BOLETIM TÉCNICO N° 59
OUTUBRO/98
ISSN 0100-3054
Maria Cristina Leme de Lima Dias1
Walter Rodrigues da Silva2
1
Enga. Agra., Pesquisadora da Área de Propagação Vegetal, IAPAR.
Caixa Postal 481. 86001-970 -Londrina-PR E-mail: [email protected]
2
Engº. Agrº., Departamento de Agricultura, ESALQ/USP,
Caixa Postal 9. 13418-900- Piracicaba-SP E-mail: [email protected]
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DIRETORIA EXECUTIVA
Diretor-Presidente: Florindo Dalberto
PRODUÇÃO
Coordenação Gráfica: Jentaro Lauro Fukahori
Arte-final e capa: Tadeu K. Sakiyama
Impresso na Área de Reproduções Gráficas
Tiragem: 1.000 exemplares
Todos os direitos reservados ao Instituto Agronômico do Paraná.
É permitida a reprodução parcial, desde que citada a fonte.
É proibida a reprodução total desta obra.
Publicação parcialmente financiada com recursos do FUNCAFÉ, CBPDC
(Conselho Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café)
L732t
Lima Dias, Maria Cristina Leme de
Teste de tetrazólio em sementes de café / Maria
Cristina Leme de Lima Dias e Walter Rodrigues da Silva.
Londrina : IAPAR, 1998.
16p. (IAPAR. Boletim Técnico, 59)
1. Sementes de café-Teste de tetrazólio. I. Silva,
Walter Rodrigues da. II. Instituto Agronômico do Paraná,
Londrina, PR. III. Título. IV. Série.
CDD
633.7321
AGRIS F03 2120
3575
APRESENTAÇÃO
O controle de qualidade de sementes é atividade fundamental
em todo sistema de produção de sementes. Para o produtor de
sementes de café, um teste que possibilite a avaliação rápida da
viabilidade da semente é absolutamente importante, visto o longo
tempo requerido para o teste de germinação e o curto período de
conservação dessas sementes.
Com o novo impulso dado à cultura cafeeira no Brasil e o
plantio no sistema adensado, tem-se observado grande interesse por
parte de produtores e responsáveis técnicos pelos laboratórios de
análises de sementes em conhecer técnicas e procedimentos, que
permitam uma avaliação rápida e segura da qualidade das sementes.
Com base no material didático, utilizado em palestras e aulas
proferidas pela primeira autora, sobre o teste de tetrazólio em
sementes de café e a crescente demanda de informações sobre a
metodologia do referido teste, a Coordenação da Área de Propagação
Vegetal e a Liderança do Programa Café do IAPAR têm o prazer de
apresentar o presente manual: 'TESTE DE TETRAZÓLIO EM
SEMENTES DE CAFÉ", na certeza de que trará grande contribuição
para produtores, analistas, estudantes e interessados pelo assunto.
Maria Lúcia Crochemore
Coordenadora da Área de Propagação Vegetal
Armando Androcioli Filho
Líder do Programa Café
INTRODUÇÃO
O teste de tetrazólio é um método rápido, que estima a
viabilidade das sementes com base na alteração da coloração dos
tecidos vivos em presença de uma solução de sal de tetrazólio (2,3,5trifenil cloreto de tetrazólio). No Brasil, começou a ser mais difundido
na década de 70, através do Programa do AGIPLAN do Ministério da
Agricultura, com treinamentos e lançamentos de publicações
(Delouche et al., 1976 e Grabe, 1976).
Os testes de germinação, na maioria das espécies cultivadas,
necessitam de 7 a 30 dias para obtenção dos resultados, enquanto o
de tetrazólio pode informar a viabilidade de um lote em algumas horas.
Por isso, tem importância para o setor de sementes, agilizando as
decisões de beneficiamento, armazenamento, comercialização ou
descarte de lotes.
O sal de tetrazólio é um indicador oxidante e redutor, e o
desenvolvimento de cor vermelha, não difusível no tecido vivo, é o
resultado da redução do sal pela ação enzimática, principalmente das
desidrogenases. O teste é baseado na atividade de sistemas de
enzimas, envolvidas com a atividade respiratória dos sistemas
biológicos, capazes de catalizar as reações durante a glicólise e o ciclo
de Krebs, tornando-se inativas com a perda da viabilidade dos tecidos.
Durante os processos respiratórios, substâncias interniediárias
são produzidas e servem de substratos para as enzimas, íons de
hidrogênio são transferidos para o tetrazólio, que atua como um
receptor de hidrogênio. O tetrazólio é reduzido a uma substância de
cor vermelha, insolúvel e estável, denominada formazan. Como essa
reação ocorre no interior das células e o pigmento não é difusível, há
um delineamento nítido entre o tecido vivo, que adquire a cor
vermelha, e o tecido morto, que permanece sem alteração de cor, já
que não há respiração.
A distribuição das áreas vivas e mortas nas sementes pode ser
visualizada e, conforme sua localização, permite avaliar a viabilidade
das sementes.
