela taxa. As taxas de
31
reações em bioprocessos são aproximadas por relações originadas da teoria enzimática ou
reações químicas (VOLESKY e VOTRUBA, 1991).
Na literatura são reportados diversos modelos de crescimento microbianos não
estruturados e não segregados, ou seja, que consideram uma população homogênea de células
com propriedades médias. Os modelos cinéticos não estruturados são equações matemáticas
propostas para representar a velocidade específica de crescimento (µ), dispondo de poucas
informações a cerca do metabolismo microbiano. De uma maneira geral, os modelos cinéticos
são funções da concentração de substrato limitante. No entanto, alguns modelos propostos
levam em conta a concentração de células dentro do biorreator, concentração de produto e
concentração de inibidor (VOLESKY e VOTRUBA, 1991).
Os modelos cinéticos de crescimento microbiano são divididos em três grandes grupos:
único substrato limitante, inibição por substrato e inibição por produto. Dependendo das
condições operacionais, do microorganismo, e da forma de operação do bioprocesso, um ou
outro modelo apresenta um melhor desempenho. No entanto, é necessário investigar qual o
melhor modelo para representar o processo em estudo, uma vez que existem inúmeros modelos
não estruturados. Muitos trabalhos publicados têm por objetivo selecionar o melhor modelo
cinético.
BIROL et al. (1998), trabalhando com a produção de etanol a partir de fermentação de
glicose em processo batelada através de células imobilizadas de Saccharomyces cerevisiae,
testou onze modelos diferentes encontrados na literatura para cultivo com células suspensas
livres e a aplicabilidade destes modelos para cultivos com leveduras imobilizadas. Os autores
verificaram que os modelos de Monod e de Hinshelwood foram os mais apropriados para
descrever o comportamento do crescimento microbiano em concentrações de glicose inicial de 8
a 10%.
ZELIC et al. (2004) investigaram a influência de 10 modelos cinéticos não estruturados
no ajuste do crescimento celular, consumo de substrato e formação de piruvato através de
Escherichia coli YYC202 em biorreator batelada alimentada. O modelo que melhor descreveu o
processo levava em conta a inibição pela formação de produto.
BURHAN et al. (2005), objetivando aumentar a escala de produção da enzima
ciclodextrina-glucanotransferase (CGTase), determinaram o modelo cinético que melhor
representasse o processo. Foram investigados dois modelos cinéticos com inibição pelo
substrato: modelo de Andrews e modelo de Aiba. Os resultados apresentados mostraram que o
modelo de Andrews melhor representa os dados experimentais, sendo escolhido como o modelo
cinético do processo de produção da CGTase.
32
2.7 ESTIMAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS
A otimização matemática pode ser usada como uma ferramenta computacional que
surgiu para encontrar a melhor solução para um dado problema num caminho sistemático e
eficiente (MOLES et al., 2003). A otimização de processos é uma das áreas da engenharia que
mais cresce, devido ao seu grande impacto de mercado, tanto para indústrias quanto para centros
de pesquisas. A principal razão que motiva o emprego das técnicas de otimização é o fato que
muitos problemas apresentam muitas soluções e, portanto, é muito difícil encontrar a melhor
solução (BIEGLER e GROSSMANN, 2004a). No contexto de sistemas bioquímicos, o
acoplamento da otimização com módulos de simulação abre muitas possibilidades. As duas
principais aplicações das ferramentas de otimização podem ser descritas como (MOLES et al.,
2003):
•
Resolução de problemas de projeto: como melhorar uma rota metabólica de forma que
maximize a produção de um determinado produto de interesse e minimize a produção de
produtos indesejáveis;
•
Estimação de parâmetros: Dado um conjunto de dados experimentais, ajustar o modelo
de tal forma que reproduza os resultados da melhor maneira possível.
A otimização contínua, de variáveis ou de parâmetros, é apresentada na seguinte forma
geral (BIEGLER e GROSSMANN, 2004a):
Minimizar à F(x), sujeita à:
h( x) = 0
g ( x) ≤ 0
(II.1)
Em engenharia bioquímica, os problemas de otimização normalmente trabalham com
funções não convexas e com múltiplos estados estacionários. A estimação de parâmetros
cinéticos de modelos biológicos é geralmente muito complexa, principalmente devido a nãolinearidade do sistema, grande número de parâmetros e interações entre eles, além do pouco
conhecimento inicial sobre os coeficientes estequiométricos (RIVERA et al., 2006). Uma
abordagem sistemática é necessária para encontrar a melhor estrutura do modelo e o melhor
conjunto de valores para os parâmetros desse modelo, com relação a algumas restrições (HAAG
et al., 2005).
A estimação de parâmetros de sistemas dinâmicos não lineares está baseada na
minimização da FO, a qual determina o quão bom esta o ajuste do modelo em relação aos dados
experimentais, sujeita as restrições da dinâmica do sistema (conjunto de equações diferenciais) e
33
a outras restrições (equações algébricas). Matematicamente, a formulação do problema de
estimação de parâmetros pode ser definida como (MOLES et al., 2003):
Encontrar p que minimize:
J = ∫ (y exp (t ) − y (p, t ) ) W (t )(y exp (t ) − y (p, t ) )dt
tf
T
0
(II.2)
Sujeita à:
f (z, y, p, t ) = 0
(II.3)
y (t 0 ) = y 0
(II.4)
h( z , y , p) = 0
(II.5)
g (z , y , p) ≤ 0
(II.6)
p L ≤ p ≤ pU
(II.7)
onde J é a FO a ser minimizada, p é o vetor dos parâmetros a serem estimados, yexp é o vetor dos
dados experimentais, y(p, t) é o vetor das variáveis de estado calculados pelo modelo, z é o
vetor diferencial das variáveis de estado, f é o conjunto de equações diferencias e algébricas
descrevendo a dinâmica do sistema e h e g são as restrições de igualdade e desigualdade que
estão relacionadas com restrições de rota metabólica ou restrições físicas. Finalmente, p é
mantido dentro de um limite inferior e superior, pL e pU, respectivamente.
A formulação acima com restrições algébrico-diferenciais forma um problema de
programação não linear. Devido a esta natureza não linear e restrita da dinâmica do sistema,
estes problemas apresentam com freqüência mínimos locais, apresentado uma FO não convexa.
Dessa forma, a resolução desse problema através de métodos locais, provavelmente, a solução
encontrada será de natureza local (MOLES et al., 2003). Uma solução para esse impasse é o
emprego de métodos globais para a resolução desse problema, os quais foram amplamente
estudados a partir dos anos 90. Muitos trabalhos publicados retratam as inúmeras vantagens
desses métodos em relação aos métodos de otimização local.
