LÍGIA MARIA BORGES MARQUES SANTANA
BIOMARCADORES HISTOPATOLÓGICOS PARA O
MONITORAMENTO AMBIENTAL DA BACIA
DO RIBEIRÃO JACUTINGA (LONDRINA, PR)
Londrina
2004
LÍGIA MARIA BORGES MARQUES SANTANA
BIOMARCADORES HISTOPATOLÓGICOS PARA O
MONITORAMENTO AMBIENTAL DA BACIA
DO RIBEIRÃO JACUTINGA (LONDRINA, PR).
Monografia apresentada ao curso de
Graduação em Ciências Biológicas da
Universidade Estadual de Londrina como
requisito à obtenção do título de Bacharel.
Orientadora: Profª. Drª Cláudia B. R.
Martinez
Londrina
2004
LÍGIA MARIA BORGES MARQUES SANTANA
BIOMARCADORES HISTOPATOLÓGICOS PARA O
MONITORAMENTO AMBIENTAL DA BACIA
DO RIBEIRÃO JACUTINGA (LONDRINA, PR).
Monografia apresentada ao curso de
Graduação em Ciências Biológicas da
Universidade Estadual de Londrina como
requisito à obtenção do título de Bacharel.
Orientadora: Profª. Drª Cláudia B. R.
Martinez
BANCA EXAMINADORA
Cláudia Bueno dos Reis Martinez
____________________________________________
Marta Marques de Souza
Andressa das Graças Silva
Londrina, 06 de dezembro de 2004.
Aos meus pais,
por todo amor,
e dedicação a
seus filhos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que colaboraram para a realização deste trabalho e em especial:
À minha orientadora Cláudia, que me recebeu em seu laboratório desde que eu era uma
simples caloura. Uma grande pessoa e uma grande amiga, com a qual me sinto honrada em ter
iniciado minha vida científica e em saber que sempre poderei contar com ela.
À Marta, que considero minha outra orientadora e consultora para todos os assuntos, sempre
atenta a ajudar a todos do lab. Também uma grande amiga muito valiosa que conheci.
À Andressa, minha amiga e mestra, que me ensinou todos os passos que dei neste laboratório.
Aos estagiários e amigos do lab Gabriel, Bruno A., Ju Simonato, Vivian, Ju Ruiz, Marina,
Laura, Bruno B., Thiago, Dalita, Elis e Enê; e aos amigos que também passaram por aqui Ju
Schietti, Indi, Alexandre e Catarina, pelos momentos vividos neste laboratório e fora dele;
levarei saudades de todos.
Aos funcionários do interlaboratório de fisiologia Afonso, Corino e Neil, sempre bem
humorados e prontos para ajudar e emprestar qualquer material de que precisava.
Á Estação de Piscicultura da UEL que cedeu alguns peixes que usei neste trabalho.
À equipe de coleta (“ECPUEL”), uma divertida turma sem a qual não conseguiríamos
capturar os animais que usamos.
Ao Oscar e ao Mário Orsi também pela ajuda.
Ao Paulo, nosso “expert” em consertar o micrótomo.
A minha grande amiga, embora pequena, companheira inseparável de todas as horas Maíra, e
aos meus amigos Taís e Elvis, que são minha família amada em Londrina.
Ao meu namorado Titi, que embora tenha demorado a entrar em minha vida, já me marcou
para sempre.
À Jaque, minha amiga da “terra natal”, que me conhece desde que comecei a falar, apesar de
nem precisar falar muito quando estamos juntas.
Aos meus amigos da graduação, em especial Camila e Henrique, pela divertida companhia.
E agradeço imensamente aos meus pais, Olga e Maurício, os que mais batalharam pela minha
saúde, felicidade e formação, e à minha família toda, irmãos, avós, tios e primos, os grandes
amores de minha vida.
À natureza e a Deus, como não?
TUDO É QUESTÃO DE VER
QUE A VIDA É MAIOR QUE O FATO
A FORÇA É MAIOR QUE O ATO
E A SEMENTE REPOUSA NO FRUTO
COMO O SENTIDO NO TATO
TUDO CONTÉM O SER
ASSIM COMO O SER CONTÉM TUDO
CONTINENTE E CONTEÚDO
FUNDIDOS NUM SÓ MISTÉRIO
QUE DE REPENTE É SÉRIO
DE REPENTE É CARICATO.
SANTANA, L. M. B. M. Biomarcadores histopatológicos para o monitoramento
ambiental da bacia do ribeirão Jacutinga (Londrina, PR). 2004. Monografia (Bacharelado
em Ciências Biológicas) – Universidade Estadual de Londrina, Paraná.
RESUMO
A bacia do ribeirão Jacutinga (Londrina, PR) além de receber efluentes industriais, urbanos e
resíduos da agropecuária, foi atingida no ano de 2002 por cerca de 100 mil litros de óleo
Diesel, devido ao vazamento de um “pool” de combustíveis localizado nas suas proximidades.
Para o biomonitoramento desta bacia, foi verificada a ocorrência e a severidade de alterações
histológicas nas brânquias, fígado e rim de lambaris (Astyanax altiparanae) e de cascudos
coletados em dois locais no ribeirão Jacutinga (J1 e J2) e quatro no ribeirão Lindóia (L1, L2,
L3 e L4), que recebeu a descarga de óleo. Lambaris da Estação de Piscicultura da UEL,
devidamente aclimatados, e cascudos provenientes de um ribeirão de outra microbacia,
devidamente aclimatados e após processo de depuração, foram usados como controle.
Imediatamente após a captura, os animais foram sacrificados e seus órgãos retirados e fixados
em Bouin. As brânquias foram descalcificadas e, então, os três órgãos foram diafanizados em
xilol, incluídos em parafina, cortados em fatias de 4 e5µm, corados com HE e analisados ao
microscópio de luz. Cortes de fígado também foram submetidos à reação histoquímica de
PAS para detecção da quantidade de glicogênio dos hepatócitos. As alterações foram
avaliadas semi-quantitativamente de duas formas: a) atribuição do valor médio de alteração
(VMA), relacionado à distribuição das alterações; b) cálculo do índice de alteração histológica
(IAH), que avalia a severidade das alterações. Os resultados obtidos nos diferentes pontos de
coleta foram comparados com os do controle utilizando-se testes estatísticos (ANOVA ou
Kruskal-Wallis), considerando-se P<0,05. As principais alterações histológicas nas brânquias
foram: aneurismas, desarranjo lamelar, hiperplasia, hipertrofia e fusão das lamelas
secundárias nas duas espécies de todos os trechos de coleta; ruptura do epitélio lamelar nos
lambaris de J1 e L2; e rompimento de células pilares nos cascudos de L1. Nos fígados foram:
atrofia celular e nuclear, hiperemia, núcleos picnóticos e vacuolização nuclear nas duas
espécies. Nos rins foram: degeneração granular e hialina, e redução do espaço de Bowman,
nas duas espécies de todos os trechos; e necrose focal nos lambaris de L4 e J2 e nos cascudos
de J1. Quanto à intensidade das alterações observadas, elas foram leves, nas brânquias,
significativamente maiores que o controle nos lambaris de L2 e L4; moderadas nos fígados,
significativamente maiores nos cascudos de L1, L2 e L3; e severas nos rins, principalmente
nos lambaris dos trechos J2 e L4 embora sem serem estatisticamente diferentes. Estes
resultados indicam que a bacia do ribeirão Jacutinga está comprometida desde sua nascente,
com agravamento na foz de seus ribeirões, provavelmente devido à gama de efluentes urbanos
e de afluentes contaminados que recebe. Os fígados e os rins dos peixes foram os órgãos mais
sensíveis à poluição dessa bacia, sendo biomarcadores adequados a programas de
monitoramento da contaminação aquática.
Palavras chave: Biomarcadores histopatológicos, peixes, ribeirão urbano.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Foto de Astyanax altiparanae. ............................................................................. 201
Figura 2. Hypostomus ancistroides (Foto de Horácio Mori)................................................ 223
Figura 3. Mapa da bacia hidrográfica do ribeirão Jacutinga, Londrina, PR, com a localização
dos trechos de coleta de A. altiparanae e H. ancistroides. .................................... 234
Figura 4. Trechos de coleta no ribeirão Jacutinga: a) Trecho J1 e b) Trecho J2. .................. 245
Figura 5. Trechos de coleta no ribeirão Lindóia: a) trecho L1; b) trecho L2; c) trecho L3 e d)
trecho L4. ............................................................................................................ 267
Figura 6. Leituras físico-químicas da água de cada local de coleta. A) Medidas de oxigênio
dissolvido e temperatura. B) Medidas de pH e condutividade............................... 334
Figura 7. Fotomicrografia do tecido branquial dos animais analisados.. ............................ 3738
Figura 8. Fotomicrografia do tecido hepático dos animais analisados. ................................ 401
Figura 9. Fotomicrografia hepática dos animais analisados evidenciando a quantificação do
glicogênio presente nos hepatócitos. .................................................................... 423
Figura 10. Relação entre as médias da quantidade de glicogênio hepático e a freqüência da
vacuolização citoplasmática dos hepatócitos dos animais analisados. A) Astyanax
altiparanae. B) Hypostomus ancistroides............................................................. 434
Figura 11. Fotomicrografia renal dos animais analisados. ................................................... 456
Figura 12. Fotomicrografia do tecido renal analisado evidenciando a formação de novos
néfrons...................................................................................................................48
Figura 13. Médias de VMA (Valor Médios de Alteração e de IAH(Índice de Alterações
Histológicas) das brânquias (a e b), fígados (c e d) e rins (e e f) dos Astyanax
altiparanae e dos Hypostomus ancistroides analisados.............................................49
ÌNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Escala do índice médio associado aos efeitos no funcionamento do órgão. ............ 30
Tabela 2. Classificação das alterações histológicas de brânquias, fígado e rim quanto ao
estágio de comprometimento das funções teciduais................................................31
Tabela 3. Biometria e fator de condição dos peixes amostrados. ........................................... 34
Tabela 4. Número de órgãos analisados. ...............................................................................35
Tabela 5. Freqüência das alterações histológicas encontradas nas brânquias dos Astyanax
altiparanae analisados segundo a classificação das lesões (modificado de Poleksic e
Mitrovic-Tutundzic, 1994 por Silva, 2004). ...........................................................38
Tabela 6. Freqüência das alterações histológicas encontradas nas brânquias dos H.
