Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Genética
Billy Manoel dos Santos
Identificação molecular de bactérias lácticas
presentes no caldo de cana-de-açúcar
Recife
2012
Billy Manoel dos Santos
Identificação molecular de bactérias lácticas
presentes no caldo de cana-de-açúcar
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
Universidade
em
Federal
Genética
de
da
Pernambuco
como parte dos requisitos exigidos para
obtenção do título de Mestre em Genética.
Orientador: Marcos Antônio de Morais Júnior
Coorientador: Brígida Thays Luckwu de Lucena
Recife
2012
Billy Manoel dos Santos
Identificação molecular de bactérias lácticas
presentes no caldo de cana-de-açúcar
Aprovado em ___/___/____
Banca Examinadora:
____________________________________________
Dr. Marcos Antônio de Morais Júnior
Universidade Federal de Pernambuco
____________________________________________
Dr. Valdir de Queiroz Balbino
Universidade Federal de Pernambuco
____________________________________________
Dra. Brígida Thays Luckwu de Lucena
Universidade Estadual da Paraíba
ii
Dedico este trabalho à minha estimada
esposa que sempre esteve do meu lado me
estimulando a seguir em frente.
iii
Agradecimentos
Agradeço aos meus orientadores, Dr. Marcos Morais e Dra. Brígida Lucena,
por confiarem e me introduzir no fascinante mundo da Ciência, por sempre me
ajudar quando mais necessitei e por suas amizades que permanecerão para
sempre. À minha mãe Irenice Maria dos Santos que me ofereceu a melhor educação
que uma pessoa humilde pode dar. Meus familiares e amigos que também me
fortaleceram a me aconselharam sempre. meus superiores hierárquicos da Briosa
Polícia Militar de Pernambuco, que me apoiaram e, que quando possível me
ajudavam para que pudesse concluir o trabalho que comecei.
Sou grato ao meu casal de pastores, Prs. Dawison Alves e Adriana Alves,
pelas orações e conselhos.
E por fim, e com certeza o mais importante de todos, o meu Pai, que sempre
me aconselhou a andar por caminhos planos, segura na minha mão sempre que
necessito e que me deu a vida, e hoje eu vivo em função dEle. Pai é por isto e por
muito mais eu Te agradeço, pois até aqui o Senhor me ajudou.
iv
Resumo
A indústria alcooleira no Brasil perde anualmente vários milhares de reais
devido a episódios de contaminação produzidos por bactérias. Além disso, outros
milhares são gastos com o uso de antibióticos industriais para a contenção dessas
contaminações. Infelizmente, não há ainda um catálogo completo de informações
sobre todas as possíveis espécies bacterianas envolvidas na contaminação
industrial, seus efeitos no processo e os fatores que levam a essas contaminações.
Com a crescente demanda por fontes de energia renováveis, principalmente o
etanol, grandes esforços têm sido feitos para aumentar a sua produção. Este
trabalho tem como objetivo principal identificar as bactérias lácticas que entram no
processo de fermentação alcoólica através do caldo de cana-de-açúcar com a
utilização de ferramentas moleculares para uma rápida e eficiente identificação. Para
foram realizadas coletas em quatro destilarias do Nordeste do Brasil durante a safra
de 2007/2008. A identificação dos isolados foi realizada através da técnica ARDRA e
pela análise do sequenciamento de DNA dos genes pheS e 16S. Os resultados
obtidos mostram que os lactobacilos são os principais contaminantes do processo,
com o Lactobacillus fermentum se destacando entre as demais. Também foi
observado que entram no processo bactérias dos gene Weissella e Leuconostoc,
com destaque para a W. confusa e o Leuc. mesenteroides que foram identificadas
em três das destilarias estudadas. Além da identificação, os isolados de W. confusa
e o Leuc. Mesenteroides foram tipados pelo REP-PCR com o primer (GTG)5. Os
resultados mostraram que, além da diversidade de espécies bacterianas detectadas,
existe uma diversidade de linhagens dessas duas principais espécies no processo. A
espécie Leuc. mesenteroides tem sido apontada como contaminante em processo
de fermentação alcoólica industrial, sendo algumas linhagens capazes de causar a
formação de dextrana, podendo causar danos ao processo fermentativo. Desta
forma se faz necessário trabalhos futuros com o fim de correlacionar os perfis destas
espécies com possíveis danos à fermentação, para que com este conhecimento
possa ser criadas novas estratégias de controle destes microorganismos.
Palavras-chave:
Lactobacillus,
Leuconostoc,
Identificação
molecular,
processo fermentativo, Weissella
v
Abstract
The alcohol industry in Brazil loses several thousand dollars each year due to
episodes of contamination produced by bacteria. In addition, thousands more are
spent on the industrial use of antibiotics to contain these contaminants.
Unfortunately, there is still no complete catalog of all possible information about
bacterial species involved in industrial pollution, its effects on the process and the
factors that lead to these contaminants. With the growing demand for renewable
energy sources, especially ethanol, great efforts have been made to increase
production. This work has as main objective to identify lactic acid bacteria that enter
the process of fermentation through the juice sugarcane with the use of molecular
tools for rapid and efficient identification. For this, samples were taken at four
distilleries in northeastern Brazil during the harvest of 2007/2008. The identification of
isolates was performed using the ARDRA technique and analysis of DNA sequencing
of the pheS and 16S genes. The results show that lactobacilli are the main
contaminants of the process with Lactobacillus fermentum stood out among the
others. We also observed that bacteria enter the process of genus Weissella and
Leuconostoc, with emphasis on the W. confused and Leuc. mesenteroides that were
identified in three distilleries studied. Besides identification, the isolates of W. confusa
and Leuc. mesenteroides were typed by rep-PCR with the primer (GTG)5. The results
showed that, in addition to the variety of bacterial species found, there are several
lines of these two major species in the process. The species Leuc. mesenteroides
has been identified as a contaminant in industrial fermentation process, some strains
can cause the formation of dextran, causing damage to the process. Thus further
work is required in order to correlate the profiles of these species with possible
damage to the fermentation, so that this knowledge can be created new control
strategies such microorganisms.
Key words: Lactobacillus, Leuconostoc, molecular identification, fermentative
process, Weissella
vi
Lista de Figuras
Item
Página
Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de três importantes representantes 11
das bactérias lácticas
Figura 2. Mapa físico da região 16S-23S ITS do rDNA típico do gênero
21
Lactobacillus
Figura 3. Amplificação da região espaçadora 16S-23S do agrupamento
22
de genes de rDNA das amostras de bactérias lácticas da Fermentec
Ltda
Figura 4. Árvore filogenética feita a partir de sequências do gene
25
16S mostrando a posição do Lactobacillus hammesii sp. nov.
strains LP38T e LP39 entre alguns lactobacilli
Figura 5. Gêneros de LAB encontrados no caldo de cana das
37
destilarias Japungu, Miriri e Giasa durante a safra 2007/2008.
Figura 6. Distribuição percentual das espécies de bactérias lácticas
38
identificadas utilizando as técnicas de ARDRA e sequênciamento do
genes 16S e pheS.
Figura 7. Bactérias lácticas identificadas a partir da análise do perfil de
39
restrição do rDNA amplificado ARDRA.
Figura 8. Bactérias Lácticas identificadas a partir da análise de
40
sequências do gene 16S
Figura 9. Árvore filogenética construída a partir do gene pheS utilizando
40
o método Neighbour-Joining dos isolados da destilaria Giasa.
Figura 10. Dinâmica da população bacteriana da destilaria Giasa
41
vii
durante a safra 2007/2008
Figura 11. Bactérias lácticas identificadas pela análise do perfil de
42
digestão do rDNA amplificado.
Figura 12. Dinâmica da população bacteriana da destilaria Japungu
44
durante a safra 2007/2008
Figura 13. Árvore filogenética construída a partir das sequências de
46
nucleotídeos do gene 16S dos isolados encontrados no caldo de cana
da destilaria Japungu durante a safra de 2007/2008.
Figura 14. Bactérias lácticas identificadas pela análise do perfil de
47
digestão do rDNA amplificado.
Figura 15. Diversidade da população bacteriana presente no caldo de
49
cana da destilaria Miriri durante a safra 2007/2008.
Figura 16. Árvore filogenética construída a partir das sequências do
50
gene 16S dos isolados da destilaria Miriri
Figura 17. Árvore filogenética construída a partir das sequências do
52
gene 16S dos isolados da destilaria Trapiche.
Figura 18. Perfil de amplificação da região espaçadora 16S-23S dos
53
isolados identificados como pertencentes ao gênero Weissella.
Figura 19. Perfis representativos de rep-PCR dos isolados das
55
destilarias Japungu, Miriri e Trapiche Identificados como W. confusa
Figura 20. Perfil de amplificação da região espaçadora 16S-23S dos
56
isolados identificados como pertencentes ao gênero Leuconostoc.
Figura 21. Perfis representativos de rep-PCR dos isolados das
56
destilarias Japungu e Trapiche Identificados como Leuc. mesenteroides
viii
Lista de Tabelas
Tabela 1. Contaminantes bacterianos encontrados na Fermentação
8
Etanólica.
Tabela 2. Primers utilizados nas reações de PCR e sequenciamentos.
36
Tabela 3. Isolados identificados a partir do sequenciamento dos genes
41
16S e pheS
Tabela 4. Isolados identificados através da análise das sequências
43
parciais dos genes 16S e pheS durante a safra 2007/2008.
Tabela 5. Isolados identificados a partir do sequenciamento dos genes
48
16S e pheS oriundos da destilaria Miriri durante a safra 2007/2008
Tabela 6. Isolados identificados a partir do sequenciamento dos genes
51
16S e pheS encontrados no caldo de partida da destilaria Trapiche.
ix
Lista de Abreviaturas
Item
Definição
AAB
Bactéria Acido Acético
AFLP
Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados
ARDRA
Análise de Restrição de DNA Ribossomal Amplificado
BSA
Albumina de Soro Bovino
DDH
Hibridização DNA-DNA
DNA
Ácido Desoxirribonucleico
ISR
Região Espaçadora Intergênica
ITS
Regiões Espaçadoras Intergênicas
LAB
Bactéria ácido láctica
MLSA
Análise de Sequências de Multiplos Loci)
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
PFGE
Eletroforese em Campo Pulsátil
RAPD
Amplificação Aleatória do DNA Polimórfico
REA
Análise de Enzimas de Restrição
rep-PCR Amplificação de elementos de DNA repetitivos bacteriano
rRNA
Ácido Ribonucleico Ribossomal
tRNA
Ácido Ribonucleico transportador
UFC
Unidade Formadora de Colônia
x
Sumário
Item+
Pagina
Resumo
v
Abstract
vi
Lista de Ilustrações
vii
Lista de tabelas
ix
Lista de abreviaturas
x
1. Introdução
1
2. Revisão da Literatura
3
2.1 Fermentação Alcoólica
3
2.2 Contaminantes bacterianos do processo de produção do etanol
4
2.3. Bactérias Lácticas (Lactic Acid Bacteria-LAB)
10
2.4. Identificação e Tipagem Genética
15
2.4.1. Perfil de plasmidial
16
2.4.2. Eletroforese em campo pulsátil (PFGE)
17
2.4.3. Amplificação aleatória do DNA polimórfico (RAPD)
17
2.4.4. Análise de enzimas de restrição (REA)
18
2.4.5. Ribotipagem
18
2.4.6. Análise de Restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA)
19
2.4.7. Sequênciamento de DNA
23
2.4.8. Rep-PCR
27
3. Objetivos
30
3.1. Objetivo Geral
30
xi
3.2. Objetivos específicos
30
4. Material e Métodos
31
4.1. Isolamento, manutenção e identificação bacteriana
31
4.1.1 Isolamento e purificação das Culturas
31
4.2. Tipagem Genética
32
4.2.1. Extração de DNA
32
4.2.2. ARDRA-PCR
33
4.2.3. Rep-PCR
33
4.2.4. Sequênciamento dos genes 16S rRNA e pheS
34
5. Resultados
37
5.1. Análise Molecular das Bactérias isoladas do Caldo de Cana
37
5.1.1. Destilaria Giasa
39
5.1.2. Destilaria Japungu
42
5.1.3. Destilaria Miriri
47
5.1.4. Destilaria Trapiche
51
5.2. Análise Intraespecífica dos isolados
53
5.2.1. Weissella confusa
53
5.2.2. Leuconostoc mesenteroides
55
6. Discussão
57
7. Conclusões
61
8. Referências Bibliográficas
62
9. Anexos
73
10. Curriculum Lattes
84
xii
1. Introdução
No Brasil o processo de produção do etanol se dá através da fermentação do
caldo e/ou melaço de cana-de-açúcar pela levedura Saccharomyces cerevisiae, a
mesma levedura que é utilizada na indústria da panificação. Curiosamente este
processo ocorre em ambientes com baixa assepsia, que propiciam a contaminação
por vários microrganismos, ocorrendo a entrada de bactérias e/ou a contaminação
por outras espécies de leveduras, que são chamados de microrganismos selvagens.
Estes podem promover episódios de contaminações que resultam numa queda na
taxa de produção do etanol, consequentemente uma redução no rendimento
industrial.
As contaminações bacterianas, observadas no processo de fermentação do
etanol, são apontadas como sendo as principais causas para a queda da viabilidade,
do crescimento das leveduras e as que causam maiores prejuízos para a industria,
proporcionando uma diminuição na produção do etanol. As bactérias lácticas (Lactic
Acid Bacteria – LAB) se destacam como sendo os principais contaminantes
bacterianos do processo, fermentando o carboidrato a ácido láctico e a ácido acético
em pequenas quantidades, estes metabólitos diminuem o rendimento do etanol pela
inibição da fermentação, principalmente pela ação do ácido láctico. Além disso, o
estresse celular pelo qual as leveduras são submetidas faz com que excretem
nutrientes para o meio, tais como, adenina, guanina, ácido aspártico e nicótico,
triptofano, glicina e lisina, que podem estimular o crescimento bacteriano, agindo
como um processo de feedback para os episódios de contaminação.
Grandes perdas econômicas causadas pela queda do rendimento do etanol
proveniente das contaminações por bactérias são observadas. Isto ocorre devido
aos gastos com o controle dos episódios de contaminações quanto, quanto a
redução da produção efetiva do etanol.
A identificação das espécies de LAB que entram no processo de fermentação
é de fundamental importância para a criação de uma base de dados para um maior
conhecimento da complexa microbiota do processo de produção do etanol. E a partir
destas informações buscar maneiras para um controle mais eficaz dos episódios de
contaminações para que haja um aumento na produção de etanol.
2
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Fermentação Alcoólica
O processo de fermentação industrial para a produção de álcool combustível
ocorre através de dois processos: a) o processo de batelada alimentada (fed-batch)
no qual toda fermentação se processa em dornas individuais com recuperação do
fermento e sua reutilização em fermentações posteriores e; b) o processo continuo,
que consiste na fermentação através de dornas interligadas nas quais a fermentação
ocorre gradualmente em vários estágios, nesse processo também ocorre a
reutilização do fermento, pois o mesmo retorna a dorna inicial depois de centrifugado
juntamente com o mosto para realimentação do processo (Wheals et al., 1999; SilvaFilho, 2003).
As espécie de leveduras comumente utilizadas para fermentar açucares são
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Schizasaccharomyces pombe
e Kluyveromyces sp. (Kosaric et al. 1983). Sendo a S. cerevisiae que eram utilizada
na industria da panificação. Estas se constituem um bom fermento por serem mais
tolerantes a mudanças das condições do meio. Porém estas não são mais utilizadas
pois durante o processo pois perdem sua viabilidade rapidamente, permanecendo
por poucas gerações, causando instabilidade que oferece condições para
organismos oportunistas se estabelecerem no processo, tais como outras leveduras
e diversos outros tipos de bactérias (Basso et al., 2008).
Para aumentar o desempenho e a longevidade das células de leveduras no
processo fermentativo se passou a usar as células de leveduras provenientes do
próprio processo de fermentação alcoólica. Esta medida fez reduzir o risco de
3
contaminações por organismos indesejáveis pois
estas são mais resistentes e
apresentam maior rendimento de etanol (Basso et al. 1993; Basso e Amorim, 1996).
Apesar da utilização de células de leveduras obtidas diretamente da
fermentação ainda ocorre contaminação do processo. Silva-Filho et al. observou que
durante o processo fermentativo linhagens de leveduras introduzidas pelo substrato
não estéril substituíram as leveduras introduzidas no começo da fermentação
causando instabilidade durante o processo. Esta instabilidade pode ser apontada
como uma das causas para o estabelecimento de episódios de contaminação tanto
por outras leveduras, tais como a levedura Dekkera bruxelensis foi apontada como
uma das maiores contaminantes das destilarias de álcool do Nordeste do Brasil (De
Sousa-Liberal et al. 2007). Fato que também foi observado em destilarias de álcool
na America do Norte e Europa onde os substratos utilizados são o amido de milho e
a beterraba açucareira, respectivamente (Abbott et al. (2005); de Miniac, 1989; Ciani
et al., 2003).
Atualmente as leveduras utilizadas para a fermentação são obtidas a partir de
seleções de S. cerevisiae utilizadas em processos fermentativos anteriores. Estas
linhagens podem ser adquiridas comercialmente para este fim.