Métodos de otimização global podem ser classificados em dois grandes grupos:
determinísticos e estocásticos. Métodos estocásticos trabalham com uma abordagem
probabilística, ou seja, há o envolvimento de elementos aleatórios, estes métodos somente têm
uma garantia teórica de convergência para a solução global (MOLES et al., 2003; BIEGLER e
GROSSMANN, 2004b). A principal vantagem dos métodos estocásticos é a facilidade de
implementação e são muito usados em problemas onde há poucas avaliações da FO. Soluções
refinadas requerem um alto custo computacional (BANGA et al., 2005). Uma vasta revisão
34
bibliográfica contemplando os métodos estocásticos pode ser encontrada em SCHWAAB
(2005).
Métodos determinísticos são aqueles que provém um nível de garantia que o ótimo
global será encontrado. Estes métodos apresentaram avanços importantes em certos tipos de
problemas de otimização global. Porém, deve ser notado que, apesar dos métodos
determinísticos poderem garantir encontrar o ótimo global de alguns tipos de problemas, o
esforço computacional associado aumenta rapidamente (freqüentemente exponencialmente)
com o tamanho do problema, tornando difícil a sua utilização prática e o seu fácil entendimento
dentro da indústria (MOLES et al., 2003).
Entre as técnicas estocásticas de otimização global, o método de Simulated Annealing
(SA) é, talvez, o mais empregado para uma ampla faixa de aplicação nas mais diferentes
disciplinas (GENOVESE et al., 20005). O SA é um método de busca direto que pode ser
conectado a pacotes de simulação disponíveis. Assim, a otimização pode ser realizada ao longo
de sucessivas simulações. O SA tem sido empregado no projeto e controle de processos
químicos, biológicos e alimentícios, mas sua integração com softwares comerciais ainda não foi
reportada na literatura (LI et al., 2000).
O método do SA foi desenvolvido em 1980 por KIRKPATRICK et al. (1983) e é
consideravelmente mais simples que abordagens baseadas no gradiente. Particularmente, o SA
tem um número de abordagens promissoras (FABER et al., 2005; LI et al., 2000):
•
O algoritmo somente usa o valor da função objetivo, sem o uso de derivadas;
•
O algoritmo tem um grande potencial de encontrar o ótimo global;
•
Sua complexidade é baixa;
•
O método não é afetado pela descontinuidade do modelo.
FABER et al. (2005) apresentam dois estudos de caso da aplicação do SA na otimização
de processos. No primeiro estudo de caso é apresentada a otimização dinâmica de um reator
batelada visando maximizar a produção de um produto B qualquer. Os resultados mostraram
que o SA encontra o mínimo global com um número menor de iterações, quando comparado
com os métodos determinísticos.
KOOKOS (2004) usou o simulated annealing para encontrar o perfil ótimo da vazão de
alimentação num biorreator batelada alimentada para a produção de etanol. Além disso,
apresenta a possibilidade de utilizar o SA para maximizar o potencial econômico da produção
de penicilina. No primeiro caso os resultados obtidos foram significativamente melhores que os
35
reportados na literatura. No segundo caso o SA exibiu uma excelente robustez e a solução foi
facilmente encontrada apesar da complexidade da função objetivo.
No trabalho de LI et al., (2000) o SA foi acoplado a uma rotina de simulação de
processos para determinar a operação ótima de uma coluna de destilação de uma solução
binária. O desenvolvimento desta abordagem permitiu a predição da taxa de refluxo
minimizando o tempo de operação para a recuperação do produto.
O uso do SA em bioprocessos está restrito basicamente à determinação do perfil ótimo
de alimentação em biorreatores operando no modo batelada alimentada. No entanto, há uma
carência muito grande do emprego do SA para a otimização de parâmetros cinéticos do sistema
de equações algébrico diferencial em processos biológicos.
O simulated annealing pode ser usado para otimizar problemas que envolvem equações
algébrico-diferenciais (DAE) na forma de (II.2-II.7) se algumas etapas forem entendidas. Um
algoritmo para a resolução de DAE deve ser acoplado ao SA, com as variáveis de controle
necessitando serem discretizadas e os limites e as restrições de desigualdade necessitando serem
implementadas (FABER et al., 2005).
2.8 REDES NEURAIS
A aplicação de redes neurais na modelagem e controle de processos vem aumentando
muito nos últimos anos. Seu uso é especialmente útil na modelagem de sistemas complexos ou
que apresentam alguma incerteza quanto à cinética ou parâmetros do modelo. Em indústrias
químicas e alimentícias, modelos não lineares são requeridos para controle, otimização e
predição do comportamento de processos. O desenvolvimento desses modelos é uma tarefa
difícil, principalmente quando o processo é muito complexo ou quando o mesmo é pouco
compreendido. A maior vantagem em elaborar um modelo matemático com redes neurais
artificiais reside no fato que sua síntese não requer o conhecimento detalhado do processo.
Tipicamente, o principal objetivo em desenvolver modelos com redes neurais é o de predizer de
forma confiável comportamentos transientes e permanentes, de forma a monitorar e melhorar a
performance do processo (SIMÕES, 2001).
Redes neurais são métodos matemáticos baseados na estrutura neurológica do cérebro
utilizada para criar modelos de entrada/saída do tipo “caixa preta”. Trata-se, portanto de uma
técnica de inteligência artificial, cuja característica é o “aprendizado” de uma lógica existente
num determinado conjunto de dados e com isso ser capaz de predizer valores diferentes
36
daqueles utilizados para o treinamento da rede (SIMÕES, 2001). Os modelos são construídos
juntando-se várias funções em camadas ou níveis. Estas funções são chamadas de neurônios e
são funções não lineares da combinação linear de entradas (SALAS, 2003).
Cada função ou neurônio tem vários parâmetros que necessitam serem ajustados, para
que a rede possa representar devidamente o modelo. O ajuste destes parâmetros é feito
treinando-se a rede neural com dados de entrada e saída do sistema a ser modelado. Os
parâmetros são ajustados de modo a reproduzir o sistema a ser modelado, utilizando-se uma
técnica de otimização que tem como variáveis independentes os parâmetros e, como função
objetivo, a minimização do erro entre o valor de saída medido do sistema e o valor calculado
pela rede (SALAS, 2003).
Uma vez atendidos os critérios para o ajuste dos parâmetros, o modelo reproduzirá o
comportamento do sistema. No entanto, ressalta-se que a falta de condições para a extrapolação
dos dados é uma das principais desvantagens da utilização de redes neurais (SALAS, 2003).
Na definição da arquitetura do modelo podem ser utilizados três tipos de ligações entre
neurônios: ligações entre neurônios de uma mesma camada; ligações entre neurônios de
camadas diferentes e ligações recorrentes do próprio neurônio. A arquitetura da rede mais
utilizada para modelagem de processos químicos, alimentícios e biotecnológicos é a do tipo
feedforward, com conexão de neurônios de um nível anterior para o posterior. Uma rede neural
típica apresenta três camadas de neurônios: camada de entrada (input), intermediária (hidden) e
de saída (output). A Figura 2 apresenta um diagrama esquemático de uma arquitetura de rede do
tipo feedforward com 3 entradas, 4 neurônios na camada intermediária e 3 saídas (SALAS,
2003).