ancistroides analisados segundo a classificação das lesões (modificado de Poleksic e
Mitrovic-Tutundzic, 1994 por Silva, 2004). ...........................................................38
Tabela 7. Freqüência das alterações histológicas encontradas nos fígados dos Astyanax
altiparanae analisados segundo a classificação das lesões (baseada em Poleksic e
Mitrovic-Tutundzic,1994, e modificada por Rigolin De Sá ,1998). ........................41
Tabela 8. Freqüência das alterações histológicas encontradas nos fígados dos H. ancistroides
analisados segundo a classificação das lesões (baseada em Poleksic e MitrovicTutundzic,1994, e modificada por Rigolin De Sá ,1998). ....................................... 41
Tabela 9. Freqüência das alterações histológicas encontradas nos rins dos Astyanax
altiparanae analisados segundo a classificação das lesões (SILVA, 2002). ............ 46
Tabela 10. Freqüência das alterações histológicas encontradas nos rins dos H. ancistroides
analisados segundo a classificação das lesões (SILVA, 2002). ............................... 46
Tabela 11. Freqüência da formação de novos néfrons observadas nos rins dos animais
analisados segundo a classificação de Silva, 2002. .................................................47
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................12
1.1 A contaminação aquática ............................................................................................12
1.2 A bacia do ribeirão Jacutinga......................................................................................13
1.3 Biomarcadores como indicadores de poluição.............................................................14
1.4 Biomarcadores histopatológicos .................................................................................14
2 OBJETIVOS .....................................................................................................................18
2.1. Objetivos Gerais ........................................................................................................ 18
2.2. Objetivos Específicos ................................................................................................ 18
3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 20
3.1 As coletas ...................................................................................................................20
3.2 Espécies estudadas...................................................................................................... 20
3.3 Locais de coleta.......................................................................................................... 23
3.4 Grupos controles......................................................................................................... 27
3.5 Amostragem dos animais............................................................................................27
3.6 Processamento histológico..........................................................................................28
3.7 Análise do material.....................................................................................................28
3.8 Análise dos resultados ................................................................................................ 32
4 RESULTADOS.................................................................................................................33
4.1 Características da água................................................................................................ 33
4.2 Biometria dos animais ................................................................................................ 34
4.3 Histopatologia branquial.............................................................................................35
4.4 Histopatologia hepática............................................................................................... 39
4.5 Histopatologia renal....................................................................................................43
TRECHOS DE COLETA ....................................................................................................46
5 DISCUSSÃO ....................................................................................................................49
5.1 Histopatologia branquial.............................................................................................50
5.2 Histopatologia hepática............................................................................................... 52
5.2 Histopatologia renal....................................................................................................54
6 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 578
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................59
ANEXOS .............................................................................................................................64
1 INTRODUÇÃO
1.1 A contaminação aquática
A importância da água é mundialmente conhecida por ser um elemento
essencial à vida. Embora a água tenha se tornado indispensável em diversas atividades
humanas (irrigação agrícola, produção de energia, abastecimento público, recreação e lazer,
entre outras), somente nas últimas décadas o homem começa a se preocupar com a escassez
desse recurso.
O processo de urbanização, fruto do crescimento populacional global e dos
avanços industriais, colocou esse ecossistema em risco. Em 1980, Fellenberg já afirmava que
a poluição das águas processa-se num ritmo muito mais assustador, visto a grande quantidade
de compostos nocivos lançados nelas. Em muitas cidades de todo o mundo, o lançamento de
efluentes urbanos nos corpos d’água, aliado à falta de políticas públicas adequadas bem como
de recursos financeiros, corroboram para o agravamento da contaminação desse ambiente.
Ao atingirem as águas, o excesso de poluentes orgânicos presentes
principalmente nos efluentes domésticos e industriais e em alguns fertilizantes agrícolas
aceleram o processo de eutrofização. Isso significa uma redução do oxigênio disponível na
água e muitas vezes a geração de compostos, ambos dificultando a sobrevivência de muitos
organismos ou até eliminando-os (PHILLIPS, 1976). Da mesma maneira, materiais em
suspensão, também presentes em alguns escoamentos urbanos e agrícolas, prejudicam a
qualidade das águas e a sobrevivência dos organismos (ABEL, 1989).
Mas, a toxicidade de alguns compostos químicos presentes nesses rejeitos é,
muitas vezes, mais preocupante. É o caso de metais pesados e compostos organoclorados que
apresentam potencial de biomagnificação (MASON, 1996), visto que seus efeitos são
cumulativos ao serem transferidos na cadeia alimentar, e assim podem aparecer em tempos e
espaços indeterminados (JOBLING,1995) prejudicando a sobrevivência de muitas espécies.
1.2 A bacia do ribeirão Jacutinga
A cidade de Londrina, norte do Paraná, sofreu um crescimento desordenado,
principalmente a partir de 1960, com o contingente populacional que migrou da zona rural
para a cidade (KISHI, 2003). Esta rápida ocupação envolveu muitos rios e ribeirões sem o
devido acompanhamento ou planejamento dos órgãos públicos (NAKASHIMA, 2003).
Esta situação é encontrada na bacia do ribeirão Jacutinga. Essa bacia é uma
das mais importantes da região, apresentando a quarta maior área de drenagem entre as dez
bacias hidrográficas presentes em Londrina, com aproximadamente 241 km2. Parte dela,
inclusive sua nascente, localiza-se no extremo norte do município de Londrina, desaguando
no rio Tibagi, no município de Ibiporã, vizinho de Londrina. Seu maior afluente é o ribeirão
Lindóia que apresenta proporcionalmente uma área correspondente à metade da área da bacia
do Jacutinga. É um local com ocupação recente, mais intensificada depois da década de 80.
O ribeirão Jacutinga atravessa uma área eminentemente agrícola, onde são
produzidas, soja, milho e sorgo, além de algumas poucas horticulturas. O município de
Ibiporã possui um ponto de captação de água localizada na porção baixa do rio, antes da
confluência com o ribeirão Lindóia. O ribeirão Lindóia passa pela região urbana de Londrina
e recebe efluentes das águas pluviais e de esgotos domésticos clandestinos.
Em maio de 202, um vazamento de cerca de 100 mil litros de óleo diesel
proveniente do Pool de Combustíveis de Londrina atingiu as águas do ribeirão Lindóia,
intensificando a preocupação sobre o nível de contaminação nesta bacia hidrográfica.
1.3 Biomarcadores como indicadores de poluição
Um dos efeitos mais visíveis da contaminação aquática é a mortandade de
peixes e demais organismos viventes nos corpos d’água impactados. Contudo, concentrações
subletais de poluentes em ambientes aquáticos são mais freqüentes que a mortandade em
massa (POLÉKSIC; MITROVIC-TUTUNDZIC, 1994). As substâncias tóxicas podem ter
efeitos prejudiciais bastante visíveis quando presentes em grandes quantidades num
organismo, ao passo que quantidades diminutas de produtos tóxicos podem causar efeitos
adversos não aparentes (RAND; PETROCELLI, 1985; RAND, 1995).
Os teleósteos são um importante modelo de vertebrados em sistemas in vivo
para a análise de contaminantes ambientais (HINTON; COUCH, 1998). Como os vertebrados
primariamente aquáticos mais representativos, merecem atenção particular em programas de
monitoramento dos ecossistemas aquáticos (NAGEL; ISBERNER, 1998), visto que, quando
estes ambientes se encontram poluídos por contaminantes orgânicos ou inorgânicos, os peixes
são inevitavelmente contaminados (STREIT, 1998).
O estresse químico promovido por concentrações subletais de xenobióticos
nos ecossistemas aquáticos pode alterar a capacidade de peixes de realizar várias funções
biológicas (JOBLING, 1994). Assim, essas respostas biológicas fornecem informações sobre
as condições de seu habitat e podem ser empregadas como ferramenta no monitoramento
ambiental para um avaliação do impacto em locais poluídos, constituindo-se um biomarcador
(VAN der OOST et al, 2003).
1.4 Biomarcadores histopatológicos
Dentre as diversas alterações metabólicas e estruturais que podem ocorrer
devido a presença de contaminantes e outros agentes estressores no ambiente estão as
alterações histológicas (SNIESZKO, 1974; MÖLLER, 1985; ANDERSON, 1990). As
análises histopatológicas de órgãos-alvo constituem-se uma maneira sensível de detecção dos
efeitos diretos de compostos químicos, tanto em pesquisas de laboratório como em campo.
Por meio dessas análises, pode-se diferenciar as lesões presentes nos órgãos que foram
induzidas por doenças e outros fatores do ambiente daquelas causadas pela exposição aos
poluentes (SCHWAIGER et al., 1997).
Entre os órgãos considerados alvos para os contaminantes estão as
brânquias, o rim e o fígado que, nos peixes, costumam indicar os efeitos da poluição
apresentando alterações histológicas mais lentas que as fisiológicas, porém de alta relevância
funcional (ADAMS et al, 1990).
As brânquias estão diretamente envolvidas em uma variedade de funções,
dentre as quais trocas gasosas, osmorregulação, balanço ácido-básico e excreção de nitrogênio
(HEATH, 1987). Sua complexa arquitetura de filamentos compostos por lamelas achatadas,
densamente enfileiradas, revestidas por um extenso e delgado epitélio proporciona uma
grande área superficial para o movimento do oxigênio, dióxido de carbono, eletrólitos, água,
amônia e íons hidrogênio, entre o sangue e a água (MARTINEZ; CÓLUS, 2002). Devido a
este amplo contato permanente com o ambiente aquático, as brânquias podem reagir a agentes
estressores presentes no ambiente. Assim, alterações na organização branquial de peixes têm
sido usadas para defender a hipótese de que as brânquias são potenciais indicadores da
degradação de ambientes aquáticos (OJHA, 1999), que podem ser empregadas no
monitoramento ambiental (MEYERS; HENDRICKS, 1985; SCHWAIGER, et al., 1997).
O fígado de teleósteos é um dos órgãos mais sensíveis para mostrar
alterações bioquímicas, fisiológicas e estruturais como conseqüência da exposição a vários
tipos de poluentes ambientais (HEATH, 1987; HINTON; COUCH, 1998). Devido às suas
várias funções metabólicas, entre elas o metabolismo de xenobióticos, e sua sensibilidade a
poluentes do ambiente, este órgão tem recebido atenção especial em estudos toxicológicos,
relacionados à contaminação de diferentes espécies de peixes com agentes químicos orgânicos
e inorgânicos (HINTON et a.l., 1992). Assim, alguns parâmetros hepáticos, tais como
alterações histológicas e depleção de glicogênio, têm sido utilizados como biomarcadores de
contaminação aquática (HINTON et al., 1992) em programas de biomonitoramento
(SCHWAIGER et al., 1997).
Em exposições subcrônicas à contaminação, o rim é o órgão mais afetado,
quando comparado com brânquias e fígado (THOPHON et al, 2003), ficando claro que
problemas nesse órgão decorrentes da contaminação levarão certamente a complicações ainda
maiores nos demais sistemas do animal. Nos peixes dulcícolas a principal função do rim é
eliminar o excesso de água sem perder íons importantes, portanto esses animais possuem altas
taxas de filtração glomerular sendo que ocorre quase 100% de reabsorção dos íons Na+ e Cl(HICKMAN; TRUMP, 1969). O rim de peixes também é um importante órgão na elaboração
da resposta imunológica, então, alterações morfológicas nesse órgão podem comprometer a
resposta imune, prejudicando a homeostase do animal e seu bem-estar (ZAPATA; COOPER,
1990). Estudos histopatológicos renais em peixes têm sido realizados na tentativa de se
identificar lesões que possam vir a ser utilizadas como biomarcadores histológicos da
contaminação aquática (HINTON et al., 1992).
Assim, o presente trabalho enfoca o uso de análises histopatológicas como
uma ferramenta sensível para detectar a presença de contaminantes e seus possíveis efeitos
tóxicos em brânquias, fígados e rins de lambaris (Astyanax altiparanae) e de cascudos
(Hypostomus ancistroides) coletados na bacia do ribeirão Jacutinga.