Assim como outras leveduras se estabelecem devido a instabilidade outras
bactérias também entram e podem trazer grandes problemas para a fermentação.
2.2 Contaminantes bacterianos do processo de produção do etanol
O caldo de cana-de-açúcar se constitui um ótimo substrato para o
crescimento de uma flora microbiana diversificada, devido ao sua composição em
nutrientes orgânicos e inorgânicos, alta atividade aquosa, pH e temperaturas
4
favoráveis. Assim normalmente é possível se encontrar uma microbiota bacteriana
presente no mosto utilizado como matéria-prima para a produção de açúcar e etanol
(Yokoya, 1991; Gallo, 1992; de Souza-Liberal et al., 2007).
No Brasil o processo fermentativo ocorre em um ambiente séptico e, por
conta disso, está propenso a contaminações por bactérias e/ou outros tipos de
leveduras. Vários são os problemas que podem surgir durante a fermentação, dentre
eles os mais comuns são:
Competição por açúcares. As bactérias estranhas ao processo competem e
assimilam o açúcar que tinha por finalidade ser convertido em etanol;
Toxinas e ácidos. Com o consumo do açúcar pelas bactérias são lançados ao
meio toxinas e principalmente ácidos orgânicos que podem inibir o processo por
causar a morte da levedura devidos suas propriedades e características
importantes com relação aos efeitos inibitórios. Um dos ácidos mais importantes
que causam problemas à fermentação é o ácido lático produzido em sua grade
parte pelas bactérias lácticas;
Floculação. Este é um fenômeno apresentado por leveduras, as quais se unem
em agregados denominados flocos, constituídos por centenas e milhares de
células. Ela propicia perdas de células de levedura no fundo das dornas ou nas
centrifugas. Isto se acentua mais pela utilização do reciclo de células, o qual é
utilizado para aumentar a produtividade do processo, reduzindo o tempo e os
custos da fermentação (Yokoya & Oliva-Neto, 1991)
Muito estudos foram feitos onde ficou claro que as bactérias têm um papel
muito importante na fermentação, se destacando desempenhando um mal papel
5
para o processo.
Vale salientar que nem todas as bactérias são prejudiciais à
fermentação, muitas delas estão relacionadas com a produção de congêneres
secundários que contribuem de forma benéfica para a qualidade de bebidas como a
cachaça e o wisky uma vez que estes congêneres são responsáveis pela produção
de sabor e aroma destas bebidas (Schwan et. al., 2001)
Amorim & Oliveira (1982) encontraram como principais contaminantes da
fermentação alcoólica as bactérias dos gêneros Acetobacter, Bacillus, Lactobacillus,
Leuconostoc e Atreptococcus.
Rondini (1985) encontrou no ambiente fermentativo um predomínio de
bactérias Gram-positivas (65,1%), dentro das quais 62,1% pertencentes ao gênero
Bacillus, 3% ao Lactobacillus e 1,5% pertencendo ao gênero Leuconostoc. Um
estudo feito por Silva (1988) da microbiota bacteriana do caldo clarificado,
pasteurizado e previamente resfriado encontrou bactérias dos gêneros Bacillus,
Lactobacillus e Leuconostoc, com cerca de 3%, 38% e 12%, respectivamente.
Gallo (1989) isolou a partir de coletas realizadas em diferentes pontos do
processo fermentativo 334 culturas microbianas onde foi contatado a predominância
de bactérias Gram-positivas (98,52%), onde 87,76% eram bastonetes, dentre eles
73,95% bastonetes não esporulados. Ainda neste estudo o autor comprovou que o
gênero mais frequente foi o Lactobacillus (59,75%), com a identificação das
seguintes espécies: L. acidophillus, L. agilis, L. amylophilus, L. animalis, L. buchneri,
L. coryniformis subsp. torquens, L. delbruekii subsp. bulgaricus, L. delbruekii
subsp.lactis, L. fermentum, L. helveticus, L. murinus, L. plantarum, L. reuteri, L. sake,
L. viridescens, L. vitulinus; 26,58% de Bacillus, dos quais foram identificados: B.
brevis, B. coagulans, B. lentus, B. megaterium, B.pasteurii, B. stearothermophilus;
6
8,76% de Staphylococcus; 1,56% de Micrococcus; 1,48% de representantes da
família Enterobacteriaceae; 1,26% de Pediococcus e 0,70% de Streptococcus.
Analises feitas a partir do leite de leveduras sem tratamento acido mostraram
que, 62% das bactérias encontradas foram da espécie L. fermentum, 9% de L.
murinus, 2% de L. plantarum, 9% de L. vaccinostercus e 2% de Leuconostoc (OlivaNeto, 1990).
Em seus estudos de caracterização da microbiota contaminante da produção
de álcool combustível, nos Estados Unidos, utilizando o milho como substrato Skiner
e Leathers (2004) demonstraram que prevaleceram as bactérias lácticas, em
particular Lactobacillus sp., representando cerca de 40% dos contaminantes totais
isolados. Alem de outros isolados, menos frequentes, dos gêneros Clostridium,
Eubacterium, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus e Weissella (Tabela 1).
A maior parte dos trabalhos realizados tornou evidente a predominância de
bactérias, principalmente as Gram-positivas, no processo de fermentação do etanol
com um importante destaque aos microorganismos dos gêneros Bacillus e
Lactobacillus.
As fontes de contaminações são peculiares de cada etapa do processo
fermentativo e de cada destilaria. Bem como a seleção de determinadas espécies ou
linhagens de microrganismos que favorecidos pelas condições pelas quais ocorre a
fermentação em um determinada destilaria (Cherubin, 2003). Além de inúmeras
fontes de contaminações que vão desde os microrganismos encontrados no solo
onde é plantada a matéria prima até a linha de produção (dornas, fermento,
trocadores de calor, etc.) da destilaria.
Cherubim (2003) demonstrou que as contaminações bacterianas industriais
são prejudiciais quando estão acima de 5,0 x 10 6 UFC/mL e; nestes casos, os
7
prejuízos econômicos são significativos quando atingem valores acima de 1,0 x 10 8
UFC/mL onde acontecem as quedas de rendimentos fermentativos.
Tabela 1 Contaminantes bacterianos encontrados na Fermentação Etanólica.
Organismo
Referência
Bacteriodes forsytus
Skinner e Leathers (2004)
Bifidobacterium sp., Bif. adolescentis, Bif. angulatum,
Skinner e Leathers (2004)
Clostridium sp., Cl. aerotolerans, Cl. Clostridiiforme
Skinner e Leathers (2004)
Eubacterium biforme
Skinner e Leathers (2004)
Fusobacterium nucleatum
Skinner e Leathers (2004)
Lactobacillus sp., L. acidophilus, L. amylovorus, L. brevis, L.
Skinner e Leathers (2004);
buchneri, L. casei, L. crispatus, L. delbrueckii subsp delbrueckii, L.
Lucena et al. (2010); Chang
delbrueckii subsp. lactis, L. diolivorans-like, L. ferintoshensis, L.
et al. (1995)
fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. hilgardii, L. lindneri, L.
manihotivorans, L. mucosae, L. nagelii, L. paracasei subsp.
paracasei, L. pentosus, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L.
salivarus, L. vini, Lactobacillus sp. desconhecidas
Lactococcus sp., Lac. lactis subsp. lactis, Lac. raffinolactis
Skinner e Leathers (2004)
Leuconostoc sp., Leuc. carnosum, Leuc. citreum, Leuc. lactis subsp.
Skinner e Leathers (2004)
lactis, Leuc. mesenteroides subsp. cremoris
Oenococcus kitharae-like
Lucena et al. (2010)
Pediococcus sp., P. acidilactici, P. damnosus, P. parvulos, P.
Skinner e Leathers (2004)
pentosaceus, Pediococcus sp. desconhecidas
Propionibacterium granulosum
Skinner e Leathers (2004)
Weissella sp. W. confusa, W. paramesenteroides, W. viridescens
Skinner e Leathers (2004);
Lucena et al. (2010)
Modificado a partir de Beckner et al. (2011)
8
Makanjuola et a.l (1992) constatou uma contagem de bactérias de 4,5 x 108
UFC/mL em 30 horas de fermentação resultou em uma queda de 17% no
rendimento do etanol. A queda do rendimento fermentativo geralmente deve-se à
redução da viabilidade celular das leveduras em função do aumento da acidez no
mosto após oito horas de cultivo associado com bactérias dos gêneros Bacillus e
Lactobacillus da fermentação alcoólica (Alcarde et al., 2002).
Lucena et. al. (2010) em seu estudo realizado em destilarias do Nordeste do
Brasil, demonstrou que as LABs são facilmente encontradas nas destilarias. A maior
frequência de isolados foram pertencentes ao gênero Lactobacillus tendo a maioria
dos isolados identificados como pertencendo as espécies Lactobacillus fermentum e
Lactobacillus vini. Estas espécies foram encontradas em meio contendo mais de
10% de etanol, sugerindo uma seleção de bactérias tolerantes a etanol ao longo do
tempo em todo processo. Além destas, foram encontrados isolados pertencentes as
espécies: L. plantarum, L. nagelii, L. amylovorus, L. brevis, L. diolivorans - like, L.
ferintoshensis, L. manihotivorans, L. mucosae e Oenococcus kitaharae - like, todas
pertencentes ao gênero Lactobacillus. Além destas também foram encontrados
isolados da espécie Weissella parameseteroides.
Por estar presentes em processos fermentativos com diferentes substratos e
com os problemas que podem surgir no processo pela entrada deste organismos é
de suma importância que se conheça quais as espécies de bactérias lácticas estão
relacionadas com a contaminação da fermentação alcoólica.
9
2.3. Bactérias Lácticas (Lactic Acid Bacteria-LAB)
As bactérias lácticas é como são chamadas as bactérias que são grampositivas, não formadoras de esporos, ácido tolerantes, fastidiosas, estritamente
fermentativas, catalase-negativas, desprovidas de citocromos que crescem sob
condições microaerofílicas a condições estritamente anaeróbicas. Elas também
possuem um baixo conteúdo de guanina e citosina (G+C), ficando entre 33% a 55%.
Esta alta heterogeneidade é refletida pelos testes fenotípicos dos isolados de
Lactobacillus de diversos ecossistemas, que mostram perfis de fermentação do
açúcar intermediários o que dificulta mais a tipagem ao nível de espécie. Dentre o
grande número de gêneros que existe de bactérias lácticas os mais importantes são:
Bifidobacterium,
Carnobacterium,
Enterococcus,
Lactobacillus,
Lactococcus,
Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetraghenococcus e Weissella (Klein et
al. 1998; Holzapfel et al. 2001; Moreira et al. 2005).
As bactérias lácticas são encontradas em diversos tipos de habitats, desde
solo, plantas, adubo, carnes, água, esgotos, restos de alimentos, em fermentações
lácticas (na produção de laticínios como: queijos, iogurtes e manteiga) e em
fermentações alcoólicas (produção de etanol e bebidas destiladas como: vinho,
uísque, cachaça, cerveja). Além desses habitats as LAB também podem, ser
encontradas na cavidade oral, trato digestivo e vaginal humano, e podem trazer
benefícios para estes ecossistemas (Holzapfel et al. 2001; Morea et al. 1998;
Simpson et al. 2001; Du Plessis et al., 2004). Elas também são quimiotróficas e
fermentam o carboidrato produzindo como produto final ácido láctico e, em
pequenas quantidades ácido acético. Algumas características fisiológicas são de
interesse por suas funções como probióticos, uma pré-condição para sobreviver no
10
trato intestinal. Estas características são de menor interesse para a taxonomia das
LAB, pois pode ocorrer mudanças morfofisiológicas nas bactérias devido as
condições do meio onde elas estão sendo cultivadas, dificultando a identificação
precisa dos isolados (Klein et al., 1988).
Dentre as inúmeras espécies de bactérias utilizadas pelo homem podem se
destacar as pertencentes ao gênero Lactobacillus (Figura 1). Elas estão envolvidas
nas fermentações para a produção de diversos produtos tais como: vinho, cerveja,
uísque de malte dentre outras bebidas fermentadas. Também estão presentes na
fabricação de iogurtes, kefir, queijos. Ainda, outras espécies do gênero Leuconostoc
são utilizadas na fabricação de queijos e manteiga. Na produção de vinho e cidra se
destacam as bactérias do gênero Oenococcus. Alem de outros gêneros como o
Weissella e Pediococcus que são responsáveis pela degradação de carnes e
vegetais, fermentação, preparo e conservação de alimentos (Slonczewski e Foster,
2008).
Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de três importantes representantes das bactérias lácticas.
Weissella confusa (A) encontrada em fermentações alcoólica (Lucena et al., 2010); Lactobacillus
casei
(B)
utilizado
no
preparo
(http://www.probioticsnews.creativetesting.co.uk/library);
de
Oenococcus
leites
oeni
fermentados
(C)
bactéria
frequentemente utilizada na fermentação de vinhos (barra = 3µm) (http://genome.jgipsf.org/oenoe/oenoe.home.html).
11
A identificação das bactérias tem sido, e ainda é feito principalmente através
da utilização de marcadores morfofisiológicos e bioquímicos. Entretanto estes
marcadores contam com a expressão de fenótipos variados, os quais podem não ser
expressos sob certas condições (Nour, 1998).
Tradicionalmente, as LAB têm sido classificadas com base nas propriedades
fenotípicas, isto é, morfologia, no padrão de fermentação de carboidratos, diferenças
entre a resistência a diferentes concentrações de NaCl, crescimento em diferentes
tipos de meios e temperaturas e resistência a antibióticos. Por muito tempo estes
foram os únicos critérios utilizados para a taxonomia de LAB (Holzapfel et at. 2001;
Klein et al. 1998). Já os métodos taxonômicos modernos aplicados a LAB incluem a
caracterização fenotípica e genotípica, reveladas em nível molecular. A identificação
molecular de LAB é baseada nas análises na homologia DNA-DNA como método de
referência. Para tal, sondas de ácidos nucleicos têm sido desenvolvidas para varias
espécies de Lactobacillus, frequentemente em combinação com métodos primários
(Klein et al. 1998; Tilsala-Timisjärvi e Alatossava 1997). A utilização de técnicas que
são baseadas em características fenotípicas e genômicas, conhecida como
taxonomia polifásica,
têm se mostrado capaz de diferenciar espécies que são
fenotipicamente semelhantes, mas diferente ao nível de genotípico. A taxonomia
polifásica tem se mostrado confiável por se associar técnicas que revelam
diferenças tanto a nível intra como interespecíficos do microrganismos. Isto é de
suma importância na industria, uma vez que muitas espécies de bactérias são
utilizadas como probiótico, sendo de extrema importância uma classificação mais
acuradas desse grupo (Holzapfel et at. 2001; Klein et al. 1998).
Por muito tempo as bactérias lácticas foram classificadas por suas
características fenotípicas, tais como: morfologia, fermentação de diferentes
12
carboidratos, variação na temperatura de crescimento, fermentação de glicose, entre
outras. Mas com os avanços nas técnicas moleculares novas técnicas têm surgido
para aumentar e agilizar a identificação de bactérias muito próximas.
A definição de espécie biológica não é aceita em espécies procarióticas,
sendo necessário uma novo conceito de espécies para as mesmas. Em seu estudo
Vandamme et al. (1996) definiu uma espécie procariótica como "uma categoria que
engloba
(preferencialmente)
um
grupo
coerente
genômicamente
de
isolados/linhagens individuais que compartilham um alto grau de similaridade em
características independentes, testadas comparativamente sob condições altamente
padronizadas" (Gevers et al., 2005). Na pratica, uma espécie procariótica é
considerada sendo um grupo de linhagens, incluindo a linhagem tipo, que são
caracterizada por um alto grau de consistência fenotípica, mostrando 70% de
hibridização DNA-DNA (DDH, DNA-DNA Hybrization) e mais de 97% de identidade
na sequência do gene 16S do RNA ribossomal (rRNA) (Vandamme et al., 1996;
Gevers et al., 2005).
Desde a década de 1970, espécies procarióticas foram descritas com base
em dados produzidos em experimentos de hibridização DNA-DNA. Nesta
abordagem, a similaridade genética entre isolados é avaliada pelo grau em que seus
genomas hibridizam sob condições padronizadas. Isolados que demonstram mais de
70% de DDH e valores menores que 5% de diferença em sua temperatura de
desnaturação (ΔTm) são considerados como pertencentes à mesma espécie
(embora este valor limite pode ser ajustado pelos especialistas que estão
familiarizados com a excentricidade de cada um dos grupos taxonômicos). Ao passo
que, os isolados que compartilham menos que 50% de DDH pertencem,
definitivamente, a espécies diferentes. Para facilitar a identificação são necessárias
13
consistência fenotípica dentro da espécie e as diferenças entre as espécies. A
análise comparativa da sequência do gene 16S rRNA é amplamente utilizado para
determinar a posição filogenética do isolados. Linhagens que mostram similaridade
menores que 97% na sequência do gene 16S rRNA com todos os taxa conhecidos
são consideradas como pertencendo a uma nova espécie, já que não existem
exemplos em que cepas com este ponto de divergência na sequência do gene 16S
do rRNA cumprir os critérios de apresentar mais de 70% de DDH (Gevers et al.,
2005).