37
Figura 2. Estrutura de uma rede neural do tipo feedforward
As redes neurais encontraram nos processos biotecnológicos uma vasta área de atuação,
devido à dinâmica altamente complexa e não linear. LINKO et al. (1997) usaram três diferentes
funções de transferência na estimação da atividade de lipase. Com a tangente hiperbólica como
função de transferência e variando o número de neurônios na camada intermediária de 5 – 9
houve pouca diferença nos resultados; com uma função sigmoidal mono-polar, 5 neurônios
apresentaram melhor efeito; com uma função sigmoidal bipolar 9 neurônios apresentou
melhores resultados. No entanto, o R2 foi próximo a 0,9 em todos os casos.
YE et al. (1994) usaram uma rede neural com 5 camadas em combinação com controle
fuzzy feedforward-feedback de um biorreator batelada alimentada contendo Escherichia coli
para a produção de β-galactosidade. A mudança no pH do meio de cultura e o crescimento
específico foram usados com entrada para a rede neural fuzzy calcular a taxa de alimentação de
glicose.
BAS et al. (2007a) descreveram a aplicação de redes neurais para a determinação da
cinética de reações enzimáticas e estimar constantes cinéticas. Uma reação enzimática modelo, a
hidrólise da maltose catalisada pela amiloglucosidade, foi realizada num reator batelada. As
redes neurais foram treinadas com dados de sete cinéticas e a validação foi realizada com 8
cinéticas. Os resultados obtidos mostraram que as redes neurais foram eficientes na estimação
de parâmetros, apresentando melhores resultados em comparação com o método convencional.
BAS et al. (2007b) usaram redes neurais para estimar a taxa de reação enzimática sem a
38
existência de um modelo cinético. O estudo foi realizado no mesmo sistema descrito acima. A
rede neural usada foi do tipo feedforward com três entradas, 4 neurônios na camada interna e
uma saída. Os resultados obtidos mostraram boa eficiência das redes na regressão dos dados
experimentais, apresentando um coeficiente de regressão superior a 0,90 para todas as cinéticas.
DESAI et al. (2005) usaram redes neurais para modelar o crescimento de Sacharomyces
cerevisiae e a produção de β-glucano. As entradas para a rede foram: concentração de glicose,
peptona, extrato de levedura, extrato de malte, Mn2+ e Mg2+. O erro encontrado entre os valores
preditos e experimentais foi inferior a 5% para as duas variáveis de estado.
2.9 MODELOS HÍBRIDOS
Genericamente, um modelo fenomenológico pode ser uma ferramenta poderosa devido a
sua ampla faixa de aplicabilidade. Contudo, a necessidade de estimar um grande número de
parâmetros e resolver complexos sistemas de equações constitui uma grande desvantagem na
sua aplicação (SIMÕES, 2001).
O modelo híbrido busca superar as desvantagens apresentadas nos modelos
fenomenológicos e puramente empíricos. A modelagem híbrida visa à fusão de todo o
conhecimento do processo com a metodologia das redes neurais. O conhecimento pobre ou
desconhecimento de propriedades do processo, como cinéticas reacionais, podem ser
minimizados, ou superados, com a adição de metodologias de inteligência artificial, como as
redes neurais (SIMÕES, 2001).
A inclusão prévia do conhecimento é investigada como uma maneira de melhorar as
predições da rede. O conhecimento prévio do sistema, nesse caso, são as equações do balanço
dos fenômenos que se quer representar. A utilização desse modelo fenomenológico, juntamente
com uma rede neural, ajuda a controlar a precisão dos resultados dentro da faixa de
aceitabilidade de treinamento da rede. De acordo com a literatura, a utilização de conhecimentos
prévios aumenta a capacidade de generalização do modelo puramente neural. Sabe-se ainda que
a modelagem híbrida necessita de menos dados para a estimativa de parâmetros, produz
predições mais consistentes e precisas, além de fornecer predições mais realísticas (SIMÕES,
2001).
ZORZETTO et al. (2000) apresentaram uma comparação entre o emprego de redes
neurais e modelos híbridos na modelagem do processo de produção de cerveja. Um modelo
fenomenológico foi usado para simular o comportamento de uma planta real, sendo adicionados
39
níveis de ruídos aos dados gerados para o modelo com o objetivo de tornar os mesmos mais
reais possíveis. Primeiramente, foram usadas 2 redes neurais distintas para modelar o processo.
No segundo momento, as equações de balanço foram incorporadas em cada um dos dois
modelos baseados nas redes, com o objetivo de gerar modelos híbridos. As redes neurais foram
usadas para estimar a taxa de crescimento microbiano. O modelo híbrido apresentou melhores
resultados comparados com as redes neurais puras ou modelo fenomenológico.
TEIXEIRA et al. (2005) desenvolveram um modelo híbrido com objetivo de minimizar
as complexidades do metabolismo do BHK-21 e otimizar o estudo. Devido às incertezas
apresentadas pelo modelo cinético, as redes neurais foram usadas em paralelo para fornecer um
fator de correção desse desvio. Sendo assim, a taxa de reação era fornecida para as equações
fenomenológicas. Os resultados obtidos foram satisfatórios, mostrando que o uso de redes
neurais como uma alternativa de correção de desvios do modelo cinético do processo é
interessante.
COSTA et al. (1999) propuseram um modelo híbrido, combinando as equações de
balanço de massa com redes neurais do tipo FLN (Functional Link Networks) para estimar a
taxa de reação da produção de penicilina e etanol em biorreator do tipo batelada alimentada. O
modelo híbrido conseguiu prever a dinâmica do processo com precisão.
SILVA et al. (2000) propuseram o desenvolvimento de um modelo híbrido como uma
alternativa de medidas diretas de processos fermentativos. O processo estudado foi à produção
de cefalosporina C em biorreator batelada alimentada. As equações de balanço de massa foram
acopladas a uma rede neural do tipo feedforward, onde a rede foi usada para estimar o
crescimento celular e a taxa de formação de produto, as quais são inseridas nas equações de
balanço. Os resultados obtidos encorajam o uso de modelos híbridos no desenvolvimento de
algoritmos de controle de processos.
40
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MICRORGANISMO E MANUTENÇÃO
Para produção da goma xantana foi utilizada uma linhagem da bactéria Xanthomonas
campestris pv mangiferaeindicae IBSBF 1230, obtida a partir da Coleção de Culturas de
Fitobactérias do Instituto Biológico – Campinas – SP. Este microrganismo foi utilizado por já
ter sido avaliado pelo grupo de pesquisa Processos Tecnológicos e Biotecnológicos da URICampus de Erechim como bom produtor da goma xantana utilizando soro de queijo como
substrato (Gollo et al., 2006).