2 OBJETIVOS
2.1. Objetivos Gerais
•
Verificar a ocorrência de alterações histológicas nas brânquias, fígados e rins de lambaris
(Astyanax altiparanae) e de cascudos (Hypostomus ancistroides) coletados na bacia do
ribeirão Jacutinga.
•
Utilizar as alterações histológicas como biomarcadores para a avaliação da qualidade
ambiental da bacia do ribeirão Jacutinga.
2.2. Objetivos Específicos
•
Analisar as brânquias, fígados e rins de exemplares de Astyanax altiparanae e de
Hypostomus ancistroides coletados em 6 locais da bacia do ribeirão Jacutinga (2 no
ribeirão Jacutinga e 4 no ribeirão Lindóia).
•
Analisar as brânquias, fígados e rins de exemplares de Astyanax altiparanae provenientes
da Estação de Piscicultura da UEL (EPUEL), para utilização como controle.
•
Analisar as brânquias, fígados e rins de exemplares de Hypostomus ancistroides coletados
em campo após serem submetidos a um processo de depuração, para utilização como
controle.
•
Identificar as alterações histológicas branquiais, hepáticas e renais em todos os animais
analisados.
•
Quantificar as alterações histológicas branquiais, hepáticas e renais dos animais
determinando-se o Valor Médio de Alteração (VMA) e o Índice de Alteração Histológica
(IAH) para cada órgão analisado.
•
Quantificar o glicogênio hepático presente nos animais em estudo.
•
Comparar os pontos de coleta entre si e com e com os controles, baseando-se nas
alterações observadas nos órgãos analisados, para verificação da qualidade ambiental dos
locais de coleta.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 As coletas
Duas espécies de peixes foram coletadas em diferentes trechos dos ribeirões
Jacutinga e Lindóia, escolhidos conforme a ocorrência dos peixes ao longo dos ribeirões, bem
como a facilidade de acesso aos locais. A captura dos animais deu-se por pesca artesanal, com
o uso de equipamentos de pesca manual como tarrafas, puçás, covos, peneiras e redes de
arrasto e de espera. Em algumas vezes, quando possível, empregou-se pesca elétrica.
Da água de cada local de coleta foram determinadas medidas de pH,
empregando-se pHmetro de bolso (Corning, pH – 30), temperatura e teor de oxigênio
dissolvido, por meio de oxímetro de campo (Orion 810), e condutividade, com condutivímetro
(Corning, CD – 30).
3.2 Espécies estudadas
A) Astyanax altiparanae (Garutti & Britski, 2000)
Figura 1. Foto de Astyanax altiparanae.
Nome popular: lambari-do-rabo-amarelo
Classe: Actinopterygii
Ordem: Characiformes
Família: Characidae
Subfamília: Tetragonopterinae
Presente em vários tipos de ambientes lênticos e lóticos, com ampla
distribuição geográfica, como os rios da bacia do Rio Paraná (BERTACO; LUCENA;
BECKER, 1998; GARUTI; BRITSKI, 2000).
Sua ocorrência em diversos habitats permite supor sua grande plasticidade
ecofisiológica para utilização desses habitats (BERTACO; LUCENA; BECKER, 1998) e
também uma tolerância a um amplo espectro de variação de diversos parâmetros físicos e
químicos da água (MENNI et al, 1996 apud, BERTACO; LUCENA; BECKER, 1998).
Os lambaris são peixes de pequeno porte (atingem cerca de 10cm),
prolíferos e servem de alimento para peixes carnívoros maiores. Desempenham importante
função na cadeia alimentar dos sistemas ecológicos em que ocorrem (AGOSTINHO et al.,
1984). Apresentam grande flexibilidade alimentar, alimentando-se principalmente de insetos e
sementes. São catadores de itens na coluna d'água.
A. altiparanae (GARUTI; BRITSKI, 2000), anteriormente denominada de
A. bimaculatus, é caracterizado por apresentar uma pinta e uma mancha preta de cada lado do
corpo, na região da linha lateral. Sua coloração, em geral, é amarela, com reflexos prata
iridescentes. As nadadeiras são amareladas com margem prateada.
Por se tratar de um animal da coluna d’água, pode sofrer maior impacto dos
componentes químicos que ocorrerem em suspensão na água.
B) Hypostomus ancistroides (Ihering, 1911)
A)
Figura 2. Hypostomus ancistroides (Foto de Horácio Mori).
Nome popular: cascudo
Classe: Actinopterygii
Ordem: Siluriformes
Família: Loricariidae
São animais de água doce. Apresentam o corpo recoberto por placas ósseas
em várias séries. Os lábios são alargados em forma de dentículos com dois lobos desiguais,
adaptados para raspar algas de substrato. São, portanto, pastadores, com dieta composta
principalmente por diatomáceas, clorofíceas e matéria orgânica. Possuem cauda achatada,
normalmente com quilha lateral.
São organismos bentônicos, de extrema importância para o ecossistema por
promoverem a circulação da matéria orgânica depositada no substrato (FAVARO; CHAVES,
1999).
Assim, por serem detritívoros e ocuparem fundo de rios, estão mais sujeitos
a incorporar os eventuais contaminantes presentes tanto na água como no sedimento.
3.3 Locais de coleta
Seis trechos dos ribeirões foram escolhidos para a coleta dos peixes: dois no
ribeirão Jacutinga (J1 e J2) e quatro no ribeirão Lindóia (L1, L2, L3 e L4). Os lambaris foram
coletados nos dois trechos do ribeirão Jacutinga e nos trechos L1, L2, L4 do ribeirão Lindóia;
os cascudos foram coletados apenas no trecho J1 do ribeirão Jacutinga e nos trechos L1, L2 e
L3 do ribeirão Lindóia. A localização dos trechos está representada na Figura 3.
Figura 3. Mapa da bacia hidrográfica do ribeirão Jacutinga, Londrina, PR, com a localização dos trechos de
coleta de A. altiparanae e H. ancistroides. Projeção UTM, fonte: IBGE, folhas SF-22-U-II e SF-22-U-I.
A bacia do Jacutinga possui área de drenagem de 241 km2. Corre por uma
extensão de 32 km e tem cerca de 15 tributários na margem esquerda e 15 na margem direita.
O ribeirão Lindóia, seu maior afluente, nasce próximo ao trevo LondrinaCambé, com inclinação noroeste-nordeste, atravessa o norte do município de Londrina no
sentido longitudinal e deságua na margem direita do ribeirão Jacutinga, no município de
Ibiporã (14 Km a leste de Londrina).
Próximo ao Lindóia, localiza-se o Pool de Combustíveis, formado por uma
associação entre as empresas Esso, Texaco e Petróleo Ipiranga (administradora), responsável
pelo vazamento de cerca de 100 mil litros de óleo diesel no ribeirão no início de 2002.
Os trechos de coleta estão caracterizados a seguir.
Trecho J1 (23º14’3,2’’S - 51º13’4,7’’W): Margens com vegetação ripária escassa (bambu,
capim gordura, capim elefante, etc), algumas áreas de mata terciária, outras de área degradada
em recuperação e área agrícola. Substrato composto por laje entremeado de solo e por rochas
de diversos tamanhos (Fig. 4a).
Trecho J2 (23º13’36,2”S – 50º38’42,7”W): Margem direita com capim colonião e ainda
cultivo de milho a menos de 3m da margem; margem esquerda com uma mata restaurada com
cerca de 20m de árvores. Substrato com rochas de diversos tamanhos, entremeadas com lama
e poucas Lages (Fig. 4b).
a)
b)
Figura 4. Trechos de coleta no ribeirão Jacutinga: a) Trecho J1 e b) Trecho J2.
Trecho L1 (23º16’24”S – 51º9’55,9”W): Localizado ainda em área urbana, corre sob uma
ponte. Margens com uma vegetação composta basicamente por gramíneas; leito composto
basicamente por substrato argiloso, com poucas pedras de pequeno porte espalhadas pelo
mesmo (Fig. 5a).
Trecho L2 (23º 16' 23,5"S - 51º 8' 0,5"W): Margem direita: predominantemente com
gramíneas (contas). Margem esquerda: mata secundária (cerca de 20 a 30m de largura).
Diversas barragens artificiais constituídas de troncos e rochas. Tipo de substrato: Laje, poucas
rochas soltas, pouca lama (Fig. 5b).
Trecho L3 (23º17’19,5”S – 51º6’20,9”W): Presença de mata ciliar estreita em ambas as
margens. Substrato rochoso, intercalando lajes e rochas soltas. Situado em zona urbana, onde
se localizam pequenas chácaras e pesque-pagues, próximo às indústrias Milênia Agro
Ciências e Frango-vit (Fig. 5c).
Trecho L4 (23º16’40,7”S – 51º5’41,6”W): Localizado a jusante da foz do ribeirão Água das
pedras, substrato composto por lama, ausência de mata ciliar, pequena plantação à margem
direita, predomínio de gramínea em ambas as margens, área marginal sujeita a alagamento.
Situado fora da área urbana (Fig. 5d).
a)
b)
c)
d)
Figura 5. Trechos de coleta no ribeirão Lindóia: a) trecho L1; b) trecho L2; c) trecho L3 e d) trecho L4.
3.4 Grupos controles
Lambaris cedidos pela Estação de Piscicultura da UEL foram aclimatados
em laboratório por 10 dias em tanque contendo água de poço artesiano e então amostrados.
Já os cascudos usados como controle foram capturados no ribeirão Cambé,
um ribeirão pertencente a uma outra bacia hidrográfica de Londrina, livre, portanto, de
qualquer influência que o óleo do vazamento possa ter exercido sobre os animais. Esses
animais foram acondicionados em laboratório por 15 dias em tanque contendo água de poço
artesiano e algumas pedras com detritos de que pudessem se alimentar. Os cascudos foram
submetidos a um processo de depuração que se deu com a troca de 2/3 da água do tanque a
cada três dias até serem amostrados, totalizando três trocas de água.
3.5 Amostragem dos animais
Imediatamente após serem retirados da água, os peixes foram sacrificados
por meio de secção medular. Em seguida, foram obtidas suas biometrias (peso e
comprimentos total e padrão) e suas brânquias, fígado e rim foram retirados com material de
dissecção. Para preservação química e estrutural, as brânquias e os fígados extraídos foram
fixados em solução de Bouin por 8 horas e os rins por 12 horas (ANEXO A). Após este
período no fixador, os órgãos foram conservados em álcool 70% até serem processados
histologicamente.
3.6 Processamento histológico
Em primeiro lugar, o segundo arco branquial direito foi separado e
descalcificado com EDTA (ANEXO B). Posteriormente, esse arco branquial descalcificado,
uma parte do fígado e os rins dos peixes coletados foram impregnados e incluídos em parafina
(INLAB) após adequada desidratação numa série crescente de álcoois (80, 90 , 95 e 100%) e
diafanização em xilol (PA) (ANEXOS C e E).
Os blocos formados de cada órgão foram cortados em micrótomo American
Optical “820” em cortes de 4 e 5µm de espessura, esticados em banho-maria a cerca de 48ºC
e retirados com as lâminas e aderidos a elas com gelatina em pó. As lâminas foram secas em
temperatura ambiente e então coradas com Hematoxilina e Eosina (HE) (ANEXO D e F).