Na prática, a caracterização taxonômica de uma coleção de
isolados
começam com uma triagem que permite os isolados esteritamente relacionados
sejam agrupados e distinguidos de isolados não relacionados. Os métodos de
triagem frequentemente utilizados incluem o conteúdo de ácidos graxos celular (um
método quimiotaxonômico no qual os lipídeos que estão presentes nas células
bacterianas são analisados e usados para delinear agrupamentos) (Welch, 1991;
Gevers et al., 2005) e uma ampla gama de métodos de tipagem baseads na análise
de DNA, incluindo AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) entre outro
métodos que se utilizam de primers randômicos (Vos, et al., 1996; van Belkum,
1994; Gevers 2005). Estes métodos têm a vantagem de serem relativamente rápidos
e fáceis de executar e podem ser automatizados, tornando-os úteis para a triagem
padronizada grande número de isolados. Posteriormente, a análise da sequência
genética do gene ribossomal 16S rRNA é realizada com representantes dos
diferentes grupos, e estas sequências são comparadas com as de espécies
conhecidas. Desta forma, a posição filogenética é determinada. Com base nos
resultados desta análise, os organismos são selecionados, e devem ser incluídos
em experimentos de hibridização DNA-DNA (Gevers et al., 2005).
14
2.4. Identificação e Tipagem Genética
Pesquisas continuas têm sido realizadas para definir um conceito de espécie
procariótica, devido a particularidades da reprodução destes microrganismos.
Stackebrandt (2002) sugeriu uma espécie procariota como "um grupo (de
preferência) genomicamente coerente de isolados individuais/cepas compartilhando
um alto
grau
de semelhança
em (muitas) características independentes,
comparativamente testado sob condições altamente padronizadas". Com esta
continua busca por um conceito natural de espécie,
baseados em novas
abordagens genômicas e no crescente número de genomas sequenciados
disponíveis vem mudando continuamente a taxonomia bacteriana e seus conceitos.
Considerando que o conceito de espécies é o arcabouço teórico que descreve o que
são espécies de bactérias e explica como eles são formados.
A definição das espécies é a forma como a concepção é exercida na prática,
e consistem de um conjunto de regras de fácil aplicação e estável (Doolittle & Papke,
2006; Konstantinidis et al., 2006). A definição de espécies bacterianas considera
espécies de bactérias os grupos de linhagens que são caracterizados por um certo
grau de consistência fenotípica, por um significativo grau de hibridação (>70%) DNADNA (DDH) e mais de 97% de identidade sequência do gene 16S da RNA do
ribosomal (rRNA) (Ursing et al., 1995; Vandamme et al., 1996; Gevers et. al., 2005).
Gevers et. al. (2005) em seu trabalho de reavaliação de espécies
procarióticas demonstrou em seu estudo que a utilização do DDH e a análise de
sequencias do gene 16S associadas com a utilização da Multilocus Sequence
Analysis (MLSA) pode melhorar a caracterização genotípica dos procariotos ao nível
intraespecífico com o uso de busca de similaridade entre genes housekeeping.
15
Inúmeras técnicas têm sido utilizadas para a identificação das LAB para uma
rápida e precisa identificação e diferenciação inter e intraespecíficas. Para obter uma
identificação precisa, técnicas fenotípicas e genotípicas são frequentemente
combinadas em uma abordagem polifásica, onde as deficiências de um método é
compensado pelo uso de outro método (De Bruyne, 2009).
Alguns destes métodos se destacam por já serem consolidados devido à
rapidez, praticidade, robustez, reprodutibilidade e eficácia na identificação de
microrganismos. Dentre estes podemos citar alguns mais utilizados para o fim de
identificar espécies ou linhagens de bactérias: perfil plasmidial, eletroforese em gel
de campo pulsátil (PFGE).
2.4.1. Perfil plasmidial
Consiste numa técnica utilizada para caracterizar bactérias a partir da análise
do padrão criado quando plasmídios são separados, com base no peso molecular,
por eletroforese em gel de agarose. Entretanto a falta de estabilidade dos plasmídios
por um longo tempo para algumas linhagens em particular, pode ser a sua maior
desvantagem (Towner & Cockayne, 1993). Em bactérias lácticas, o perfil plasmidial
era considerado útil para a tipagem de linhagens dentro de uma espécie. Contudo,
como resultado da instabilidade do DNA extracromossomal, métodos que utilizam o
DNA cromossomal, têm sido mais utilizados por demonstrarem melhores resultados
(Duffner e O’Connell, 1995, Holzapfel et al., 2001).
16
2.4.2. Eletroforese em campo pulsátil (PFGE)
Consiste em um método com alto poder discriminatório e reprodutível, e tem
sido usado para diferenciar linhagens de importantes bactérias probióticas, como
Bifidobacteria, L. casei, L. acidophilus (Roy et al. 1996; Ferrero et al. 1996; Roussel
et al. 1993; Holzapfel et al. 2001). Em muitos estudos com Lactobacillus, o PFGE
tem se mostrado como um método poderoso para tipagem de linhagens, sendo
também utilizado em estudos epidemiológicos. Contudo consiste em uma técnica
laboriosa e cara, e apenas um limitado número de amostras pode ser analisado ao
mesmo tempo (Ventura e Zink, 2002).
2.4.3. Polimorfismo de amplificação aleatória do DNA (RAPD)
Essa técnica tem como principal vantagem a geração de perfis moleculares
sem a necessidade de conhecimento específico do genoma a ser estudado.
Contudo,
seu
aspecto
negativo
consiste
na
sua
baixa
reprodutibilidade,
necessitando de condições cuidadosamente controladas (Seseña, 2004). Por ser
uma técnica rápida e simples de ser executada ela elimina muitos problemas
encontrados por outras técnicas moleculares como o PFGE e perfil plasmidial. Van
Reenen (1996) utilizou esta metodologia para diferenciar Lactobacillus plantarum e
Lactobacillus pentosus que apresentavam padrões similares para assimilação de
açucares,
contudo
apresentaram
padrões
distintos
para
o
RAPD.
Outra
desvantagem é o alto nível de padronização e controles dos parâmetros, como
concentrações adequadas de DNA, magnésio, primer e enzima, assim como o
número de ciclos da PCR (Bassam et al., 1992).
17
2.4.4. Análise de Enzimas de Restrição (REA)
A utilização de endonucleases de restrição para a digestão do DNA
cromossomal gera um padrão de fragmentos de restrição são separados em gel de
agarose em uma eletroforese convencional. O padrão de bandas gerado por esta
técnica é de difícil análise visual, sendo necessário a utilização de programas
computacionais de análise multivariável (Charteris et al. 1997). O método de REA
tem sido utilizada e conseguido bons resultados para a diferenciação de linhagens
de L. acidophilus (Roussel et al. 1993) L. casei e L. rhamnosus (Ahrné e Molin,
1997), e L. reuteri (Ahrné e Molin, 1997; Stahl e Molin, 1994).
2.4.5. Ribotipagem
Consiste na hibridização do tipo Southern Blotting de fragmentos de restrição
do rRNA por . Em geral, o padrão obtido é mais estável e de melhor interpretação
que o padrão conseguido pela REA (Charteris et al. 1997). A alta reprodutibilidade é
outra vantagem desta técnica e a possibilidade de se utilizar uma sonda universal
para todas as espécies, levando-se em consideração a similaridade entre os genes
ribossomais (Pot et al. 1993; Grimont et al. 1986; Holzapfel et al. 2001). A
ribotipagem vem sendo frequentemente utilizada na identificação e caracterização
de linhagens e diferentes espécies de LAB encontradas em diferentes processos
industriais como: fabricação do queijo mussarela (Morea et al. 1998), na produção
de whisky (Simpson et al. 2001), trato vaginal (Pavlova et al. 2002), processo de
fermentação do vinho (Du Plessis et al., 2004), produção de álcool combustível
(Skinner e Leathers, 2004) entre outros.
18
2.4.6. Análise de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA)
A técnica de ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) consiste
na análise do perfil de digestão do produto da PCR da região ITS do loco de rDNA.
O perfil gerado por ARDRA é distinto entre os grupos, podendo se diferenciar dentro
de um mesmo grupo. Esta técnica tem se mostrado uma ferramenta importante na
identificação de bactérias, e de linhagens dentro das espécies, pois nem sempre os
métodos clássicos baseados nas características bioquímicas e/ou morfofisiológicas
geram resultados claros e confiáveis (Dubernet et al. 2002; Collado e Hernández,
2007).
Assim como a ribotipagem, a ARDRA faz uso da análise dos genes
ribossomais que carregam consigo informações úteis sobre a relação evolutiva e de
parentesco entre as bactérias (Miteva et al. 2001). Esta metodologia combina
facilidade, rapidez, especificidade e sensibilidade, sendo ela precisa para a
identificação de bactérias e se mostrando bastante eficiente na diferenciação das
espécies dos gêneros Lactobacillus, Streptococcus e Bifidobacterium (Miteva et al.
2001; Moreira et al. 2005; Collado e Hernández, 2007).
Três tipos de rRNAs são encontrados nos ribossomos das bactérias (23S,
16S e 5S). Os genes codificantes destes rRNAs são separados por sequências
espaçadoras (ISRs) e são organizados em operons que podem variar de 1 a 11 por
célula bacteriana. O mais comum arranjo destes genes para as diferentes
subunidades dentro do operon segue a seguinte ordem 16S-23S-5S, são raras as
exceções nas quais os genes não se encontram dispostos desta forma (Gürtler e
Stanisich, 1996; Pisabarro et al. 1998; Roth et al. 1998; García-Martinez et al. 1999).
Estes genes são essenciais para a sobrevivência dos organismos e são altamente
19
conservados entre as espécies bacterianas. O comprimento
das regiões
espaçadoras entre os genes do rRNA 16S-23S (ISRs), que são amplificados pela
ribotipagem por PCR, podem variar entre as diferentes espécies ou dentro da
mesma espécie (García-Martinez et al. 1999). As variações no comprimento das
ISRs 16S-23S podem ser explicadas pelo fato de existir números e tipos de genes
diferentes do tRNA que pode-se encontrar dentro destas regiões (Gürtler e
Stanisich, 1996); além da presença de sequencia de reconhecimento de enzimas,
como a ribonuclease III, esta enzima está envolvida no processo de splicing para a
produção de ribossomos maduros (Bram et al. 1998); e boxA, sequência que tem um
papel anti-terminador durante a transcrição (Harvey et al. 1988). O restante desta
região consiste em sequências de genes não essenciais, e estas sequências estão
sujeitas a frequentes eventos de inserção-deleção (García-Martinez et al., 1999).
É sabido que a sequência espaçadora 16S-23S do DNA ribossomal exibe
uma grande quantidade de elementos, com comprimentos variados e sequências
conservadas com papeis funcionais definidos, como por exemplo, genes de tRNAs
(Ruiz et al. 2000).
A técnica de ARDRA-PCR foi utilizada com sucesso na diferenciação das
espécies de bactérias produtoras de ácido acético destituídas de variações
intraespecíficas indicando que a alta variabilidade da sequência 16S-23S ITS nestas
bactérias pode ser utilizadas para fazer a identificação e classificação taxonômica de
linhagens ou de grupos relatados dentro das próprias linhagens de bactérias (Ruiz et
al. 2000; Shang et al. 2003).
Para as espécies de Lactobacillus a utilização de sondas espécie-especificas
para a diferenciação intraespecífica de todas as linhagens para L. delbrueckii
conseguiu diferenciar com sucesso três linhagens de L. delbrueckii: a L. delbrueckii
20
subsp. bulgaris de L. delbrueckii subsp. delbrueckii/L. delbrueckii subsp. lactis pela
análise do perfil de restrição do 16S gerado com a enzima EcoRI (Miteva et al.
2001).
A metodologia da ARDRA constitui um especifico e reprodutível caminho para
a identificação de LAB ao nível de espécie. Além disso, a maior parte dos gêneros
co-isolados com Lactobacillus pôde ser identificada com precisão através da ARDRA
da 16S-23S rRNA (Moreira et al. 2005). Esta região permite discriminar o gênero
Lactobacillus devido ao seu padrão de amplificação, apresentando três bandas,
correspondendo às três regiões espaçadoras (pequena, media e grande regiões
espaçadoras), similar as encontradas nas espécies dos gêneros Pediococcus,
Carnobacterium, Leuconostoc e Weissella. Estas diferenças nos tamanhos são
devido a inserção do gene do tRNA-Ala dentro do médio espaçador ou dos genes
dos tRNA-Ala e tRNA-Ile dentro do espaçador maior (Figura 1). Bifidobacteria,
Enterococci, Streptococci e Staphylococci apresentam padrões de amplificação com
uma banda ou duas com tamanhos diferentes, também devido a inserção dos genes
dos tRNA (Moreira et al. 2005).
16-1A
16S
23-1B
23S
ITS (p)
tRNA
tRNA
AL A
AL A
ITS
5S
ITS (m)
tRNA
IL E
ITS (g)
Inserção de tRNAs
Figura 2. Mapa físico da região 16S-23S ITS do rDNA típico do gênero Lactobacillus mostrando
a inserção dos tRNAs da alanina e isoleucina. Modificado de Lucena (2010)
21
O gênero Lactobacillus apresenta um perfil de amplificação da região 16S23S ITS com três bandas com a banda menor com cerca de 503 pb (Figura 2). Um
estudo realizado por Lucena (2010) de linhagens industriais mostrou (Fermentec
Ltda) o perfil de amplificação típico para Lactobacillus.
1Kb
FT338B FT400B FT025B FT008B
FT337B FT124B
Figura 3. Amplificação da região espaçadora 16S-23S do agrupamento de genes de rDNA das
amostras de bactérias lácticas da Fermentec Ltda. As linhagens estão representadas na
parte superior do gel. Modificado a partir de Lucena (2010)
Segundo Moreira et al. (2005) o padrão de amplificação e o perfil de digestão
dos três espaçadores tem permitido a identificação de diferentes espécies de
Lactobacillus, o que indica ser essa uma metodologia fácil e rápida para
identificação de bactérias lácticas.
Com isso, a técnica de ARDRA poderá ser utilizada na análise da população
bacteriana associada a produção de etanol para a identificação dos contaminantes
bacterianos presentes no processo de fermentação alcoólica. Por se tratar de uma
técnica rápida, com alta sensibilidade e precisa para a identificação de LAB.
22
2.4.7. Sequênciamento de DNA
A utilização de macromoléculas como as sequências de DNA tem se
mostrado uma ótima ferramenta para a identificação e diferenciação de espécies
intimamente relacionadas. A décadas a o DNA tem sido descrita como sendo um
documento que registra as mudanças evolutivas das espécies e sendo utilizado para
da diversidade filogenética e a relação evolutiva entre diferentes espécies.
Diversos estudos têm sido feito e demonstrado que o uso de gene
codificadores de proteínas são como marcadores filogenéticos têm sido utilizados
como marcadores filogenéticos para a classificação e identificação de bactérias
lácticas. A utilização de genes informativos, como o gene 16S rRNA, são
considerados verdadeiros cronômetros evolutivos por estarem presentes em todos
os seres vivos pois a comparação de sua sequência entre diversos organismos
permite inferências filogenéticas entre os mesmos. Isto é possível porque além de
estarem presentes em todos seres vivos, são conservados do ponto
de vista
evolutivo mas apresentam regiões com variação de nucleotídeos nas diferentes
espécies, o que permite a comparação de organismos mesmo filogeneticamente
distantes.
A adoção de técnicas que utilizam o gene 16S rDNA para identificar e até
mesmo classificar uma bactéria foi sugerida e incentivada pelo comitê de sistemática
bacteriana em 2002 (Stackebrandt et. al. 2002). Desde 2003 esta abordagem é
amplamente utilizada para estudar comunidades microbianas complexas como solo,
ar e água (Hongoh et. al. 2003).
O gene 16S é comumente considerado como um confiável marcador
filogenético para atribuir relações evolutivas entre espécies do gênero Lactobacillus
23
(Schleifer & Ludwig, 1995). Este gene ainda é o alvo mais comumente utilizado em
estudos de diversidade bacteriana. Este gene é um marcador universal altamente
conservado com funções bem definidas desde os primórdios da evolução e é
relativamente não afetado por pressões ambientais. Isto, junto ao tamanho do gene,
faz com que ele seja um bom relógio evolutivo (Kimura et al., 1997; Mohania et al.,
2008). Mesmo sendo considerado um marcador universal bem conservado existem
deficiências associadas ao seu uso. Primeiro, por ser bem conservado ele limita o
poder de resolução. Segundo, o gene 16S rRNA aparece em diferentes espécies de
bactérias em diferentes números cópias do gene (Mohania et al., 2008).
Para superar estes problemas a utilização de genes classificados como
housekeeping, genes constitutivos que são requeridos para a manutenção das
funções celulares básicas, vem surgindo como uma alternativa para a resolução
destes problemas (Naser et al., 2007). Estudos recentes in silico baseados em
genomas completos têm providos as bases para o estabelecimento de uma serie de
genes housekeeping que podem predizer precisamente o parentesco genômico
aumentar a precisão da identificação das espécies. A necessidade por marcadores
genômicos alternativos que forneçam mais altos níveis de discriminação do que o
gene 16S rRNA têm levado a um sequenciamento sistemático de genes
housekeeping (Coenye et al., 2005; Gevers et al., 2005; Konstatinidis & Tiedje, 2005;
Naser et al., 2005a).