A linhagem foi mantida em meio YM (Yeast Malt), contendo (g.L-1): extrato de levedura
3,0; extrato de malte 3,0; peptona 5,0; glicose 10,0; agar 20,0; água destilada q.s.p.; pH 7,2
(JEANNES et al., 1976). Meio YM líquido acrescido de glicerol (agente crioprotetor) foi
utilizado para armazenamento da cultura a -80ºC com a finalidade de preservar a cultura e
diminuir o risco de alteração no perfil genético (ROTTAVA, 2005). Todos os procedimentos
foram realizados de forma asséptica. A linhagem inoculada em ágar YM foi incubada para o
crescimento celular em estufa por 24 horas a 28ºC ± 2ºC e, após este período, armazenadas a
4ºC. Foram realizados repiques a cada 30 dias. Através de semeadura em estrias, em ágar YM,
foi possível caracterizar visualmente as colônias de X. campestris estudadas verificando
algumas de suas características morfológicas.
3.2 PRODUÇÃO DE CÉLULAS
A produção de células foi realizada em duas etapas. Primeiro preparou-se um pré-inóculo,
partindo de três alçadas de cultura crescida sobre ágar YM e incubada em estufa por 24 a 48
horas, até atingir uma DO560nm entre 3,0 a 4,0, a 28º ± 2ºC. Esta foi inoculada em 50 mL de
meio YM líquido, em erlenmeyer de 250 mL, incubado em agitador orbital, a 120 rpm, 28ºC ±
2ºC, até atingir uma DO560nm entre 3,0-4,0, o que ocorre entre 22 a 26 horas.
Transcorrido este período, preparou-se o inóculo, através da transferência asséptica de 2
mL de pré-inóculo para erlenmeyeres de 300 mL, contendo 100 mL de meio YM líquido e
incubou-se em agitador orbital, 120 rpm, a 28ºC ± 2ºC, até DO560nm entre 3,0 a 4,0, que
correspondem ao ótimo da fase de crescimento exponencial do microrganismo. Essa faixa de
41
absorbância é atingida em aproximadamente 20 a 24 horas de incubação e corresponde a uma
concentração celular em torno de 108 UFC/mL.
3.3 CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO
A curva foi realizada em triplicata, a partir da transferência asséptica de 2 mL de inóculo
inicial (DO560nm = 3,5) em 100 mL de meio YM líquido. Este foi incubado em agitador orbital,
com agitação de 120 rpm, 28º ± 2ºC. Foram retiradas amostras a cada 4 horas, de forma
asséptica, para verificação do crescimento microbiano.
O crescimento celular foi avaliado através da leitura de absorbância, em comprimento de
onda de 560 nm, em espectrofotômetro, contra um branco constituído do meio YM sem inóculo;
e do plaqueamento em ágar YM através da técnica do pour-plate. As curvas de crescimento
microbiano foram construídas a partir dos dados de absorbância e contagem total de células.
3.4 SORO DE QUEIJO
O soro de queijo mussarela utilizado neste trabalho foi cedido pelo laticínio da COCEL
(Cooperativa Central do Alto Uruguai) em Erechim – RS. O soro de queijo foi utilizado líquido
e logo após coletado. Em cada um dos experimentos retirou-se uma amostra de soro de queijo
para monitorar as características pH (IAL, 1985), acidez total, gordura, proteína e lactose
(Tronco, 1997). O soro era coletado em condições reais do processamento do queijo, a
aproximadamente 40ºC, sendo armazenado sob refrigeração e utilizado para análises e para
fermentação no mesmo dia.
3.5 PRODUÇÃO DE GOMA XANTANA
Para os ensaios de produção de goma xantana, foi utilizado meio industrial à base de soro
de queijo obtido a partir de queijo mussarela. Foi utilizado um biorreator de bancada (Figura 3)
de 2,5 L (BIOSTAT® B – B. Braun Biotech International GmbH), contendo 900 mL de meio de
fermentação composto por: soro de queijo, 0,1 % (m/v) sulfato de magnésio e 2 % (m/v)
fosfato de potássio, referentes às concentrações otimizadas para produção de goma xantana em
42
agitador orbital, conforme descrito por GOLLO et al. (2006). O pH inicial do meio foi ajustado
para 7,2 e mantido livre durante a fermentação. O meio foi autoclavado a 121ºC/15min. Ao
meio de fermentação foi adicionado 100 mL de inóculo sendo, portanto, o volume final
utilizado nos experimentos de 1000 mL.
Foram realizados 11 experimentos com acompanhamento cinético, sendo variadas as
condições de aeração e agitação conforme descrito na Tabela 2. Todos os ensaios foram
realizados a 28ºC ± 2ºC por 72 horas, sendo retiradas amostras a cada 12 horas (GOLLO et al.
2009). As respostas avaliadas foram produção de biopolímero, células, açúcares redutores totais,
oxigênio dissolvido e pH.
Tabela 2. Condições experimentais avaliadas no estudo cinético realizado.
Ensaio
Aeração (vvm)
Agitação (rpm)
1
0,5
180
2
2,5
180
3
0,5
600
4
2,5
600
5
6
0
2,9
410
410
7
8
1,5
1,5
101
693
9
1,5
390
10
1,5
390
11
1,5
390
Figura 3. Ilustração do aparato experimental utilizado no estudo da produção da goma xantana
43
3.6 RECUPERAÇÃO DO BIOPOLÍMERO
A recuperação do biopolímero do caldo fermentado foi realizada através centrifugação a
9625 x g por 30 minutos a 4ºC, para a sedimentação das células. As células sedimentadas foram
colocadas em placas de petri previamente pesadas e secas em estufa, a uma temperatura de 5060ºC ± 5°C, até massa constante, aproximadamente 24 horas, sendo calculada a massa seca de
células para o volume total de caldo (GIAVASIS et al., 2003).
Após a retirada das células, ao sobrenadante que continha o polissacarídeo, foi adicionado
etanol 92,6ºGL (1:4 v/v) para precipitação da goma. Essa solução foi armazenada sob
refrigeração ± 4ºC, durante 24 horas. Transcorrido o tempo de refrigeração, as amostras foram
centrifugadas a 9625 x g, durante 30 minutos, a 4ºC, para recuperação do biopolímero
precipitado. O precipitado foi colocado em placas petri - previamente pesadas - e seco em estufa
(50ºC/24 horas) até massa constante. A massa seca foi ressuspendida em água ultrapura (sistema
milli-Q, milipore) e liofilizadas. O polissacarídeo liofilizado foi armazenado em frascos
plásticos vedados. Para realização das análises reológicas (viscosidade aparente), o
polissacarídeo foi dialisado por 48 horas contra água ultrapura estéril, sendo novamente
liofilizado e armazenado em frascos vedados (PACE, 1991; FIALHO, et al., 1999).