Cortes de fígado também foram submetidos à reação histoquímica de PAS
(Periodic Acid Schiff) para detecção de glicogênio nos hepatócitos (ANEXO G).
As lâminas permanentes foram montadas com bálsamo do Canadá sintético
(Nuclear) para fixação das lamínulas e secas em temperatura ambiente. Posteriormente, as
lâminas de cada órgão foram analisadas ao microscópio de luz, fotografadas por uma câmara
digital (Motic Cam) e analisadas utilizando-se o software Motic 2000.
3.7 Análise do material
Os mesmos critérios de classificação das lesões histológicas foram adotados
para os três órgãos em estudo, levando-se em conta os possíveis desvios na morfologia normal
de cada órgão. Assim, as alterações histológicas nas brânquias, fígados e rins de cada animal
amostrado foram avaliadas semiquantitativamente de duas formas:
A) Atribuição do Valor Médio de Alteração Histológica (VMA)
O VMA está associado à ocorrência de alterações histopatológicas, tanto nas
brânquias quanto no fígado e nos rins. Cada órgão analisado foi classificado, baseado em
Schwaiger et al. (1997), com um valor numérico conforme a escala:
grau 1: ausência de alteração histológica,
grau 2: ocorrência de lesões pontualmente localizadas,
grau 3: lesões amplamente distribuídas pelo órgão.
Ao final, foram calculadas as médias desses valores de VMA para cada
local amostrado.
B) Cálculo do Índice de Alteração Histológica (IAH)
A severidade de cada alteração histológica encontrada nos três órgãos em
estudo foi classificada em estágios progressivos quanto ao comprometimento das respectivas
funções teciduais:
estágio I: alterações que não comprometem o funcionamento do tecido,
estágio II: alterações mais severas e que prejudicam o funcionamento
normal do órgão,
estágio III: alterações muito severas e irreversíveis.
Essa classificação é modificada por Silva (2004) de Poleksic e MitrovicTutundzic (1994) para as brânquias; baseada em Poleksic e Mitrovic-Tutundzic (1994) e
modificada por Rigolin De Sá (1998) para os fígados; e segundo Silva (2002) para os rins. Na
Tabela 2 encontram-se as possíveis alterações histológicas de cada órgão segundo sua
classificação nesses estágios.
Esses dados foram utilizados para o cálculo do valor do IAH, através da
fórmula: IAH =100 ΣI + 101 ΣII + 102 ΣIII, sendo I, II e III correspondente ao número de
alterações de estágio I, II e III, respectivamente.
Uma média dos valores de IAH também foi calculada para cada local
amostrado e para cada controle. Com os valores das médias de IAH, denominados índices
médios (I), relacionou-se a severidade das alterações com o comprometimento funcional do
órgão e sua capacidade de recuperação. A Tabela 1 mostra essa associação entre o índice
médio (I) e o efeito da severidade das alterações sobre os órgãos, numa escala de 0 a 100.
Tabela 1. Escala do índice médio (0 – 100) associado aos efeitos no funcionamento do órgão.
Índice Médio
0 – 10
11 – 20
21 – 50
51 – 100
> 100
Efeito
Funcionamento normal do órgão
Danificação leve a moderada do órgão
Modificação moderada a severa do órgão
Modificação severa do órgão
Danificação irreparável do órgão
Tabela 2. Classificação das alterações histológicas de brânquias, fígado e rim quanto ao
estágio de comprometimento das funções teciduais.
Estágio
BRÂNQUIA
Congestão vascular
I
Constrição do seio lamelar
sanguíneo
Desarranjo lamelar
Dilatação do canal marginal
Dilatação do seio lamelar
sanguíneo
Elevação das células epiteliais
Fusão de parte da lamela
primária
Fusão de parte da lamela
secundária
Fusão de várias lamelas
secundárias
Hiperplasia das células
epiteliais
Hipertrofia do epitélio lamelar
Presença de parasitas
II
Aneurisma lamelar
Completa fusão de toda lamela
secundária
Espessamento do tecido
proliferativo
Rompimento de células pilares
Ruptura do epitélio lamelar
ÓRGÃO
FÍGADO
Atrofia celular
Atrofia nuclear
Deformação do contorno celular
Deformação do contorno
nuclear
Dessaranjo dos cordões
hepáticos
Estagnação biliar
Hipertrofia celular
Fibrose
Necrose focal
Aumento do volume glomerular
Degeneração granular
Degeneração hialina
Núcleo na periferia da célula
Dilatação da luz tubular
Dilatação dos capilares do
glomérulo
Espessamento do endotélio
capilar glomerular
Estreitamento da luz tubular
Vacuolização citoplamática
Hipertrofia celular
Hipertrofia nuclear
Hipertrofia nuclear
Presença de parasitas
Túbulos em regeneração
Vacuolização celular
Degeneração citoplamática
Degeneração dos canalículos
biliares
Degeneração nuclear
Degeneração nuclear
Degeneração tubular
Hiperemia
Núcleos picnóticos
Rompimento celular
Núcleos picnóticos
Oclusão da luz tubular
Presença de hemácias no espaço
de Bowman
Redução do espaço de Bowman
Rompimento celular
Vacuolização nuclear
Ruptura dos vasos
Vacuolização nuclear
III
RIM
Atrofia celular
Atrofia nuclear
Necrose focal
Necrose total
Novo néfron
Necrose focal
Necrose total
A quantidade de glicogênio nos hepatócitos, evidenciada pela coloração da
reação histoquímica de PAS (Periodic Acid Schiff), foi determinada conforme a seguinte
escala:
0 – ausência de glicogênio,
1 – pouco glicogênio,
2 – quantidade moderada de glicogênio,
3 – muito glicogênio.
Após essa análise, foi calculada uma média do conteúdo de glicogênio dos
hepatócitos para cada local amostrado e para os controles.
3.8 Análise dos resultados
As médias de VMA e IAH obtidas para os três órgãos dos animais
amostrados nos trechos, bem como as médias da quantidade de glicogênio nos hepatócitos dos
animais, foram comparadas entre si e com as médias dos controles utilizando-se testes
estatísticos adequados, de acordo com a distribuição dos dados e homogeneidade da variância,
com nível de significância menor que 5% (P< 0,05).
4 RESULTADOS
4.1 Características da água
Os resultados físico-químicos da água dos locais de coleta estão representados na
30
25
20
15
10
5
0
J1
J2
L1
L2
Oxigênio Dissolvido
B)
L3
L4
Temperatura
60
50
40
30
20
10
0
8
pH
7,5
7
6,5
6
J1
J2
L1
pH
L2
TºC
12
10
8
6
4
2
0
L3
Cond. (us/cm)
A)
O.D. (mgO2/L)
Figura 6.
L4
Condutividade
Figura 6. Características físico-químicas da água de cada local de coleta. A) Medidas de
oxigênio dissolvido e temperatura. B) Medidas de pH e condutividade.
A maior medida de oxigênio dissolvido foi 8 mgO2/L., no trecho L4, e a
menor foi 4mgO2/L, no trecho J2. A leitura do oxigênio dissolvido na água do trecho L1 não
foi realizada.
A temperatura mais elevada observada foi 28ºC no trecho J2, sendo que a
temperatura dos demais locais manteve-se em torno de 20ºC.
Os resultados de pH apresentaram pouca variação entre os locais amostrados
(entre 6,7 e 7,3). A condutividade foi maior no trecho L2 (54,1µs/cm), e menor no trecho L1
(21µs/cm).
4.2 Biometria dos animais
Na Tabela 3 estão as médias de peso, comprimento padrão e do cálculo do
fator de condição dos animais coletados.
Tabela 3. Biometria e fator de condição dos peixes amostrados.
Espécie
Astyanax altiparanae
Local
J1
J2
L1
L2
L4
CTR
TOTAL
n
12
15
15
9
8
12
71
Peso (g)
9,8 ± 6,3
14,5 ± 3,8
11,1 ± 8,4
10,8 ± 5,2
12,8 ± 3,1
18,8 ± 3,8
Comprimento padrão (cm)
7,1 ± 1,2
7,8 ± 0,7
7,2 ± 1,4
7,2 ± 1,1
7,4 ± 1,0
9,0 ± 0,8
Fator de condição (K)
1,3 ± 0,3
1,6 ± 0,1
1,4 ± 0,2
1,4 ± 0,1
1,7 ± 0,2
1,4 ± 0,1
Hypostomus ancistroides
J1
9
30,6 ± 17,4
10,7 ± 2,1
1,1 ± 0,2
L1
7
34,7 ± 29,4
10,6 ± 3,1
1,0 ± 0,1
L2
9
22,5 ± 24,7
9,1 ± 3,4
1,0 ± 0,1
L3
7
73,2 ± 33,2
13,9 ± 2,5
0,9 ± 0,2
CTR
7
25,6 ± 8,4
10,3 ± 1,2
1,0 ± 0,1
39
TOTAL
TOTAL 110
n = número de animais coletados; média ± desvio padrão; Fator de condição (K) = Peso/ (Comprimento total x
comprimento total x comprimento total) x 100.
Os exemplares de Hypostomus ancistroides apresentaram-se maiores que os
de Astyanax altiparanae. Porém, o fator de condição destes foi maior que o dos cascudos.
Infelizmente, a análise de todos os animais amostrados não foi possível em
virtude do tempo disponível. A Tabela 4 mostra o número de cada órgão analisado por
espécie e por local.
Tabela 4. Número de órgãos analisados.
Espécie
Astyanax altiparanae
Local
J1
J2
L1
L2
L4
CTR
TOTAL
Brânquia
12
15
15
9
8
12
71
Órgão analisado
Fígado
0
4
4
4
4
4
20
Rim
4
4
7
7
6
6
34
Total de animais
coletados
12
15
15
9
8
12
71
Hypostomus ancistroides
J1
L1
L2
L3
CTR
TOTAL
TOTAL
9
7
9
7
7
39
110
0
4
4
4
4
16
36
4
6
4
4
6
24
58
9
7
9
7
7
39
110
4.3 Histopatologia branquial
As duas espécies de peixe analisadas apresentam a estrutura branquial típica
descrita para teleósteos. Possuem quatro pares de arcos branquiais, um em cada lado da
faringe, compostos por diversos filamentos (ou lamelas primárias), sobre os quais dispõem-se
as lamelas secundárias a intervalos regulares, acima e abaixo dos filamentos. Estas lamelas
secundárias são constituídas por duas finas camadas de células epiteliais pavimentosas as
quais envolvem os espaços vasculares formados pelas células pilares. A Figura 7A mostra
este arranjo branquial típico, sem a ocorrência de alterações.
As histopatologias mais freqüentes estão apresentadas nas Tabelas 5 e 6.
Hiperplasia das células epiteliais (Fig. 7D), hipertrofia do epitélio
respiratório (Fig. 7B), desarranjo lamelar, fusão de parte da lamela secundária (Fig. 7B e 7F) e
congestão vascular (Fig. 7D) foram as alterações de estágio I mais freqüentes nos lambaris
(Tabela 5). Aneurisma lamelar (Fig. 7C), uma alteração de estágio II, foi encontrada nos
lambaris de todos os locais de coleta e no grupo controle, porém sendo freqüente nos trechos
J2 e L1, e muito freqüentes em L2 e L4. Outra alteração de estágio II observada foi a ruptura
do epitélio lamelar (Fig. 7E), freqüente em J1 e muito freqüente em L2.