Os estudos de análises de sequências de loco único (SLSA - Single-locus
sequence analysis) focam genes codificadores de proteínas que tem evolução
relativamente lenta, porem mais rapidamente do que os genes 16S rRNA, para obter
uma alta resolução taxonômica (Figura 3).
24
Figura 4. Árvore filogenética feita a partir de sequências do gene 16S mostrando a posição do
T
Lactobacillus hammesii sp. nov. strains LP38 e LP39 entre alguns lactobacilli. (Reproduzido de
Valcheva et al., 2005)
Para ser utilizado para discriminação de espécies, é ideal que os gene esteja
presente em uma única copia no genoma, evoluir com maior rapidez do que os
genes rRNA e ser amplamente distribuídos entre os genomas bacterianos. Aqueles
genes nos quais a recombinação pode conferir uma vantagem seletiva, ou genes
ligados estreitamente, devem ser evitados. Além disso, estes genes devem ser
informativos e com um adequado grau de resolução e fornecer variabilidade para
diferenciar espécies de um gênero em particular (Naser et al., 2007).
A utilização de genes housekeeping tal como o gene que codifica a
subunidade α da RNA polimerase (gene rpoA) e a enzima fenilalanina-tRNA
sintetase bacteriana (gene pheS) têm se mostrado como um robusto sistema para a
identificação de todas as espécies reconhecidas de Enterococcus (Naser, et al.,
2005b) e de todas as espécies do gênero Lactobacillus (Naser et al., 2007). A partir
25
da análise dos genes pheS e ropA é possível fazer a diferenciação efetiva das
espécies de Lactobacillus com um alto nível de discriminação quando comparado
com o gene 16S rRNA.
RecA é uma pequena proteína essencial para o reparo e manutenção do
DNA. Está envolvida no processo de recombinação homóloga do DNA, indução do
sistema SOS (um sistema de reparo do DNA pós-replicação), e indução dos
mecanismos de reparação de lesões no DNA. Devido ao seu papel fundamental, o
gene recA é ubíquo, e seu produto tem sido proposto como um marcador
filogenético para espécies muito próximas (Felis et al., 2001; Torriani et al., 2001). O
uso desta metodologia para a diferenciação de três espécies do grupo Lactobacillus
plantarum (L. plantarum, L. pentosus e L. paraplantarum) teve êxito e mostrou um
alto poder discriminatório no uso deste gene para separar espécies de difícil
diferenciação, tais como Bifidobacterium longum e Bifidobacterium infantis.
Validando a utilização deste gene como marcador filogenético-taxonômico para
espécies relacionadas, abrindo uma nova possibilidade para uma rápida e segura
identificação de LAB importantes de uso industrial.
Silvers et al. (2003) determinou as sequências de nucleotídeos do gene atpD
que codifica a subunidade β da ATPase das bactérias Oenococcus oeni,
Leuconostoc
mesenteroides
subsp.
mesenteroides,
Pediococcus
damnosus,
Pediococcus parvulus, Lactobacillus brevis e Lactobacillus hilgardii. A árvore obtida
a partir destas sequências indicaram que O. oeni e L. mesenteroides subsp.
mesenteroides formaram um grupo bem separados de P. damnosus e P. parvulus
e das duas espécies de Lactobacillus.
Tapp et al. (2003) em seus estudos, do gene rnpB, que é universalmente
presente em bactérias Gram-positivas com baixo conteúdo de G+C e, que codifica a
26
subunidade de RNA da endoribonuclease P, revelou que o mesmo se mostrou
adequado para analises filogenéticas de taxa relativamente próximos e como uma
potencial
ferramenta
para
discriminação
de
espécies
dentro
do
gênero
Streptococcus. Em outro estudo, o uso de sequências parciais do gene rpoB, que
codifica a subunidade altamente conservada da RNA polimerase bacteriana. As
sequências do gene rpoB mostraram um maior poder discriminatório do que
sequências do gene 16S rRNA para a identificação de LAB dos gêneros
Streptococcus, Enterococcus, Gemella, Abiotrophia e Granulicatella (Drancourt et
al., 2004).
2.4.8. Rep-PCR
A técnica Rep-PCR faz uso de sequências oligonucleotídicas iniciadoras
complementares de sequências de DNA repetitivas muito conservadas e presentes
em numerosas cópias no genoma da maioria das bactérias Gram-negativas e de
várias bactérias Gram-positivas.
Foram identificadas três famílias de sequências repetitivas: 1) as sequências
REP (Repetitive Extragenic Palindromic elements) com 35-40 pares de bases, as
quais são altamente conservadas em várias espécies bacterianas; 2) as sequências
ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus elements) de 124-127 pares
de bases, as quais contêm um elemento repetitivo central invertido altamente
conservado e que estão localizados nas regiões extragênicas do genoma
bacteriano; 3) o elemento BOX de 154 pares de bases.
A amplificação das sequências entre cada um destes elementos repetitivos
têm sido utilizadas para gerar perfis de DNA de várias espécies bacterianas, tanto
27
Gram-positivas quanto Gram-negativas (Vuyst et al., 2008). Sequências com
unidades de repetição (GTG)5 aparecem distribuídas amplamente nos genomas de
diversos grupos de bactérias. A amplificação das sequências destes elementos
repetitivos gera padrões de impressões genéticas (DNA fingerprints) específicos
para diversas espécies de Lactobacillus (Gevers et al., 2001) e Enterococcus (Švec
et al., 2005), permitindo uma especiação e tipagem rápida, precisa e confiável.
A Rep-PCR consiste em uma técnica com alto poder discriminatório, baixo
custo, adequado para discriminação de linhagens e pode ser considerada como uma
ferramenta confiável para a classificação e tipagem de um grande numero de
bactérias Gram-negativas e várias bactérias Gram-positivas (Gevers et al., 2001).
Hyytiä-Trees et al. (1999) sugeriu que um adequado nível de discriminação
entre linhagens de Lactobacillus sakei pode ser conseguido com o uso combinado
da Rep-PCR usando primers BOX e REP e RAPD. Enquanto que, Sohier et al.
(1999) demonstrou a aplicabilidade da rep-PCR para identificar as espécies de
Lactobacillus hilgardii e Lactobacillus brevis.
A técnica de Rep-PCR utilizando o iniciador (GTG)5 é uma ferramenta rápida,
de fácil perfomance e, reprodutível para a diferenciação de uma grande variedades
de Lactobacillus associados a alimentos no nível de espécie, subespécie e,
potencialmente, ate o nível de linhagem, com um protocolo de desempenho simples.
Esta técnica consiste em uma ferramenta genotípica promissora para a especiação
e tipagem rápida e confiável de Lactobacillus entre outras LAB em indústrias de
fermentação (Gevers et al., 2001, Lucena et al., 2010).
Vuyst et al. (2008) fez a utilização do primer (GTG)5 que permitiu a
identificação da impressão genética das bactérias ácido acético (AAB - Acetic Acid
Bacteria) durante um dia de trabalho. Fazendo uso desta ferramenta para a
28
classificação e identificação de AAB no nível de espécies, bem como a para a
caracterização destas bactérias ao nível intraespecífico. A utilização do primer
(GTG)5 pode aumentar o conhecimento a cerca da ecologia biodiversidade tanto das
LAB como das AAB e ajudar a determinar com mais precisão o seu comportamento
de crescimento e benéficos ou indesejáveis papeis durante várias etapas da
fermentação de alimentos.
Diante disto, a taxonomia dos procariotos vem evoluindo juntamente com os
avanços nas áreas de Genética de Populações de microrganismos, Ecologia,
Genômica, Transcripitônica e na facilidade de obtenção de dados sequênciamento.
Isto faz com que os conceitos de espécie sejam revistos.
Avanços na área molecular leva a crer que o futuro da taxonomia e
sistemática microbiana terá como base a abordagem de análise de sequências de
DNA (Gevers et al. 2005). Assim esta abordagem pode ser utilizada para o estudo
de populações complexas de microganismos como a do processo de fermentação
etanólica industrial. O conhecimento das espécies bacterianas que entram no
processo fermentativo contribuirá para um maior controle das contaminações
bacterianas que diminuem o rendimento da produção de etanol. Isto trará benefícios
econômicos para o setor industrial.
29
3. Objetivos
3.1 Geral
Este trabalho teve como principal objetivo a identificação de bactérias
presentes no caldo de cana-de-açúcar e destilarias da região Nordeste do Brasil.
3.2 Específicos
Identificar quais grupos bacterianos entram no processo fermentativo do caldo
de cana-de-açúcar.
Verificar quais as bactérias lácticas mais comuns quais problemas podem ser
identificados como sendo causados por sua presença durante a fermentação.
Demonstrar a eficácia das técnicas de ARDRA e Sequênciamento de DNA
para identificação empregadas neste trabalho
30
4. Material e Métodos
4.1. Isolamento, manutenção e identificação bacteriana
Amostras do caldo de cana-de-açúcar de quatro destilarias localizadas nos
estados da Paraíba e Pernambuco, região Nordeste do Brasil, foram coletadas
durante o período da safra de 2007-2008. As coletas foram realizadas nas usinas
Giasa (Pedras de Fogo-PB), Japungu e Miriri (Santa Rita-PB) e Trapiche (SirinhaémPE) onde 100mL do caldo de partida foi coletado em sacos estéreis e transportados
em gelo para o laboratório onde foram executados os experimentos.
Inicialmente amostras foram diluídas em solução salina 0,85% estéril até
3x10-4 e semeadas em placas de Petri contendo o meio de cultura MRS® sólido
acrescido de ciclohexamida (0,2 gL-1) para inviabilizar o crescimento de fungos. As
placas foram incubadas em jarras de anaerobiose a 37ºC com geradores de
anaerobiose Anaerocult A (Merk) (Skinner e Leathers, 2004).
4.1.1 Isolamento e purificação das Culturas
Após o crescimento, foram selecionadas as placas nas quais havia um
crescimento de aproximadamente 100 colônias com uma boa distribuição na placa.
As colônias foram caracterizadas segundo a sua morfologia, e o isolamento
realizado por amostragem estratificada segundo cada morfotipo. Os isolados foram
mantidos em glicerol 30% a -20oC. As colônias foram semeadas em meio MRS
líquido para o crescimento e posterior extração do material genético das mesmas.
31
4.2. Tipagem Genética
4.2.1. Extração de DNA
O método extração de DNA foi adaptado do protocolo de Moreira et al. (2005).
Resumidamente, os isolados obtidos foram semeados em 10mL do meio MRS
líquido em tubos Falcon™ de 15mL. As células foram centrifugadas por 10min a
4.000 rpm, e o sedimento celular foi ressuspenso em 1ml de LiCl 5M, transferidos
para microtubos de 1,5mL e incubados por 1h sob agitação constante. Após
incubação, as células foram centrifugadas a 4.000 rpm em microcentrífuga de
bancada. O sedimento foi ressuspenso em 1ml do tampão TE10 (Tris 50mM, EDTA
10mM, pH 8,0) acrescido de 3 L de solução de lisozima (10mg/mL) e incubados por
1h e posteriormente centrifugados por 10min a 4.000 rpm. O sedimento foi
novamente ressuspensos em TE10 (540 µL) acrescido de 60µL de solução de SDS
(10%) para permitir a lise celular (entre cada fase de ressuspensão o sedimento foi
lavado em água mili-Q).
Os tubos foram centrifugados mais uma vez e o sobrenadante foi transferido
para outro microtubo onde foi acrescido de clorofane (fenol-clorofórmio + álcool
isoamílico, 1:1) na quantidade de 600μL por microtubo e centrifugado por 10min a
14.000 rpm, ao sobrenadante retirado e transferido para um novo microtubo onde foi
acrescido 600μL de clorofil (clorofórmio-álcool isoamílico, 24:1). O DNA foi
precipitado em 600μL de álcool isopropanol 100%, centrifugado a 4°C a 14.000 rpm
por 30min. Mais uma vez ressuspendido em 500μL de etanol 70% e centrifugado a
4°C a 14.000 rpm por 10min e, por fim ressuspendido em 100μL de água estéril.
32
4.2.2. ARDRA-PCR
A amplificação da região espaçadora 16S-23S do gene do rRNA seguiu o
protocolo descrito por Moreira et al. (2005), utilizando o primer 16-1A, e o primer 231B, (Tabela 2) (Tilsala-Timisjarvi e Alatossava, 1997).
Para a amplificação realizou-se uma reação em cadeia da polimerase (PCR)
com as seguintes condições: 10pmol de cada primer, 0,2 mM de cada dNTP,
tampão de reação (1X), com 1,5mM de MgCl2 e 5U de Taq DNA polimerase
(Invitrogen Life Technologies) para um volume final de 50µL. A amplificação
consistiu de um ciclo de desnaturação de 2 minutos a 94°C, seguido de 35 ciclos de
desnaturação a 94°C por 30seg, anelamento a 55°C por 1min, extensão a 72°C por
1min e extensão final a 72°C por 10min. Os produtos da amplificação foram
separados em gel de agarose 1,4% submetidos a 5 V/cm por 45min em tampão TBE
0,5X, corados em brometo de etídeo, e visualizados em transiluminador ultravioleta.
Os produtos de amplificação foram digeridos com 12 enzimas de restrição
(SphI, NcoI, NheI, SspI, SfuI, EcoRV, DraI, VspI, HincII, EcoRI, HindIII, AvrII)
(Fermentas) e os fragmentos de digestão foram separados em gel de agarose 1,4%
submetidos a 5 V/cm por 45min em tampão TBE 0,5X, corados em brometo de
etídeo, e visualizados em transiluminador ultravioleta. Os produtos de digestão
foram comparados com o banco de dados genéticos descrito por Moreira et al.
(2005) (Anexo 1).
4.2.3. rep-PCR
Para realizar a reação de amplificação dos elementos repetitivos do DNA foi
utilizado primer (GTG)5 segundo Lucena et al. (2010). Na reação de amplificação foi
33
utilizado 0,2 pmol do primer (GTG)5; 0,2 mM de dNTP; 3 mM MgCl2; 0,025 µg/µL de
BSA (Bovine Serum Albumin - soro de albumina bovina)e 1 U Taq polimerase
(Invitrogen). O programa de amplificação foi composto por um período de
desnaturação a 95°C por 7min, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95°C por
1min, anelamento a 40°C por 1min, extensão a 65ºC por 8min seguidos por um
período de extensão final de 16min. O produto da PCR foi separado em gel de
agarose 1,5% submetido a 5 V/cm em tampão TBE 0,5X, corado em brometo de
etídeo. As imagens do foram capturadas usando um sistema de captura de imagens
PhotoCapture™. A similaridade entre os padrões de amplificações foram
determinadas através de análises visuais das imagens.
4.2.4. Sequênciamento dos genes 16S rRNA e pheS
O gene 16S rRNA foi amplificado por PCR utilizando os primers 27F e 519R,
desenhados para o anelamento nas extremidades do gene e amplamente utilizados,
que amplificam um fragmento de aproximadamente 492 pb (Hauben et al. 2005)
(Tabela 1). O programa térmico consistiu de 1 ciclo de desnaturação a 95°C por 3
minutos, seguidos por 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 1min; anelamento a
51°C por 1min e 30s; extensão a 72°C por 3min e uma extensão final a 72°C por
30min no termociclador Biocycler (MJ96+).
Para o gene pheS foram utilizados os primers 21-F, e 22-R ou 23-R (Tabela
2) (Naser et al. 2005b). As reações para amplificações foram feitas utilizando 0,5 µM
de cada primer, 0.2 mM de cada dNTP, tampão de reação (1X) com 1,5 nM de
MgCl2 e 1U de Taq polimerase (Invitrogen). As amplificações foram feitas em no
termociclador Biocycler (MJ96+) programado para 1 ciclo de desnaturação de 5
34
minutos a 95°C, seguidos por 3 ciclos de desnaturação 95°C por 1 minuto,
anelamento a 46°C por 2 minutos e 15 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e 15
segundos e 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 35 segundos, anelamento a 46°C
por 1 minuto e 15 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e 15 segundos, e uma
extensão final de 7 minutos a 72°C.
Os produtos da PCR foram purificados com o kit Wizard® SV Gel and PCR
Clean-Up System (Promega). Cerca de 50 a 100 ng do produto da purificação foram
misturados com a reação de marcação BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing
Kit (Applied Biosystems), seguindo as instruções do fabricante na presença de um
dos primers descritos na concentração de 1,2µM. O sequênciamento foi realizado na
Plataforma Genômica do Laboratório Central do Centro de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Pernambuco, utilizando o sequenciador 3500 Genetic
Analyser (Applied Biosystems - USA). A verificação da qualidade das sequências
geradas foi feita pelo programa Sequencing Analysis (Applied Biosystems), que
gerou arquivos com o eletroferograma de cada sequência.
Inicialmente as sequências fora editadas através do programa Pregap4
pertencentes ao Standen Package (Standen, 1998) e submetidas à busca de
similaridade no banco de dados do NCBI, utilizando a ferramenta Blast N (Altschul et
al., 1997). A identificação bacteriana foi assumida se a sequência de consulta
mostrou similaridade >90% com a sequência de nucleotídeos da linhagem tipo para
o gene pheS (Naser et al., 2007) e similaridade > 97% para o gene 16S (Gevers et
al., 2005).