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REAÇÃO DO TETRAZÓLIO
A velocidade da reação do tetrazólio é afetada por diversos
fatores: pH, temperatura, pressão atmosférica, concentração da
solução e o nível de deterioração ou dormência das sementes.
O equipamento necessário não é complexo, mas requer um
maior tempo de trabalho do analista em relação ao demandado pelo
teste de germinação. Exige, também, o conhecimento da estrutura
embrionária da semente.
Como a avaliação é feita sem a germinação, não são
identificados os microrganismos presentes e, também, os eventuais
danos causados por produtos utilizados no tratamento das sementes.
Além de nem sempre ser possível detectar danos mecânicos de
ocorrência recente.
As sementes de café (Coffea spp.) perdem rapidamente a
qualidade fisiológica e o teste de germinação necessita de 30 dias para
obtenção dos resultados finais. Esses fatos, além de impedirem que a
informação, proveniente do teste de germinação, reflita fielmente a
viabilidade do lote analisado, causam dificuldades na comercialização
devido ao curto espaço de tempo disponível entre a colheita e a
semeadura.
Diante dessa situação, uma série de pesquisas tem sido
desenvolvidas, visando abreviar o prazo requerido para a obtenção dos
resultados de viabilidade, através de métodos indiretos passíveis de
correlação com o teste de germinação. Dentre as tentativas realizadas,
a do teste de tetrazólio tem-se mostrado como uma das mais eficientes,
não apenas pela rapidez proporcionada, mas também por ser uma
técnica amplamente utilizada em várias espécies, como por exemplo
soja (França Neto et al, 1988) e milho (Dias & Barros, 1995).
A maior dificuldade na aplicação do teste de tetrazólio, em
sementes de café, reside na metodologia a ser, adotada para sua
condução, uma vez que o embrião, além de necessitar de um íntimo
contato com a solução, encontra-se em região de difícil acesso para a
sua exposição, durante a avaliação. Paralelamente, a idade de póscolheita da semente pode exigir diferentes tempos de permanência na
solução de tetrazólio para a coloração dos embriões.
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Buscando contornar esses problemas, Dias & Silva (1986)
desenvolveram metodologia para o teste de tetrazólio em sementes de
café, visando a obtenção de resultados equivalentes aos de germinação
e a facilidade na execução, utilizando técnica que procurou evitar, ao
máximo, danos mecânicos sobre o embrião, durante o processo de seu
preparo para a avaliação. Os resultados obtidos não indicaram
diferenças significativas entre as informações provenientes dos testes
de germinação e de tetrazólio. Posteriormente, Dias & Barros (1993),
comparando vários testes para avaliação da qualidade fisiológica de
sementes de café, verificaram que o teste de tetrazólio foi o que
apresentou maior sensibilidade para detectar diferenças de qualidade
entre os lotes estudados.
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
- sal de tetrazólio (2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio);
- água destilada;
- placas de Petri, Becker ou copos plásticos descartáveis;
- frasco de vidro escuro (âmbar);
- bisturi, estilete e pinças;
- papel toalha e papel filtro;
- estufa ou germinador com controle de temperatura;
- lupa e microscópio estereoscópio;
- refrigerador.
PREPARO DA SOLUÇÃO
As soluções devem ser preparadas com água destilada, com pH
entre 6 e 8, devendo ser acondicionadas em frasco de vidro escuro
(âmbar) e guardadas em local escuro e fresco. Embora, para sementes
de café, as Regras para Análise de Sementes (Brasil, 1992)
recomendem solução a 1% (que é obtida misturando-se 10 g do sal de
tetrazólio em 1 litro de água destilada), o teste pode ser conduzido com
concentração de 0,1 %, sem prejudicar a precisão dos resultados e
com significativa redução de custo.
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OBTENÇÃO DA AMOSTRA
As sementes são obtidas do componente "sementes puras" da
análise de pureza, da mesma forma adotada na obtenção da amostra
de trabalho para o teste de germinação. Nas análises oficiais são
testadas 200 sementes (duas subamostras de 100 ou quatro de 50);
para testes não oficiais, as amostras podem ser menores, geralmente
duas repetições de 50 sementes, em virtude da uniformidade das
condições ambientais proporcionadas pelo teste e da reduzida
possibilidade de aparecimento das infecções, que normalmente
ocorrem no teste de germinação.
PRÉ - CONDICIONAMENTO
Após a retirada manual dos pergaminhos, as sementes são
embaladas em papel toalha úmido, para que a embebição provoque o
amolecimento da semente e a ativação do sistema enzimático,
facilitando o seu corte, a penetração da solução e o desenvolvimento
da coloração. A embebição deve ser feita durante 18-24 horas a 30° C
para acelerar o processo. Para evitar a perda de água, as amostras
devem permanecer em câmara úmida ou acondicionadas em sacos
plásticos.
PREPARO DAS SEMENTES
As sementes de café são seccionadas, conforme o indicado na
Figura 1. Com o uso de um bisturi, a parte do endosperma portadora
do embrião é retirada, de forma a não danificar ou expor o embrião. O
restante do endosperma é descartado.