As alterações branquiais nos cascudos (Tabela 6) foram menos freqüentes
que nos lambaris. Hipertrofia do epitélio respiratório, hiperplasia das células epiteliais,
desarranjo lamelar e fusão de parte da lamela secundária foram as alterações de estágio I que
mais ocorreram. Alterações de estágio II nos cascudos foram raramente presentes ou pouco
freqüentes. Somente L1 apresentou uma alteração de estágio II freqüente, o rompimento de
células pilares.
As médias de VMA dos lambaris coletados mantiveram-se entre 2 e 2,6,
sendo os trechos L4 e J2 significativamente maiores que o controle, e J2 significativamente
maior que J1 (Fig. 13a). As médias de IAH mantiveram-se entre 11,5 e 22,2, sendo os trechos
L2 e L4 significativamente maiores dos demais trechos de coleta e do controle (Fig. 13b). Os
valores de VMA e IAH para as brânquias de cascudos não variaram significativamente entre
os diferentes pontos de amostragem. As médias de VMA foram de 2,3 e 2,4 (Fig. 13a), e de
IAH mantiveram-se entre 10,6 e 16,1, sendo a maior no J1 e a menor em L3 (Fig. 13b).
A)
B)
D)
C)
*
*
*
*
E)
*
F)
Figura 7. Fotomicrografia do tecido branquial dos animais analisados. A) Estrutura normal de
um filamento branquial (seta branca) mostrando lamelas sem alterações (colchete) e as células
pilares (seta preta) (Foto de A. Silva). B) Fusão de lamelas devido à hipertrofia das células
epiteliais (cabeça de seta). C) Aneurismas lamelares (asteriscos). D) Hiperplasia das células
epiteliais (colchete e seta preta) e congestão lamelar (asterisco). E) Ruptura do epitélio
lamelar (cabeça de seta). F) Fusão focal das lamelas devido à hiperplasia das células epiteliais
(seta branca). Escala barra = 25µm. HE.
Tabela 5. Freqüência das alterações histológicas encontradas nas brânquias dos Astyanax
altiparanae analisados segundo a classificação das lesões (modificado de Poleksic e MitrovicTutundzic, 1994 por Silva, 2004).
TRECHOS DE COLETA
ALTERAÇÃO HISTOLÓGICA
BRANQUIAL
J1
J2
L1
L2
Índice
Congestão vascular
I
+
+
0+
+++
Constrição do seio lamelar sanguíneo
I
0
0
0
0
Desarranjo lamelar
I
0
++
+++
0
Dilatação do canal marginal
I
+
0+
0
++
Dilatação do seio lamelar sanguíneo
I
0+
0+
0+
++
Elevação das células do epitélio
I
0+
+
+
+
Fusão de parte da lamela primária
I
0+
0
0
0
Fusão de parte da lamela secundária
I
0
++
++
0+
Fusão de várias lamelas secundárias
I
++
0
0
++
Hiperplasia com fusão lamelar
I
0
0+
+
0+
Hiperplasia das células epiteliais
I
+++
+++
+++
+++
Hipertrofia do epitélio respiratório
I
0+
++
++
+
Presença de parasitas
I
0
0+
0+
0
Proliferação de células de cloreto
I
0
0
0
0
Aneurisma lamelar
II
0+
++
++
+++
Completa fusão de toda lamela secundária
II
0
0
0
0
Espessamento do tecido proliferativo
II
+
0+
0
0+
Ruptura do epitélio lamelar
II
++
0+
0+
+++
0 ausente; 0+ raramente presente; + pouco freqüente; + + freqüente; + + + muito freqüente.
L4
++
0+
++
+
0+
++
0
0+
+
0
+++
+++
0+
0+
+++
0
+
0+
CTR
0
0
+++
0
+
0+
0
0+
0+
++
+++
+++
+
0+
+
0+
0
0+
Tabela 6. Freqüência das alterações histológicas encontradas nas brânquias dos H.
ancistroides analisados segundo a classificação das lesões (modificado de Poleksic e
Mitrovic-Tutundzic, 1994 por Silva, 2004).
TRECHOS DE COLETA
ALTERAÇÃO HISTOLÓGICA
BRANQUIAL
J1
L1
L2
L3
Índice
Congestão vascular
I
0+
0
0
0
Desarranjo lamelar
I
+++
+++
+++
+++
Dilatação do seio lamelar sanguíneo
I
0+
0
0+
+
Elevação das células do epitélio
I
0
0+
0
+
Fusão de parte da lamela primária
I
0
0
0+
0
Fusão de parte da lamela secundária
I
0+
++
++
++
Fusão de várias lamelas secundárias
I
0
0
0
0+
Hiperplasia com fusão lamelar
I
0
0+
0+
0+
Hiperplasia das células epiteliais
I
+++
+
+++
+++
Hipertrofia do epitélio respiratório
I
+++
+
++
++
Muco
I
0+
0
0
0
Presença de parasitas
I
0+
+
0+
+
Proliferação de células de cloreto
I
0+
0+
0+
0
Aneurisma lamelar
II
+
0+
0+
0
Completa fusão de toda lamela secundária
II
0+
0
0+
0
Espessamento do tecido proliferativo
II
0
0+
0+
0
Rompimento de células pilares
II
+
++
0
0+
Ruptura do epitélio lamelar
II
+
0
+
+
0 ausente; 0+ raramente presente; + pouco freqüente; + + freqüente; + + + muito freqüente.
CTR
0
+++
0
++
0
+
+
0
+++
+++
0
+
0
0
0
0
0
+
4.4 Histopatologia hepática
O fígado dos animais estudados apresentou hepatócitos hexagonais, com citoplasma
de aspecto granular e vacuolizado, núcleo arredondado e central e nucléolo evidente. Os
hepatócitos dispõem-se em cordões margeando os sinusóides (Fig. 8A). Também compõem a
arquitetura hepática, os ductos biliares (células epiteliais cúbicas envoltas por uma camada de
tecido conjuntivo), as células endoteliais dos vasos sanguíneos e alguns macrófagos. A
presença de hepatopâncreas (porções do tecido pancreático entre as células do parênquima
hepático) foi muito comum nos fígados analisados.
Nas Tabelas 7 e 8 encontram-se as alterações hepáticas mais freqüentes nos lambaris e
nos cascudos analisados, respectivamente.
Deformação do contorno nuclear (Fig. 8C), núcleo na periferia da célula
(Fig. 8C), atrofia nuclear (Fig. 8E) e atrofia celular foram as alterações de estágio I mais
observadas tanto nos lambaris quanto nos cascudos (Tab. 7 e 8).
Quanto às alterações de estágio II, para os lambaris, a presença de núcleos
picnóticos (Fig. 8B, D e E) foi muito freqüente em L1 e L4, e freqüente em L2; a
vacuolização nuclear (Fig. 8B e C) foi freqüente em L1 e L4; a degeneração nuclear foi
freqüente em L2; e a hiperemia (Fig. 8D) foi freqüente em L1. Já para os cascudos, a
degeneração citoplasmática (Fig. 8B) e a presença de núcleos picnóticos foram muito
freqüentes em J2; a degeneração nuclear foi freqüente em J1, L1 e L2; a hiperemia foi
freqüente em L1 e L3; e a vacuolização nuclear foi muito freqüente em J2 e freqüente em L2
e L3.
A única alteração encontrada de estágio III foi a necrose focal, a qual esteve
raramente presente apenas nos lambaris de L4, sendo ausentes nos demais animais.
As médias de VMA do fígado das duas espécies estudadas não foram
estatisticamente diferentes entre os pontos de coleta e o grupo controle. Estas variaram entre 2
e 2,5 para os lambaris coletados, sendo a menor média observada em L4 e a maior em L2 e J2
(Fig. 13c). As médias de VMA dos cascudos coletados variaram entre 2 e 2,3, sendo a menor
em L1 e L3 e a maior em L2 (Fig. 13c).
O IAH dos lambaris coletados manteve-se entre 35 (em L2) e 50,5 (em L3)
(Fig 13d).
Os cascudos coletados na bacia do Jacutinga apresentaram valores de IAH
significativamente diferentes do controle, porém com médias bem menores que as dos
lambaris: entre 22,3 (em L1) e 28,5 (em L2) (Fig 13d).
A)
B)
C)
D)
E)
*
Figura 8. Fotomicrografia do tecido hepático dos animais analisados. A) Disposição dos
hepatócitos em cordões margeando um capilar sinusóide. B) Vacuolização nuclear (setas
pretas), degeneração do citoplasma (seta branca) e núcleo picnótico (cabeça de seta). C)
núcleos na periferia da célula (círculo preto), deformação do contorno celular (seta branca) e
núcleo hipertrofiado e com vacuolização (seta preta). D) Hiperemia (asterisco) e núcleo
picnótico (cabeça de seta). E) Hipertrofia nuclear (seta branca), núcleo picnótico (cabeça de
seta) e atrofia nuclear (seta preta). Escala barra = 25µm. HE.
Tabela 7. Freqüência das alterações histológicas encontradas nos fígados dos Astyanax
altiparanae analisados segundo a classificação das lesões (baseada em Poleksic e MitrovicTutundzic,1994, e modificada por Rigolin De Sá ,1998).
TRECHOS DE COLETA
ALTERAÇÃO HISTOLÓGICA
HEPÁTICA
L1
L2
L4
Índice
Atrofia celular
I
+++
0
+
Atrofia nuclear
I
++
+
+
Deformação do contorno nuclear
I
++
0+
0
Hipertrofia nuclear
I
0+
0
0+
Núcleo na periferia da célula
I
+++
+++
+++
Degeneração citoplamática
II
+
+
+
Degeneração nuclear
II
0+
++
0
Hiperemia
II
++
+
0
Núcleos picnóticos
II
+++
++
+++
Vacuolização nuclear
II
++
+
++
Necrose focal
III
0
0
0+
0 ausente; 0+ raramente presente; + pouco freqüente; + + freqüente; + + + muito freqüente.
CTR
0
0
+
0
+++
0
0
0+
+
+
0
Tabela 8. Freqüência das alterações histológicas encontradas nos fígados dos H. ancistroides
analisados segundo a classificação das lesões (baseada em Poleksic e MitrovicTutundzic,1994, e modificada por Rigolin De Sá ,1998).
TRECHOS DE COLETA
ALTERAÇÃO HISTOLÓGICA
HEPÁTICA
J2
L1
L2
L3
Índice
Atrofia celular
I
+
++
0+
++
Atrofia nuclear
I
0+
0+
++
0+
Deformação do contorno celular
I
0+
0+
0
0+
Deformação do contorno nuclear
I
++
+++
++
+++
Hipertrofia nuclear
I
0+
0+
0
0+
Núcleo na periferia da célula
I
+++
+++
+++
++
Degeneração citoplamática
II
+++
0+
+
0
Degeneração nuclear
II
++
++
++
+
Hiperemia
II
0
++
0+
++
Núcleos picnóticos
II
+++
0
0+
0
Vacuolização nuclear
II
+++
0
++
++
0 ausente; 0+ raramente presente; + pouco freqüente; + + freqüente; + + + muito freqüente.