3.7 FORMULAÇÃO DO PROBLEMA DE MODELAGEM MATEMÁTICA DO PROCESSO
DE PRODUÇÃO DE GOMA XANTANA
O desenvolvimento de um modelo matemático para qualquer processo depende da maneira
como são coletados os dados experimentais que serão usados na estimação de parâmetros. No
caso deste trabalho, onde foi avaliado a influência da agitação e aeração sobre o consumo de
lactose, crescimento microbiano e produção de goma xantana, inviabiliza a proposição de um
modelo puramente fenomenológico para o processo, o qual é baseado nas equações de balanço
de massa mais o modelo cinético de crescimento. A dificuldade reside no fato que a condição
inicial (em termos de concentração de células, lactose e goma) é sempre a mesma em todos os
experimentos, não sendo possível avaliar o efeito das variáveis operacionais estudadas.
Por outro lado, a aplicação de um modelo puramente empírico baseado em redes neurais é
inviável, devido à baixa quantidade de dados experimentais coletados. Conforme já apresentado
44
na revisão deste trabalho, as redes neurais apresentam como principais desvantagens a
necessidade de grande quantidades de dados para o seu treinamento e a baixa capacidade de
extrapolação. Uma alternativa é combinar as duas estratégias no desenvolvimento de um
modelo híbrido.
O modelo híbrido consiste em agrupar numa única abordagem as vantagens da
modelagem fenomenológica e as vantagens das redes neurais. As equações do balanço de massa
governam o comportamento do sistema e as redes neurais fornecem os valores dos parâmetros
para os modelos. A Figura 4 apresenta um diagrama esquemático do funcionamento do modelo
híbrido empregado neste trabalho. Por exemplo, para calcular o valor das variáveis de estado
(X, S, P) em t + ∆t é necessário fornecer para a rotina de integração numérica uma condição
inicial (X0, S0, P0) e o valor de µ (o qual é dependente de X, S, P). Os valores das variáveis de
estado são fornecidos pelo usuário (quando é condição inicial) ou pela própria rotina de
integração, sendo calculados e re-alimentados no programa. Tanto a equação para µ quanto as
equações de balaço são dependentes de um conjunto de parâmetros cinéticos. Esses parâmetros
serão calculados pelas redes, a partir de um conjunto de dados de entrada, e fornecidos para a
rotina de integração numérica.
Figura 4: Diagrama esquemático do funcionamento do modelo híbrido
3.7.1 Parte Fenomenológica
A parte fenomenológica do modelo híbrido que descreve a produção de goma xantana em
biorreator batelada é baseada nas seguintes hipóteses:
•
O biorreator é considerado como um tanque de mistura perfeita;
45
•
O balanço energético foi desconsiderado, uma vez que todo o processo foi realizado sob
um rígido controle de temperatura;
•
O único substrato limitante no meio é a concentração de lactose. Todos os outros
nutrientes, tais como: nitrogênio, fosfato e fatores de crescimento foram considerados
em excesso, não sendo incluídos nas equações de balanço;
•
O crescimento celular ocorre exclusivamente devido ao consumo de lactose;
•
A produção de goma xantana é parcialmente associada ao crescimento microbiano;
O modelo matemático proposto consiste de um conjunto de equações algébrico-
diferenciais levando em consideração o crescimento microbiano (X), o consumo de substrato
(S) e a produção de goma xantana (P), conforme descrito pelas seguintes equações:
dX
= µX
dt
(1)
1
dS
=−
µX
dt
Yx / s
(2)
dP
= (αµ + β ) X
dt
(3)
De acordo com simulações preliminares foi verificado que o modelo cinético de
crescimento microbiano que melhor representou o processo foi o modelo de Contois, sendo
descrito conforme:
µ =µ max
S
ksX + S
(4)
3.7.2 Parte Empírica
A rede proposta neste estudo é uma rede do tipo feedforward¸ a qual é composta por três
camadas denominadas de camada de entrada, intermediária e de saída. O número de neurônios
na camada de entrada será definido como sendo igual ao número de variáveis de entrada; o
número de neurônios na camada intermediária será definido por tentativa e erro, buscando-se o
número mínimo de neurônios que fornece o menor erro quadrático e, ao mesmo tempo, que
apresente resultados satisfatórios; a camada de saída será composta por 5 neurônios, os quais
correspondem aos parâmetros do modelo. A função de ativação usada na aplicação de redes
46
neurais no modelo híbrido será a tangente hiperbólica. Como a função de transferência usada
neste trabalho apresenta respostas normalizadas entre -1 e 1, os dados de saída da rede, ou seja,
os parâmetros do modelo foram denormalizados, conforme apresentado na tabela seguinte. A
Tabela 6 apresenta os limites máximos e mínimos para cada parâmetro do modelo. Os mesmos
limites apresentados na Tabela 6 foram usados para a denormalização dos parâmetros da rede.
Tabela 3: Limites dos Parâmetros usados na denormalização das saídas da rede neural
Parâmetros
Yx/s (-)
α (U.mL-1)
β (U.mL-1.h-1)
µmax (h-1)
ks (g.L-1)
Limite Inferior
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Limite Superior
0,65
10,0
10,0
1,0
10,0
Os dados de entrada que serão utilizados para o treinamento da rede são: tempo de
fermentação, agitação e aeração, as quais são as variáveis manipuladas do processo de produção
de goma xantana. O número de neurônios da camada intermediária foi determinado por tentativa
e erro, sendo considerado o número de unidades que possibilitou a obtenção do menor valor da
função objetivo.
No modelo híbrido, a rede fornece o valor dos parâmetros do modelo. Ou seja, os pesos
e bias são otimizados de maneira que se encontre o conjunto de parâmetros ótimos que
minimize o erro quadrático entre o valor da variável de estado calculada pelas equações do
modelo fenomenológico e o valor experimental, conforme definido pela equação:
n
FO = min ∑ (Yi − Yicalc )
2
(7)
i =1
As equações dos modelos foram resolvidas numericamente pelo algoritmo LIMEX e os
pesos ótimos da rede foram determinados pelo algoritmo simulated annealing . Os valores das
variáveis de estado calculados e experimentais usados no cálculo da FO foram normalizados
entre 0 – 1, devido a ordem de grandeza entre as variáveis.
Durante a etapa de treinamento da rede foi usado um conjunto experimental composto
por 9 fermentações com agitação e aeração variando na faixa de 101 a 693 rpm e 0 a 2,5 vvm,
respectivamente. Para a validação do modelo foram usadas 2 fermentações adicionais com
47
agitação e aeração de 390 rpm e 1,5 vvm, respectivamente e 600 rpm e 2,5 vvm,
respectivamente.
Os dados experimentais usados nesse trabalho foram determinados em períodos
igualmente espaçados de 12h. Portanto, as entradas da rede serão alimentadas a cada 12h de
fermentação. Como a LIMEX fornece várias saídas densas dentro desse intervalo, optou-se por
empregar o mesmo conjunto de parâmetros dentro de cada intervalo. Por exemplo, no período
entre 0h – 11,999h a rede é alimentada com os dados determinados experimentalmente em t = 0.
A rede só será re-alimentada quando o tempo for igual á 12h. Ou seja, no período de 0h –
11,999h tem-se o mesmo conjunto de parâmetros; no período de 12h – 23,999h tem-se um novo
conjunto de parâmetros, seguindo o mesmo raciocínio no decorrer da fermentação.