Após a edição foi feito o alinhamento múltiplo utilizando a ferramenta
ClustalW do programa MEGA 4 (Tamura et al., 2007), que também foi utilizado para
a construção e visualização das árvores filogenéticas geradas. Os agrupamentos
35
baseados nas inferências filogenéticas foram construídos aplicando o algoritmo
Neighbour-Joining (Saitou e Nei, 1987) com testes estatísticos de bootstrap com
2000 replicações.
Tabela 2. Primers utilizados nas reações de PCR e sequenciamentos.
Primer
Sequência (5'→3')a
Posição
Referencia
b
Tilsala-Timisjarvi e Alatossava, 1997
16-1A
GTCGGAATCGCTAGTAATCG
1361
23-1B
GGGTTCCCCCATTCGGA
127 b
Tilsala-Timisjarvi e Alatossava, 1997
21-F
CAYCCNGCHCGYGAYATGC
557 c
Naser et al. 2005b
22-R
CCWARVCCRAARGCAAARCC
1031c
Naser et al. 2005b
c
Naser et al. 2005b
23-R
GGRTGRACCATVCCNGCHCC
968
27F
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
8-27c
Hauben et al. 2005
519R
GTATTACCGCGGCTGCTG
536-519c
Hauben et al. 2005
a
Y:C ou T; N:A,C,G ou T; H:A, C ou T; W:A ou T; R:A ou G; V:A, C ou G
Posição de ligação no cromossomo de L. casei
c
Posição de ligação no cromossomo de E. coli
b
36
5. Resultados
5.1. Análise Molecular das Bactérias isoladas do Caldo de Cana
Como forma de identificação os perfis de ARDRA obtidos neste trabalho foram
comparados com um banco de dados gerados por Moreira et al. (2005) e Lucena (2010).
Foram analisados neste trabalho através da ARDRA um total de 141 isolados
oriundos do caldo de partida das quatro destilarias estudadas durante a safra 2007-2008,
sendo 25 pertencendo a Giasa; 52 isolados a Japungu; 44 a Miriri e 20 da Trapiche. Pelo
uso da técnica de ARDRA foi possível identificar 33,33% do total de isolados de todas as
destilarias (Anexo 2).
Figura 5. Gêneros de LAB encontrados no caldo de partida das destilarias Japungu, Miriri e
Giasa durante a safra 2007/2008.
Neste estudo foi possível encontrar no caldo de alimentação do processo de
fermentação seis gêneros de LAB (Figura 5). A maioria dos isolados encontrados
encontradas pertenceram ao gênero Lactobacillus, que é comumente encontrado durante
a produção de álcool nas destilarias do Nordeste brasileiro (Lucena et al., 2010).
37
A diversidade de LAB encontradas nas destilarias estudadas foi grande. Foram
encontradas 15 espécies de bactérias utilizando as técnicas descritas na seção anterior.
Destacam-se as espécies L. fermentum, Leuc. mesenteroides que apresentaram a maior
abundancias nas amostras coletadas, cada um representou 24% dos isolados
identificados e W. confusa que teve uma frequência também elevada (20%) porém menor
que as primeiras (Figura 6). As demais espécies foram encontradas em uma frequência
bem abaixo das bactérias que predominaram durante o período de estudo.
Figura 6. Distribuição percentual das espécies de bactérias lácticas identificadas utilizando as
técnicas de ARDRA e sequênciamento do genes 16S e pheS.
38
5.1.1. Destilaria Giasa
Nesta destilaria foram feitas três coletas durante o período da safra, e puderam ser
identificados através da análise do perfil de restrição do rDNA amplificado 65% dos
isolados (Anexo 2), sendo o gênero Lactobacillus o mais frequente, representado pelas
espécies L. fermentum (44%) e L. delbrueckii (4%) seguidas por Lactococcus,
representado por Lac. lactis (16%). Cerca de 36% dos isolados desta destilaria não
puderam ser identificados utilizando a ARDRA (Figura 7).
Figura 7. Bactérias lácticas identificadas a partir da análise do perfil de restrição do
rDNA amplificado ARDRA. N=25
Os isolados não identificados foram submetidos a análise do sequênciamento do
genes 16S e pheS. A identificação destes isolados se deu primeiramente com o
sequênciamento do gene 16S, com as sequências dos isolados apresentando
similaridade de 97% ou mais com sequências depositadas no Genebank.
Dos isolados que tiveram o gene 16S sequenciados 95% foram identificados como
pertencendo a espécie L. fermentum, enquanto que 5% foram identificados como
Oenococcus sp. (Figura 8).
39
O isolado GCP7.2.1 foi identificado como sendo um Oenococcus sp. devido a
problemas de sequência e foi o único com similaridade abaixo de 97% de similaridade
com a espécie mais próxima ao mesmo (Oenococcus kitaharae).
Figura 8. Bactérias Lácticas identificadas a partir da análise de sequências do gene 16S.
Figura 9. Árvore filogenética construída a partir do gene pheS utilizando o método NeighbourJoining dos isolados da destilaria Giasa.
Os isolados identificados como sendo L. fermentum a partir da análise do
sequênciamento do gene 16S foram confirmados pelo sequênciamento do gene pheS
como pertencentes a esta espécie (Figura 9) onde pode-se observar a formação de um
agrupamento composto pelos isolados sequenciados. Nesta nova análise foi possível
identificar o isolado GCP7.3.15 como pertencendo a espécie L. fermentum, devido a esta
40
análise da sequência do gene pheS. A Tabela 3 mostra os isolados identificados pela
análise das sequências dos genes 16S e pheS. O sequênciamento se mostrou uma ótima
ferramenta para a identificações destes isolados.
Durante a safra foi encontrada uma baixa diversidade bacteriana (Figura 7), fato
que pode ser explicado pelo pequeno número de
colônias que foram isoladas. A
dinâmica da população bacteriana foi variável, onde não foi possível encontrar as
mesmas espécies ao longo das três coletas.
Tabela 3. Isolados identificados a partir do sequênciamento dos genes 16S e pheS
Isolado
Marcador
Identificação
GCP7.3.7
16S
Lactobacillus fermentum
GCP7.3.8
16S
Lactobacillus fermentum
GCP7.3.14
16S
Lactobacillus fermentum
GCP7.3.15
pheS
Lactobacillus fermentum
GCP7.3.16
16S
Lactobacillus fermentum
GCP7.3.17
16S
Lactobacillus fermentum
GCP7.3.18
16S
Lactobacillus fermentum
GCP7.3.19
16S
Lactobacillus fermentum
Figura 10. Dinâmica da população bacteriana da destilaria Giasa durante
a safra 2007/2008
41
5.1.2. Destilaria Japungu
Três coletas foram realizadas nesta destilarias e após o isolamento foram obtidos
54 isolados. A maior parte dos isolados não puderam ser identificados pela ARDRA,
apenas 35% deles foram identificados (Figura 11).
Quatro gêneros de LAB foram encontrados nas coletas realizadas nesta destilaria.
Houve uma predominância do gênero Leuconostoc (56%) seguidos por Wissella (38%),
Lactobacillus (4%) e Staphylococcus (2%).
Grande parte dos isolados não apresentou o perfil de amplificação da região
espaçadora típica do gênero Lactobacillus (Figura 2), mas apresentaram diversos perfis
de ARDRA que não haviam sido observados no banco de dados já estabelecido na
literatura.
Figura 11. Bactérias lácticas identificadas pela análise do perfil de digestão do rDNA amplificado.
N=54
Os isolados não identificadas foram submetidas ao sequênciamento do gene 16S
para uma nova tentativa de identificação. A partir da análise do sequênciamento foram
42
identificados todos as bactérias lácticas que não possuíam perfis de ARDRA no banco de
dados (Tabela 4).
Tabela 4. Isolados identificados através da análise das sequências parciais dos genes
16S e pheS durante a safra 2007/2008.
Isolados
Marcador
Identificação
JCP7.1.1
pheS
Weissella cibaria
JCP7.1.2
16S
Leuconostoc garlicum
JCP7.1.3
pheS
Leuconostoc garlicum
JCP7.1.4
pheS
Weissella cibaria
JCP7.1.5
16S
Weissella cibaria
JCP7.1.7
16S
Weissella cibaria
JCP7.1.8
16S
Leuconostoc citreum
JCP7.1.9
16S
Leuconostoc garlicum
JCP7.1.12
16S
Leuconostoc garlicum
JCP7.1.14
16S
Staphylococcus epidermidis
JCP7.1.16
16S
Leuconostoc garlicum
JCP7.1.17
16S
Leuconostoc citreum
JCP7.1.20
pheS
Weissella cibaria
JCP7.1.21
16S
Weissella confusa
JCP7.2.2*
16S
Weissella confusa
JCP7.2.3
16S
Leuconostoc garlicum
JCP7.2.8*
16S
Weissella confusa
JCP7.2.9*
16S
Weissella confusa
JCP7.2.10
16S
Weissella confusa
JCP7.2.11*
16S
Weissella confusa
JCP7.2.12*
16S
Weissella confusa
43
JCP7.2.14*
16S
Leuconostoc citreum
JCP7.2.15*
16S
Weissella confusa
JCP7.2.16*
16S
Leuconostoc citreum
JCP7.2.17*
16S
Leuconostoc citreum
JCP7.2.18
16S
Leuconostoc citreum
JCP7.2.19
16S
Leuconostoc citreum
JCP7.2.20*
16S
Leuconostoc citreum
JCP7.3.3
16S
Leuconostoc mesenteroides
JCP7.3.7
pheS
Leuconostoc mesenteroides
JCP7.3.14
16S
Leuconostoc mesenteroides
JCP7.3.16*
16S
Weissella cibaria
JCP7.3.20
16S
Leuconostoc mesenteroides
* Isolados que tiveram suas identificações confirmadas pelo sequenciamento do gene pheS.
A dinâmica das bactérias lácticas nas coletas realizadas durante a safra de
2007/2008 é mostrada na Figura 12.
Figura 12. Dinâmica da população bacteriana da destilaria Japungu durante a safra 2007/2008
44
Analisando a Figura 12 pode-se observar que há um aumento na diversidade das
bactérias nesta destilaria, principalmente na primeira coleta onde predominou o isolado
identificado como W. cibaria (46%) seguidos por Leuc. mesenteroides (31%), Leuc.
citreum, w. confusa e S. epidermidis todos com 8% dos isolados identificados.
Na segunda coleta houve uma queda no numero de espécies, mas com um
aumento na frequência
de W. confusa (62%) e Leuc. citreum (38%) das espécies
identificadas.
Na terceira coleta verificou-se que o Leuc. mesenteroides foi a espécie de maior
frequência com de 73% seguidos pelo aparecimento do L. fermentum, que só havia sido
identificado pela ARDRA, representando 23% dos isolados seguido pela W. cibaria
identificada com 4% dos isolados identificados.
Um dos fatores que pode explicar este aumento é por esta destilaria receber cana
de vários produtores, forma como é feita a coleta por cada um destes produtores e o
contaminação dos equipamentos responsáveis pela moagem da cana.
Durante a safra foram identificadas bactérias pertencentes à espécie Leuconostoc
garlicum. Esta foi descrita por Kim e Kyung (2003), isoladas a partir do alho utilizado na
culinária (Allium sativum) porém não tiveram seu artigo publicado e nem seu epíteto
reconhecido mas já existe inúmeras sequências depositadas no Genebank. Não existe
estudos anteriores que tenham encontrado esta espécie no caldo de cana para produção
do etanol.
Com estudo filogenético feito a partir das sequências obtidas foi possível obter a
árvore filogenética observada na Figura 13 a partir do agrupamento tipo Neighbor Joining.
45
Nela é pode-se observar que os resultados obtidos pelo sequenciamento são robustos e
consistentes com os resultados da análise utilizando a ferramenta BLAST do GeneBank.
Figura 13. Árvore filogenética construída a partir das sequências de nucleotídeos do gene 16S,
utilizando o agrupamento do tipo Neighbor joinning, dos isolados encontrados no caldo de cana da
destilaria Japungu durante a safra de 2007/2008.
46
5.1.3 Destilaria Miriri
Durante o período da safra fora efetuadas três coletas nesta destilaria, espécies de
três gêneros foram encontradas durante esta safra. Houve um predomínio do gênero
Weissella (46%), seguido por Lactobacillus e Leuconostoc com 38% e 16% das espécies
encontradas, respectivamente.
Em uma primeira análise feita pela ARDRA de todos os isolados apenas 32%
foram identificados de acordo com seu perfil de restrição do DNA ribossomal amplificado
(Figura 14). A grande maioria não pode ser identificada devido a divergências entre os
perfis encontrados neste trabalho e na literatura. Porém este método pode identificar com
grande precisão as espécie L. nagelli, L. salivarus e L. fermentum.
Figura 14. Bactérias lácticas identificadas pela análise do perfil de digestão do
rDNA amplificado. N=54
Os 68% dos isolados não identificados foram submetidos ao sequenciamento dos
genes pheS e 16S. E a partir da análise das sequências obtidas através da busca de
similaridade entre sequências do Genebank foram identificadas as bactérias lácticas
mostradas na tabela 5.
47
Tabela 5. Isolados identificados a partir do sequênciamento dos genes 16S e pheS
oriundos da destilaria Miriri durante a safra 2007/2008
Isolado
Marcador
Identificação
MCP7.1.1
16S
Weissella cibaria
MCP7.1.4
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.1.5
16S
Leuconostoc mesenteroides
MCP7.1.6
16S
Leuconostoc pseudomesenteroides
MCP7.1.7
16S
Weissella confusa
MCP7.1.9
16S
Leuconostoc pseudomesenteroides
MCP7.1.11
16S
Leuconostoc lactis
MCP7.1.13
16S
Leuconostoc pseudomesenteroides
MCP7.1.14
16S
Leuconostoc pseudomesenteroides
MCP7.1.17
16S
Leuconostoc pseudomesenteroides
MCP7.1.19
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.1.20
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.3.1
pheS16S
Weissella confusa
MCP7.3.2
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.3.3
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.3.4
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.3.5
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.3.6
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.3.7
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.3.8
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.3.9
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.3.10
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.3.11
pheS/16S
Weissella confusa
MCP7.3.12
16S
Leuconostoc lactis
48
Durante a safra foi possível observar que houve uma queda no numero de
espécies de LAB encontradas (Figura 15). A diversidade na primeira coleta foi a maior
observada entre as destilarias estudadas com seis espécies encontradas. A espécies
Leuc. pseudomesenteroides foi a predominante com cerca de 36% dos isolados seguidos
por W. confusa, (22%), L. salivarus e L. nagelii ambos com 14% e W. cibaria e Leuc.
mesenteroides com 7% cada. Na segunda coleta só foi encontrado isolados pertencentes
a espécie L. fermentum, isso se deve ao fato dela ter apresentado um número reduzido
de isolados coletados (N=09).
Figura 15. Diversidade da população bacteriana presente no caldo de cana da destilaria Miriri
durante a safra 2007/2008.
Apenas duas espécies foram encontradas na terceira coleta com a predominância
da bactéria W. confusa (92%) e a espécie L. fermentum encontrada em 8% dos isolados
desta coleta.
A partir da análise filogenética, através da construção de arvores filogenéticas
baseadas nas sequências de nucleotídeos obtidas através do sequenciamento do gene
49
16S foi possível fazer a identificação das espécies bacterianas que não apresentaram o
perfil de amplificação da região espaçadora dos genes 16S e 23S diferentes do
apresentado pelas bactérias do gênero Lactobacillus (Figura 17).
A análise da árvore da maior consistência à análise feita através da busca de
similaridade entre as sequências depositadas no Genebank.
Figura 16. Árvore filogenética construída a partir das sequências do gene 16S dos isolados da
destilaria Miriri utilizando o agrupamento Neighbor Joining.
50
5.1.4 Destilaria Trapiche
Nesta destilaria foi realizada apenas uma coleta durante a safra, com um total de
20 isolados dos quais apenas dois não obtiveram crescimento no meio liquido. Três
gêneros foram encontrados com Leuconostoc se destacando dentre os demais com onze
isolados identificados representando 75% dos mesmos seguidos por Lactobacillus (15%)
e Weissella (10%).
Através da ARDRA foram identificados 17% dos isolados (Anexo 2). Todos foram
pertencentes a espécie L. plantarum. Os outros 83% dos isolados encontrados não
possuíam perfil de restrição do rDNA amplificado no banco de dados, sendo necessário
fazer uma análise de sequências de nucleotídeos. As identificações são mostradas na
tabela 6.
Tabela 6. Isolados identificados a partir do sequênciamento dos genes 16S e pheS
encontrados no caldo de partida da destilaria Trapiche.
Isolado
TCP7.1.1
TCP7.1.2
TCP7.1.3
TCP7.1.4
TCP7.1.5
TCP7.1.6
TCP7.1.7
TCP7.1.8
TCP7.1.9
TCP7.1.10
TCP7.1.11
TCP7.1.13
TCP7.1.14
TCP7.1.15
TCP7.1.16
TCP7.1.17
Marcador
16S/pheS
16S
16S
16S
16S
16S
16S
16S
16S
16S
16S
16S
16S
pheS
16S
16S
Identificação
Weissella confusa
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Lactobacillus plantarum
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Weissella paramesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
51
Figura 17. Árvore filogenética construída a partir das sequências do gene 16S dos isolados da destilaria
Trapiche utilizando o agrupamento Neighbor Joining.