CTR
+
0+
0
+
+
+++
0
0
0
0
0+
A vacuolização citoplasmática, comum nos hepatócitos dos teleósteos, foi
muito freqüente nos animais analisados. A classificação empregada para a quantificação do
glicogênio hepático, por meio da coloração da reação histoquímica de PAS, pode ser
observada na Figura 9.
A)
B)
D)
C)
E)
Figura 9. Fotomicrografia hepática dos animais analisados evidenciando a quantificação do
glicogênio presente nos hepatócitos. A) Vacuolização citoplasmática (coloração HE). B)
Ausência de glicogênio nos hepatócitos (reação de PAS). C) Hepatócitos com pouca
quantidade de glicogênio (reação de PAS). D) Hepatócitos com quantidade moderada de
glicogênio (reação de PAS). E) Hepatócitos com muito glicogênio (reação de PAS). Escala
barra = 25µm. HE.
A relação do conteúdo de glicogênio presente nesses vacúolos com a
freqüência em que a vacuolização citoplasmática ocorreu encontra-se na Figura 10.
100
2
75
50
1
25
0
0
quantificação do
glicogênio
CTR
B)
%
3
J2
L1
L2
L4
100
3
75
2
1
50
25
0
0
CTR
quantidade de glicogênio
L1
L2
%
quantificação do
glicogênio
A)
L3
vacuolização citoplasmática
Figura 10. Relação entre as médias da quantidade de glicogênio hepático e a freqüência da
vacuolização citoplasmática dos hepatócitos dos animais analisados. A) Astyanax altiparanae.
B) Hypostomus ancistroides.
Os lambaris e os cascudos coletados apresentaram uma reserva de glicogênio hepático
compatível a vacuolização observada nos hepatócitos (Fig. 10A e B), embora a reserva dos
cascudos dos trechos L1 e L3 tem sido um pouco menores.
Os animais dos dois grupos controles apresentaram intensa vacuolização
citoplasmática, porém pouca quantidade de glicogênio nos hepatócitos.
4.5 Histopatologia renal
As Figuras 11A e 11B mostram o arranjo normal dos túbulos renais e de um
corpúsculo renal, respectivamente.
De maneira geral, as mesmas alterações ocorreram nas duas espécies
estudadas, porém com maiores freqüências nos lambaris (Tabelas 9 e 10).
Degeneração granular (Fig. 11G), degeneração hialina (Fig. 11I),
estreitamento da luz tubular, hipertrofia celular, hipertrofia nuclear, vacuolização celular e
dilatação dos capilares do glomérulo (Fig. 11E) foram as alterações de estágio I mais
freqüentes tanto nos lambaris quanto nos cascudos (Tabelas 9 e 10). Além dessas, o aumento
do volume glomerular (Fig. 11E) também foi freqüente nos cascudos (Tabelas 10).
Degeneração tubular (Fig. 11C e D), oclusão da luz tubular (Fig. 11D) e
redução do espaço de Bowman (Fig. 11C e E) foram as alterações de estágio II mais
encontradas nos lambaris coletados, principalmente nos trechos J2, L1, L2 e L4 (Tabela 9). A
presença de núcleos picnóticos foi muito freqüente nos lambaris de J2 (Tabela 9). Para os
cascudos coletados, a redução do espaço de Bowman foi muito freqüente em todos os trechos;
a degeneração tubular foi freqüente em J1 e muito freqüente em L3 (Tabela 10).
A oclusão da luz tubular e a redução do espaço de Bowman foram as únicas
alterações de estágio II muito freqüentes nos dois controles (Tabelas 9 e 10).
A necrose focal (Fig. 11H), de estágio III, foi freqüente nos lambaris de J2 e
L4, pouco freqüente nos cascudos de J1, e raramente presente nos lambaris de J1 e L1, sendo
ausente nos demais locais (Tabelas 9 e 10).
Nas figuras 13e e 13f observam-se que as médias de VMA e de IAH dos
rins dos animais estudados apresentaram os maiores valores encontrados quando comparado
aos outros órgãos analisados. Para os lambaris, o VMA manteve-se entre 2 e 2,8, para J1 e J2
respectivamente, e o IAH entre 29,7 e 111,3, para L2 e J2 respectivamente. As médias de L3
também foram bem elevadas, apresentando VMA de 2,7 e IAH de 106,5. Para os cascudos, o
VMA também se manteve entre 2 e 2,8, porém para L1 e J1 respectivamente, e o IAH entre
32, 3, para L4, e 76, para J1. Apesar dos elevados valores observados, não houve diferença
significativa visto os grandes desvios nas médias.
A)
B)
C)
D)
E)
*
F)
G)
H)
I)
Figura 11. Fotomicrografia renal dos animais analisados. A) Exemplo de túbulos renais sem alteração (foto de A.
Silva). B) Corpúsculo renal sem alteração, evidenciando o espaço de Bowman (seta branca). C) Degeneração
tubular (cabeça de seta) e redução do espaço de Bowman (seta branca) devido ao aumento do volume glomerular
(asterisco) e à dilatação dos capilares do glomérulo (seta preta). D) Detalhe da degeneração tubular (cabeça de
seta) e oclusão da luz tubular (setas pretas). E) Detalhe da redução do espaço de Bowman (setas brancas). F)
Núcleos hipertrofiados e degenerados (seta branca). G) Degeneração granular (seta preta). H) Necrose focal. I)
degeneração hialina (seta preta). Escala barra = 25µm. HE.
Tabela 9. Freqüência das alterações histológicas encontradas nos rins dos Astyanax
altiparanae analisados segundo a classificação das lesões (SILVA, 2002).
TRECHOS DE COLETA
ALTERAÇÃO HISTOLÓGICA
RENAL
J1
J2
L1
L2
Índice
Atrofia do glomérulo
I
0
0+
0
0
Aumento do volume glomerular
I
0
+
+
+
Degeneração granular
I
0
0+
+++
+++
Degeneração hialina
I
++
+++
++
++
Dilatação dos capilares do glomérulo
I
0+
+
++
++
Espessamento do endotélio capilar
glomerular
I
0
0
0
0
Estreitamento da luz tubular
I
0+
0
++
+++
Hipertrofia celular
I
0+
0
+++
+
Hipertrofia nuclear
I
0+
0+
++
0+
Presença de parasitas
I
0
0
0
0
Túbulos em regeneração
I
0
+
0+
0
Vacuolização celular
I
+
++
0+
0
Degeneração nuclear
II
0
0
0
0+
Degeneração tubular
II
0+
+++
++
+
Núcleos picnóticos
II
0
+++
0
0
Oclusão da luz tubular
II
0
+
+++
+++
Presença de hemácias no espaço de
Bowman
II
0
0
+
0
Redução do espaço de Bowman
II
++
++
+++
+++
Necrose focal
III
0+
++
0+
0
0 ausente; 0+ raramente presente; + pouco freqüente; + + freqüente; + + + muito freqüente.
L4
0
+
+++
+++
+
CTR
0
0+
+++
+++
+++
0+
+
+++
0+
0+
0
0+
0
+++
0
+++
0+
+
+
0+
0
0+
+
0
+
0
+++
0+
+++
++
0
+++
0
Tabela 10. Freqüência das alterações histológicas encontradas nos rins dos H. ancistroides
analisados segundo a classificação das lesões (SILVA, 2002).
TRECHOS DE COLETA
ALTERAÇÃO HISTOLÓGICA
RENAL
J1
L1
L2
L3
Índice
Aumento do volume glomerular
I
0
++
+++
0+
Degeneração granular
I
+
++
+
++
Degeneração hialina
I
++
+
++
++
Dilatação dos capilares do glomérulo
I
+
++
+++
0+
Espessamento do endotélio capilar
glomerular
I
0
0
+
0+
Estreitamento da luz tubular
I
0+
++
++
0+
Hipertrofia celular
I
0+
0+
0
0+
Hipertrofia nuclear
I
0+
+
+
+++
Vacuolização celular
I
+++
+
+
+++
Degeneração nuclear
II
0
0
0
0
Degeneração tubular
II
++
+
0+
+++
Núcleos picnóticos
II
0
0+
0
0
Oclusão da luz tubular
II
0
+
+
+
Redução do espaço de Bowman
II
+++
+++
+++
+++
Vacuolização nuclear
II
0+
+
0+
0
Necrose focal
III
+
0
0
0
0 ausente; 0+ raramente presente; + pouco freqüente; + + freqüente; + + + muito freqüente.
CTR
+++
+++
+++
++
0
0
0
0+
0+
0+
+
0
+++
+++
0
0
A)
B)
Figura 12. Fotomicrografia do tecido renal analisado evidenciando a formação de novos
néfrons. A) Vista geral de um novo néfron sendo formado. B) Detalhe do novo néfron em
maior aumento. Escala barra = 25µm. HE.
A formação de novos néfrons também foi analisada (Fig. 12). Embora não
seja uma alteração, sua ocorrência em quantidade muito elevada pode ser um indicativo de
distúrbio do órgão.
A Tabela 11 mostra a freqüência da formação de novos néfrons encontrada.
Nos lambaris coletados, a formação de novos néfrons foi muito freqüente em L1, freqüente
em J2, L2 e L4 e pouco freqüente em J1. E nos cascudos, a formação de novos néfrons foi
freqüente nos animais coletados nos trechos L1 e L2.
Tabela 11. Freqüência da formação de novos néfrons observadas nos rins dos animais
analisados, segundo a classificação de Silva, 2002.
Local de coleta
Espécie
CTR
J1
J2
L1
L2
L3
L4
Astyanax altiparanae
0+
+
++
+++
++
*
++
Hypostomus ancistroides
0+
0+
**
++
++
0+
*
0 ausente; 0+ raramente presente; + pouco freqüente; + + freqüente; + + + muito freqüente. * espécie não
coletada nesse trecho. ** não analisado.
a)
VMA brânquia
3
*
*•
2
1
CTR
J1
c)
J2
L1
L2
L3
b)
125
100
75
50
25
0
*#
CTR
L4
VMA fígado
IAH brânquia
J1
d)
J2
L1
L2
L3
2
1
CTR
J1
e)
J2
L1
L2
L3
L4
VMA rim
L4
*
*
*
L1
L2
L3
L4
L2
Ha
L3
L4
IAH fígado
125
100
75
50
25
0
3
*#
CTR
J1
f)
J2
IAH rim
125
100
75
50
25
0
3
2
1
CTR
J1
J2
L1
Aa
L2
Ha
L3
L4
CTR
J1
J2
L1
Aa
Figura 13. Médias de VMA (Valor Médio de Alteração) e de IAH (Índice de Alterações
Histológicas) das brânquias (a e b), fígados (c e d) e rins (e e f) dos Astyanax altiparanae e
dos Hypostomus ancistroides analisados. As linhas verticais representam o erro padrão. *
indica diferença significativa em relação ao respectivo controle; • indica diferença
significativa em relação ao trecho J1 na mesma espécie; e # indica diferença significativa em
relação aos demais trechos de coleta para a mesma espécie (P< 0,05).