Fig. 1 - Esquema dos cortes efetuados no endosperma da semente de café
para a coloração no tetrazólio. Londrina, PR. 1998.
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COLORAÇÃO
As porções dos endospermas portadoras dos embriões são
submersas em solução de tetrazólio e levadas à câmara sob 35° C,
para acelerar a reação, em ausência de luz.
Após 14 a 16 horas, a solução de tetrazólio é eliminada e as
porções dos endospermas são lavadas em água corrente e conservadas
imersas em água até a avaliação. Se esta não for imediata, as
amostras devem ser mantidas a 5 - 10° C. A interpretação pode ser
adiada por algumas horas, porém a demora aumentará a dificuldade
de extração do embrião e a precisão do teste ficará prejudicada.
AVALIAÇÃO
Para a avaliação, os embriões são cuidadosamente extraídos da
parte remanescente do endosperma, com o auxílio de bisturi e estilete,
e colocados sobre papel filtro umedecido (Figura 2). A interpretação do
teste deve ser realizada com o auxílio de microscópio estereoscópio.
Fig. 2 -
Extração do embrião da semente de café, após a sua coloração, para a
avaliação do teste de tetrazólio. Londrina, PR. 1998.
O teste de tetrazólio baseia-se principalmente na distribuição
dos tecidos vivos com coloração de rosa claro a vermelho; dos tecidos
mortos descoloridos ou acinzentados, entre os vários órgãos do
embrião. Por isso, para avaliação do teste é necessário conhecer com
segurança a estrutura das sementes e das plântulas. Se a importância
e a função de cada órgão não for conhecida, as reações coloridas não
terão sentido.
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Além da coloração são observadas a turgescência dos tecidos, a
ausência de fraturas em regiões vitais da semente e a sua formação
morfológica. Em café podem ocorrer sementes sem embrião ou com a
presença de mais de um embrião. Sementes sem embrião são
anotadas como não viáveis.
Diferenças na coloração dos tecidos podem não significar
variações na viabilidade e, sim, alterações na permeabilidade.
Sementes deterioradas, geralmente, colorem-se mais rápida e
profundamente de vermelho-grená. As sementes vigorosas colorem-se
vagarosamente, em tom rosa claro, brilhante e superficial, independentemente do período de permanência no tetrazólio, demonstrando
dificuldade de penetração do sal nos tecidos com células portadoras de
membranas celulares pouco deterioradas, O analista deve conhecer
essas diferenças de coloração porque, também, podem indicar tempo
insuficiente de contato com o tetrazólio ou concentração inadequada
da solução.
Devem ser consideradas viáveis as sementes que apresentarem
embriões coloridos de rosa claro ou vermelho, segundo os critérios
apresentados na Figura 3:
1 - Embrião totalmente colorido de rosa claro.
2 - Embrião com a extremidade da radícula descolorida ou
acinzentada.
3 - Embrião com as extremidades dos cotilédones descoloridas ou
acinzentadas.
4 - Embrião com as extremidades da radícula e dos cotilédones
descoloridas ou acinzentadas.
5 - Embrião com coloração vermelha intensa, indicadora de
deterioração fisiológica ou de danificação superficial, em área total
ou circunscrita a pequenas regiões.
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V=VIÁVEL
Fig. 3 -
NV+NÃO VIÁVEL
Representação esquemática dos critérios para avaliação da
viabilidade dos embriões no teste de tetrazólio em sementes
de café. As áreas coloridas de rosa claro a vermelho indicam
as regiões de tecidos vivos. Londrina, PR. 1998.
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REFERÊNCIAS
BRASIL, Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Regras para
análise de sementes. Brasília, 1992. 365 p.
DELOUCHE, J. C; STILL, T. W.; RASPET, M.; LIENHARD, M. O teste
de tetrazólio para
viabilidade da semente. Brasília,
AGIPLAN,1976. 103 p.
DIAS, M. C. L. L. & SILVA, W. R. da. Determinação da viabilidade de
sementes de café através
do teste de tetrazólio. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, 21(11): 1139-1145, 1986.
DIAS, M. C. L. L. & BARROS, A. S. R. Avaliação de testes para
determinação da qualidade
fisiológica de sementes de café
(Coffea arabica l). Informativo ABRATES, 3(3): 155, 1993.
DIAS, M. C. L. L. & BARROS, A. S. R. Avaliação da qualidade de
sementes de milho. Londrina, IAPAR, 1995. 43 p. (IAPAR.
Circular, 88).
FRANÇA NETO, J. B.; PEREIRA, L. A. G.; COSTA, N. P. da;
KRZYZANOWSKI, F. C; HENNING, A. A. Metodologia do teste de
tetrazólio em sementes de soja. Londrina, EMBRAPA-CNPSo,
1988. 60 p. (EMBRAPA-CNPSo. Série Documentos, 32).
GRABE, D. F. Manual do teste de tetrazólio em sementes. Brasília,
AGIPLAN, 1976. 85 p.
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AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem aos funcionários do Laboratório de
Análise de Sementes do IAPAR pelas colaborações recebidas.