52
5.2 Análise Intraespecífica dos isolados
A técnica de rep-PCR com o uso do primer (GTG)5 foi utilizada com a finalidade de
diferenciar ao nível intraespecífico os isolados das espécies W. confusa.
e Leuc.
Mesenteroides identificados na safra 2007/2008. Este isolados foram os que
apresentaram uma maior abundância durante as análises, ficando atrás
apenas dos
isolados de L. fermentum (Figura 6).
5.2.1 Weissella confusa
Esta espécie de bactéria foi encontrada apenas nas destilarias Japungu, Miriri e
Trapiche. Os perfis de amplificação da região espaçadora 16S-23S obtidos destes
isolados foram diferentes dos encontrados no gênero Lactobacillus, apresentando uma
quarta banda entre o primeiro e o segundo espaçador com aproximadamente 620pb
(Figura 18). Além disso, seu espaçador menor apresentou um tamanho superior com
aproximadamente 580pb contrastando com o perfil característicos dos Lactobacillus onde
o menor espaçador apresenta aproximadamente 503pb. Isso se mostrou uma constante
nos isolados do gênero Weissella, podendo ser descrito como uma característica que os
diferencia dos Lactobacillus.
1
2
3
4
5
100pb
600bp
Figura 18. Perfil de amplificação da região espaçadora 16S-23S dos isolados identificados como
pertencentes ao gênero Weissella. Marcador de peso molecular (100bp Biolabs)
53
Estes isolados apresentaram diferentes perfis de amplificação e de restrição do
rDNA amplificado, por isso, foi feita uma análise intraespecífica de alguns dos isolados
representativos encontrados. Para isso, foi utilizada a técnica de rep-PCR com a
utilização do primer (GTG)5 com a finalidade de diferenciar estes isolados que foram
detectados nas destilarias estudadas.
Foi observado que mesmo em isolados de uma mesma coleta existe diferenças
entre os mesmos sugerindo uma diferenciação intraespecífica. Na figura 20 pode-se ver
que em coletas feitas na três destilarias que os isolados de W. confusa apresentam perfis
de rep-PCR semelhantes, como no caso dos isolados 6, 7, 8, 9, 13 e 14 que apresentam
um perfil bem característico e distinto dos demais. Mesmo tendo este perfil característico
eles apresentaram mudanças sutis que não são suficientes para afirmar que pertencem a
linhagens distintas.
Os isolados 2 e 3 formam outro grupo distinto, com conjuntos de bandas bem
diferenciados. Da mesma forma que os isolados anteriores, os isolados 10, 11 e 12
também apresentam um perfil diferente. Apesar de também apresentarem diferenças
entre si estas não são relevantes e pode-se afirmar que pertencem a uma mesma
linhagem.
Os isolados 1, 4 e 5 apresentaram perfis totalmente distinto entre si e os demais,
com conjuntos de bandas singulares a cada isolado. Estes pode-se dizer que são
linhagens de W. confusa distintas das outras encontradas.
54
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14 100pb
Figura 19. Perfis representativos de rep-PCR dos isolados das destilarias Japungu, Miriri e Trapiche
Identificados como W. confusa. (1- TCP7.1.1; 2- JCP7.2.9; 3- JCP7.2.10; 4- JCP7.1.21; 5- MCP7.3.17;
6- MCP7.3.1; 7- MCP7.3.2; 8- MCP7.3.3; 9- MCP7.3.4; 10- MCP7.3.5; 9- MCP7.3.6; 10- MCP7.3.7; 11MCP7.3.8; 12- MCP7.3.9; 13- MCP7.3.10; 14- MCP7.3.11).
5.2.2 Leuconostoc mesenteroides
Esta espécie também foi identificada em três das destilarias estudadas (Japungu,
Miriri e Trapiche).
Bem como a espécie W. confusa, os isolados de Leuc. Mesenteroides,
apresentaram um perfil de amplificação da região espaçadora 16S-23S distintos,
apresentando uma única banda com tamanho aproximado de 620pb (Figura 20). O
isolado 5 tem o perfil do gênero Weissella.
Através do rep-PCR foi possível analisar seus perfis e verificar que os isolados de
destilarias diferentes apresentaram perfis distintos.
Na figura 22 onde mostra o rep-PCR de isolados das destilarias Japungu, Miriri e
Trapiche fica evidente a diferença entre os perfis. Os isolados 5, 6 e 7 são os que mais se
55
assemelham entre si onde pode-se dizer que são pertencentes a uma mesma linhagem.
Os outros isolados ao que parece são linhagens diferentes de Leuc. mesenteroides.
1
2
3
4*
5
100pb
Figura 20. Perfil de amplificação da região espaçadora 16S-23S dos isolados identificados
como pertencentes ao gênero Leuconostoc. Marcador de peso molecular (100pb Biolabs).
(1 - TCP7.1.7; 2 - TCP7.1.8; 3 - TCP7.1.9; 4 - TCP7.1.10; 5 - TCP7.1.11). * Isolado
identificado como Weissella confusa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 100pb
Figura 21. Perfis representativos de rep-PCR dos isolados das destilarias Japungu e Trapiche
Identificados como Leuc. mesenteroides (100pb Biolabs). (1- MCP7.1.5; 2- JCP7.3.3; 3- JCP7.3.14;
4- JCP7.3.20; 5- TCP7.1.2; 6- TCP7.1.3; 7- TCP7.1.4; 8- TCP7.1.17; 9- TCP7.1; TCP7.1.5)
56
6. Discussão
Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que LABs são comumente
encontradas no processo fermentativo e, que no caldo de partida utilizado por destilarias
produtoras de etanol do Nordeste do Brasil há uma predominância das bactérias lácticas
pertencentes ao gênero Lactobacillus. Estes resultados são inédito quanto a entrada do
substrato no processo fermentativo mas ao mesmo tempo coerentes, pois coincidem com
os dados encontrados na literatura onde foram estudados a produção de etanol em
destilarias nos Estados Unidos com a utilização do milho como substrato (Skiner and
Leathers, 2004) e no Brasil utilizando a cana-de-açúcar (Lucena et al. 2010).
Foram encontradas no caldo de partida seis espécies de lactobacilos, destas
destaca-se o L. fermentum, esta espécie é a principal responsável por grandes quedas na
produção e rendimento da produção do etanol devido a capacidade que algumas
linhagens desta bactéria têm de induzir a floculação e a perda de viabilidade quando em
sinergia com cálcio, das leveduras dando origem ao que se chama de "pé-de-cuba"
causador de entupimentos de tubulações e centrífugas de separação (Yokoya & OlivaNeto, 1991; Ludwig et al. 2001), em alguns casos o L. plantarum podem causar o mesmo
efeito floculante do L. fermentum dependendo da linhagem e densidade da bactéria no
processo (Garcia, 2000; Alcarde, 2001). Outros estudos demonstraram que a queda da
concentração final do etanol pode chegar a 17% quando a contaminação chega a 10 8
CFU/mL de L. fermentum em alguns casos pode se chegar a 22% na queda da produção,
aumento do desvio de carboidratos para a produção de glicerol e acido lático, queda de
55% da viabilidade da levedura e redução na formação de massa celular de levedura
(Thomas et al., 2001; Bischoff et al., 2008; Beckner et al., 2011).
57
No inicio da fermentação o L. fermentum não foi a espécie mais abundante
identificada nas destilarias, porém estudo pretéritos mostram que esta espécie tende a ter
um aumento com no decorrer da fermentação e que ela é bastante adaptadas as
condições do processo.
Além desta, outras espécies de Lactobacillus identificadas neste estudo já haviam
sido detectadas no processo fermentativo anteriormente, como: L. nagelii e L.
satsumensis
que
são
organismos
versáteis,
que
possuem
um
metabolismo
homofermentativo anaeróbico facultativo e com capacidade de fermentar pentoses e
hexoses (ribose e arabinose) a acido láctico.
Foi demonstrado por Chin e Ingledew (1994) os efeitos das LAB sobre a S.
cerevisiae pela inoculação de L. fermentum e L. delbrueckii, onde foi verificado uma
queda na viabilidade da levedura.
Também foram identificados os lactobacilos L. delbruekii, L. plantarum e L.
salivarus foram encontrados nas coletas realizadas mas com uma menor frequência, mas
que são comuns na fermentação alcoólica em destilarias do Nordeste do Brasil (Lucena et
al. 2010).
Na descrição da microbiota da tradicional fermentação alcoólica no Vietnã ficou
evidente que as LAB tiveram um destaque, onde se destacaram as espécies de LAB
Pediococcus pentosaceus, L. plantarum, L. brevis, W. confusa e W. paramesenteroides.
Além das espécies que são produtoras de amilase (Bacillus subtilis, B. circulans, B.
amyloliquefaciens e B. sporothermodurans), bactérias produtoras de acido acético
(Acetobacter orientalis e A. pasteurianus) e alguns patógenos de plantas (Burkholderia
58
ubonensis, Ralstonia solanacearum e Pelomonas puraquae) foram também detectados
(Thanh et al., 2008).
Existe inúmeros relatos da presença de Leuconostoc (Skinner-Nemec, Nichols &
Leathers, 2007; Amorim, 2005; Skinner & Leathers, 2004; Oliva-Neto & Yokoya, 1998), e
alguns de Weissella (Passoth, Blonqvist & Schnürer, 2007; Skinner & Leathers, 2004) no
processo de produção do bioetanol.
Algumas destas espécies foram comuns na fermentação nas destilarias estudadas,
como as W. confusa e W. paramesenteroides. Outras espécies encontradas foram a W.
cibaria esta não havia sido encontrada na fermentação alcoólica.
As espécies do gênero Leuconostoc são facilmente encontrados no inicio da
fermentação mas elas raramente causam grandes infecções, por apresentar uma baixa
resistência ao etanol. Kaji (1989) simulou uma fermentação mista entre a S. cerevisiae e
as bactérias L. fermentum e Leuc. mesenteroides subsp. mesenteroides, apenas os
lactobacilos puderam ser recuperados após a fermentação. A causa da não recuperação
do Leuconostoc foi atribuída ao efeito inibitório do etanol, que a 3% foi capaz de reduzir a
velocidade especifica máxima de crescimento e, em concentrações superiores a 6%
houve a interrupção total do crescimento. Lucena (2010) em seus estudos sobre a
diversidade genética de bactérias láticas em destilarias de álcool combustível encontrou
espécies de Leuconostoc apenas nas primeiras coletas. Os resultados aqui obtidos
mostram que estes organismos estão presentes no caldo de partida, porém não
permanecem no processo.
Um dado interessante observado nas analises foi a identificação da "espécie"
Leuconostoc garlicum na destilaria Japungu (dados não mostrados). Estes isolados
59
apresentaram uma similaridade acima 97% do seu gene 16S com sequências
depositadas no Genebank, todavia este nome taxonômico genérico não foi publicado a
tempo para a submissão das sequências ao Genebank. A espécie foi descrita por Kim e
Kyung (2003) contudo não foi publicado (dados do NCBI).
Nossos dados mostram que a diversidade bacteriana encontra no caldo de partida
é composta basicamente por espécies que não permanecem ao longo da fermentação.
Portanto espécies como o Leuc. mesenteroides, Leuc. psendomesenteroides, Leuc
citreum, Leuc. garlicum, W. cibaria, W. confusa, W. paramesenteroides, Lac. Lactis,
Staphylococcus epidermidis e O. kitaharae que não afetam drasticamente a produção do
bioetanol.
No presente trabalho também foi avaliado a variabilidade intraespecífica de
isolados de Leuc. mesenteroides e W. confusa a partir da utilização da técnica de repPCR com o uso do primer (GTG)5. Foram escolhidas estas duas espécies por ser estas as
mais bem distribuídas entre as destilarias, as mais abundantes não-lactobacilos e também
apresentaram perfis de amplificação da região espaçadora 16S-23S diferentes aos perfis
dos lactobacilos (Figuras 19 e 21). Esta técnica foi viável para esta análise intraespecífica
dos isolados oriundos do processo fermentativo. O Leuc. mesenteroides é conhecido por
produzir dextrana a partir de sacarose (Kaji, 1989) isto ainda não havia sido feito com
estas espécies. Nos perfis encontrados claramente foi observado que existem diferentes
linhagens de W. confusa, porém os dados são conclusivos pois se trata de um novo
achado tendo que ser feito estudo minuciosos sobre o efeito de cada linhagem na
fermentação, da mesma forma ocorreu com os isolados de Leuc. mesenteroides, porém
se sabe que estas espécies não permanecem no processo por muito tempo por não
tolerarem a altas concentrações de etanol.
60
7. Conclusões
A diversidade de bactérias presentes no caldo de partida utilizado no processo de
fermentação do bioetanol, apresentou o gênero Lactobacillus como o principal
contaminante do processo, seguido pelos gêneros Leuconostoc e Weissella.
A técnica de ARDRA, baseada na análise do perfil de digestão da amplificação da
região espaçadora 16S-23S, se mostrou efetiva na identificação dos lactobacilos, mas
pouco eficaz na identificação de outras espécies devido ao banco de dados que ainda é
pequeno. Esta técnica não pode ser utilizada isoladamente para identificação de todas as
espécies bacterianas presentes no caldo de cana.
O sequenciamento do gene pheS para a identificação das espécies se mostrou
eficaz em apenas alguns casos, pois assim como no caso da ARDRA o banco de
sequências depositadas ainda é pequeno. Sendo assim, foi necessário o sequenciamento
do gene 16S que foi de maior precisão.
Neste estudo, obtivemos diferentes perfis genotípicos de Leuc, mesenteroides e W.
confusa, com a utilização do rep-PCR, demonstrando que esta técnica pode ser utilizada
como marcador intraespecífico destas espécies. Mais estudos são necessários para uma
melhor compreensão do papel de cada linhagem no processo.
61
8. Referências Bibliográficas
Abbott DA, Hynes SH, Ingledew WM (2005) Growth rates of Dekkera/Brettanomyces
yeasts hinder their ability to compete with Saccharomyces cerevisiae in batch corn
mash fermentations. Appl Microbiol Biotechnol 2005, 66:641-647.
Ahrné S and Molin, G. (1997) Restriction endonuclease analysis of total chromosomal
DNA of Lactobacillus. Microecol Ther. 26: 27-30.
Alcarde VE (2001) Avaliação de parâmetros que afetam a floculação de leveduras e
bactérias isoladas de processos industriais de fermentação alcoólica. Universidade
Estadual de Campinas - Ciências de Alimentos. 91p. Tese (Doutorado).
Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W and Lipman DJ (1997)
Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search
programs. Nucleic Acids Res 25: 3389-3402.
Amorim HV, Oliveira AJ (1981) Infecção na Fermentação: como evitá-la. Açúcar e Álcool.
Fermentec v.1, n 5, p. 12-18.
Basso LC, Oliveira AJ, Orelli VD, Campos AD, Gallo CR, Amorim HV (1993) Dominance of
wild yeast over industrial yeast strains evaluated by karyotiping technique. Yeast
Newsletter 52: 50-53.
Basso LC e Amorim HV (1996) Habilidade fermentativa de leveduras isoladas do
processo industrial. Relatório Anual de Pesquisa em Fermentação Alcoólica. v 1,
Fermentec, Piracicaba, São Paulo, Brasil, pp 52-76.
Bassam BJ, Caetano-Anollés G, Gresshoff P M (1992) DNA amplification fingerprinting of
bacteria. Applied Microbiology Biotechnology, 38: 70-76.
Beckner M, Ivey ML, Phister TG (2011) Microbial contamination of fuel ethanol
fermentations. Lett Appl Microbiol 2011 Oct;53(4):387-94.
Bischoff KM, Skinner-Nemec KA and Leathers TD (2007) Antimicrobial susceptibility of
Lactobacillus species isolated from commercial ethanol plants. J Ind Microbiol
Biotechnol 34: 739–744.
62
Björkroth J and Korkeala H (1996) rRNA gene restriction patterns as a characterisation
tool for Lactobacillus sake producingropy slime. Int J Food Microbiol 30: 293-302.
Bram RJ, Young RA, Steitz JA (1980) The ribonuclease III site flanking 23S sequences in
the 30S ribosomal precursor RNA of Escherichia coli. Cell 19: 393-401.
Chagnaud, P., Machinis, K., Coutte, L. A., Marecat, A., Mercenier, A. (2001) Rapid PCR –
based procedure to identify lactic acid bacteria: application to six common
Lactobacillus species. J Microbiol Methods 44: 139-148.
Charteris WP, Kelly PM, Morelli L and Collins JK (1997) Selective detection, enumeration
and identification of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in
mixed bacterial population. Int J Food Microbiol 35: 1-27.
Cherubin RA (2003) Efeito da viabilidade da levedura e da contaminação bacteriana na
fermentação alcoólica. Univ. de São Paulo Piracicaba/Escola Sup. de Agricultura Luiz
de Queiroz - Agronomia. 124p. Tese (Doutorado)
Chin PM and Ingledew WM (1994) Effect of lactic acid bacteria on wheat mash
fermentations prepared with laboratory backset. Enz Microbiol Technol, v. 16, p.311317.
Ciani M, Maccarelli F and Fatichenti F (2003) Growth and fermentation behaviour of
Brettanomyces/Dekkera yeasts under different conditions of aerobiosis. World J
Microbiol Biotechnol 19, 419–422.