5 DISCUSSÃO
As medidas físico-químicas auxiliam na caracterização dos trechos de
coleta. Valores críticos, muito acima ou abaixo do comum, podem refletir distúrbios na
qualidade da água. Neste trabalho, os valores observados de oxigênio dissolvido, temperatura,
pH e condutividade não chamaram a atenção por serem críticos. Apenas a leitura de oxigênio
dissolvido do trecho J2, que foi de 4mgO2/L, manteve-se no limite do valor considerado
crítico para esse parâmetro, que seria abaixo de 4mgO2/L (CAMARGO, 2004; SILVA, 2004).
Dados da CETESB, 2001, afirmam que valores de condutividade maiores que 100µs/cm têm
sido relatados para locais muito impactados. Os trechos amostrados apresentaram leituras de
condutividade entre 54,1 e 21µs/cm, estando portando dentro da normalidade para este
parâmetro.
O fator de condição é um índice que reflete as interações entre os fatores
bióticos e abióticos sobre a condição fisiológica dos peixes. São informações adicionais que
contribuem para o entendimento do ciclo biológico das espécies de peixes, para o manejo
adequado dessas espécies, e, portanto, para a manutenção do equilíbrio no ecossistema
(LIZAMA; AMBRÓSIO, 2002). Um decréscimo no fator de condição é normalmente
interpretado como depleção das reservas energéticas estocadas, como glicogênio hepático e
gorduras corporais. A redução do fator de condição também pode estar atribuída a um
aumento na taxa metabólica em resposta a fatores estressantes (HOQUE et al., 1998).
5.1 Histopatologia branquial
As brânquias exibem uma grande superfície a qual está em contato direto e
permanente com a água e, portanto, seus potenciais estressores (BERNET et al., 1999). O
sentido do fluxo sangüíneo nas lamelas é oposto ao do fluxo respiratório da água entre as
lamelas secundárias. Este sistema, chamado contra-corrente, acentua a capacidade das trocas
gasosas devido ao amplo contato da superfície epitelial com o meio externo e à alta taxa de
perfusão em favor da oxigenação das brânquias (TAKASHIMA; HIBIYA, 1995). Entretanto,
a entrada de poluentes também é facilitada por estes mecanismos respiratórios (MALLATT,
1985; HEATH; 1987; BONGA, 1997) podendo resultar em danos branquiais os quais podem
modificar essas trocas gasosas e levar a uma hipóxia interna no peixe (NAGAE, 1996).
A maioria das lesões branquiais que ocorrem em exposições subletais afeta
o epitélio da lamela secundária (HINTON; LAUREN, 1990). O epitélio branquial de peixes é
um tecido extremamente sensível, dinâmico e metabolicamente ativo (RANKIN et al., 1982;
HINTON et al., 1992; POLEKSIC; MITROVIC TUTUNDZIC, 1994).
São exemplos dessas alterações: hiperplasia e hipertrofia do epitélio
respiratório, desarranjo lamelar e fusão parcial das lamelas secundárias (MALLATT, 1985;
HINTON; LAURÉN, 1990; POLEKSIC; MITROVIC-TUTUNDZIC, 1994; FERNANDES;
MAZON, 2003; CAMARGO, 2004). Tais alterações foram freqüentes nos lambaris e nos
cascudos coletados nos ribeirões Jacutinga e Lindóia, e também foram observadas nos
animais usados como controle neste estudo.
A hiperplasia celular consiste em uma proliferação de células entre lamelas
secundárias adjacentes, reduzindo este espaço interlamelar, podendo culminar na fusão das
lamelas (HEATH,1987; HINTON et al., 1992; FACÁRIO, 2003). A fusão das lamelas é um
mecanismo natural de defesa para manter a superfície lamelar afastada do contato direto com
compostos químicos. Estas adaptações contra os distúrbios do ambiente aquático reduzem a
área da superfície respiratória e, assim, as trocas gasosas, que ali ocorrem normalmente, são
dificultadas visto o decréscimo na capacidade de difusão podendo levar o peixe à asfixia
(OJHA, 1999).
Além dessas alterações no epitélio branquial, podem ocorrer alterações
vasculares nas lamelas quando os animais estão sob estresse mais severo. Assim, um aumento
do fluxo sanguíneo para o interior da lamela ou mesmo a ação direta dos contaminantes pode
desestruturar as células pilares ou até mesmo rompe-las (HEATH, 1987). Conforme a
intensidade do fluxo sanguíneo e a severidade do dano das células pilares podem originar
alterações de estágio I, como dilatação do canal marginal e congestão vascular, ou de estágio
II, como aneurisma (TAKASHIMA; HIBIYA, 1995; ROSETY-RODRÍGUEZ, 2002). Esta
última é considerada mais grave e cuja restauração do tecido, embora mais difícil, ainda é
possível (POLEKSIC; MITROVIC-TUTUNDZIC, 1994), dependendo do tamanho e da
quantidade em que ocorreu pelo tecido branquial. Aneurismas foram muito encontrados nos
lambaris coletados nos ribeirões Jacutinga e Lindóia, sendo muito freqüentes nos trechos de
coleta do Lindóia mais a jusante. WINKALER et al, 2001 também observaram aneurismas
nas lamelas de lambaris (Astyanax altiparanae) coletados no ribeirão Cambé, impactado com
esgoto doméstico e rural, e no córrego Capivara, que apresentava elevados níveis de metais na
água, ambos também em Londrina, Paraná.
A ruptura do epitélio lamelar e o rompimento de células pilares também
podem ser consideradas reflexos da ação dos agentes tóxicos sobre o órgão (CAMARGO,
2004), e são classificadas como graves. A primeira ocorreu com mais freqüência nos lambaris
coletados no trecho L2 do ribeirão Lindóia, e a segunda, nos cascudos coletados no trecho L1.
Mallatt, 1985, em uma revisão estatística sobre alterações na estrutura
branquial induzidas por tóxicos e outros irritantes, concluiu que as lesões são de natureza não
específicas, pois foram detectadas sob diferentes condições de exposição. Essas alterações não
específicas são, portanto, reações fisiológicas das brânquias ao estresse como respostas de
defesa.
Nesse estudo, as brânquias foram os órgãos menos sensíveis aos poluentes
da bacia do ribeirão Jacutinga.
De maneira geral, foram observados os mesmos tipos de alterações
branquiais tanto nos lambaris quanto nos cascudos coletados nos ribeirões Jacutinga e
Lindóia. Porém, as alterações ocorreram com mais freqüência e maior intensidade nos
lambaris. Apenas os lambaris dos trechos L2 apresentaram alterações classificadas entre
moderadas e severas interferindo no funcionamento normal das brânquias. Nos animais dos
demais locais, tanto cascudos quanto lambaris, as histopatologias observadas provocam danos
leves a moderados nas funções branquiais.
5.2 Histopatologia hepática
O fígado de teleósteos é o local mais importante na síntese de enzimas de
biotransformação, além de ser também essencial na síntese de bile, armazenamento de
lipídeos e glicogênio, bem como a produção de vitelogenina e proteínas presentes na película
que envolve o ovo (GOKSOYR; HUSOY, 1998). É um dos órgãos mais afetados por
alterações morfológicas decorrentes da exposição a contaminantes (RODRIGUES; FANTA,
1998).
As alterações nos hepatócitos encontradas neste trabalho, como deformação
do contorno nuclear, hipertrofia nuclear, núcleo na periferia da célula e atrofia celular e
nuclear, têm sido relatadas em animais expostos a contaminantes (BRAUNBECK et al. 1990)
e outros ambientes aquáticos degradados (TAKASHIMA; HIBIYA, 1995; SCHWAIGER et
al, 1997; RIGOLIN de SÁ, 1998; MONTEIRO, 2001).
O tamanho da célula e do núcleo, em preparações para microscopia, reflete
seu estado funcional (TAKASHIMA; HIBIYA, 1995). Em estado hiperfuncional, por
exemplo, a hipertrofia nuclear pode indicar um aumento de suas atividades, sugerindo uma
intensificação da atividade metabólica do hepatócito frente às condições ambientais, seja pela
presença de algum composto químico ou pela ausência de alguma substância (MEYER;
HENDRICKS, 1985; HINTON et al, 1992).
O armazenamento de glicogênio e lipídios que ocorre naturalmente nos
hepatócitos de peixes confere a essas células um aspecto vacuolizado quando submetidas à
coloração com HE (TAKASHIMA; HIBIYA, 1995). A relação entre a quantidade de
glicogênio hepático e a freqüência da vacuolização observada nesses hepatócitos tem sido
analisada para revelar o estado nutricional do animal. Takashima e Hibiya, 1995, alertam que
uma intensa vacuolização citoplasmática nem sempre significa um grande acúmulo de
glicogênio. Pacheco e Santos, 2002, descrevem o aumento da vacuolização nos hepatócitos
como sinal de processos degenerativos, sugerindo problemas metabólicos possivelmente
relacionados à exposição a contaminantes.
A reserva de glicogênio encontrada nos lambaris e cascudos coletados nos
ribeirões Jacutinga e Lindóia parece ser satisfatória aos animais, sendo compatíveis à
vacuolização observada em seus hepatócitos. Estes resultados sugerem que as condições
ambientais dos trechos amostrados não estão interferindo nos estoques de glicogênio desses
animais. A intensa vacuolização e a pouca reserva de glicogênio observada nos peixes
controles provavelmente ocorreu porque esses animais não se alimentaram adequadamente
durante o período em que ficaram acondicionados aos tanques, embora a oferta de alimento
(ração comercial) para os mesmos tenha ocorrido neste período.
As médias de IAH dos animais coletados revelaram alterações de
intensidade moderada nos hepatócitos quanto aos seus efeitos sobre o funcionamento do
órgão. Isso se deve à freqüência das alterações de estágio II observadas, dentre elas a
hiperemia, caracterizada pelo aumento do fluxo sanguíneo no tecido hepático, aumentando a
oxigenação de regiões prejudicadas deste tecido e facilitando o transporte de macrófagos até
elas, podendo indicar um mecanismo auxiliar na desintoxicação (SILVA, 2204).
Também foram observadas alterações degenerativas nos hepatócitos das
duas espécies estudas como degeneração citoplasmática e nuclear, vacuolização nuclear e
núcleos picnóticos, as quais podem comprometer as funções desempenhadas pelo fígado
devido à redução da área metabolicamente ativa do órgão (HINTON; LAURÉN, 1990;
HINTON et al., 1992; TAKASHIMA; HIBIYA, 1995; TEH et al., 1997; LANGIANO, 2003).
Picnose é um processo que tem sido relatado em casos de intoxicação severa e foi detectado
em Oreochromis niloticus expostas a 36 ppm do herbicida Roundup (JIRAUNGKOORSKUL
et al., 2002).
A ocorrência e a freqüência dessas alterações hepáticas nos lambaris e
cascudos coletados sugerem que o comprometimento da qualidade da água dos ribeirões da
bacia do Jacutinga está afetando a saúde desses animais.
5.2 Histopatologia renal
O tecido renal mostrou-se o mais sensível deste estudo,
apresentando
modificações severas nos lambaris capturados nos trechos mais próximos a foz dos ribeirões
Jacutinga (trecho J2) e Lindóia (trecho L4), embora a análise estatística não tenha sido
significativamente diferente.