48
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. ESTUDO DA PRODUÇÃO DA GOMA XANTANA
As Tabelas 4 e 5 apresentam os resultados obtidos nos experimentos cinéticos, em
diferentes condições de agitação e aeração (Tabela 2).
.Tabela 4. Cinética da produção de goma, formação de células e consumo de substrato para os
experimentos 1 a 6. Unidades: [g.L-1].
Tempo Lactose Células
Goma
Tempo Lactose Células
Goma
0
4,422
0,5
0
0
4,52
0,7
0
12,00
4,469
0,8
3,2
12,00
3,78
1,1
5,4
24,00
3,734
1,2
4,5
24,00
2,81
1,6
6,6
36,00
3,094
3,0
6,3
36,00
2,45
3,2
7,1
48,00
2,905
3,2
10,1
48,00
2,31
4,5
12,3
72,00
1,440
4,0
20,0
72,00
2,22
4,0
24,0
96,00
1,500
4,1
19,8
96,00
2,00
4,1
21,0
Experimento 1
Tempo Lactose Células
Experimento 2
Goma
Tempo Lactose Células
Goma
0
4,61
0,7
0
0
4,61
0,7
0
12,00
4,30
2,3
8,2
12,00
3,10
3,1
11,1
24,00
3,50
2,5
8,9
24,00
2,90
3,9
15,7
36,00
2,30
3,2
9,1
36,00
1,30
4,1
16,2
48,00
2,40
4,0
11,1
48,00
1,40
4,4
18,3
72,00
2,20
4,0
18,0
72,00
1,50
4,5
29,0
96,00
1,90
4,1
18,9
96,00
1,20
4,6
28,2
Experimento 3
Experimento 4
49
Tempo Lactose Células
Goma
Tempo Lactose Células
Goma
0
4,5
0,8
0
0
4,5
0,8
0,0
12,00
4,3
2,9
8,2
12,00
3,5
2,9
10,1
24,00
3,8
3,0
9,3
24,00
3,0
3,0
11,4
36,00
2,9
4,0
10,2
36,00
2,9
4,0
12,4
48,00
1,4
4,2
11,3
48,00
1,4
4,2
15,1
72,00
1,5
4,5
15,0
72,00
1,3
4,5
20,2
96,00
1,2
4,6
16,0
96,00
1,2
4,6
21,2
Experimento 5
Experimento 6
Tabela 5. Cinética da produção de goma, formação de células e consumo de substrato para os
experimentos 7 a 11. Unidades: [g.L-1].
Tempo
Lactos
Célula
Goma
e
s
0
4,5
0,8
0,0
12,00
4,0
1,5
24,00
2,5
36,00
Tempo
Lactos
Célula
e
s
0
4,5
0,8
0,0
11,1
12,00
4,0
3,2
14,1
3,0
13,3
24,00
2,5
3,8
15,5
2,9
4,2
14,9
36,00
2,9
4,5
16,3
48,00
1,1
4
15,1
48,00
1,1
4,8
21,2
72,00
1,3
3,8
15,3
72,00
1,3
3,8
25,7
96,00
1,2
3,9
15,0
96,00
1,2
3,9
31
Experimento 7
Tempo
Lactos
Célula
e
s
0
4,8
0,8
12,00
3,2
24,00
Goma
Experimento 8
Temp
Lactos
Célula
o
e
s
0
0
4,8
0,8
0
3,2
14,1
12,00
4,3
3,1
14,1
2,9
3,8
15,5
24,00
2,9
3,6
15,5
36,00
1,8
4,5
16,3
36,00
1,9
4,0
16,3
48,00
1,3
4,8
21,2
48,00
1,1
4,5
21,2
72,00
1,5
3,8
36,0
72,00
1,3
3,8
35,3
96,00
1,6
3,9
35,3
96,00
1,5
3,9
35,7
Experimento 9
Goma
Goma
Experimento 10
50
Tempo Lactose Células
Goma
0
4,8
0,8
0
12,00
4,1
2,9
14,1
24,00
2,7
3,5
15,5
36,00
2,1
4,3
16,3
48,00
1,2
4,7
21,2
72,00
1,3
3,8
36,2
96,00
1,2
3,9
35,9
Experimento 11
A partir dos resultados apresentados na Tabela 4 pode-se perceber que a maior produção
de goma xantana ocorre entre 72 h e 96 h. Esse fato ocorre devido a bactéria Xanthomonas
campestris excretar para o meio seu metabólito na sua fase de desaceleração e declínio celular,
sendo a formação de produto parcialmente associada ao crescimento da biomassa. Segundo
Casas et. al. (2000), as variáveis temperatura, velocidade de agitação e concentração inicial de
oxigênio afetam a taxa e rendimento da produção de goma xantana. A produção de células é
máxima já em 48 h para alguns experimentos e em 72 h a 96 h de fermentação para o restante.
Nos experimentos 1, 3, 4, 5 e 6 a máxima produção de células ocorre no final da
fermentação, o que indica ser a aeração o fator determinante. Nesses experimentos a aeração é a
dos níveis experimentais mais baixos, repercutindo num tempo mais longo de crescimento
celular devido à disponibilidade de oxigênio para a manutenção e duplicação celular ser menor.
Já para os experimentos 2, 7, 8, 9, 10 e 11 a aeração é a dos níveis mais altos, resultando num
tempo mais curto de produção celular máxima e, ainda, tendo uma formação de produto mais
acentuada. Verifica-se que a lactose foi consumida no decorrer da fermentação, evidenciando
que a bactéria X. campestris pv é capaz de utilizar a lactose como fonte de carbono para
produção de goma xantana, comprovando os resultados encontrados por GOLLO (2006).
A análise estatística dos resultados apresentados na Tabela 4 referentes a máxima
produção de células e concentração de goma xantana possibilita a avaliação dos efeitos das
variáveis estudadas (agitação e aeração). A Figura 5 apresenta os efeitos principais, quadráticos
e de interação entre as variáveis para a concentração máxima de goma xantana (Figura 5a) e
máxima concentração celular obtida (Figura 5b).
Conforme pode ser visualizado, tanto aeração quanto agitação apresentam influência
estatisticamente significativa (p<0.1) na produção de goma xantana. O incremento no valor das
duas variáveis pode levar a um incremento na produção de goma xantana, uma vez que os
51
efeitos lineares dessas variáveis foram positivos. Com relação aos termos quadráticos, os
mesmos apresentaram valores negativos que, do ponto de vista matemático, indicam a presença
de um ponto de máximo. Do ponto de vista de bioprocessos, este resultado é interessante, pois
indica que existe um conjunto de valores para as variáveis operacionais (agitação e aeração) em
que a produção de goma xantana é ótima. Sendo assim, a otimização do processo pode ser
obtida através da aplicação da metodologia de planejamentos de experimentos ou através do
desenvolvimento de um modelo matemático que possa ser usado como ferramenta de
otimização.
a)
b)
Figura 5: Análise dos efeitos das variáveis estudas sobre a máxima concentração de goma
xantana (a) e a máxima concentração celular (b) obtidas nos experimentos da Tabela 4.