Clementino MM, Filippis I, Nascimento CR, Branquinho R, Rocha CL and Martins O (2001)
PCR analysis of tRNA intergenic spacer, 16S-23S internal transcrobed spacer, and
randomly amplified polymorphic DNA reveal inter- and intraspecific relationships of
Enterobacter cloacae strains. J Clin Microbiol 39: 3865-3870.
Coenye T, Spilker T, Reik R, Vandamme P and Lipuma JJ.(2005) Use of PCR analyses to
define the distribution of Ralstonia species recovered from patients with cystic fibrosis.
J Clin Microbiol. Jul;43(7):3463-6.
63
Collado, M. C., Hernández, M., (2007) Identification and Differentiation of Lactobacillus,
Streptococcus and
Bifidobacterium species in fermented milk products with
bifidobacteria. Microbiol Res. 162: 86-92.
de Bruyne K. (2009) Applocation of multilocus sequence analysis and matrix assisted laser
desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometry in molecular taxonomy of lactic
acid bacteria. Univesiteit Gent - Departament of Biochemistry and Microbiology. Tese
(Doutorado).
de Miniac M (1989) Contamination des fermentations alcooliques industrielles par les
levures du genre Brettanomyces. Ind Aliment Agric 106, 559–563.
de Souza-Liberal AT, Basílio AC, do Monte Resende A, Brasileiro BT, da Silva-Filho EA,
de Morais JO, Simões DA and de Morais MA Jr. Identification of Dekkera bruxellensis
as a major contaminant yeast in continuous fuel ethanol fermentation. J Appl
Microbiol. 2007;102:538–547.
Doolittle WF and Papke RT (2006) Genomic and the bacterial species problem. Genome
Biol 7, 116.
Drancourt, M., Roux, V., Fournier, P.E., Raoult, D. (2004) rpoB gene sequence-based
identification
of
aerobic
Gram-positive
cocci
of
the
genera
Streptococcus,
Enterococcus, Gemella, Abiotrophia and GranulicatellaI. J Cli Microbiol 42, 497-504.
Du Plessis, H. W., Dicks, L. M. T., Pretorius, I. S., Lambrechts, M. G., du Toit, M. (2004)
Identification of lactic acid bacteria isolated from South African brandy base wines. Int
J Food Microbiol 91: 19-29.
Dubernet, S., Desmasures, N., Guéguem, M., (2002) A PCR-based method for
identification of lactobacilli at the genus level. FEMES Microbiol Lett 214: 271-275.
Duffner F and O’Connell M (1995) Comparative evaluation of plasmid profile and
ribotyping in the analysis of Lactobacillus plantarum strain heterogeneity in silage. J
Appl Bacteriol 78: 20-27.
Ferrero M, Cesena C, Morelli L, Scolari G and Vescovo M (1996) Molecular
characterization of Lactobacillus casei strains. FEMS Microbiol Lett 140:215–219.
64
Garcia CE (2000) Efeito do nível de contaminação de bactérias isoladas de processo
industrial de fermentação alcoólica, na floculação de levedura. Univ. de São
Paulo/Escola Sup. de Agricultura Luiz de Queiroz - Ciência e Tecnologia de
Alimentos. 80p. Dissertação (Mestrado).
Gallo CD (1989) Contaminantes bacterianos em mosto e dornas de fermentação
alcoólica. In: Eguchi SY, Yokoya F, Canhos VF and Gallo CR Pontos Criticos
Microbiologicos em Usinas de Açúcar e Álcool. Campinas: Fundação Tropical de
Pesquisas André Tosello, , 18p.
Gallo CR (1992) Identificação de bactérias contaminantes da fermentação alcoólica.
STAB - Açúcar Alcool e Subprodutos, Piracicaba, Fermentec v. 10, n. 5, p. 30-34.
Gevers D, Huys G and Swings J (2001) Applicability of rep-PCR fingerprinting for
identification of Lactobacillus species. FEMS Microbiol Lett. 205(1):31-6.
Gevers D, Cohan FM, Lawrence JG, Spratt BG, Coenye T, Feil EJ, Stackebrandt E, Van
de Peer Y, Vandamme P, Thompson FL and Swings J. (2005) Opinion: Re-evaluating
prokaryotic species. Nat Rev Microbiol 3:733-739.
Grimont F and Grimont PDA (1986) Ribosomal ribonucleic acid gene restriction as
potential taxonomic tools. Ann Inst Pasteur Microbiol 137B:165–175.
Gürtner V and Stanish A (1996) New approaches to typing and identification of bacteria
using the 16S-23S rDNA spacer region. Microbiol 142: 3-6.
Harvey S, Hill CW, Squires C, and Squerea CL (1988) Loss of the spacer loop sequence
from the rrnB operon in the Escherichia coli K12 subline that bears the relA1 mutation.
J Bacteriol 170: 1235-1238.
Hauben L, Vauterin L, Swings J, Moore ER (1997) Comparison of 16S Ribosomal
Sequences of All Xantomonas Species. Int J Syst Bacteriol. Vol. 47 No. 2. p. 328-335.
Holzapfel WH, Haberes P, Guisen R, Björkroth J and Schillinger U (2001) Taxomomy and
important features of probiotic microorganism in food and nutrition. Am J Clin Nutr 73:
365-373.
65
Hongoh Y, Yuzawa H, Ohkuma M and Kudo T (2003) Evaluation of primers and PCR
condition for the analysis of 16S rRNA genes from a natural environment. FEMS
Microbiol Lett Oxford, v.221, p.299-304.
Hyytiä-Trees E, Lyhs U, Korkeala H and Bjorkroth J (1999) Characterisation of ropy slimeproducing Lactobacillus sakei using repetitive element sequence-based PCR. Int J
Food Microbiol. 50, 215-219.
Kim MH and Kyung KH (2003) Leuconostoc garlicum sp. nov. isolated from garlic (NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=255248)
(Não
publicado)
Kimura K, McCartney AL, McConnell MA and Tannock GW (1997) Analysis of fecal
populations of bifidobacteria and lactobacilli, and investigation of the immunological
responses of their human hosts to the predominant strains. Appl Environ Microbiol 63:
3394– 3398.
Klein G, Pack A, Bonaparte C and Reuter G. (1998) Taxonomy and physiology of probiotic
lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol 41: 103-125.
Kosaric N, Weiczorek A, Cosentino GP, Magee RJ and Prenosil JE Ethanol fermentation.
In: REHN HJ and Reed G Eds. Biotechnol - A Comprehensive Treatise in 8 volumes.
Weinhein, Verlag Chemie, 1983. V.3, p.257-385.
Konstantinidis KT, Ramette A and Tiedje JM (2006) The bacterial species definition in the
genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361, 1929-1940.
Lopes ACS, Rodrigues JF, Clementino MBM, Miranda CAC, Nascimento APA and Morais
MA Jr (2007) Application of PCR ribotyping and tDNA-PCR for Klebsiella pneumoniae
identification. Mem Inst Oswaldo Cruz 102: 827-832.
Lucena BTL (2010) Diversidade de Bactérias Lácticas Presentes em Destilarias de Álcool
Combustível. Univ. Fed. Pernambuco - UFPE. 22p. Tese (Doutorado).
Lucena BT, dos Santos BM, Moreira JL, Moreira AP, Nunes AC, Azevedo V, Miyoshi A,
Thompson FL, de Morais MA Jr. (2010) BMC Microbiol nov 23;10:298.
66
Ludwig KM, Oliva-Neto P, and Angelis DF (1997) Qualificação da floculação de
Sacaromyces cerevisiae por bactérias contaminantes da fermentação alcoólica. Ciênc
Tecnol Aliment Campinas, v.21, n.1, p. 63-68.
Ludwig KM, Oliva-Neto P and Angelis DF (2001) Quantification of Saccharomyces
cerevisiae flocculation by contaminant bacteria from alcoholic fermentation. Ciênc
Tecnol Aliment, v21, p.63-68.
Makanjuola DB, Tymon A and Springham DG (1992) Some Effects of lactic acid bacteria
on laboratory-scale yeast fermentation. Enz Microbiol Technol v.14, n,4, p,350-357.
Miteva V, Boudakov I, Ivanova-Stoyancheva G, Marinova B, Mitev V and Mengaud J
(2001) Differentiation of Lactobacillus deubrueckii subspecies by ribotyping and
amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). J Appl Microbiol 90: 909-918.
Mohania D, Nagpal R, Kumar M, Bhardwaj A, Yadav M, Jain S, Marotta F, Singh V,
Parkash O and Yadav H. (2008) Molecular approaches for identification and
characterization of lactic acid bacteria. J Dig Dis. nov;9(4):190-8.
Morea M, Barizzi F, Cappa F and Cocconcelli PS (1998) Molecular characterization of
Lactobacillus community in tradicional processing of mozzarella cheese. Int J Food
Microbiol 43: 53-60.
Moreira JLS, Mota RM, Horta MF, Teixeira SMR, Neumann E, Nicoli JR and Nunes AC
(2005) Identification to the species level of Lactobacillus isolated in probiotic
prospecting studies of human, animal or food origin by 16S-23S rRNA restriction
profiling. BMC Microbiol 5: 15-23.
Narendranath N V, Hynes S H, Thomas K C e Ingledew W M (1997) Effects of Lactobacilli
on yeast-catalyzed ethanol fermentations. Applied and Environmental Microbiology 63:
4158-4163.
Narendranath NV, Thomas KC and Ingledew WM (2000) Urea Hydrogen Peroxide
Reduces the Numbers of Lactobacilli, Nourishes Yeast, and Leaves No Residues in
the Ethanol Fermentation. Appl Environ Microbiol 66(10): 4187-4192.
67
Naser S, Thompson FL, Hoste B, Gevers D, Vandemeulebroecke K, Cleenwerck I,
Thompson CC, Vancanneyt M and Swings J (2005a) Phylogeny and identification of
enterococci using atpA gene sequence analysis. J Clin Microbiol 43, 2224-2230.
Naser S, Thompson FL, Hoste B, Gevers D, Dawyndt P, Vancanneyt M and Swings J
(2005b) Aplication of multilocus sequence analysis (MLSA) for rapid identification of
Enterococcus species based on rpoA and pheS genes. Microbiol 151, 2141-2150.
Naser S, Dawyndt P, Hoste B, Gevers D, Vandemeule-broecke K, Cleenwerck I,
Vancanneyt M and Swings J (2007) Identification of lactobacilli by pheS and rpoA
gene sequence analyses. Int J Syst Evol Microbiol 57: 2777-2789.
Niederhauser C, Höfelein C, Allmann M, Burkhalter P, Lüthy J and Candrian U (1994)
Random amplification of polymorphic bacterial DNA: evaluation of 11 oligonucleotides
and application to food contaminated with Listeria monocytogenes. J Appl Bacteriol
77: 574-582.
Nour M (1998) 16S-23S and 23S-5S intergenic spacer regions of lactobacilli: nucleotide
sequence, secondary structure and comparative analysis. Res Microbiol 149: 433-448.
Oliva-Neto P, Yokoya F (1994) Evaluation of bacterial contamination in a fed-batch
alcoholic fermentation process. World J Microbiol Biotechnol v. 10, n.6, p.697-699.
Oliva-Neto P and Yokota F (1997) Effects of nutritional factors on growth of Lactobacillus
fermentum mixed with Sacharomyces cerevisiae in alcoholic fermentation. Rev.
Microbiol. v.28, p.25-31.
Passoth V, Blomqvist J and Schnürer J (2007) Dekkera bruxellensis and Lactobacillus vini
Form a Stable Ethanol-Producing Consortium in a Commercial Alcohol Production
Process. Appl Environ Microbiol 73: 4354–4356.
Pavlova SI, Kilic AO, So JS, Nader-Macias ME, Simões JA and Tao L (2002) Genetic
diversity of vaginal lactobacilli from women in different countries based on 16S rRNA
gene sequences. J Appl Microbiol 92: 451-459.
68
Pisabarro A, Correia A and Martín J, (1998) Characterization of the rrnB operon of the
plant pathogen Rhodococcus fascians and targeted integrations of exogenous genes
at rrn loci. Appl Environ Microbiol 64, 1276-1282.
Pot B, Hertel C, Ludwig W, Descheemaker P, Kersters K and Schleifer KH (1993)
Identification and classification of Lactobacillus acidophilus, L. gasseri and L. johnsonii
strains by SDS PAGE and rRNA-targeted oligonucleotide probe hybridization. J Gen
Microbiol 139:513–7.
Rondini
MAT
(1985)
Isolamento,
Caracterização
e
Identificação
de
Bactérias
Contaminantes de Dornas de Fermentação nas Destilarias de Etanol. Piracicaba.
Univ. São Paulo - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. p.37 Tese
(Mestrado).
Roth A, Fischer M, Hamid ME, Michalke S, Ludwig W and Mauch H (1998) differentiation
of Phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA
gene internal transcribed spacer sequences. J Clin Microbiol v.36, p.139-147.
Roussel Y, Colmin C, Simonet JM and Decaris B (1993) Strain characterization, genome
size and plasmid content in the Lactobacillus acidophilus group (Hansen and
Mocquot). J Appl Bacteriol 74:549–56.
Roy D, Ward P and Champagne G (1996) Differentiation of bifidobacteria by use of
pulsed-field gel electrophoresis and polymerase chain reaction. Int J Food Microbiol
29:11–29.
Ruiz A, Poblet M, Mas A and Guillamón JM (2000). Identification of acetic acid bacteria by
RFLP PF PCR-amplifield 16S rDNA intergenic spacer. Int J Syst Evol Microbiol. 50,
1981-1987
Schell DJ, Dowe N, Ibsen KN, Riley CJ, Ruth MF and Lumpkin RE (2007) Contaminant
occurrence, identification and control in a pilot-scale corn fiber to ethanol conversion
process. Bioresour Technol 98: 2942-2948.
69
Schleifer KH and Ludwig W (1995) Phylogenetics relationships of acid lactic bacteria. In
The Genera of Lactic Acid Bacteria ed. Wood, B.J.B. and Holzapfel, W.H. vol. 2, p. 718. Blackie Academic Professional.
Schwan RF, Mendonça AT, Silva-Jr JJ, Rodrigues V and Wheals AE (2001) Microbiology
and physiology of Cachaça (Aguardente) fermentation. Antonie van Leeuwenhoek,
Dordrecht, v.79, p.89-96, 2001.
Seseña S, Sánchez I and Palop L (2004) Genetic diversity (RAPD-PCR) of lactobacilli
isolated from “Almagro” eggplant fermantations from two seasons. FEMS Microbiol
Lett 238: 159-165.
Shang S, Fu J, Dong G, Hong W, Du L and Yu X (2003) Estabilishment and analysis of
specifc DNA patterns in 16S-23S rRNA gene spacer regions for differentiating different
bacteria. Chin Med J 116 (1), 129-133.
Silva N (1998) Influência do resfriamento em torres sobre a microflora do caldo de cana
no processo de produção de álcool. Campinas. Univ. Campinas
- Faculdade de
Engenharia de Alimentos. p.117. Dissertação (Mestrado).
Silva-Filho EA (2003) Caracterização genética de populações de leveduras em destilarias
de álcool combustível com vistas à seleção de linhagens promissoras para a
expressão heteróloga de genes de interesse industrial. Recife. Univ. Fed.
Pernambuco. Tese (Doutorado) p.50.
Silvers M, Uermosi C, Fehlmann M and Krieger S (2003) Cloning, sequence analysis and
expression of the FaF0-ATPase beta-subunit from wine lactic acid bactéria. Sys Appl
Microbiol 26, 350-356.
Simpson KL, Pettersson B and Priest FG (2001) Characterization of lactobacilli from
Scotch malt whisky distilleries and description of new Lactobacillus ferintoshensis sp.
Nov., a new species isolated from malt whisky fermentation. Microbiology 147: 10071016.
Skinner KA and Leathers TD (2004) Bacterial Contaminants of fuel ethanol production. J
Ind Microbiol Biotechnol 31: 401-408.
70
Sohier D, Coulon J and Lonvaud-Funel A (1999) Molecular identification of Lactobacillus
hilgardii and genetic relatedness with Lactobacillus brevis. Int J Syst Bacteriol 49,
1075-1081.
Spacov ICG, Silva SAM, Morais Jr MA, Morais MMC (2006) Polymorphism of the rDNA
and tDNA loci in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa: a perspective for
molecular epidemiology surveillance. Gen Mol Biol 29: 722-729.
Stackebrandt E, Frederiksen W, Garrity GM, Grimont PA, Kämpfer P, Maiden MCJ,
Nesme X, Rosselló R, Swings J, Trüper HG, Vauterin L, Ward AC and Whitman WB
(2002). Report of the ad hoc committee for re-evaluation of the species definition in
bacteriology. Int J Syst Evol Microbiol 52, 1043-1047.
Stahl M and Molin G (1994) Classification of Lactobacillus reuteri by restriction
endonuclease analysis of chromosomal DNA. Int J Syst Bacteriol. 44: 9–14.
Staden R, Beal KF and Bonfield JK (1998) The Staden Package. Comp Meth Mol Biol,
132, 115-130.
Tamura K, Dudley J, Nei M and Kumar S (2007) Mega4: Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) Software version 4.0. Mol Biol Evol 24: 1596-1599.