Processos degenerativos e até mesmo necrose deste tecido foram observadas
nas duas espécies estudadas, sendo mais freqüentes nos lambaris, que se demonstraram mais
sensíveis que os cascudos.
As degenerações tubulares, granular e hialina, têm sido descritas para o rim
de peixes expostos a vários contaminantes (TAKASHIMA; HIBIYA, 1995) e, como ocorre
nas brânquias, não se trata de respostas a um agente estressor específico (CAMARGO, 2004).
O acúmulo de grânulos pequenos no citoplasma deixando as células hipertrofiadas e com
aspecto de rede caracteriza a degeneração granular, a qual pode resultar em degeneração
hialina quando os grânulos tornam-se maiores e eosinófilos. Segundo Hinton e Laurén, 1990,
e Takashima e Hibiya,1995, esses grânulos podem ser formados pelas próprias células ou
resultarem da reabsorção de excessos de proteína plasmática perdidos pela urina devido a
danos no glomérulo e em casos mais graves podem levar à necrose do tecido. Prochilodus
lineatus expostos a concentrações subletais de triclorfon (VEIGA et al., 2002) e Salmo trutta
e Barbatula barbatula expostos a água de dois ribeirões contaminados com pesticidas, PCB,
PAH e metais (GERNHOFER et al., 2001; SCHWAIGER, 2001) também apresentaram
degenerações tubulares como as encontradas nos rins dos animais deste estudo.
Alterações no corpúsculo renal podem prejudicar a formação do filtrado que
ocorre nos glomérulos (MEYER; HENDRICKS, 1985; HINTON; LAURÉN, 1990). A
dilatação dos capilares do glomérulo, devido ao aumento do fluxo sanguíneo, e o
espessamento do endotélio capilar glomerular, pela proliferação anormal de células, podem
levar à redução do espaço de Bowman. Esta redução foi uma das alterações mais freqüentes
nos lambaris e cascudos coletados nos ribeirões da bacia do Jacutinga. Nos trabalhos citados
com Prochilodus lineatus (VEIGA et al., 2002) e com Salmo trutta e Barbatula barbaluta
(GERNHOFER et al., 2001; SCHWAIGER, 2001) essa alteração também foi observada.
A regeneração tubular e a formação de novos néfrons podem ser um
indicativo de adaptação e restauração do tecido após danos nos rins dos peixes (HINTON;
LAURÉN,
1990;
TAKASHIMA;
HIBIYA,
1995;
CORMIER
et
al,
1995;
REIMSCHUESSEL, 2001). Neste trabalho, embora a formação de novos néfrons tenha sido
bem freqüente nos animais coletados no ribeirão Lindóia, a quantidade desta estrutura
presente em cada peixe analisado não foi excessiva a ponto de chamar a atenção para este
fato.
Assim, este estudo revelou que as espécies Astyanax altiparanae e
Hypostomus ancistroides dos ribeirões Jacutinga e Lindóia, da bacia do Jacutinga, apresentam
modificações em suas brânquias, fígados e rins como resposta aos prováveis agentes
estressores que estão presentes neste ambiente. A espécie H. ancistroides mostrou-se mais
resistente que A. altiparanae, visto que nesta última a severidade das alterações foi maior.
Dos órgãos analisados, o rim e o fígado mostram-se mais sensíveis às
alterações, constituindo-se os mais sensíveis como biomarcadores em programas de
monitoramento ambiental.
A bacia do ribeirão Jacutinga, como tipicamente ocorre com ribeirões
urbanos,
mostrou-se
impactada.
Os
ribeirões
Jacutinga
e
Lindóia
apresentam
comprometimento da qualidade de suas águas desde suas nascentes, sendo este
comprometimento mais agravado na foz desses ribeirões, provavelmente em virtude da
confluência de afluentes urbanos poluídos bem como de efluentes de diversas origens ao final
de seus percursos.
O óleo proveniente do vazamento ocorrido em 2002, dois anos atrás, parece
não ser a causa mais relevante para a indução das alterações observadas nos peixes.
6 CONCLUSÕES
•
Os lambaris (Astyanax altiparanae) e cascudos (Hypostomus ancistroides) da bacia do
ribeirão Jacutinga apresentaram lesões teciduais, sendo estas de intensidade leve nas
brânquias, moderada nos fígados e severa nos rins.
•
O fígado e o rim dos peixes foram os órgãos mais afetados pela poluição das águas
destes ribeirões, constituindo-se biomarcadores histopatológicos sensíveis para o
monitoramento ambiental.
•
Os ribeirões Jacutinga e Lindóia estão impactados desde a nascente até a foz de seus
cursos, sendo a qualidade das águas próximas à foz destes ribeirões mais
comprometidas.
•
A poluição observada na bacia do ribeirão Jacutinga deve-se aos efluentes urbanos que
atingem direta e indiretamente as águas dos principais ribeirões componentes dessa
bacia e de seus afluentes.
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ANEXOS
ANEXO A – Fixação com BOIUN
Para preparar 300mL de BOUIN:
225mL de ácido pícrico diluído *
75mL de formol
15mL de ácido acético
* diluir o pó de ácido pícrico em água destilada até que ocorra precipitação.
Manter em geladeira.
Tempo de fixação dos órgãos para Astyanax altiparanae e Hypostomus ancistroides:
Brânquias – 8 horas
Fígado – 8 horas
Rim – 12 horas
Após a fixação, manter os órgãos em álcool 70%.
ANEXO B – Descalcificação das brânquias de Astyanax altiparanae e Hypostomus
ancistroides
Preparação da solução de EDTA 7%: 70g de sal dissódico de EDTA em 1L de água destilada.
Gotejar NaOH 1M* até atingir pH 7,2.
*NaOH 1M = 4g de NaOH em 100mL de água destilada.
Descalcificação das brânquias: colocar o arco branquial na solução de EDTA por 15 minutos
na estufa a 60ºC.
ANEXO C - Protocolo de inclusão de brânquias e fígado de Astyanax altiparanae e de
Hypostomus ancistroides.
Desidratação em:
álcool 80%
1h
álcool 90%
1h
álcool 95%
1h
álcool 100%
30 min
álcool 100%
30 min
álcool 100%
30 min
álcool 100% + xilol
30 min
Diafanização em xilol P.A
10 a 15 min
Impregnação em estufa 58-60ºC com:
xilol + parafina (1:1)
30 min
xilol + parafina (1:2)
30 min
parafina pura
3h
Emblocagem em moldes cúbicos de papel com parafina, solidificada em temperatura
ambiente;
Microtomia: os blocos trimados foram cortados em micrótomo American Optical “820” com
espessuras de 4 e 5µm;
Montagem de lâminas: após os cortes, as brânquias foram colocadas em banho-maria, em
torno de 50o C, com gelatina em pó para serem aderidas às lâminas e esticadas. Em seguida,
foram mantidas na estufa durante 24 horas para secagem. Quando secas, as lâminas foram
coradas.
ANEXO D – Procedimento para coloração em microscopia de luz da brânquia (HE)
Desparafinização com duas séries de xilol por 10 minutos cada;
Hidratar em série gradual de álcoois 100%, 95% e 70% por 5 minutos cada;
Lavar em água corrente e água destilada por 10 minutos;
Corar com hematoxilina de HARRIS por 15 segundos, passagem rápida;
Lavar em água corrente e água destilada;
Contracorar com eosina de LISON por 2 minutos, passagem rápida;
Desidratar com álcool 70% e 95%, passagem rápida;
Desidratar com dois banhos de álcool 100%, por 5 minutos cada;
Tratar em álcool + xilol (1:1), por 5 minutos;
Diafanizar com duas séries de xilol por 5 minutos cada;
Montar as lâminas com bálsamo do Canadá;
ANEXO E – Protocolo de inclusão do rim
Desidratação em: álcool 80%
1h
álcool 90%
1h
álcool 100%
1h
Diafanização em xilol P.A.
1h
3h
Impregnação em estufa 58-60oC com parafina pura
Emblocagem em moldes cúbicos de papel com parafina solidificado a temperatura ambiente;
Microtomia: a trimagem dos blocos foi feita na forma de pirâmide para serem obtidos cortes
de 5 µm em micrótomo LEITZ WETZLAR;
Montagem de lâminas: após os cortes, as brânquias foram colocadas em banho-maria, em
torno de 50o C, com gelatina em pó para serem aderidas às lâminas e esticadas. Em seguida,
foram mantidas em temperatura ambiente durante 24 horas para secar.
ANEXO F – Procedimento para coloração de rim em microscopia de luz (HE)
Disparafinar em xilol e metanol + H2O2 0,9% por 30 minutos cada;
Hidratar em série crescente de álcoois 100, 90, 80, 70 e 50%, por 10 minutos cada;
Lavar em água corrente e destilada;
Corar com hematoxilina de HARRIS por 15 segundos, passagem rápida;
Lavar em água corrente e destilada;
Contracorar com eosina de LISON por 2 minutos, passagem rápida;
Desidratar com álcool 70% e 95%, passagem rápida.
Desidratar em álcool 100%, por 5 minutos.
Tratar em álcool + xilol (1:1), por 5 minutos.
Diafanizar com duas séries de xilol por 5 minutos cada.
Montar as lâminas com bálsamo do Canadá.
ANEXO G – Procedimento para coloração em microscopia de luz do fígado em PAS
Disparafinar e hidratar em:
xilol
xilol
álcool 100%
álcool 100%
álcool 95%
álcool 70%
10’
5’
5’
5’
5’
5’
Lavar durante 5 minutos em água destilada;
Oxidar em ácido periódico 0,5% por 5 minutos;
Lavar por 5 minutos em água destilada;
Tratar por 15 minutos no reativo de Schiff;
Lavar por 10 minutos em água corrente;
Lavar em três banho de água sulfurosa por 2 minutos cada;
Lavar em água destilada por 5 minutos;
Contracorar por 35 segundos com hematoxilina de Harris;
Fazer viragem em água corrente por 10 minutos;
Desidratar, diafanizar e montar.
ANEXO H – Soluções corantes para microscopia de luz
Hematoxilina de HARRIS
Reagentes:
1 g de hematoxilina
10 mL de álcool absoluto
20 g de alúmem de potássio
200 mL de água destilada
0,5 g de óxido de mercúrio
Eosina de LISON
Reagentes:
2 g de eosina
1 g de bicromato de potássio
20 mL de solução saturada de ácido pícrico
20 mL de álcool absoluto
160 mL de água destilada
Reagente de Schiff, segundo Lillie
Levar 100 mL de água destilada até ebulição;
Interromper o aquecimento e adicionar à água 1g de fucsina básica (para-rosanilina);
Resfriar a solução até 60oC. Filtrá-la.
Acrescentar 4g de bissulfito de potássio. Dissolver bem.
Juntar 10 mL de HCL 1N.
Deixar a solução em repouso, no escuro, durante 24 horas;
Acrescentar à mesma 200 mg de carvão ativo (Norit). Agitar com veemência e depois
filtrar. Conservar em refrigerador a 0-4oC.
Atenção: a solução deverá ficar incolor ou levemente cor de palha. Em caso contrário
deverá ser desprezada.
Preparação de água sulfurosa
10 mL de HCl 1N
10 mL de Na2S2O5 a 10% (metabissulfita de sódio)
Completar o volume para 200 mL de água destilada.