Com relação ao crescimento microbiano, pode-se perceber que a única variável que
apresenta efeito significativo positivo (p<0.15) é a agitação do sistema. Este resultado é
esperado, devido ao fato que a produção de goma aumenta a viscosidade do meio, exigindo um
incremento na agitação para tornar o meio uniforme. Os demais efeitos não foram
estatisticamente significativos.
Alguns autores também relataram a influência do tempo de fermentação na produção da
goma, onde um maior tempo de fermentação acarreta uma maior produtividade, como (SOUZA
e VENDRUSCULO, 2000; ANTUNES et al., 2000b; MOREIRA, et al, 2001). Isto também foi
observado por PADILHA, (2003) trabalhando com X. axonopodis pv manihotis onde obteve
produção de 6,9 g.L-1 e 7,9 g.L-1 com 72 h e 96 h de fermentação, respectivamente.
NITSCHKE, et al. (2001) utilizando agitação de 180 rpm e 28 oC alcançou uma
produção de 14,7 g/kg em meio a base de soro de leite integral 4% (soro de queijo em pó)
adicionando 0,01% de sulfato de magnésio e 0,5% de fosfato de potássio, porém com outra
bactéria (C7L). Sabe-se que diferentes linhagens de X. campestris podem produzir goma xantana
com diferentes composições, viscosidade e rendimento. Por esse motivo salienta-se a
52
importância de pesquisas de novas linhagens que possam produzir goma xantana em meio de
soro de queijo com alto rendimento e de boa qualidade.
Meio à base de soro de queijo diluído 1:4 com água foi utilizado para a produção de
gelana, obtendo-se 7,9 g.L-1 do polissacarídeo. Ao aumentar a diluição do soro de queijo,
ocorrem diminuições na produção de gelana (FIALHO et al., 1999).
Resíduos agroindustriais estão sendo utilizados em muitos trabalhos envolvendo a
produção de polissacarídeos, entre eles pode-se citar a produção de goma xantana em água
residual de moinho de azeitona, onde foi obtida uma produção de 7 g.L-1 de goma utilizando-se
20% do rejeito (LÓPEZ, et al., 2001); em meio contendo melaço, chegando a uma produção de
53 g.L-1 (KALOGIANNIS, et al., 2003) e 38,16 g.L-1 de goma xantana (MAYESKI, 2005).
Esses resultados confirmam o que foi descrito por MOREIRA, et al., (2001), que os
rendimentos de goma xantana dependem da composição do meio e da linhagem da bactéria X.
campestris utilizada.
GOLLO (2006), utilizando a mesma linhagem e o mesmo meio de produção em
experimentos realizados em shaker a 28°C e 180 rpm, obteve um máximo de produção de 25,42
g.L-1 em 72 horas de fermentação. Esses valores foram superiores aos obtidos por ROTTAVA
(2005), que, entre outras, utilizou a mesma cepa, mas em meio sintético MPI+II (g.L-1)
contendo NH4H2PO4 2,5; K2HPO4 5,0; H3BO3 0,006; (NH4)2SO4 2,0; FeCl3 0,0024;
CaCl2.2H2O 0,002; ZnSO4 0,002; sacarose 50,0, pH 7,0, no qual obteve 8,83g.L-1 de
polissacarídeo.
MAYESKI
(2005),
trabalhando
com
meio
sintético
e
X.
campestris
pv
mangiferaeindicae 1230, obteve uma produção de 30,27 g.L-1. MOREIRA et al., (2001)
trabalhando com 18 linhagens diferentes de X. campestris, encontraram rendimentos que
variaram de 2,3 a 8,3 g.L-1 utilizando meio PMII composto por 1,5 g.L-1 NH4H2PO4; 2,5 g.L-1
K2HPO4; 0,2 g.L-1 MgSO4.7H2O e 50 g.L-1 de sacarose, após 72 horas de fermentação, 28ºC e
200 rpm.
ESGALHADO et al. (1995) trabalharam com X. campestris NRRL B-1459 nas seguintes
condições: temperatura entre 25 e 30ºC e pH entre 7,0 e 8,0 com meio contendo extrato de
malte, extrato de levedura, peptona e acrescido de sais e glicose, obtiveram produção máxima
de goma xantana de 18 g.L-1.
PAPAGIANNI et al. (2001) chegaram a um máximo de produção média de 7 g.L-1 de
goma xantana em meio LBG composto por 1% m/v tripeptona, 0,5% m/v extrato de levedura,
0,5 m/v NaCl e 0,2% m/v glicose utilizando a bactéria X. campestris ATCC 1395. Esse valor foi
obtido após 72 horas de incubação com velocidade de agitação de 600 rpm trabalhando em
53
fermentador. Verificaram que com a diminuição da velocidade de agitação ocorrem diminuições
na produção de goma xantana. BERWANGER (2005) observou que níveis maiores de agitação
na obtenção de polissacarídeos sintetizados por Sphingomonas capsulata acarretavam maiores
produtividades, chegando a um limite de 208 rpm em agitador orbital.
De acordo com GARCÍA-OCHOA et. al. (2000), a produção de xantana é acompanhada
por um grande aumento na viscosidade do meio devido o acúmulo do exopolissacarídeo,
provocando uma redução significativa na taxa de transferência de oxigênio. Com o aumento na
viscosidade, a velocidade de agitação não deve ser mantida constante durante o processo, pois a
transferência mássica de oxigênio pode ser afetada, alterando a produção de goma xantana.
De acordo com CHI e ZHAO (2003) pesquisas feitas com pululana indicam que diferentes
velocidades de rotação dos frascos tiveram grande efeito na biosíntese do biopolímero,
indicando que um aumento na agitação acarreta um aumento no rendimento. Assim a literatura
cita que o coeficiente de transferência de oxigênio está correlacionado com a velocidade de
agitação e velocidade superficial do gás, e no caso de fluidos não-newtonianos, a viscosidade do
meio também deve ser levada em conta (GARCÍA-OCHOA, 2000). A produção máxima de
goma ocorre quando a produção de células atinge seu máximo(96 horas) e a produção de goma
xantana tem seu máximo em 96 horas.
A agitação e a aeração são parâmetros necessários para evitar condições de anaerobiose
decorrentes de alta viscosidade do meio devido a formação do polissacarídeo,visto que a
bactéria é estritamente aeróbia.Os microorganismos conseguem manter bom desempenho e,
quando cultivados em baixas concentrações de oxigênio dissolvido, são interessantes para o
ponto de vista econômico.A manutenção de altas concentrações de oxigênio dissolvido demanda
um
maior
consumo
de
energia,em
virtude
de
uma
maior
agitação
e
aeração
(SCHMIDELL,2001).