Thomas KC, Hynes SH and Ingledew WM (2001) Effect of lactobacilli on yeast growth,
viability and batch and semi continuos alcoholic fermentation of corn mash. J Appl
Microbiol, v.90, p.819-828.
Tilsala-Timisjarvi A and Alatossava T (1997) Development of oligonucleotide primers from
the 16S-23S rRNA intergenic sequences for identifying different dairy and probiotic
lactic acid bacteria by PCR. Int J Food Microbiol 35:49-56.
Towner KJ and Cockayne A (1993) Molecular methods for microbial identification and
typing. Chapman & Hall, London.
Using JB, Russellomora RA, Garciavaldes E and Lalucat J (1995) Taxonomic note - a
pragmatic approuch to the nomenclature of phenotypically similar genomic groups. Int
J Syst Bacteriol 45, 604.
71
Valcheva R, Korakli M, Onno B, Prévost H, Ivanova I, Ehrmann MA, Dousset X, Gänzle
MG and Vogel RF (2005) Lactobacillus hammesii sp. nov., isolated from French
sourdough. Int J Syst Evol Microbiol. mar v. 55, n.2, p. 763-767.
van Belkum A (1994) DNA fingerprinting of medically important microorganisms by use of
PCR. Clin. Microbiol. Rev. 7, 174-184.
van Reenen CA and Dicks LMT (1996) Evaluation of numerical analysis of random
amplified polymorphic DNA (RAPD)-PCR as a method to differentiate Lactobacillus
plantarum and Lactobacillus pentosus. Curr Microbiol 32:183-187.
Ventura M and Zink R (2002) Specific identification and molecular typing analysis of
Lactobacillus johnsonii by using PCR – based methods and pulsed-field gel
electrophoresis. FEMS Microbilol Lett 217: 141-154.
Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J,
Peleman J and Kuiper M (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting.
Nucleic Acids Res. nov 23, 4407-4414.
Vuyst L, Camu N, De Winter T, Vandemeulebroecke K, Van de Perre V, Vancanneyt M,
De Vos P and Cleenwerck I. (2008) Validation of the (GTG)(5)-rep-PCR fingerprinting
technique for rapid classification and identification of acetic acid bacteria, with a focus
on isolates from Ghanaian fermented cocoa beans. Int J Food Microbiol. jun
30;125(1):79-90.
Wheals EA, Basso LC, Alves DMG and Amorim HV (1999) Fuel ethanol after 25 years.
Trends Biotechnol 17: 482-487.
Welch DF (1991) Application of cellular fatty acid analysis. Clin. Microbiol. Rev. 4, 422438.
Yokoya F and Oliva-Neto P (1991) Características da floculação de leveduras por
Lactobacillus fermentum. Rev. Microbiol 22(1), 12-16.
72
9. Anexos
9.1 Quadro comparativo das bactérias do gênero Lactobacillus
9.2 Lista de isolados identificados a partir do caldo de cana das destilarias
estudadas neste trabalho
73
Anexo 1
Quadro comparativo das bactérias do gênero Lactobacillus
SphI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
NcoI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
NheI
+
+
+
-
SspI
+
+
+
+
+
+
-
SfuI
+
+
+
+
+
+
+
+
EcoRV
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
DraI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
VspI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
HincII
+
+
+
-
EcoRI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
HindIII
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
AvrI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Identificação
L. acidophilus
L. agilis
L. alimentarius
L. amylovorus
L. animalis
L. brevis
L. casei
L. camelliae
L. colehominis
L. crispatus
L. delbrueckii
75
SphI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
NcoI
+
+
+
+
-
NheI
-
SspI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
SfuI
-
EcoRV
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
DraI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
VspI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
HincII
+
+
+
+
+
+
+
-
EcoRI
-
HindIII
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
AvrI
+
+
+
-
IDENTIFICAÇÃO
L. "diolivorans like"
L. farciminis
L. ferintoshensis
L. fermentum
L. frumenti
L. fructivorans
L. gasseri
L. hilgardii
L. jensenii
L. johnsonii
L. murinus
76
SphI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
NcoI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
NheI
+
+
+
-
SspI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
SfuI
+
+
+
+/-
EcoRV
+
+
+
+
+
+
-
DraI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
VspI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
HincII
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/-
EcoRI
+
+
+
-
HindIII
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
AvrI
-
IDENTIFICAÇÃO
L. mucosae
L. nageli
L. panis
L. pantheris
L. paralimentarius
L. paraplantarum
L. pentosus
L. perolens
L. plantarum
L. pontis
L. reuteri
-
77
SphI
+
+
0
+
+
+
+
+
+
+
+
+
NcoI
0
+
+
+
-
NheI
0
+
+
+
-
SspI
0
+
+
+
+
+
+
-
SfuI
0
+
+
+
-
EcoRV
+
+
+
0
-
DraI
+
+
+
+
+
0
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+/+/-
VspI
0
+
+
+
+
+
+
-
HincII
+
+
0
+
-
EcoRI
0
+
+
+
HindIII
+
+
+
+
+
0
+
+
+
+
-
AvrI
0
-
IDENTIFICAÇÃO
L. rhamnosus
L. rossii
L. ruminis
L. safranciscencis
L. sakei
L. salivarus
L. vaginalis
L. vini
Modificada a partir de Moreira et al. (2005) e Lucena (2010).
78
Anexo 2
Lista de isolados identificados a partir do caldo de cana das destilarias estudadas neste trabalho
Isolados
Identificação
Local de Coleta
Metodologia para Identificação
GCP7.1.1
GCP7.1.2
GCP7.1.3
GCP7.1.4
GCP7.3.1
GCP7.3.2
GCP7.3.3
GCP7.3.2
GCP7.3.4
GCP7.3.5
GCP7.3.6
GCP7.3.7
GCP7.3.8
GCP7.3.9
GCP7.3.10
GCP7.3.11
GCP7.3.12
GCP7.3.13
GCP7.3.14
GCP7.3.15
GCP7.3.16
GCP7.3.17
Lactococcus lactis
Lactococcus lactis
Lactococcus lactis
Lactococcus lactis
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Destilaria Giasa - PB
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
Sequênciamento
Sequênciamento
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
79
GCP7.3.18
GCP7.3.19
GCP7.3.20
JCP7.1.1
JCP7.1.2
JCP7.1.3
JCP7.1.4
JCP7.1.5
JCP7.1.6
JCP7.1.7
JCP7.1.8
JCP7.1.9
JCP7.1.10
JCP7.1.11
JCP7.1.12
JCP7.1.14
JCP7.1.15
JCP7.1.16
JCP7.1.17
JCP7.1.20
JCP7.1.21
JCP7.2.2
JCP7.2.3
JCP7.2.8
JCP7.2.9
JCP7.2.10
JCP7.2.11
JCP7.2.12
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Weissella cibaria
Leuconostoc garlicum
Leuconostoc garlicum
Weissella cibaria
Weissella cibaria
Leuconostoc mesenteroides
Weissella cibaria
Leuconostoc citreum
Leuconostoc garlicum
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc garlicum
Staphylococcus epidermidis
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc garlicum
Leuconostoc citreum
Weissella cibaria
Weissella confusa
Weissella confusa
Leuconostoc garlicum
Weissella confusa
Weissella confusa
Weissella confusa
Weissella confusa
Weissella confusa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Giasa
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Sequênciamento
Sequênciamento
ARDRA
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
ARDRA
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
ARDRA
ARDRA
Sequênciamento
Sequênciamento
ARDRA
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
80
JCP7.2.14
JCP7.2.15
JCP7.2.16
JCP7.2.17
JCP7.2.18
JCP7.2.19
JCP7.2.20
JCP7.3.1
JCP7.3.2
JCP7.3.3
JCP7.3.4
JCP7.3.5
JCP7.3.6
JCP7.3.7
JCP7.3.8
JCP7.3.9
JCP7.3.10
JCP7.3.12
JCP7.3.13
JCP7.3.14
JCP7.3.15
JCP7.3.16
JCP7.3.17
JCP7.3.18
JCP7.3.19
JCP7.3.20
MCP7.1.1
MCP7.1.2
Leuconostoc citreum
Weissella confusa
Leuconostoc citreum
Leuconostoc citreum
Leuconostoc citreum
Leuconostoc citreum
Leuconostoc citreum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Weissella cibaria
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Weissella cibaria
Lactobacillus nagelli
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Japungu - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
ARDRA
ARDRA
Sequênciamento
ARDRA
ARDRA
ARDRA
Sequênciamento
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
Sequênciamento
ARDRA
Sequênciamento
ARDRA
ARDRA
ARDRA
Sequênciamento
Sequênciamento
ARDRA
81
MCP7.1.3
MCP7.1.4
MCP7.1.5
MCP7.1.6
MCP7.1.7
MCP7.1.9
MCP7.1.10
MCP7.1.11
MCP7.1.12
MCP7.1.13
MCP7.1.14
MCP7.1.17
MCP7.1.19
MCP7.1.20
MCP7.2.1
MCP7.2.3
MCP7.2.9
MCP7.2.10
MCP7.2.15
MCP7.2.16
MCP7.2.17
MCP7.2.19
MCP7.2.20
MCP7.3.1
MCP7.3.2
MCP7.3.3
MCP7.3.4
MCP7.3.5
Lactobacillus nagelli
Weissella confusa
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc pseudomesenteroides
Weissella confusa
Leuconostoc pseudomesenteroides
Lactobacillus salivarus
Leuconostoc lactis
Lactobacillus salivarus
Leuconostoc pseudomesenteroides
Leuconostoc pseudomesenteroides
Leuconostoc pseudomesenteroides
Weissella confusa
Weissella confusa
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Weissella confusa
Weissella confusa
Weissella confusa
Weissella confusa
Weissella confusa
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
ARDRA
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
ARDRA
Sequênciamento
ARDRA
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
ARDRA
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
82
MCP7.3.6
MCP7.3.7
MCP7.3.8
MCP7.3.9
MCP7.3.10
MCP7.3.11
MCP7.3.12
MCP7.3.20
TCP7.1.1
TCP7.1.2
TCP7.1.3
TCP7.1.4
TCP7.1.5
TCP7.1.6
TCP7.1.7
TCP7.1.8
TCP7.1.9
TCP7.1.10
TCP7.1.11
TCP7.1.13
TCP7.1.14
TCP7.1.15
TCP7.1.16
TCP7.1.17
TCP7.1.18
TCP7.1.19
TCP7.1.20
Weissella confusa
Weissella confusa
Weissella confusa
Weissella confusa
Weissella confusa
Weissella confusa
Leuconostoc lactis
Lactobacillus fermentum
Weissella confusa
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Lactobacillus plantarum
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Weissella paramesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Miriri - PB
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Destilaria Trapiche - PE
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
ARDRA
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
Sequênciamento
ARDRA
ARDRA
ARDRA
83
10. Curriculum Lattes
Billy Manoel dos Santos
Curriculum Vitae
Outubro/2012
84
Billy Manoel dos Santos
Curriculum Vitae
______________________________________________________________________________________
Dados pessoais
Nome
Billy Manoel dos Santos
Filiação
Valdemiro Manoel dos Santos e Irenice Maria dos Santos
Nascimento 11/05/1982 - Recife/PE - Brasil
Carteira de Identidade
5193768 ssp - PE - 08/04/1999
CPF
037.521.584-09
______________________________________________________________________________________
Formação acadêmica/titulação
2010 - 2012
Mestrado em Genética.
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife, Brasil
Título: Identificação Molecular de bactérias Lácticas Presentes no Caldo de Cana-deaçúcar, Ano de obtenção: 2012
Orientador: Marcos Antônio de Morais Júnior
Co-orientador: Brígida Thays Luckwu de Lucena
2004 - 2008
Graduação em Ciências Biólógicas / bach..
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife, Brasil
Título: IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS LÁCTICAS ISOLADAS DA FERMENTAÇÃO
ALCOÓLICA INDUSTRIAL PELA TÉCNICA DE ARDRA-PCR
Orientador: Marcos Antônio de Morais Júnior
______________________________________________________________________________________
Formação complementar
2012 - 2012
Curso de curta duração em Uso Progressivo da força e Tecnologias Não Letais.
Academia Integrada de Defesa Social, ACIDES, Brasil
2012 - 2012
Curso de curta duração em Uso Diferenciado da Força.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
2012 - 2012
Curso de curta duração em Enfrent. da Expl. Sex. de Crianças e Adolescentes.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
2012 - 2012
Curso de curta duração em Inglês 1.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
2012 - 2012
Curso de curta duração em Formação de Formadores.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
2011 - 2011
Curso de curta duração em Aspectos Jurídicos da Abordagem Policial.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
2010 - 2010
Curso de curta duração em Aconselhamento Genético: aspectos práticos.
Sociedade Brasileira de Genética, SBG, Ribeirao Preto, Brasil
2010 - 2010
Curso de curta duração em Violência, Criminalidade e Prevenção.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
2010 - 2010
Curso de curta duração em Genética Forense.
Sociedade Brasileira de Genética, SBG, Ribeirao Preto, Brasil
85
Inglês V.
Instituto de Apoio a Fundação Universidade de Pernambuco, IAUPE, Recife, Brasil
Ano de interrupção: 2010
2010 - 2010
Curso de curta duração em Polícia Comunitária.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
2009 - 2009
Curso de curta duração em Investigação criminal 1.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
Bolsista do(a): Secretaria Nacional de Segurança Pública
2009 - 2009
Curso de curta duração em Mulher Vítima de Violência Doméstica.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
Bolsista do(a): Secretaria Nacional de Segurança Pública
2009 - 2009
Ingês III.
Instituto de Apoio a Fundação Universidade de Pernambuco, IAUPE, Recife, Brasil
2009 - 2009
Inglês IV.
Instituto de Apoio a Fundação Universidade de Pernambuco, IAUPE, Recife, Brasil
2009 - 2009
Curso de curta duração em Mediação de Conflitos 1.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
Bolsista do(a): Secretaria Nacional de Segurança Pública
2008 - 2008
Curso de curta duração em Gerenciamento de Crises.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
Bolsista do(a): Secretaria Nacional de Segurança Pública
2008 - 2008
Curso de curta duração em Utilização de SNPs em Genética Forense.
Sociedade Brasileira de Genética, SBG, Ribeirao Preto, Brasil
2008 - 2008
Inglês II.
Instituto de Apoio a Fundação Universidade de Pernambuco, IAUPE, Recife, Brasil
2008 - 2008
Inglês I.
Instituto de Apoio a Fundação Universidade de Pernambuco, IAUPE, Recife, Brasil
2008 - 2008
Curso de curta duração em Técnicas e Tecnol. Não Letais na Atuação Policial.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
Bolsista do(a): Secretaria Nacional de Segurança Pública
2008 - 2008
Curso de curta duração em Uso Progressivo da Força.
Secretaria Nacional de Segurança Pública, SENASP, Brasil
Bolsista do(a): Secretaria Nacional de Segurança Pública
2005 - 2005
Curso de curta duração em Proc de Mat Biológico p/ Incl e cortes em Parafin.
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife, Brasil
______________________________________________________________________________________
Atuação profissional
1.
Universidade Federal de Pernambuco - UFPE
____________________________________________________________________________
Vínculo institucional
86
2010 - Atual
2007 - 2008
Vínculo: Aluno de Mestrado , Enquadramento funcional: Pesquisador ,
Carga horária: 36, Regime: Parcial
Vínculo: Aluno de Iniciação Científica , Enquadramento funcional:
Pesquisador , Carga horária: 20, Regime: Parcial
____________________________________________________________________________
Atividades
04/2007 - Atual
Pesquisa e Desenvolvimento, Centro de Ciências Biológicas
Linhas de pesquisa:
Identificação Molecular de Bactérias Lácticas
04/2007 - 12/2008 Estágio, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Genética
Estágio:
Biologia Molecular
2.
Polícia Militar de Pernambuco - PMPE
____________________________________________________________________________
Vínculo institucional
2006 - Atual
Vínculo: Servidor público , Enquadramento funcional: Policial Militar , Carga
horária: 48, Regime: Integral
______________________________________________________________________________________
Linhas de pesquisa
1.
Identificação Molecular de Bactérias Lácticas
______________________________________________________________________________________
Áreas de atuação
1.
Genética Molecular e de Microorganismos
Producão
______________________________________________________________________________________
Produção bibliográfica
Artigos completos publicados em periódicos
1. SOUZA, RAFAEL BARROS, Santos, Billy Manoel dos, FÁTIMA RODRIGUES DE SOUZA, RAQUEL,
SILVA, PAULA KATHARINA NOGUEIRA DA, LUCENA, BRÍGIDA THAIS LUCKWU, MORAIS, MARCOS
ANTONIO
The consequences of Lactobacillus vini and Dekkera bruxellensis as contaminants of the sugarcane-based
ethanol fermentation. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. , v.39, p.1 - 8, 2012.
2. LUCENA, BRIGIDA TL, DOS SANTOS, Billy M, MOREIRA, JOÃO LS, MOREIRA, ANA PAULA B,
NUNES, ALVARO C, AZEVEDO, VASCO, MIYOSHI, ANDERSON, THOMPSON, FABIANO L, DE MORAIS,
MARCOS
Diversity of lactic acid bacteria of the bioethanol process. BMC Microbiology (Online). , v.10, p.298 - , 2010.
87