NITSCHKE, et al. (2001) utilizando agitação de 180 rpm e 28 oC, alcançou uma
produção de 14,7 g/kg em meio a base de soro de leite integral 4% (soro de queijo em pó),
adicionando 0,01% de sulfato de magnésio e 0,5% de fosfato de potássio, porém com outra
bactéria (C7L). Sabe-se que diferentes linhagens de X. campestris podem produzir goma xantana
com diferentes composições, viscosidade e rendimento. Por esse motivo salienta-se a
importância de pesquisas de novas linhagens que possam produzir goma xantana em meio de
soro de queijo com alto rendimento e de boa qualidade.
Meio à base de soro de queijo, diluído 1:4 com água foi utilizado para a produção de
gelana, obtendo-se 7,9 g.L-1 do polissacarídeo. Ao aumentar a diluição do soro de queijo,
ocorrem diminuições na produção de gelana (FIALHO et al., 1999).
54
Resíduos agroindustriais estão sendo utilizados em muitos trabalhos envolvendo a
produção de polissacarídeos. Entre eles pode-se citar a produção de goma xantana em água
residual de moinho de azeitona, onde foi obtida uma produção de 7 g.L-1 de goma, utilizando-se
20% do rejeito (LÓPEZ, et al., 2001); em meio contendo melaço, chegando a uma produção de
53 g.L-1 (KALOGIANNIS, et al., 2003) e 38,16 g.L-1 de goma xantana (MAYESKI, 2005).
Esses resultados confirmam o que foi descrito por MOREIRA, et al., (2001), que os
rendimentos de goma xantana dependem da composição do meio e da linhagem da bactéria X.
campestris utilizada.
Alguns autores também relataram à influência do tempo de fermentação na produção da
goma, em que um maior tempo de fermentação acarreta uma maior produtividade (SOUZA e
VENDRUSCULO, 2000; ANTUNES et al., 2000b; MOREIRA, et al, 2001). Isso também foi
observado por PADILHA, (2003), trabalhando com X. axonopodis pv manihotis, onde obteve
produção de 6,9 g.L-1 e 7,9 g.L-1 com 72 horas e 96 horas de fermentação respectivamente.
4.2 MODELAGEM MATEMÁTICA DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE GOMA
XANTANA
No desenvolvimento do modelo híbrido é necessário definir a arquitetura da rede neural
mais adequada para representar o processo. As entradas da rede foram definidas como sendo o
tempo de fermentação e as duas variáveis operacionais, agitação e aeração, totalizando três
entradas. As saídas da rede são os parâmetros do modelo matemático proposto, que corresponde
a 5 unidades. O número ótimo de neurônios da camada intermediária deve ser determinado para
que a rede possa estimar de maneira satisfatória os parâmetros do modelo. Neste trabalho, foi
avaliada a influência de 1-10 neurônios na camada intermediária, cujos resultados são
apresentados na Figura 6. Como pode ser visto, a partir de 2 neurônios na camada intermediária
há pouca influência sobre o valor da função objetivo. No entanto, a configuração com 8
neurônios internos apresentou os melhores resultados em termos do ajuste global, sendo que a
arquitetura ótima da rede utilizada neste estudo foi 3-8-5.
55
35
Função objetivo
30
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Número de neurônios intermediários
Figura 6: Influência do número de neurônios intermediários no valor da função objetivo.
A partir da escolha da melhor arquitetura da rede neural, a próxima etapa é a simulação
do processo. As Figuras 7 e 8 apresentam os resultados referentes ao desempenho do modelo
híbrido proposto para simular o processo de produção de goma xantana no biorreator batelada.
Como pode ser visto, o modelo apresentou resultados satisfatórios com relação ao ajuste dos
dados experimentais, principalmente no que diz respeito ao consumo de lactose no meio. Com
relação ao crescimento microbiano, o modelo foi apto para predizer a tendência de crescimento,
com exceção do experimento 2, onde o modelo apresentou resultados insatisfatórios. Com
relação a produção de goma xantana, o modelo representou de maneira satisfatória a tendência
do processo.
56
Figura 7: Avaliação do desempenho do modelo híbrido proposto para simular o processo de
produção de goma xantana nos experimentos 1-5.
57
Figura 8: Avaliação do desempenho do modelo híbrido proposto para simular o processo de
produção de goma xantana nos experimentos 6-11.
Os resultados obtidos na modelagem matemática do processo de produção de goma
xantana usando o modelo híbrido proposto foram satisfatórios. Estes resultados indicam que a
estratégia de combinar redes neurais e modelo fenomenológico em uma estrutura híbrida é uma
ferramenta interessante para a simulação de bioprocessos, principalmente nos casos onde se tem
pouca informação a cerca dos mecanismos envolvidos no crescimento microbiano. Resultados
similares com relação a aplicação de modelos híbridos para a estimação de parâmetros de
bioprocessos foram obtidos por Mazutti (2006), onde o modelo híbrido apresentou melhor
desempenho em relação ao modelo puramente fenomenológico e com relação a aplicação de
redes neurais puras (Mazutti et al., 2010).
58
5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Os resultados obtidos neste trabalho com relação aos efeitos da agitação e aeração
permitem concluir que, ambas as variáveis apresentam influência sobre a produção de goma
xantana e, com relação ao crescimento microbiano, somente a agitação apresentou influência
significativa no processo. Além disso, as maiores produções de goma foram verificadas no
período final de fermentação (entre 72 e 96h). Esse fato ocorre devido a bactéria Xanthomonas
campestris excretar para o meio seu metabólito na sua fase de desaceleração e declínio celular,
indicando que a formação de produto é parcialmente associada ao crescimento microbiano.
Com relação ao modelo matemático proposto para representar o processo de produção de
goma xantana em biorreator batelada, pode-se verificar que o emprego de uma estrutura híbrida,
combinando as equações de balanço de massa com as redes neurais, é uma ferramenta
interessante para a estimação de parâmetros em bioprocessos.Os resultados obtidos nesse
trabalho com relação a qualidade de ajuste foram satisfatório, uma vez que o modelo foi apto
para descrever o perfil cinético do crescimento microbiano, consumo de lactose e produção de
goma xantana no meio. O modelo híbrido é uma ferramenta interessante a ser utilizada em
bioprocessos, principalmente nas situações onde o a rota metabólica não é bem conhecida ou
elucidada.
O desenvolvimento desta dissertação teve como um dos principais objetivos de propiciar
um incremento no conhecimento da modelagem de bioprocessos, com grande apelo ao uso de
meio alternativo, neste caso, o soro de queijo para que uma série de trabalhos possam ser
realizados no futuro. A seguir serão apresentadas algumas sugestões para trabalhos futuros:
•
Usar dados de consumo de oxigênio para estimar os parâmetros do modelo híbrido
verificando seu comportamento.
•
Desenvolver estratégias de controle de processos, a partir do modelo matemático.
•
Uso do modelo matemático para a otimização da produção de goma xantana.
59
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